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CN112334153A - 用于免疫细胞操作的具有稳定的mhc分子的支架 - Google Patents

用于免疫细胞操作的具有稳定的mhc分子的支架 Download PDF

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CN112334153A
CN112334153A CN201980041621.5A CN201980041621A CN112334153A CN 112334153 A CN112334153 A CN 112334153A CN 201980041621 A CN201980041621 A CN 201980041621A CN 112334153 A CN112334153 A CN 112334153A
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CN
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aapc
scaffold
glu
cells
arg
Prior art date
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Application number
CN201980041621.5A
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塞恩·雷克·哈德鲁普
索伦·尼伯·雅各布森
苏尼尔·库马尔·萨伊尼
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Danish Technical University
Original Assignee
Danish Technical University
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Publication date
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Abstract

本发明涉及人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，以向细胞提供特异性功能性刺激，以获得对于介导肿瘤消退或病毒清除而言理想的表型特性和功能特性。特别地，本发明的支架包含稳定的MHC I类分子，所述稳定的MHC I类分子包含重链，所述重链包含通过二硫桥连接的α‑1结构域和α‑2结构域，其中所述MHC I类分子不含抗原肽。所述支架可以按需负载抗原肽，从而为以肽‑MHC定向方式有效扩增和功能刺激特异性T细胞提供了灵活的平台。

Description

用于免疫细胞操作的具有稳定的MHC分子的支架
技术领域
本发明涉及人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，以向细胞提供特异性功能性刺激，以获得对于介导肿瘤消退或病毒清除而言理想的表型特性和功能特性。特别地，本发明的支架包含不含抗原肽的稳定的MHC I类分子。支架可以按需负载抗原肽，从而为以肽-MHC定向方式有效扩增和功能刺激特定T细胞提供了灵活的平台。
背景技术
在恶性黑色素瘤研究中，免疫治疗方法过继细胞转移(ACT)——其中从患者体内提取来自外周血(PBMC)的肿瘤反应性T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，使其激活并离体扩增，随后返回给患者——在超过50％的患者中表现出临床持久响应。然而，来自PBMC的肿瘤反应性T细胞或TIL的扩增需要大量的离体培养，通常以T细胞分化和功能能力为代价。结果，转移的T细胞产物可能不含有足够频率的、具有适当的表型和功能特征的肿瘤反应性CD8 T细胞，以介导肿瘤消退。此外，大多数此类肿瘤浸润性T细胞可能不是肿瘤特异性的，而是来自外周的旁观者T细胞浸润，其中T细胞受体(TCR)识别不匹配任何肿瘤抗原。最后，由于肿瘤部位存在抑制环境，肿瘤反应性T细胞部分的生长潜力可能降低。
已经尝试利用人工抗原呈递细胞(aAPC)来克服扩增的T细胞的分化和功能能力不足的问题。aAPC背后的简单概念是它们模拟TCR与由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的特异性抗原肽之间的天然相互作用。这种相互作用是通过能够引发有效免疫响应的T细胞的激活、扩增和分化来产生免疫力的核心步骤。T细胞影响分子(例如细胞因子和共刺激分子)进一步辅助天然T细胞响应的产生，它们诱导T细胞活化和功能。因此，将所有必需的分子掺入单一aAPC支架中是克服T细胞扩增的一些挑战的有希望的工具。aAPC形成了T细胞活化和分化的理想免疫突触。然而，关键的挑战是开发使aAPC能够有效地扩增所提取的TIL同时还保持功能性表型的分子的组合。
在WO2002072631中公开了利用MHC平台的许多概念，其中一种是MHC构建体，其包含其上连接有一种或多种MHC分子的载体分子。该构建体还可含有生物活性分子，例如共刺激分子或细胞调节分子。预期该MHC构建体特别用于扩增识别该构建体的细胞并用于产生用于治疗疾病(例如癌症等)的治疗组合物。WO2002072631公开了可能适用于T细胞扩增的许多共刺激分子和细胞因子，但没有鉴定出对于T细胞扩增特别合适且有效的任何特定组合。
US 2011/318380公开了WO2002072631中描述的MHC构建体在癌症疫苗和免疫监测中的应用。然而，US 2011/318380没有举例说明对于T细胞扩增特别合适且有效的共刺激分子和细胞因子的任何特定组合。
WO2009003492主要关注抗原特异性T细胞的检测，但也公开了抗原特异性T细胞的扩增。其中描述了具有和不具有复合肽的MHC多聚体，其制备方法及其在分析和治疗中使用的方法，包括能够灭活或消除不需要的靶T细胞的抗原特异性T细胞的分离。根据WO2009003492的MHC多聚体可包含葡聚糖支架和共刺激分子和细胞调节分子。然而，该公开没有明确对于T细胞扩增特别有效的分子的特定组合。
在WO2009094273中公开了一种用于扩增抗原特异性T细胞的aAPC组合物，其包含纳米颗粒、细胞因子、偶联剂、T细胞受体活化剂和共刺激分子。T细胞受体活化剂可以是与抗原肽结合的MHC分子。此外，描述了扩增的T细胞在过继免疫疗法中的用途。然而，仅探索了aAPC上单一细胞因子(即IL-2)的适合性，并且仅将其与外源细胞因子进行了比较。
因此，先前对于aAPC支架的公开的共同之处在于它们仅以大致一般性的方式描述该概念。由于只有在组合了刺激分子的特定组合时，才能满足T细胞扩增的成功标准，即活性T细胞的比例高、T细胞的抗原特异性高且T细胞的功能性高，因此非常需要定义明确且有效的aAPC支架。只有当满足T细胞扩增的所有三个成功标准时，才能最佳地制备所得的T细胞群以应用它们的抗肿瘤或抗病毒功能。
已知的aAPC支架的另一个局限性是其效率低下且生产不灵活，这与加速开发新型免疫疗法的高通量平台的需求不一致。aAPC支架制备的主要瓶颈是由抗原肽呈递对MHC分子的需求造成的。简而言之，MHC分子的再折叠过程很复杂，因为在没有β2-微球蛋白(B2M)和抗原肽的情况下，重链不能折叠成其天然状态。因此，空MHC I类分子极不稳定，容易发生聚集。因此，每一个想要用于T细胞刺激的肽-MHC组合都需要独立的生产线。这造成了困难，因为抗原肽的分布非常广泛，每个患者每个HLA分子有效呈递的估计范围为200.000个肽，而MHC I类分子的种类非常多，现有已知的MHC I类分子超过12.000个。此外，在特定情况下，选择相关的抗原肽取决于目标疾病、患者的MHC特征和可用的T细胞库。因此，目前的一条生产线只能产生一种抗原肽特异性aAPC支架，使得它几乎不可能符合巨大的抗原肽多样性，并且利用传统个性化aAPC生产技术覆盖广泛的可能的抗原肽和MHC分子组合存在挑战。
重组MHC I类分子在例如细菌中产生，形成不溶性的包涵体。在此之前，将这些包涵体在离液剂(chaotropic agent)溶液中变性，然后在目标特异性抗原肽的存在下去除离液剂(例如通过复性和再折叠)，从而形成pMHC复合物。然后通过凝胶过滤层析从未折叠的蛋白质中纯化pMHC复合物。这是一种费力且效率低下的技术，只能产生一种类型的pMHC。
已经寻求通过生产带有中间体肽(在MHC分子再折叠后，该中间体肽用目标抗原肽取代)的MHC分子，解决MHC分子的低效率生产问题。这种技术被称为MHC肽交换。然而，交换率并不是100％，可交换肽的损失可能会导致MHC分子的大量损失(高达50％)，而损失的MHC分子无法用于新肽的结合。此外，这种生产方法是耗时的，并且肽交换通常发生在MHC单体阶段，使得该技术不适合用于较大的支架。上述局限性限制了对aAPC支架组装的化学计量学的控制，并提供了与可变产品稳定性相关的挑战，具体取决于所组装的pMHC分子。
然而，包含pMHC的当前aAPC支架技术的另一个限制是主要组织相容性复合物的固有不稳定性，已知主要组织相容性复合物的寿命依赖于抗原肽。pMHC的不稳定性限制了pMHC保持完全功能从而可用于组装功能性aAPC支架的窗口。同时pMHC复合物的不稳定性也限制了组装好的aAPC复合物可以保持完全功能并且能够有效地且抗原特异性地刺激CD8 T细胞的时间。
在US 9,494,588中，已经提出提供空MHC I类分子作为从单个生产线生产任意抗原特异性MHC I类分子的便利方法，其中在MHC I类分子折叠之后，可以用抗原肽负载该空MHC I类分子。然而，这种方法是否适合大型aAPC支架的使用纯属推测，且未公开。例如，尚未证明它们能够以与wt MHC分子相似的抗原特异性相互作用特性与T细胞相互作用。此外，引入的突变是否会在结构上影响TCR-pMHC的相互作用尚不清楚。而同样，这种修饰的相互作用的功能也没有被描述。
因此，用于高通量设置的改进的aAPC支架将是有利的。特别地，提供可以预先产生并在需要时负载抗原肽以扩增和刺激T细胞群，从而产生高比例的活性T细胞、高抗原特异性的T细胞和高功能性的T细胞的aAPC支架将是有利的。
发明内容
因此，本发明的一个目的涉及提供人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，其扩增从外周血(PBMC)提取的肿瘤反应性T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的能力提高。
本发明的另一个目的是提供一种更加用户友好的高通量的平台，用于产生呈递不同抗原肽的改良的aAPC的大型文库。
此外，大批质量保证的aAPC支架的生产将更好地满足监管机构对质量保证不断增长的要求。在这里，我们可以针对生产挑战提供“现成(off the shelf)”解决方案，其中包括大批质量受控制的aAPC支架，这些支架可用于在终端用户使用现场负载抗原肽。对于越来越多的高度个性化的免疫治疗方案(其中对患者肿瘤进行测序，以鉴定肿瘤突变，从而预测癌症特异性肽抗原)而言，这将是理想的解决方案。可以设想将这样的抗原肽直接负载到做好的可容纳抗原肽的aAPC支架中。
特别地，本发明的一个目的是提供一种aAPC支架，其解决了现有技术的上述问题，即扩增的T细胞群的T细胞分化和功能能力不足。
本发明的另一个目的是利用所获得的具有优化的表型和功能特性的扩增的T细胞群来介导肿瘤消退或病毒清除。
因此，本发明的一个方面涉及一种人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，其包含聚合物主链，所述聚合物主链上连接有以下模板分子：
i.至少一种T细胞影响分子，以及
ii.至少一种MHC I类分子，
其中所述MHC I类分子包含重链，所述重链包含通过二硫桥连接的α-1结构域和α-2结构域。
本发明的另一方面涉及同时体外刺激和扩增T细胞的方法，其包括以下步骤：
i.提供包含T细胞的样品，
ii.使所述样品与包含根据本发明的aAPC支架的扩增溶液接触，
iii.刺激并扩增培养中的、对所述aAPC支架具有特异性的T细胞，以及
iv.从培养物中收获步骤iii)的T细胞，以获得扩增的抗原特异性T细胞群。
本发明的另一方面是提供通过本发明的方法获得的扩增的T细胞群。
本发明的又一方面涉及通过本发明的方法获得的扩增的T细胞群，其用作药物。
本发明的又一方面是提供通过本发明的方法获得的扩增的T细胞群，其用于治疗癌症或病毒病况。
本发明的又一方面是提供一种用于T细胞扩增的试剂盒，该试剂盒包括：
i.第一存储构件，其包括至少一种根据本发明的aAPC支架，和
ii.第二存储构件，其包含至少一种抗原肽，
其中，所述第一存储构件和所述第二存储构件的内容物被配置为相组合。
附图说明
图1显示了(A)示例性人工抗原呈递细胞(aAPC)支架的示意图。aAPC支架由主链组成，主链上连接有模板分子，例如未负载的MHC I类分子(或负载的肽-MHC(pMHC)I类分子)和T细胞影响分子，例如细胞因子或共刺激分子。给出了aAPC支架的实例，其中不同比例的主链和模板分子被组装至aAPC支架中。(B)仔细选择的模板分子的组合可以如何在aAPC支架中组合并用于扩增从患者提取的特异性T细胞群的图示。
图2显示了(A)来自健康供体的HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的频率，其用PE(X-轴)和APC(Y-轴)标记的四聚体直接离体检测。用比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的抗原呈递支架，加20IU/ml IL-2(添加到培养基中)(B)，游离的FLU BP-VSD肽、IL-15和IL-21(C)，或携带无关肽特异性的比例为1：10：5：5：5的抗原呈递支架(D)培养两周后，HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的频率。(E)基于HLA-A1FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的频率的扩增率，从基线、扩增后1周和2周通过四聚体染色检测。(F)扩增2周后，HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的绝对数量。
图3显示了用HLA-A*02:01、FLU 58-66GILGFVFTL肽(SEQ ID NO：20)刺激后CD8 T细胞中TNF-α和IFN-γ表达的点状图，其比较了由用Cys-突变型和野生型MHC分子组装的aAPC支架进行扩增的CD8 T细胞的功能性。使用组装比例为1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)的aAPC支架将HLA-A*02:01、FLU 58-66GILGFVFTL特异性CD8 T细胞(来自健康供体PBMC，初始频率为0.3％)(左侧，扩增前pMHC双色四聚体染色图)扩增10天，并用FLU 58-66GILGFVFTL肽刺激。将具有无关肽(HLA-A*02:01HIV Pol ILKEPVHGV(SEQ ID NO:23))特异性的aAPC支架(用于扩增培养，随后进行肽刺激)用作阴性对照。TNF-α抗体是PE-Cy7标记的(Y轴)，而IFN-γ抗体是APC标记的(X轴)。这些染色一式两份进行，仅显示了各染色中的一个。
图4显示了用HLA-A*02:01、EBV BMF1 GLCTLVAML肽(SEQ ID NO：21)刺激后CD8 T细胞中TNF-α和IFN-γ表达的点状图，其比较了由用Cys-突变型和野生型MHC分子组装的aAPC支架进行扩增的CD8 T细胞的功能性。使用组装比例为1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)的aAPC支架将HLA-A*02:01、EBV BMF1 GLCTLVAML特异性CD8 T细胞(来自健康供体PBMC，初始频率为0.05％)(左侧，扩增前pMHC双色四聚体染色图)扩增10天，并用EBVBMF1GLCTLVAML肽刺激。将具有无关肽(HLA-A*02:01HIV Pol ILKEPVHGV(SEQ ID NO:23))特异性的aAPC支架(用于扩增培养，随后进行肽刺激)用作阴性对照。TNF-α抗体是PE-Cy7标记的(Y轴)，而IFN-γ抗体是APC标记的(X轴)。这些染色一式两份进行，仅显示了各染色中的一个。
图5示出了使用aAPC支架扩增的HLA-A*02:01CMV pp65 NLVPMVATV(SEQ ID NO：22)特异性CD8 T细胞的四聚体染色点图，其比较了先组装型(post assembly)Cys-突变型MHC(即，可负载的)aAPC支架与负载抗原的、后组装型(pre assembly)支架(Cys-突变型或野生型MHC)的扩增效率。图5A，HLA-A*02:01CMV pp65 NLVPMVATV特异性CD8 T细胞的基线频率(计为以pMHC特异性双阳性四聚体测定的总CD8 T细胞的百分比)。图5B是在使用Cys-突变型MHC的负载了抗原肽的先组装型aAPC支架、使用Cys-突变型MHC的负载了抗原肽的后组装型aAPC支架、以及使用野生型MHC的负载了抗原肽的后组装型aAPC之间，比较了HLA-A*02:01CMV pp65 NLVPMVATV特异性CD8T细胞扩增10天并使用pMHC特异性PE四聚体进行定量的情况。
图6显示了用HLA-A*02:01、CMV pp65 NLVPMVATV肽(SEQ ID NO：22)刺激后CD8 T细胞中TNF-α和IFN-γ表达的点状图，其比较了用以下aAPC支架扩增的CD8 T细胞的功能：使用Cys-突变型MHC的负载了抗原肽的先组装型aAPC支架、使用Cys-突变型MHC的负载了抗原肽的后组装型aAPC支架、以及使用野生型MHC的负载了抗原肽的后组装型aAPC。TNF-α抗体是PE-Cy7标记的(Y轴)，而IFN-γ抗体是APC标记的(X轴)。这些染色一式两份进行，仅显示了各染色中的一个。
图7示出了用HLA-A*02:01、EBV BMF1 GLCTLVAML肽(SEQ ID NO：21)刺激后的TNF-α和IFN-γ双阳性CD8 T细胞的点状图。使用aAPC支架1：8：8：8(支架：MHC/pMHC：IL-2：IL-21)将来自健康供体PBMC的HLA-A*02:01、EBV BMF1 GLCTLVAML特异性CD8 T细胞扩增10天，以比较用以下aAPC支架扩增的CD8 T细胞的功能：使用Cys-突变型MHC的负载了抗原肽的先组装型aAPC支架、使用Cys突变型MHC的负载了抗原肽的后组装型aAPC支架、以及使用野生型MHC的负载了抗原肽的后组装型aAPC(图7B)。TNF-α抗体是PE-Cy7标记的(Y轴)，而IFN-γ抗体是APC标记的(X轴)。这些染色一式两份进行，仅显示了各染色中的一个。供体PBMC中的基线HLA-A*02:01、EBV BMF1 GLCTLVAML特异性CD8 T细胞显示为通过pMHC特异性双色四聚体(占总CD8 T细胞的百分比)测量(图7A)。
图8示出了流式细胞仪分析的点状图，其比较了使用用wt MHC制备的pMHC四聚体(上图)或Cys-突变型pMHC四聚体(下图)的HLA-A*02:01抗原特异性CD8 T细胞的TCR识别。分析了四种不同的抗原特异性，以验证Cys-突变型MHC以与wt MHC相当的方式识别CD8 T细胞TCR。CD8阳性T细胞以总CD8 T细胞的百分比表示，并以两种颜色检测，因此是双阳性点图(X和Y轴)。
图9示出了在用HLA-A*01:01CMV pp65 YSEHPTFTSQY肽(SEQ ID NO：30)刺激后CD8T细胞的扩增。(A)使用分别用荧光标记PE和BV605标记的MHC四聚体，从外周血中鉴定HLA-A*01:01CMV pp65 YSEHPTFTSQY特异性CD8 T细胞。该图在CD8 T细胞上进行预圈门(pregate)。(B)使用neo2/15+pMHC Ag支架扩增2周后，HLA-A*01:01CMV pp65 YSEHPTFTSQY特异性CD8 T细胞的数量。描绘的是CD8 T细胞(Y轴)和BV605标记的MHC四聚体阳性T细胞(x轴)。细胞数量从总CD8 T细胞中的0.6％的HLA-A*01:01CMV pp65 YSEHPTFTSQY特异性CD8T细胞增加到扩增后的8.4％。(C)HLA-A*01:01CMV pp65 YSEHPTFTSQY特异性CD8 T细胞对抗原暴露作出响应的能力。所有T细胞中有40％会产生多细胞因子分泌。
现在将在下面更详细地描述本发明。
具体实施方式
定义
在进一步详细讨论本发明之前，首先定义以下术语和惯例：
人工抗原呈递细胞(aAPC)支架
在本发明的上下文中，术语“人工抗原呈递细胞(aAPC)支架”是指如本文所定义的必需分子的组装，以使其类似于抗原呈递细胞起作用。
聚合物主链
在本发明的上下文中，术语“聚合物主链”是指aAPC支架的一部分，各个模板分子固定其上。模板分子通过偶联剂(其位于聚合物主链上或作为聚合物主链的整合部分)与亲和标签(其置于模板分子上)之间的相互作用而连接。或者，偶联剂可以位于模板分子上，相应的亲和标签位于聚合物主链上。
聚合物主链可以是选自以下的材料：多糖、乙烯基聚合物、聚乙二醇、聚丙二醇、strep-tactin、聚链霉亲和素、生物素结合蛋白和聚组氨酸结合聚合物。
模板分子
在本发明的上下文中，术语“模板分子”是指连接在aAPC支架的聚合物主链上的任何分子。它们可以选自MHC I类分子、T细胞影响分子(例如细胞因子和共刺激分子)以及CD47。模板分子包含亲和标签。
在一些实施方案中，模板分子可以直接连接到固体支持物上，而不是在聚合物主链上。
T细胞影响分子
在本发明的上下文中，术语“T细胞影响分子”是指对T细胞具有生物学效应的任何分子。生物学效应包括但不限于T细胞的增殖、分化和刺激。
因此，可以将T细胞影响分子用于扩增和功能性地操纵T细胞群，以获得所需的分化，从而导致高特异性、高杀伤能力、高体内扩增和存活特性。T细胞影响分子包括但不限于细胞因子、共刺激分子和粘附分子。
本发明的aAPC支架可以包含一种或多种不同类型的T细胞影响分子，例如至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少五种不同类型的T细胞影响分子。另外，位于每个aAPC上的T细胞影响分子的数目也可以是一个或多个，并且可以根据aAPC的设计而变化。因此，aAPC支架上的T细胞影响分子的数目可以在1-100，例如1-50，例如1-25，例如1-20，例如1-15，例如1-10或1-5的范围内。
突变型半胱氨酸残基
在本发明的上下文中，术语“突变型半胱氨酸残基”是指已经人工引入MHC I类分子的重链中的半胱氨酸残基。因此，突变型半胱氨酸残基不存在于相应的野生型MHC I类分子的重链中。
可以通过本领域技术人员已知的诱变技术，例如定点诱变，来引入突变型半胱氨酸残基。
非共价相互作用
在本发明的上下文中，术语“非共价相互作用”是指通过除共价键之外的其他相互作用的任何键合。非共价键可以通过例如疏水相互作用、亲水相互作用、离子相互作用、范德华力、氢键和它们的组合形成。
偶联剂
在本发明的上下文中，术语“偶联剂”是指位于aAPC的聚合物主链上的分子实体。偶联剂可以与亲和标签非共价结合。偶联剂的实例包括链霉亲和素、亲和素、strep-tactin、抗体、聚His标签、金属离子螯合物等。
或者，偶联剂可以位于模板分子上，相应的亲和标签位于聚合物主链上。
亲和标签
在本发明的上下文中，术语“亲和标签”是指位于模板分子上的分子种类。亲和标签通过非共价相互作用高度特异性地结合偶联剂。偶联剂的实例包括生物素、抗体表位、His标签、链霉亲和素、strep-tactin、聚组氨酸、肽、金属离子螯合物等。
或者，亲和标签可以位于聚合物主链上，相应的偶联剂位于模板分子主链上。
抗原肽
在本发明的上下文中，术语“抗原肽”是指能够结合主要组织相容性复合物(MHC)分子以形成肽-MHC(pMHC)复合物的肽。pMHC复合物可以将抗原肽呈递给免疫细胞，以诱导T细胞受体依赖性免疫响应。
MHC分子可以是MHC I类分子。
MHC
在本发明的上下文中，术语“MHC”是指主要组织相容性复合物，它是一种蛋白质复合物，其主要功能是结合源自病原体的抗原肽并将其展示在细胞表面上，以被适当的T细胞识别。
MHC分子有两大类，MHC I类分子和MHC II类分子。本文中，“MHC”是指MHC I类分子。MHC I类分子由以下组成：由MHC基因产生的α链(重链)和由β2-微球蛋白基因产生的β链(轻链或β2-微球蛋白)。
重链由三个结构域组成，分别命名为α-1、α-2和α-3。α-1结构域位于非共价结合的β2-微球蛋白附近。α-3结构域是跨膜结构域，其将MHC I类分子锚定在细胞膜中。α-1结构域和α-2结构域一起形成异二聚体，该异二聚体包含结合特定抗原肽的肽结合槽。肽结合槽的氨基酸序列是关于MHC I类分子结合哪种特异性抗原肽的决定因素。
天然地，MHC I类分子的重链包含四个保守的半胱氨酸残基，导致形成两个二硫桥。在MHC I类分子的正确折叠构象中，一个二硫桥位于Cys101和Cys164之间的α-2结构域内，另一个二硫桥位于Cys203和Cys259之间的α-3结构域内，其中氨基酸编号参考不含信号肽的HLA-A。
在本发明中，通过重组引入两个半胱氨酸残基而在α-1结构域和α-2结构域之间引入了另外的二硫桥。优选地，在重链的一些位置上引入两个突变型半胱氨酸，在这些位置上，α-1结构域中的半胱氨酸残基与α-2结构域中的半胱氨酸残基之间的空间距离在2至10埃之间。
MHC分子可以是空的(empty)或与抗原肽结合。因此，在本发明的上下文中，不含抗原肽的MHC分子(即空的MHC分子)和pMHC分子之间存在区别，pMHC分子是指结合了抗原肽的MHC分子。
在本发明的上下文中，术语“可负载的aAPC支架”、“可容纳抗原肽的aAPC支架”和“空的aAPC支架”可互换使用以表示具有不含抗原肽的MHC分子的aAPC支架。
在人类中，MHC复合物由人白细胞抗原(HLA)基因复合物编码。因此，在本发明的上下文中，术语“MHC”还涵盖“HLA”。HLA存在三种主要类型，因此在本发明的上下文中，MHC包括但不限于在HLA-A、HLA-B和HLA-C的基因座中编码的HLA等位基因。类似地，MHC包括但不限于MHC I类分子，例如HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、MIC A、MIC B、CD1d、ULBP-1、ULBP-2和ULBP-3。
pMHC
在本发明的上下文中，术语“pMHC”是指与抗原肽结合的如上定义的MHC分子。因此，术语pMHC是指负载有抗原肽的MHC I类分子。
细胞因子
在本发明的上下文中，术语“细胞因子”是指影响受刺激的T细胞的扩增、存活和效应功能的免疫调节分子。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。
白介素的实例包括但不限于IL-21、IL-2、IL-15、IL-1、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-17、IL-22和IL-23。细胞因子也包括诱导与一种或多种白介素相对应的T细胞刺激和激活的白介素的变体或模拟物。白介素的变体或模拟物可包含天然细胞因子的结合位点，但蛋白质的其余部分有所变化。因此，白介素的变体或模拟物包括但不限于IL-2、IL-15和IL-21或其组合(例如IL-2/IL-15)的变体。
细胞因子组中包含的一种特定白介素变体或模拟物称为Neoleukin-2/15。Neoleukin-2/15(Neo-2/15)是一种设计型细胞因子，其具有高度稳定性，并与IL-2Rβγc牢固结合，但与CD25却不结合。
γ链受体细胞因子
在本发明的上下文中，术语“γ链受体细胞因子”是指与包含共同γ链亚基的相应细胞因子受体结合的细胞因子组。共同γ-链(γc)受体也称为CD132或白细胞介素-2受体亚基γ(IL-2RG)。γ链受体细胞因子的一个共同点是它们都通过共享的γ链受体传递其细胞内信号并影响T细胞活化和分化。
γc糖蛋白是跨膜蛋白，其包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，并且通常在淋巴细胞上表达。γc亚基是至少六种不同细胞因子受体(即IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21受体)的受体复合物的一部分。因此，γ链受体细胞因子组至少包含IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21。γ链受体细胞因子还包括诱导与一种或多种白介素相对应的T细胞刺激和激活的γ链受体细胞因子的变体或模拟物，例如IL-2、IL-15和IL-21或其组合(例如IL-2/IL-15)的变体。
共刺激分子
在本发明的上下文中，术语“共刺激分子”是指相对于未与共刺激分子接触的T细胞，在与T细胞相互作用时增强T细胞响应、增殖、细胞因子的产生和/或分泌，刺激T细胞的分化和效应功能或促进T细胞存活的分子。共刺激分子的实例包括但不限于B7.1、B7.2、ICOS、PD-L1、a-半乳糖神经酰胺、CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD27、CD28、CD30、CD69、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD147、CDw150(SLAM)、CD152(CTLA-4)、CD153(CD30L)、CD40L(CD154)、Fas(CD95)、CD40、CD48、CD70和CD72。
粘附分子
在本发明的上下文中，术语“粘附分子”是指诱导aAPC支架和T细胞之间粘附的分子。粘附分子包括但不限于ICAM-1、ICAM-2、GlyCAM-1、CD34、抗-LFA-1、抗-LFA-2(CD2)、LFA-3(CD58)、抗-CD44、抗-β-7、CXCR4、CCR5，抗-选择素L、抗-选择素E和抗-选择素P。
表位
在本发明的上下文中，术语“表位”是指被T细胞的TCR识别的抗原决定簇。由pMHC呈递的表位对任何外来物质都是高度特异性的，并且与TCR的相互作用确保了以肽-MHC指导的方式对特异性T细胞的有效扩增和功能性刺激。
固体支持物
在本发明的上下文中，术语“固体支持物”是指aAPC支架可以连接的任何类型的不溶性材料。aAPC支架可以共价或可逆地连接到固体支持物上。连接在固体支持物上的αAPC支架可以容易地与过量的试剂或溶剂分离(例如通过过滤、色谱法、离心等)。
固体支持物包括但不限于珠、孔板、颗粒、过滤器、凝胶、管和培养皿。
在本发明的一些实施方案中，模板分子(即T细胞影响分子和MHC I类分子)可以直接连接到固体支持物上。
样品
在本发明的上下文中，术语“样品”是指从受试者提取的溶液，该溶液包含T细胞群。样品不限于任何特定来源，而是可以例如从血液、组织或体液中提取。T细胞群可以包含具有不同特异性的T细胞。
扩增溶液
在本发明的上下文中，术语“扩增溶液”是指这样一种溶液，其包含用于扩增对aAPC有特异性的T细胞的aAPC支架。扩增溶液可进一步包含支持T细胞扩增、分化和刺激的其他实体，例如，除了固定在aAPC支架上的那些之外，扩增溶液还可包含其他细胞因子、共刺激分子或粘附分子。
临床相关数
在本发明的上下文中，术语“临床相关数”是指抵抗疾病所需的细胞数。临床相关细胞数的绝对值因疾病而异。重新引入到患者之前可用的细胞数量可能为105-1012个细胞/施用，例如105-1010个细胞/施用，例如106-109个细胞/施用。
药物组合物
在本发明的上下文中，术语“药物组合物”是指这样一种组合物，其包含根据本发明获得的扩增的T细胞群和/或药学上可接受的载体，所述扩增的T细胞群悬浮在合适量的药学上可接受的稀释剂或赋形剂中。
药学上可接受的
在本发明的上下文中，术语“药学上可接受的”是指当施用于人时生理上可耐受的并且通常不会产生过敏或类似的不良反应(例如胃部不适、头晕等)的分子实体和组合物。优选地，如本文所用，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物，更特别是用于人的。
佐剂
在本发明的上下文中，术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫响应的化合物或混合物。佐剂可以作为缓慢释放抗原的组织贮库和作为非特异性地增强免疫响应的淋巴系统激活剂。通常，在没有佐剂的情况下单独使用抗原的初次攻击将不能引起体液或细胞免疫响应。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳液、钥孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和可能有用的人类佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。优选地，佐剂是药学上可接受的。
赋形剂
在本发明的上下文中，术语“赋形剂”是指与本发明的组合物一起施用的稀释剂、佐剂、载体或溶媒。此类药物载体可以是无菌液体如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选使用水或水溶液盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油水溶液作为载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物载体描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。
序列同一性
在本发明的上下文中，术语“序列同一性”在本文中定义为分别在核苷酸、碱基或氨基酸水平上基因或蛋白质之间的序列同一性。具体而言，如果DNA序列的转录本可以转录为相同的RNA序列，则认为该DNA和RNA序列是相同的。
因此，在本发明的上下文中，“序列同一性”是在氨基酸水平上蛋白质之间的同一性的度量，并且是在核苷酸水平上核酸之间的同一性的度量。当序列比对时，可以通过比较每个序列中给定位置的氨基酸序列来确定蛋白质序列同一性。类似地，当序列比对时，可以通过比较每个序列中给定位置的核苷酸序列来确定核酸序列同一性。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分比，将序列进行比对以达到最佳比较目的(例如，可以在第一氨基酸序列或核酸序列中引入缺口以与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是所述序列共有的相同位置数的函数(即，％同一性＝相同位置数/位置(例如，重叠位置)总数×100)。在一个实施方案中，两个序列的长度相同。
在另一个实施方案中，两个序列具有不同的长度，并且缺口被视为不同的位置。可以手动比对序列并计算相同氨基酸的数量。或者，可以使用数学算法来完成用于确定同一性百分比的两个序列的比对。这种算法被并入(Altschul et al.1990)的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序进行，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可以用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明蛋白分子同源的氨基酸序列。
为了获得用于比较目的的缺口比对，可以利用Gapped BLAST。或者，可以使用PSI-Blast执行迭代搜索，其检测分子之间的远距离关系。当使用NBLAST、XBLAST和GappedBLAST程序时，可以使用各个程序的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。或者，可以在序列比对后，例如通过EMBL数据库(www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST)中的BLAST程序，计算序列同一性。通常，可以使用关于例如“得分矩阵”和“缺口罚分”的默认设置进行比对。在本发明的上下文中，BLASTN和PSI BLAST默认设置可能是有利的。
可以使用与上述类似的技术，在允许或不允许缺口的情况下，确定两个序列之间的同一性百分比。在计算同一性百分比时，只计算精确匹配。因此，本发明的实施方案涉及具有一定程度的序列变异的本发明的序列。
带有稳定的MHC I类分子的aAPC支架
T细胞在免疫响应中起关键作用，其中它们通过与抗原呈递细胞(APC)相互作用来识别并响应外来物质，展示与MHC分子(pMHC)复合的外来物质的抗原肽。T细胞是非常特异性的并且仅表达单一特异性的T细胞受体(TCR)，从而允许T细胞仅识别并响应单一的特异性pMHC分子。当T细胞首次被引发以产生抗原和MHC分子的特定组合的受体时，它们随后将不能识别其他特异性。T细胞的这种特化称为MHC限制，并且可用于扩增单一特异性的T细胞，而没有任何无关特异性“污染”扩增的T细胞群。
MHC分子以几种变体存在，其中MHC I类和MHC II类分子可被认为是最重要的。MHCI类分子与CD8阳性细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)相互作用，MHC II类分子与CD4阳性辅助T细胞(CD4+T细胞)相互作用。一旦被激活，CD8+T细胞通常会寻求杀死癌细胞、被感染的细胞(尤其是被病毒感染的细胞)、以过表达癌症抗原为特征的细胞、表达突变或新抗原的细胞、表达癌症睾丸抗原的细胞或以其他方式受损的细胞。另一方面，CD4+T细胞主要通过辅助免疫系统起作用，例如，通过释放细胞因子并增强CD8+T细胞。尽管不限于单一类型的T细胞，但本发明主要涉及CD8+T细胞的激活、刺激和扩增。这尤其正确，因为aAPC支架的使用在某种程度上完成了CD4+T细胞和抗原呈递细胞的联合作用。
尽管TCR-pMHC相互作用是T细胞活化的主要驱动因素，但是需要若干其他刺激来制备T细胞以获得有效的免疫响应。总的来说，CD8+T细胞的激活需要两个信号：1)TCR与pMHC I类分子之间的相互作用和2)CD28(T细胞上的膜受体)和位于APC上的CD28配体(例如B7.1(CD80)或B7.2(CD86))之间的共刺激相互作用。第二种信号用于增强增殖、细胞因子产生和细胞存活。
除刺激信号外，T细胞响应也受抑制性信号的调节。Tim-3、LAG-3和PD-1是抑制性信号调节子的实例。它们作为一种天然机制来避免过度的T细胞活化，并防止免疫系统在整个生物体中蔓延。
可以通过用CD4+T细胞释放的细胞因子刺激CD8+T细胞，来辅助次级信号，或在某些情况下替代次级信号。因此，细胞因子构成参与免疫响应调节的另一组重要分子。细胞因子通常包括白细胞介素、干扰素、趋化因子、淋巴因子和肿瘤坏死因子。它们通过受体起作用，并且其中包括调节T细胞群的成熟、生长和反应性。同时，白细胞介素-2(IL-2)和共刺激信号是保持连续的细胞分裂的最关键因素。共刺激分子和细胞因子之间微妙的相互影响是复杂的，并且是有效的且特异性的T细胞扩增的关键因素之一。
在免疫响应以及细胞过程(如细胞凋亡、增殖、粘附和迁移)中起关键作用的另一种分子是CD47。这种跨膜蛋白在人体细胞中普遍表达，但在许多不同的肿瘤细胞中也过表达，高水平的CD47允许癌细胞逃避吞噬作用。然而，CD47也在免疫细胞中广泛表达，起到“不要吃我”的信号的作用，延长免疫细胞的循环时间。表达CD47的T细胞的扩增可能是优选的，因为预测当在治疗上使用时这些细胞具有增加的半衰期。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中模板分子包含能够刺激T细胞群中CD47表达的配体。
推测CD47还可能对aAPC本身具有有益特性，例如，作为“不要吃我”的信号，延长了aAPC支架在培养或循环中的半衰期。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中aAPC支架还包含CD47。
如上述说明所示，T细胞的活化和增殖涉及许多因素。然而，出于免疫治疗和/或扩增特异性T细胞群的目的，可以设定一些理想情况下为能够提供适合于这些目的的具有高活性和功能性的T细胞群应满足的条件。因此，扩增的T细胞的优选特征包括：
a.激活剂(如CD28)的高表达
b.抑制剂(如PD1)的低表达
c.多功能性，即，同时分泌数种细胞因子
必须同时呈递有效激活和刺激所需的不同分子簇，以提供T细胞功能和扩增的最佳能力。aAPC支架的使用收集了所需分子(彼此之间具有规定的接近程度)的组合，因此构成了用于有效扩增特异性T细胞的合适平台。
利用aAPC支架有效扩增高度特化且活跃的T细胞的前景非常可观。然而，将基于MHC抗原呈递的技术转变为真正的高通量平台仍然存在挑战。这是因为在没有抗原肽的情况下不可能使MHC分子再折叠，因此其生产是复杂且昂贵的。不仅存在数千种MHC I类同种异型，而且还必须为要检查或用于治疗目的的每种抗原肽生产新的个性化aAPC支架。生产不含抗原肽的MHC分子，而在组装aAPC支架之前，根据需要添加抗原肽的方式会更加有效和灵活。使用不含抗原肽的MHC分子生产完全组装的aAPC支架，而根据需要添加抗原肽，将更加高效、灵活。
因此，为了提供用于扩增T细胞和开发新免疫疗法的高通量平台，本发明的aAPC支架可以配备空的MHC I类分子，在生产aAPC支架之后可以向这种空的MHC I类分子添加抗原肽。通过人工引入连接重链的α-1结构域和α-2结构域的二硫桥来稳定MHC I类分子。二硫桥位于C端肽结合口袋远端的肽结合槽之外。MHC I类分子的这种结构变化模仿了被结合的特异性抗原肽的构象和动态效果，从而稳定了MHC I类分子。
天然MHC I类分子以特定亲和力结合各种序列的肽。这是通过使用肽结合槽末端的保守氨基酸来完成的，形成了有助于肽结合的口袋(通常是MHC结合槽的A和F口袋)。这些结合口袋决定了结合抗原肽的一系列要求，通常称为锚定基序(通常是肽的2或3位以及c端位置)。尽管天然的MHC I类分子通过锚定基序的识别而结合许多不同的抗原肽，但是每个等位基因仅以高亲和力结合所有可用抗原肽的一个独特子集。然而，由于稳定化的MHC I类分子的人工引入的二硫桥模拟了被结合的特异性抗原肽的构象和动态效应，因此可以用能够结合多种抗原肽的空的MHC I类分子来生产本文所述的aAPC支架。以下发现进一步强调了这一点：基于稳定化的MHC I类分子的二硫桥的T细胞相互作用与用野生型MHC分子获得的T细胞相互作用完全相同。
因此，aAPC支架由聚合物主链构建，所述聚合物主链与偶联剂缀合，所述偶联剂与亲和标记的二硫桥稳定化的空MHC I类分子连接。空MHC I类分子可以负载抗原肽，以形成能够控制与特定T细胞的特异性相互作用的pMHC分子。与共同连接的亲和标记的T细胞影响分子(例如细胞因子和共刺激分子)结合使用，aAPC支架能够刺激特定的T细胞，以实现增强的功能特性。因此，本发明证明了扩增肿瘤反应性T细胞所需的特定条件，通过使用MHC负载的aAPC支架为细胞提供特异性功能性刺激，以获得对于介导肿瘤消退或病毒清除而言理想的表型和功能特性。基于pMHC分子的识别，aAPC支架(用抗原肽装载空MHC I类分子后)将特异性地与T细胞相互作用，并且可以通过该特异性相互作用以肽-MHC指导的方式有效地扩增和功能性刺激特异性T细胞。
aAPC支架可以通过种类繁多的不同模板分子(即MHC I类分子、T细胞影响分子)的组合来组装。本文所述的aAPC支架可包含一个或多个共刺激分子，包括但不限于B7.1、B7.2、ICOS、PD-L1、a-半乳糖神经酰胺、CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD27、CD28、CD30、CD69、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD147、CDw150(SLAM)、CD152(CTLA-4)、CD153(CD30L)、CD40L(CD154)、Fas(CD95)、CD40、CD48、CD70和CD72。
此外，本文所述的aAPC支架可包含一种或多种细胞因子，包括但不限于白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-7(IL-7)、白介素-8(IL-8)、白介素-9(IL-9)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-17(IL-17)、白介素-21(IL-21)、白介素-22(IL-22)、白介素-23(IL-23)、干扰素α(IFN-α)、干扰素β(IFN-β)、干扰素γ(IFN-γ)、IGIF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、肿瘤坏死因子β(TNF-β)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)及其变体和片段。
本文描述了aAPC支架，其在负载抗原肽后适合于T细胞扩增，确保了活性T细胞的高比例、T细胞的高抗原特异性和T细胞的高功能性。因此，本发明的第一方面涉及一种人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，其包含聚合物主链，所述聚合物主链上连接有以下模板分子：
i.至少一种T细胞影响分子，以及
ii.至少一种MHC I类分子，其中所述MHC I类分子包含重链，所述重链包含通过二硫桥连接的α-1结构域和α-2结构域。
α-1结构域和α-2结构域之间形成的二硫桥是被人工引入到MHC I类分子中的。具体地，在重链的氨基酸序列中引入两个突变型半胱氨酸残基，以使得能够在α-1结构域和α-2结构域之间形成二硫桥。突变型半胱氨酸残基的引入可以通过任何类型的合适诱变来进行，其中此类技术是本领域技术人员已知的。优选地，选择诱变的位置，以使得位于α-1结构域和α-2结构域中的所得突变型半胱氨酸残基彼此之间处于一定空间距离内，在正常蛋白质折叠条件下，该距离将能够形成二硫桥。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述二硫桥在位于α-1结构域的突变型半胱氨酸残基与位于α-2结构域的突变型半胱氨酸残基之间形成。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基与位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基之间的空间距离在2至10埃之间，例如在2至8埃之间，优选在2至5埃之间。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中重链包含选自以下的氨基酸序列：
a.SEQ ID NO：1，或
b.与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述氨基酸序列包含位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基和位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中重链包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：
a.SEQ ID NO：1，或
b.与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如与(a)中的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，并且
其中所述氨基酸序列包含位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基和位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基。
两个半胱氨酸残基的优选突变包括对139位氨基酸的修饰以及84位或85位氨基酸之一的修饰。139位氨基酸位于重链的α-2结构域中，并且在许多情况下是丙氨酸残基。84位或85位氨基酸位于重链的α-1结构域中，并且在许多情况下是酪氨酸残基。半胱氨酸突变可以通过使用标准遗传工程通过修饰重链基因序列而通过氨基酸置换来引入。
因此，本发明的一个优选的实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基在氨基酸残基84或85处，并且位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基在氨基酸残基139处。
当折叠MHC I类分子时，在Cys-84或Cys-85与Cys-139之间形成二硫桥。新形成的二硫桥稳定了MHC I类分子，使得其在没有抗原肽的情况下在溶液中保持稳定。然后可以通过亲和标签和偶联剂之间的相互作用，将这些稳定的空MHC I类分子连接到aAPC支架的聚合物主链上。
半胱氨酸突变残基的引入可以应用于任何类型的MHC I类分子或类MHC I类分子。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述MHC I类分子选自由以下组成的组：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、MIC A、MIC B、CD1d、ULBP-1、ULBP-2和ULBP-3。
如本文所述的aAPC支架也可与小鼠的MHC一起使用，其被称为H-2复合物。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中重链是H-2分子，例如H-2Kb或H-2Db。本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中重链包含选自以下的氨基酸序列：
a.SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中的任一个，或
b.与(a)中任一序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
MHC I类分子的优选变体包括HLA-A、HLA-B和H-2，每个均包含两个突变型半胱氨酸残基。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中重链包含选自以下的氨基酸序列：
a.SEQ ID NO：2-13中的任一个，或
b.与(a)中任一序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中重链包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：
a.SEQ ID NO：2-13中的任一个，或
b.与(a)中的任一序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如与(a)中的任一序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
注意，术语“SEQ ID NO：2-13”应理解为“SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13”。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中重链包含选自以下的氨基酸序列：
a.SEQ ID NO：2-11中的任一个，或
b.与(a)中任一序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中重链包含选自以下的氨基酸序列：
a.SEQ ID NO：2-6中的任一个，或
b.与(a)中任一序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
用于T细胞扩增的更多使用的HLA的等位基因是HLA-A 02:01等位基因。因此，本发明的一个优选的实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中重链包含选自以下的氨基酸序列：
a.SEQ ID NO：2，或
b.与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中重链包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：
a.SEQ ID NO：2，或
b.与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如与(a)中的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
通过亲和标签和偶联剂之间的相互作用将MHC I类分子连接到aAPC支架的聚合物主链上。优选地，将亲和标签，例如生物素，放在MHC I类分子上。生物素与重链的连接可以通过包含用于重链生物素化的操纵柄(handle)，例如Avi标签来完成。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中重链包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：
a.SEQ ID NO：2-13中的任一个，或
b.与(a)中的任一序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如与(a)中的任一序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，并且
其中重链还包含SEQ ID NO：19。
本发明的一个优选实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中重链包含选自以下的氨基酸序列：
a.SEQ ID NO：14，或
b.与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中重链包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：
a.SEQ ID NO：14，或
b.与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如与(a)中的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中重链包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：
a.SEQ ID NO：17，或
b.与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如与(a)中的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
重链与β2-微球蛋白分子(B2M)结合形成MHC I类分子。具体而言，重链的α-3结构域与B2M相邻。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述至少一种MHC I类分子包含β2-微球蛋白分子。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中β2-微球蛋白分子包含选自以下的氨基酸序列：
a.SEQ ID NO：15，或
b.与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
MHC I类分子也可以作为最终的融合蛋白提供，其中B2M通过接头与重链连接。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述至少一种MHC I类分子包含选自以下的氨基酸序列：
a.SEQ ID NO：16，或
b.与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述至少一种MHC I类分子包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：
a.SEQ ID NO：16，或
b.与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如与(a)中的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述至少一种MHC I类分子包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：
a.SEQ ID NO：18，或
b.与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如与(a)中的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
当同时存在几种T细胞影响分子时，可以增强一些T细胞的扩增。获得的优点可以是在T细胞的扩增和刺激中服务于不同目的(例如生长、分化、活化等)的T细胞影响分子的协同作用。因此，T细胞影响分子可以属于相同类型或不同类型的分子。因此，本申请的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中aAPC支架包含至少两种不同的T细胞影响分子。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中T细胞影响分子选自由以下组成的组：细胞因子、共刺激分子、粘附分子和抗体。
T细胞影响分子的一种优选类型是细胞因子。细胞因子调节体液免疫响应和基于细胞的免疫响应之间的平衡，并且它们调节T细胞群的成熟、生长和响应能力。一些细胞因子以复杂的方式增强或抑制其他细胞因子的作用，使得细胞因子选择之间的相互作用无法预测。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中T细胞影响分子是细胞因子。
本文所述的细胞因子包括天然细胞因子以及细胞因子的变体或模拟物，这些细胞因子的变体或模拟物被工程化以诱导增强的T细胞活化和功能。因此，细胞因子(例如白介素)的变体或模拟物可以诱导与一种或多种细胞因子相对应的T细胞活化和功能。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中T细胞影响分子是细胞因子或其变体或模拟物。本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中细胞因子选自天然细胞因子或其变体和模拟物。本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中细胞因子的变体或模拟物诱导对应于一种或多种选自以下的白介素的T细胞刺激：IL-2、IL-15和IL-21。本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中细胞因子的变体或模拟物诱导对应于两种选自以下的白介素的T细胞刺激：IL-2、IL-15和IL-21，例如IL-2/IL-15，例如IL-2/IL-21，或例如IL-15/IL-21。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中细胞因子选自由以下组成的组：IL-21、IL-2、IL-15、IL-1、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-17、IL-22和IL-23。
IL-2用于治疗性地调节免疫响应的强度。IL-2通过同时结合称为IL-2受体β和IL-2受体γ(IL-2Rβ和IL-2Rγ)的两个受体亚基，从而形成称为IL-2Rβγc的异二聚体信号转导蛋白，来传递其信息。第三种非信号转导受体称为IL-2Rα(也称为CD25)有助于信号转导复合物的形成，从而使IL-2与IL-2Rβγc之间的结合增强大约100倍。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中细胞因子包含至少IL-2或其变体和模拟物。本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中细胞因子由IL-2或其变体和模拟物组成。
IL-2的变体或模拟物称为Neoleukin-2/15。Neoleukin-2/15(Neo-2/15)是一种设计型细胞因子，其具有高度稳定性，并与IL-2Rβγc牢固结合，但与CD25却不结合。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中细胞因子包含至少Neo-2/15。本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中细胞因子由Neo-2/15组成。
已经鉴定出了能够产生特别有利的aAPC支架的不同的细胞因子组。不受理论束缚，一组有效的细胞因子是通过共享的γ链受体递送其细胞内信号并影响T细胞活化和分化的细胞因子。在本发明的上下文中，这些细胞因子被称为“γ链受体细胞因子”。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中细胞因子是γ链受体细胞因子。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子选自由IL-21、IL-2、IL-15、IL-4、IL-7和IL-9组成的组。
发明人已经在γ链受体细胞因子家族内鉴定出了刺激分子的优选组合。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子选自由IL-21、IL-2和IL-15组成的组。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子包含至少IL-21。
如前所述，几种T细胞影响分子(以下称为细胞因子)之间的相互作用可产生T细胞的扩增可从中受益的有利效应。对于γ链受体细胞因子组也是如此。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中aAPC支架包含至少两种γ链受体细胞因子。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子包含：
i.至少IL-2和IL-21，或
ii.至少IL-15和IL-21。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子是：
i.IL-2和IL-21，或
ii.IL-15和IL-21。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子包含：
i.至少IL-4和IL-21
ii.至少IL-7和IL-21，或
iii.至少IL-9和IL-21。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子是：
i.IL-4和IL-21，
ii.IL-7和IL-21，或
iii.IL-9和IL-21。
可以包含在aAPC支架中的另一种类型的T细胞影响分子是共刺激分子，它们可以增强T细胞响应、增殖、细胞因子的产生和/或分泌，刺激T细胞的分化和效应子功能，或促进T细胞的存活。因此，共刺激分子本质上以及与aAPC支架一起用于凭自身诱导T细胞扩增和分化，并增强其他T细胞影响分子(例如细胞因子)的作用。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中T细胞影响分子包含至少一种共刺激分子。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中共刺激分子选自由以下组成的组：B7.2(CD86)、B7.1(CD80)、CD40、ICOS和PD-L1。可通过偶联剂和亲和标签之间的相互作用将模板分子连接到聚合物主链上。偶联剂位于aAPC支架的聚合物主链上，并且可以通过但不限于疏水相互作用、静电相互作用或共价键合连接到主链上。当位于聚合物主链上时，偶联剂提供柔性模板，亲和标记的模板分子可以以模块方式固定到该柔性模板上。亲和标签是通过但不限于非共价相互作用与偶联剂特异性结合的分子种类。通过在每个模板分子上连接亲和标签，因此容易组装定制的aAPC支架。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中模板分子通过位于聚合物主链上的偶联剂和模板分子上的亲和标签之间的非共价相互作用连接到聚合物主链上。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中模板分子通过位于模板分子上的偶联剂和聚合物主链上的亲和标签之间的非共价相互作用连接到聚合物主链上。
亲和标签和偶联剂的许多已知的相容配对可用于本发明，包括但不限于生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白、生物素/strep-tactin、聚-His/金属离子螯合物、肽/抗体、谷胱甘肽-S-转移酶/谷胱甘肽、表位/抗体、麦芽糖结合蛋白/淀粉酶和麦芽糖结合蛋白/麦芽糖。亲和标签和偶联剂的其他已知的相容配对也可用于本发明。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中偶联剂/亲和标签选自由以下组成的组：生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白、生物素/strep-tactin、聚-His/金属离子螯合物、肽/抗体、谷胱甘肽-S-转移酶/谷胱甘肽、表位/抗体、麦芽糖结合蛋白/淀粉酶和麦芽糖结合蛋白/麦芽糖。
本发明的另一个优选实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中偶联剂是链霉抗生物素蛋白，亲和标签是生物素。
与模板分子连接的aAPC支架的聚合物主链也可以基于多种不同的材料。因此，本发明可以使用几种类型的主链，包括但不限于多糖、合成多糖、乙烯基聚合物、聚乙二醇、聚丙二醇、衍生纤维素、strep-tactin和聚链霉抗生物素蛋白。多糖可以是葡聚糖或葡聚糖的不同变体，例如羧甲基葡聚糖、多醛基葡聚糖和环糊精。合成多糖的实例是例如聚蔗糖。乙烯基聚合物包括但不限于聚(丙烯酸)、聚(丙烯酰胺)、聚(丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(马来酸)、聚(丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸)和聚(乙烯醇)。由衍生的纤维素组成的聚合物主链包括但不限于衍生的纤维素，包括羧甲基纤维素、羧甲基羟乙基纤维素和羟基-乙基纤维素。
另外，存在可以用作形成本发明的自组装aAPC支架的基础的可商购的聚合物主链。这些聚合物主链包括但不限于IBA GmbH和Beckman Coulter的Streptamers，其基于Strep-tactin蛋白，所述Strep-tactin蛋白低聚化(oligomerize)以形成能够结合若干生物素化分子(例如生物素化的MHC复合物和T细胞影响分子，例如细胞因子和共刺激分子)的多聚体。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中聚合物主链选自由以下组成的组：多糖、乙烯基聚合物、聚乙二醇、聚丙二醇、strep-tactin和聚链霉抗生物素蛋白。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中聚合物主链是多糖。
本发明的另一个优选实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中多糖是葡聚糖。
聚合物主链的大小设定了有多少个模板分子可以连接到每个aAPC支架的物理限制。聚合物主链的大小由其分子量给出。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖的分子量为50-3000kDa，例如100-2500kDa，例如250-2500kDa。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖的分子量选自由250kDa、270kDa、750kDa和2000kDa组成的组。
除了每个aAPC支架上连接的分子数量之外，另一个重要参数是模板分子在聚合物主链上分布的密度。可以通过调节aAPC支架所包含的所有分子之间的比例来改变密度。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中聚合物主链：MHC I类分子：共刺激分子：细胞因子之间的比例选自由以下组成的组：1：1：1：1、1：2：1：1、1：4：1：1、1：4：2：1、1：4：2：2、1：10：5：5、1：4：4：4、1：8：8：8、1：10：10：10、1：20：20：20、1：30：30：30、1：40：40：40、1：50：50：50、1：50：10：10或1：50：20：20。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中聚合物主链：MHC I类分子：细胞因子1：细胞因子2之间的比例选自由以下组成的组：1：1：1：1、1：2：1：1、1：4：1：1、1：4：2：1、1：4：2：2、1：10：5：5、1：4：4：4、1：8：8：8、1：10：10：10、1：20：20：20、1：30：30：30、1：40：40：40、1：50：50：50、1：50：10：10或1：50：20：20。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中聚合物主链：MHC I类分子：共刺激分子：细胞因子1：细胞因子2之间的比例选自由以下组成的组：1：1：1：1：1、1：2：1：1：1、1：4：1：1：1、1：4：2：1：1、1：4：2：2：2、1：10：5：5：5、1：4：4：4：4、1：8：8：8：8、1：10：10：10：10、1：20：20：20：20、1：30：30：30：30、1：40：40：40：40、1：50：50：50：50、1：50：10：10：10或1：50：20：20：20。
本发明可适用于扩增来自各种受试者的T细胞。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述至少一种MHC I类分子是脊椎动物MHC分子，例如人、鼠、大鼠、猪、牛或禽分子。
本发明的另一个优选实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中脊椎动物MHC I类分子是人类分子。
如上所述，MHC分子存在几种变体。MHC分子包括但不限于MHC I类分子和类MHC I类分子。类MHC I类分子包括但不限于CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、MICA、MICB、MR1、ULBP-l、ULBP-2和ULBP-3。
本发明的一个优选的实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述至少一种MHC分子是人MHC I类分子。在人类中，主要组织相容性复合物(MHC)由称为人白细胞抗原(HLA)复合物的基因复合物编码。对应于MHC I类的HLA被称为HLA-A、HLA-B和HLA-C。因此，本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述至少一种MHC I类分子选自由以下组成的组：HLA-A、HLA-B和HLA-C。
本文所述的aAPC支架包含通过连接α-1结构域和α-2结构域的二硫桥稳定的MHC I类分子。虽然这使得能够形成具有不含抗原肽的MHC I类分子的aAPC支架，但是可以提供具有或不具有负载抗原的MHC I类分子的aAPC支架。即使当提供未负载的MHC I类分子时，aAPC支架的最终预期用途包括负载抗原肽，从而形成pMHC分子。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述MHC I类分子包括不含抗原肽的肽结合槽。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述MHC I类分子包括含抗原肽的肽结合槽(pMHC)。
由pMHC分子呈递的抗原肽最终决定aAPC支架将扩增哪种类型的T细胞——该概念先前被称为MHC限制。适用于根据本发明的aAPC支架的抗原肽可以基本上来自任何来源。抗原来源可包括但不限于人、病毒、细菌、寄生虫、植物、真菌或肿瘤。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中pMHC的抗原肽衍生自选自由以下组成的组的来源：人、病毒、细菌、寄生虫、植物、真菌和肿瘤。
本发明的aAPC支架的一种用途是扩增肿瘤反应性T细胞，用于过继细胞转移(ACT)。ACT策略的强度是T细胞离体存在于与局部肿瘤环境相反的环境中，该环境对于抗原特异性T细胞群的有效扩增是最佳的。
本发明的aAPC支架的另一种潜在用途是用于扩增专门用于抵抗通常在移植后出现的某些感染的T细胞群。接受移植的患者通常接受免疫抑制治疗以避免移植物排斥。在许多情况下，这种治疗使患者易受侵袭性病毒株的侵害，导致已经虚弱的患者严重感染。本发明的aAPC支架非常适合于从移植患者中提取的T细胞的有效扩增，目的是通过ACT策略治疗任意严重感染。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中pMHC的抗原肽是癌相关表位或病毒表位。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中pMHC的抗原肽是新表位(neoepitope)，例如癌症新表位或癌症新抗原。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中癌症相关表位是与病毒诱导的癌症相关的病毒表位。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中癌症相关表位是与癌症相关的过表达抗原。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中癌症相关表位是癌睾丸抗原。
本发明的aAPC支架与可以被聚合物主链上连接的pMHC分子呈递的任何抗原肽一起起作用。一些适应症在本发明中是优选的。
因此，本发明的一个优选实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述病毒表位来自选自由以下组成的组的病毒：人乳头瘤病毒(HPV)、Merkel细胞多瘤病毒(MCV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和流感病毒。
为了优化每种aAPC支架的效率(关于aAPC支架能够扩增单一T细胞特异性的准确性)，在本发明的一个版本中，每种aAPC支架仅包含MHC I类分子的单一变体，例如，目的是针对每种类型的aAPC支架有目的地仅加载一种抗原肽。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述aAPC支架包含相同的MHC I类分子。
通过每种aAPC支架仅展示单一抗原肽，不同特异性的T细胞之间的竞争被限制到最小。如果需要，可以将几种呈递不同肽的不同支架合并在一起并同时扩增。同时扩增具有多种不同的特异性的T细胞是可能的，因为由于aAPC支架将所有模板分子(即pMHC和T细胞影响分子)彼此非常接近地聚集在一起，T细胞之间的竞争保持在最小。因此，通过使用本发明的aAPC支架扩增的T细胞群会保持特异性，并且如果重新引入到受试者中，则不同特异性的集合(pool)会确保任意免疫响应的广度。后一特征在临床上对于避免免疫逃逸变体而言是重要的。可以通过决定在单一扩增中将多少种不同的aAPC支架合并在一起来调整响应的广度。
聚合物主链可以包含根据聚合物主链的大小合理的任意数量的MHC I类分子。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中每个聚合物主链包含至少5个MHC I类分子，例如至少8个，例如至少10个，例如至少20个，例如至少30个，例如至少40个，例如至少50个，或例如至少100个MHC I类分子。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中每个聚合物主链包含至少2个MHC I类分子，例如至少3个或例如至少4个MHC I类分子。
对于一些应用，将aAPC支架固定在固体支持物上是可行的，例如，用于某些类型的分析或用于从扩增的T细胞群中分离aAPC支架。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述aAPC支架被固定在固体支持物上。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的模板分子直接附着的固体支持物。因此，在这种特殊情况下，模板分子未置于aAPC支架的聚合物主链上。
存在许多固体支持物的变体，并且可以根据aAPC支架的应用来选择。固体支持物的变体包括但不限于珠、孔板、颗粒、过滤器、凝胶、管和培养皿。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中固体支持物选自由以下组成的组：珠、孔板、颗粒、过滤器、凝胶、管和培养皿。
aAPC支架可以通过任何常规手段，例如通过接头、抗体等连接到固体支持物上。
存在大量的不同的模板分子，因此可以组装多种不同的aAPC支架。发明人已发现，模板分子的某些组合产生特别有效且优选的aAPC支架。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，
ii.γ链受体细胞因子是IL-15和IL-21，并且
iii.共刺激分子是B7.2(CD86)。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链上MHC I类分子、IL-15、IL-21和B7.2(CD86)之间的比例是2：1：1：1。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、MHC I类分子、IL-15、IL-21和B7.2(CD86)之间的比例为1：10：5：5：5。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子是IL-2、IL-15和IL-21。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，并且
ii.γ链受体细胞因子是IL-21、IL-2和IL-15。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、MHC I类分子、IL-2、IL-15和IL-21之间的比例是1：10：5：5：5。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，
ii.γ链受体细胞因子是IL-2、IL-15和IL-21，并且
iii.共刺激分子是B7.2(CD86)。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、MHC I类分子、IL-2、IL-15、IL-21和B7.2(CD86)之间的比例为1:10:5:5:5:5。
本发明的一个优选的实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，并且
ii.γ链受体细胞因子是IL-2和IL-21、或IL-15和IL-21。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中细胞因子包括至少IL-6和IL-10。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，
ii.共刺激分子是B7.2(CD86)，并且
iii.细胞因子是IL-6和IL-10。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链上MHC I类分子、IL-6、IL-10和B7.2(CD86)之间的比例是2：1：1：1。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、MHC I类分子、IL-6、IL-10和B7.2(CD86)之间的比例为1：10：5：5：5。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子包含至少IL-2和IL-21。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，并且
ii.γ链受体细胞因子是IL-2和IL-21。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链上MHC I类分子、IL-2和IL-21之间的比例是1：1：1。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中共刺激分子包含至少B7.2(CD86)。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、MHC I类分子、IL-2和IL-21之间的比例是1：8：8：8。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中聚合物主链包含至少IL-1和PD-L1。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，
ii.共刺激分子是B7.2(CD86)和PD-L1，并且
iii.细胞因子是IL-1。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链上MHC I类分子、IL-1、B7.2(CD86)和PD-L1之间的比例为2：1：1：1。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、MHC I类分子、IL-1、B7.2(CD86)和PD-L1之间的比例是1：10：5：5：5。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，
ii.共刺激分子是B7.2(CD86)和ICOS，并且
iii.细胞因子是IL-10。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，并且
ii.细胞因子是IL-1和IL-2。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，并且
ii.细胞因子是IL-2和IL-15。
本发明的aAPC支架可以是适合医院和实验室使用的试剂盒的一部分。这样的试剂盒可以包含一种或多种、适合于扩增具有不同特异性的T细胞的不同aAPC支架，以及适合于扩增从样品中提取的T细胞的培养基。该试剂盒还可以容纳扩增含T细胞样品所必需的其他化合物或分子。
因此，本发明的一个方面涉及用于T细胞扩增的试剂盒，该试剂盒包括：
i.第一存储构件，其包括至少一种如本文所述的aAPC支架，和
ii.第二存储构件，其包含至少一种抗原肽，
其中，所述第一存储构件和所述第二存储构件的内容物被配置为相组合。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的试剂盒，其中第二存储构件包括抗原肽文库。抗原肽文库可以包含一系列最常用的抗原肽。
本发明的aAPC支架可以用作免疫疗法，用于给受试者直接施用以帮助受试者的免疫系统。aAPC可以通过任何途径局部或全身施用，例如静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、透皮或口服。如本文所述的aAPC支架可用作用于T细胞扩增和/或过继性T细胞(ACT)疗法的自动化系统的一部分。因此，aAPC支架可以是例如用于制造用于临床用途的T细胞的装置或系统的组成部分。因此，本发明的一个实施方案涉及用于T细胞扩增和/或过继性T细胞(ACT)疗法的装置或系统，其包括本文所述的aAPC支架。可以将aAPC支架与各种形式的荧光激活细胞分选或类似的细胞选择策略结合一起用于细胞制造。
T细胞扩增的方法
通过从不健康的受试者中提取免疫反应性T细胞，离体扩增T细胞并将扩增的T细胞群重新引入受试者中，有可能克服可能会使免疫系统瘫痪的免疫抑制疾病的一些挑战。然而，虽然通过单采(apheresis)法从例如外周血中提取T细胞并随后重新引入到患者中是没有问题的，但是给定特异性的T细胞的激活和扩增仍然是一个巨大的挑战，所得T细胞群通常缺乏足够的分化和功能能力。
本发明的aAPC支架适用于同时体外刺激和扩增T细胞，并产生活性T细胞的比例高、T细胞的抗原特异性高且T细胞的功能性高的T细胞群。因此，本发明的另一方面涉及同时体外刺激和扩增T细胞的方法，其包括以下步骤：
i.提供包含T细胞的样品，
ii.使所述样品与包含如本文所述的aAPC支架的扩增溶液接触，
iii.刺激并扩增培养中的对所述aAPC支架具有特异性的T细胞，以及
iv.从培养物中收获步骤iii)的T细胞，以获得扩增的抗原特异性T细胞群。
本发明的一个实施方案涉及同时体外刺激和扩增T细胞的方法，其包括以下步骤：
i.提供如本文所述的aAPC支架，其中所述MHC I类分子包含不含抗原肽的肽结合槽，
ii.将所述aAPC支架与抗原肽混合以提供包含pMHC分子的负载的aAPC支架，
iii.提供包含T细胞的样品，
iv.使所述样品与步骤ii)的负载的aAPC支架接触，
v.刺激并扩增培养物中的对所述负载的aAPC支架具有特异性的T细胞，以及
vi.从培养物中收获步骤iii)的T细胞，以获得扩增的抗原特异性T细胞群。
从受试者中提取包含T细胞的样品，随后将其置于处于允许T细胞生长的条件下的包含aAPC支架的培养物中。因此，应理解，T细胞的扩增应在除aAPC支架外还含有细胞增殖所需的所有化合物和因子的溶液或培养基中进行。因此，在其中进行T细胞扩增的培养物可含有抑制无关细胞生长或促进T细胞生长的化合物，例如IL-2。
为了提高扩增的T细胞群的质量，可以经过分子量截留过滤器通过离心过滤aAPC支架，以便在aAPC与样品混合之前除去所有未结合的pMHC分子。这是为了避免来自未与支架缀合的pMHC分子的刺激，并去除过量的抗原肽和T细胞影响分子，以限制无关T细胞亚群的刺激。这同样适用于未与MHC分子复合的抗原肽，其也可以通过分子量截留过滤器离心除去。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中在与样品接触之前将扩增溶液过滤。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中经分子量截留过滤器通过离心过滤所述扩增溶液。
本发明的aAPC支架的一个优点是它们允许同时扩增不同的T细胞特异性，因为当使用多种不同的aAPC支架时，交叉反应性被降低到最小，如上所述。因此，本发明的方法对于含有具有不同特异性的多种T细胞的样品也是有效的。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中步骤i)的所述样品包含至少2种不同特异性，例如至少5种不同特异性，例如至少10种不同特异性，例如至少15种不同特异性，例如至少20种不同特异性，或例如至少50种不同特异性的T细胞。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中包含aAPC支架的所述溶液包含至少2种不同的aAPC支架，例如至少5种不同的aAPC支架，例如至少10种不同的aAPC支架，例如至少15种不同的aAPC支架，例如至少20种不同的aAPC支架，或者例如至少20种不同的aAPC支架。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中在同一样品中平行地刺激和扩增至少2种不同特异性的T细胞，例如至少5种不同特异性，例如至少10种不同特异性，例如至少15种不同特异性，或例如至少20种不同特异性的T细胞。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
i.提供样品，所述样品包含具有至少5种不同特异性的T细胞，
ii.使所述样品与包含至少5种不同aAPC支架的扩增溶液接触，
iii.平行刺激和扩增培养中的所述T细胞，所述T细胞具有针对所述至少5种不同的aAPC支架的至少5种不同的特异性，和
iv.从培养物中收获步骤iii)的T细胞，以获得具有至少5种不同特异性的扩增的抗原特异性T细胞群。
包含待扩增的T细胞的样品可以源自任何来源，但通常从血液、组织或体液中提取。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中所述样品选自由以下组成的组：外周血单核细胞、肿瘤、组织、骨髓、活组织检查、血清、血液、血浆、唾液、淋巴液、胸膜液、脑脊液(cerospinal fluid)和滑液。
根据本文所述方法的包含待扩增的T细胞的样品也可选自干细胞或TCR修饰的/转导的细胞。
本发明的方法可用于扩增表达与aAPC支架上的pMHC分子相互作用所必需的TCR的任何T细胞。因此，适于通过本发明的方法扩增的T细胞包括但不限于CD8 T细胞、CD4 T细胞、调节性T细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、NK细胞、先天的粘膜相关恒定T(mucosal-associated invariant T，MAIT)细胞和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞。
T细胞受体(TCR)基因疗法不依赖于肿瘤反应性T细胞的预先存在，并且确实可以靶向所选择的确定的癌症抗原性肽。该方法基于以下观察：可以通过引入编码TCRα链和β链(它们一起形成αβ-TCR异二聚体)的基因，使抗原特异性在T细胞之间转移。因此，编码肿瘤反应性TCR的基因的引入可用于将患者来源的细胞(自体)或非患者来源的细胞(异源)重新导向目标抗原，从而建立原本不存在的肿瘤反应性T细胞区室。到目前为止，数种TCR工程化治疗方法已经在实体瘤中显示出临床活性。这些TCR治疗方法中的大多数依赖于TCR转导的细胞的离体扩增。这些细胞可以是自体或异源T细胞、NK细胞、MAIT细胞或NKT细胞。由于癌症特异性TCR基因被转导到细胞中，因此它们不依赖于任何TCR的预先存在，因此不必一定是T细胞。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中T细胞选自由以下组成的组：CD8 T细胞、CD4 T细胞、调节性T细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、γ-δT细胞、NK细胞和先天的黏膜相关恒定T(MAIT)细胞。
本发明的一个优选实施方案涉及如本文所述的方法，其中T细胞是CD8 T细胞。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中T细胞是CAR T细胞。
为了将扩增的T细胞群重新引入患者，以使从治疗的角度来看具有意义，有必要使提取的T细胞扩增至临床相关数量。通过本发明的方法进行的T细胞的扩增的量级可以是100-3000倍。重新引入到患者之前可用的细胞数量可能为105-1012个细胞/施用，例如105-1010个细胞/施用，例如106-109个细胞/施用。根据施用途径，细胞以20mL至1L的体积施用。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中将T细胞扩增至临床相关数量。
如上文针对aAPC支架所述，MHC I类分子可以呈递多种抗原肽。关于抗原肽的选择的注意事项同样适用于该方法。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中pMHC的抗原肽是癌症相关表位或病毒表位。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中抗原肽包含癌症相关表位或病毒表位。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中癌症相关表位是与病毒诱导的癌症相关的病毒表位。
本发明的又一个实施方案涉及所述的方法，其中所述病毒表位来自选自由以下组成的组的病毒：人乳头瘤病毒(HPV)、Merkel细胞多瘤病毒(MCV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和流感病毒。
扩增的T细胞群的用途
设想通过本发明的方法获得的扩增的T细胞群可以有效地用于专注于过继免疫疗法(或过继细胞转移)的治疗方案中。在这种治疗方案中，从需要治疗的受试者中提取免疫反应性T细胞。受试者可以是任意哺乳动物，例如人、牛、猪、鸟、狗、猫、小鼠、大鼠等。T细胞的来源可以是例如外周血单核细胞、肿瘤、组织、骨髓、活组织检查、血清、血液、血浆、唾液、淋巴液、胸膜液、脑脊液或滑液。
从受试者中提取后，使用针对受试者和待治疗的病况或疾病定制的aAPC支架扩增含有具有所需的一种或多种特异性的T细胞的样品。该扩增根据如上所述的本发明的方法进行。当T细胞群扩增至临床相关数量时，将其施用于受试者以诱导免疫响应并治疗疾病。
因此，本发明的一个方面涉及通过本文所述的方法获得的扩增的T细胞群。
用本文公开的aAPC支架扩增的T细胞群具有几个有利的特征，例如高比例的抗原特异性细胞、多细胞因子分泌特征、年轻的表型和较少的衰竭。多细胞因子分泌特征可通过同时分泌INF-γ和TNF-α以及细胞毒性脱粒来表征。年轻的表型可通过活化剂(例如CD28)的高表达来表征。衰竭降低可通过抑制剂(例如PD1)的低表达来表征。因此，本发明的一个实施方案涉及通过本文所述的方法获得的扩增的T细胞群，其中扩增的T细胞群具有选自以下的特征中的至少一个，例如至少两个，例如至少三个：
i.培养2周后，抗原特异性T细胞扩增至少10倍，
ii.经过后来的抗原攻击后，会分泌INF-γ和TNF-α，
iii.高表达CD28，以及
iv.低表达PD1。
本发明的另一个实施方案涉及通过本文所述的方法获得的扩增的T细胞群，其中扩增的T细胞群包含以下特征：
i.培养2周后，抗原特异性T细胞扩增至少10倍，和
ii.经过后来的抗原攻击后，会分泌INF-γ和TNF-α。
本发明的另一个实施方案涉及通过本文所述的方法获得的扩增的T细胞群，其中扩增的T细胞群包含以下特征：
i.培养2周后，抗原特异性T细胞扩增至少10倍，
ii.经过后来的抗原攻击后，会分泌INF-γ和TNF-α，
iii.高表达CD28，以及
iv.低表达PD1。
本发明的另一个实施方案涉及通过本文所述的方法获得的扩增的T细胞群体，其中培养2周后，抗原特异性T细胞扩增至少10倍，例如至少25倍，例如至少50倍，例如至少100倍，例如至少1000倍，例如至少5000倍。
本发明的又一个实施方案涉及通过本文所述的方法获得的扩增的T细胞群体，其中培养2周后，抗原特异性T细胞扩增10倍至5000倍，例如100倍至1000倍。
本发明的另一个实施方案涉及通过本文所述的方法获得的扩增的T细胞群，其中CD28的高表达被定义为与样品中未扩增的非特异性T细胞的CD28表达相比，CD28的表达增加至少2倍，例如表达增加至少5倍，例如表达增加至少10倍。
本发明的另一个实施方案涉及通过本文所述的方法获得的扩增的T细胞群，其中PD1的低表达被定义为与样品中未扩增的非特异性T细胞的PD1表达相比，PD1的表达为最多一半(50％)，例如最多四分之一(25％)表达，例如最多十分之一(10％)表达。
本发明的第四方面涉及通过本文所述的方法获得的扩增的T细胞群，其用作药物。
更具体地，本发明的一个实施方案涉及用于疾病或病症的过继免疫疗法的方法，其包含：
i.从受试者中提取包含T细胞的样品，
ii.使所述样品与包含如本文所述的aAPC支架的扩增溶液接触，
iii.在培养中刺激并扩增对所述aAPC支架具有特异性的T细胞，
iv.从培养物中收获步骤iii)的T细胞，以获得扩增的抗原特异性T细胞群，以及
v.以有效诱导免疫响应的量向受试者施用扩增的抗原特异性T细胞群。
如上文针对aAPC支架所述，MHC I类分子可以呈递多种抗原肽。关于抗原肽的选择的注意事项同样适用于通过本发明的方法获得的扩增的T细胞群的用途。
因此，本发明的另一方面涉及通过本文所述的方法获得的扩增的T细胞群，其用于治疗癌症或病毒病况。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的用途的扩增的T细胞群，其中癌症与病毒病况有关。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的用途的扩增的T细胞群，其中病毒病况与选自由以下组成的组的病毒相关：人乳头瘤病毒(HPV)、Merkel细胞多瘤病毒(MCV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和流感病毒。
通过本文所述的方法获得的扩增的T细胞群可以配制成药物组合物，所述药物组合物还包含一种或多种佐剂和/或赋形剂和/或药学上可接受的载体。赋形剂可包括但不限于缓冲剂、悬浮剂、分散剂、增溶剂、pH调节剂和/或防腐剂。
药物组合物可以用于过继免疫疗法(或过继细胞转移)，通过任意途径局部或全身施用，例如静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、透皮或口服。
应当注意，在本发明的多个方面之一的背景中描述的实施方案和特征也适用于本发明的其他方面。
本申请中引用的所有专利和非专利参考文献都通过引用整体并入本文。
现在将在以下非限制性实施例中进一步详细描述本发明。
实施例
实施例1：使用抗原呈递支架扩增抗原特异性CD8 T细胞(图2)
在比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的抗原呈递支架，游离FLUBP-VSD肽(SEQ ID NO：29)、IL-15和IL-21细胞因子，或在MHC复合物中携带无关肽特异性的比例为1：10：5：5：5的抗原呈递支架的存在下，平行扩增来自健康供体的HLA-A1 FLU BP-VSD(VSDGGPNLY(SEQ ID NO：29))特异性CD8 T细胞。用野生型MHC制备aAPC支架。所有培养物均补充有20IU/ML IL-2并培养2周。每周一次通过四聚体染色追踪HLA-A1FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的扩增。图2中示出了代表性的点图。
结论：(图2A-D)该实验表明，使用抗原呈递支架以pMHC指导的方式扩增具有低频率基线响应的抗原特异性CD8 T细胞是可行的。当将用培养基中游离添加的肽、IL-15和IL-21刺激的细胞的扩增与用抗原呈递支架刺激的细胞的扩增进行比较时，显然用抗原呈递支架刺激的细胞在特异性CD8 T细胞的频率和绝对数量方面扩增最多(参见图2E-F)。此外，携带无关肽MHC特异性的抗原呈递支架不能刺激A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞扩增，证明在没有已确立的pMHC指导的相互作用的情况下，细胞不能从共连接的细胞因子和共刺激分子中受益。
实施例2：Cys-突变型MHC(可以容纳抗原/肽)的产生和用于特异性T细胞扩增的人 工抗原呈递细胞(aAPC)支架的组装
这里描述了如何通过链霉亲和素-生物素相互作用将MHC复合物和T细胞影响分子(例如细胞因子和刺激分子)偶联到葡聚糖上，从而制备aAPC支架。在该实施例中，制备了wtMHC以及二硫桥稳定的Cys-突变型MHC，并将其用于组装aAPC支架。原则上，生物素-链霉亲和素可以被任何二聚化结构域替代，其中二聚化结构域的一半与MHC复合物或T细胞影响分子偶联，另一半与葡聚糖或类似的支架主链偶联。
链霉亲和素修饰的葡聚糖可以以各种大小的葡聚糖商购获得，例如来自FinaBiosolutions的MW 250KDa、750KDa、2000KDa和来自Immudex的约270KDa的葡聚糖。
wt MHC和Cys-突变型MHC都是通过经典的大肠杆菌表达产生的，此处分别使用以下为例：带有Avi标签的wt HLA-A 02:01的重链(SEQ ID NO：17)和带有Avi标签的Cys-突变型HLA-A 02:01的重链(SEQ ID NO：14)。简而言之，使用pET系列质粒在大肠杆菌中产生wtMHC和MHC Cys突变蛋白以及轻链β-2微球蛋白(B2M)。通过超声处理收获含有大肠杆菌产生的蛋白质的包涵体，在裂解缓冲液(Tris-Cl 50mM，pH 8.0，1mM EDTA，25％蔗糖)中裂解大肠杆菌细胞。通过在去污剂缓冲液(Tris-Cl 20mM，pH 7.5，200mM NaCl，2mM EDTA，NP401％，脱氧胆酸1％)和洗涤缓冲液(0.5％Triton X-100，1mM EDTA)中洗涤，然后在4℃下于再增溶缓冲液(HEPES 50mM，pH 6.5，8M尿素，0.1mMβ-巯基乙醇)中孵育48小时，从而从包涵体中收获变性蛋白的可溶性级分，并将其储存在-80℃中直至用于生产MHC I类单体。
通过在辅助分子(例如二肽/三肽/小分子)存在下，将Cys-突变型MHC蛋白和B2M体外折叠(折叠缓冲液：100mM Tris-Cl，pH 8.0，400mM L-精氨酸，2mM EDTA，和蛋白酶抑制剂混合物)来制备Cys-突变型MHC单体。除了不包括辅助分子外，wt MHC的制备类似于Cys-突变型MHC单体。相反，wt MHC分子在对紫外线不稳定的肽KILGFVF-X-V(SEQ ID NO：24)的存在下再折叠，其中X表示对紫外线敏感的氨基酸3-氨基-2-(2-硝基苯基)丙酸，它在暴露于紫外线后会破坏全长肽。所得的裂解肽片段与MHC分子的结合亲和力降低，使得能够结合进入的交换抗原肽。
通过常规尺寸排阻色谱法纯化MHC单体。或者，可以使用其他标准蛋白质纯化方法。可以使用含有或不含有MHC单体稳定辅助分子(例如二肽甘氨酸-亮氨酸)的缓冲液，进行尺寸排阻色谱法纯化Cys-突变型MHC单体。
如此生产的不含抗原肽的稳定的Cys-突变型MHC单体(空MHC单体)对于快速生成大量负载抗原肽的MHC单体非常有用，可用于各种研究、诊断和治疗用途。可以通过在室温下将200μg/mL的Cys-突变型空MHC单体与100μM肽一起孵育30-60分钟，来制备负载抗原肽的Cys-突变型MHC(pMHC)单体。可以通过加入200μM所选抗原肽，然后将单体暴露于360nm的紫外光下1小时，从而从含有UV不稳定肽的MHC单体生产wt pMHC。
可以通过标准化学和酶促方案，将pMHC和T细胞影响分子(例如细胞因子和共刺激分子)生物素化。例如，可以通过以下方法以酶促方式将pMHC生物素化：在MHC重链中加入生物素化共有肽序列，从而允许使用BirA酶和游离生物素进行位点特异性生物素化。细胞因子和共刺激分子可从供应商如BioLegend和PreProtech商购获得。通过使用市售的生物素化试剂，例如ThermoFisher Scientific的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，并根据供应商的方案进行反应，可以很容易地将这些蛋白质生物素化。
在本文所述的实施例中，通过链霉亲和素-生物素相互作用组装了aAPC支架。简而言之，根据下述实施例，将生物素化分子和链霉亲和素缀合的葡聚糖以相对化学计量学在水性缓冲液(例如PBS)中组合，得到最终浓度为60nM的组装好的aAPC支架。使aAPC支架在4℃下组装1小时，然后保持在4℃直至加入细胞培养物中。组装好的支架可以在4℃下储存至少一个月。可以通过将未结合的分子离心通过MW截留过滤器(如Amicon Ultra离心过滤器单元Ultra-4，MWCO 100kDa)，从而纯化组装好的aAPC支架并使其与未结合的抗原肽、pMHC、细胞因子和共刺激分子分离。
从人PBMC或TIL建立T细胞培养物，并在48孔平底培养板中以2×106个细胞/ml起始，并在37℃和5％CO2下培养2周。通过添加在1mL新鲜X-VIVO15培养基(补充有5％热灭活的人血清)中的0.2nM终浓度的aAPC支架，来每周两次刺激细胞。培养1周后，将细胞转移到24孔平底培养板中，每周一次从培养物中取出样品用于MHC四聚体染色，通过流式细胞术追踪抗原特异性CD8 T细胞的扩增。
实施例3：使用用Cys-突变型MHC单体制备的aAPC支架扩增抗原特异性CD8 T细胞， 以及与用野生型MHC单体制备的aAPC支架相比，它们的功能评估(图3-4)
这里描述了使用针对FLU 58-66GILGFVFTL(SEQ ID NO：20)和EBV BMF1GLCTLVAML(SEQ ID NO：21)的Cys-突变型MHC I类HLA-A*02:01单体组装aAPC支架，以及使用这些aAPC支架扩增来自健康供体PBMC的特异性CD8 T细胞。对于由野生型MHC I类HLA-A*02:01单体制备的aAPC支架进行了比较性功能评估。数据如图3和4所示。
如实施例2中所述制备Cys-突变型HLA-A*02:01单体。简而言之，将包含Cys-突变型HLA-A*02:01 DNA序列(SEQ ID NO：14)的重链构建体和野生型人B2M(SEQ ID NO：15)构建体转化到大肠杆菌表达菌株pLysS中，产生这些蛋白质。通过标准程序收集包含表达蛋白质的包涵体：在裂解缓冲液中超声处理，然后在去污剂缓冲液和洗涤缓冲液中洗涤，并在4℃下将蛋白质在尿素缓冲液中增溶48小时，从而收集蛋白质的变性可溶级分。按照相似的程序来产生野生型HLA-A 02:01的可溶性变性蛋白。
将Cys-突变型HLA-A*02:01的变性可溶级分折叠，以产生Cys-突变型HLA-A*02:01的单体。在存在二肽甘氨酸-亮氨酸(GL)的情况下，将Cys-突变型HLA-A*02:01的重链蛋白和B2M以1：2摩尔比在折叠缓冲液(含有Tris-Cl100mM，pH 8.0，L-精氨酸400mM，和EDTA2mM)中混合。折叠后，根据Avi-tag的方案，在30℃下使用生物素-蛋白连接酶反应，在并入到重链中的Avi-tag序列处，将单体生物素化1小时。通过尺寸排阻色谱法(HPLC，WatersCorporation，USA)，将这些Cys-突变型HLA-A*02:01的生物素化单体纯化。由于折叠反应不包含任何HLA-A*02:01特异性抗原肽，因此Cys-突变型HLA-A*02:01单体为空的并且可以容纳肽。纯化后，对Cys-突变型HLA-A*02:01单体进行了蛋白质浓度和生物素化的质量评估，并将其保存在-80℃中直至进一步使用。
通过与上述相似的方法，但是在对UV不稳定的HLA-A*02:01特异性肽(SEQ ID NO：24)的存在下(它对野生型MHC的折叠和稳定性至关重要)，制备野生型HLA-A*02:01单体。因此，经纯化的且生物素化的野生型HLA-A*02:01单体将始终处于这种肽缔合形式。
为了组装具有特定于FLU 58-66GILGFVFTL(SEQ ID NO：20)或EBV BMF1GLCTLVAML(SEQ ID NO：21)的Cys-突变型HLA-A02:01的aAPC支架，将100μM的每种特异性的肽(稀释于PBS中)在PBS中的20μL反应中与100μg/mL Cys-突变型HLA-A02:01单体混合60分钟。平行地，通过将IL-2和IL-21与葡聚糖支架一起孵育30分钟，将细胞因子IL-2和IL-21以1：8：8的摩尔比组装在葡聚糖支架上。向这些组装好的细胞因子葡聚糖支架中，添加抗原特异性Cys-突变型HLA-A*02:01单体，使其摩尔比为1：8，并孵育30分钟，以生成主链、pMHC、IL-2、IL-21比例为1：8：8：8的抗原呈递支架。通过添加20μM D-生物素并孵育20分钟，从而封闭支架上任何可能的游离链霉亲和素位点。
由于野生型HLA-A*02:01单体与预先结合的肽相缔和，因此使用对FLU 58-66GILGFVFTL(SEQ ID NO：20)或EBV BMF1 GLCTLVAML(SEQ ID NO：21)具有特异性的野生型HLA-A02:01的aAPC支架需要额外的步骤，以用FLU 58-66 GILGFVFTL或EBV BMF1GLCTLVAML特异性肽替换预先结合的肽。将100μg/ml野生型HLA-A*02::01单体与PBS中的200μM抗原肽混合，至总体积为20μL，并在UV灯(366nm)下孵育60分钟，以促进预先结合的UV不稳定肽与抗原特异性肽的交换。反应后，如上文针对Cys-突变型aAPC支架所述，使用野生型HLA-A*02:01单体和细胞因子以1：8：8：8的摩尔比(主链：pMHC：IL-2：IL-21)组装aAPC支架。将支架储存在4℃，直到用于T细胞扩增。
为了评估和比较使用对FLU 58-66 GILGFVFTL和EBV BMF1 GLCTLVAML具有特异性的Cys-突变型和野生型HLA-A*02:01分子制备的aAPC支架，使用来自两种不同健康供体(对应于各特异性)的PBMC，用这两种类型的支架建立平行培养。除了阳性特异性的支架之外，还包括由无关肽(HLA-A*02:01 HIV Pol ILKEPVHGV(SEQ ID NO：23))制备的阴性对照支架。所有基于aAPC支架的T细胞扩增均在补充有5％人血清的X-vivo培养基的48孔平底细胞培养板中以2x106 PBMC/特异性开始。每第二天或第三天添加四次3μl的每种特异性的aAPC支架，并保持培养两周。收集10个样品，使用抗原特异性刺激诱导的细胞内细胞因子染色测试扩增。在补充有5％人血清的X-vivo培养基中，用5μM相关抗原肽攻击每种特异性的扩增细胞2小时，细胞浓度为300.000个细胞/100μL。与抗原肽一起孵育后，将扩增的细胞洗涤，并首先用相关的细胞表面抗体(CD3、CD4、CD8和存活力染料)染色，然后使用细胞透化缓冲液对TNFα(PE-Cy7)和IFNγ(APC)进行细胞内染色。然后将细胞固定并通过流式细胞仪分析。
本文给出了使用两种抗原肽的实施例。但是，本发明不限于抗原肽的限定组。其他相关的肽包括但不限于SEQ ID NO：25-28。
结论：(图3和图4)该实验表明，使用aAPC支架以pMHC指导的方式扩增具有低频率基线响应的抗原特异性CD8 T细胞是可行的，其中使用HLA-A*02:01蛋白的Cys-突变型变体来呈递FLU 58-66GILGFVFTL(图1)和EBV BMF1 GLCTLVAML(图2)抗原。该实施例证明，将Cys-突变型MHC用于aAPC支架的快速生产和抗原多样化以扩增抗原特异性T细胞是可行的。
发现用Cys-突变型MHC aAPC支架扩增的CD8 T细胞在功能上与用野生型MHC制备的aAPC支架相当，如由针对FLU 58-66GILGFVFTL(图1)和EBV BMF1 GLCTLVAML(图2)的抗原肽特异性扩增的CD8 T细胞释放的细胞内细胞因子(TNFα和IFNγ)所示。功能分析还证实，具有Cys-突变型MHC的aAPC支架仅扩增抗原特异性细胞，因为未观察到无关肽特异性CD8 T细胞的扩增。
在实施例1中显示，与使用游离抗原肽和T细胞影响分子的扩增和刺激相比，使用用wt MHC分子制备的aAPC支架刺激的细胞在特异性CD8 T细胞的频率和绝对数目方面显示出优异的扩增。在该实施例中证明，Cys-突变型MHC aAPC支架以与用wt MHC分子制备的aAPC支架相似的效率扩增和刺激CD8 T细胞。因此，Cys-突变型MHC aAPC支架优于使用游离抗原肽和T细胞影响分子的扩增和刺激。
实施例4：使用二硫桥稳定的空MHC I类组装抗原人工抗原呈递(aAPC)支架，并使 用该aAPC进行特异性T细胞扩增(图5-7)
这里描述了如何使用不具有抗原肽的Cys-突变型MHC组装aAPC支架。这样的aAPC支架可以容纳抗原肽，因此可以在抗原鉴定之前预先生产，例如关于个性化癌症免疫疗法，其中从完整的肿瘤测序中鉴定出癌症肽抗原。基本按照实施例2和3所述组装aAPC支架，除了将抗原肽装载到Cys-突变型MHC单体中是在aAPC支架组装后进行的(先组装型aAPC支架)，而不是在组装aAPC支架之前将抗原肽装载到MHC中(后组装型aAPC支架)。
这些具有空MHC分子的aAPC支架可以以单步法装载目标抗原肽，从而将其转化为pMHC特异性aAPC支架。这种可容纳抗原的aAPC支架消除了产生每种pMHC特异性aAPC支架的操作时间，并且还限制了批次特异性变异，因为每种pMHC aAPC支架都是由具有空MHC分子的aAPC支架的稳定母料产生的。
这里描述了使用这种可负载的(先组装型)aAPC支架来扩增来自健康供体PBMC的HLA-A*02:01 CMV pp65 NLVPMVATV(SEQ ID NO：22)特异性CD8T细胞。图5给出了先组装型aAPC支架与使用Cys-突变型MHC或野生型MHC分子的、具有预载抗原肽的(后组装型)aAPC支架的定量扩增效率的比较。通过测量细胞因子的释放来确定下列aAPC支架对这些对HLA-A*02:01CMV pp65NLVPMVATV具有特异性的扩增的CD8 T细胞的功能性：使用Cys-突变型MHC的先组装型aAPC支架、使用Cys-突变型MHC的后组装型aAPC支架和使用野生型MHC的后组装型aAPC支架(图6)。
为了进一步建立一般的概念证明，通过对来自不同健康供体PBMC的HLA-A*02:01EBV BMF1 GLCTLVAML(SEQ ID NO：21)特异性CD8 T细胞进行扩增和功能评估，完成了用先组装型aAPC支架进行CD8 T细胞扩增的验证。将结果与通过以下支架进行的扩增进行比较：使用Cys-突变型MHC的后组装型aAPC支架和使用野生型MHC的后组装型aAPC支架(图7)。
为了组装空aAPC支架，如实施例2中所述生产Cys-突变型MHC I类单体，不同之处在于不立即负载抗原肽。将这些生物素化的空MHC单体、细胞因子和共刺激分子通过链霉亲和素-生物素相互作用组装在链霉亲和素修饰的葡聚糖上，得到含有空MHC I类分子的可容纳抗原的aAPC支架。
如下进行使用Cys-突变型HLA-A*02:01分子组装空aAPC支架的过程。首先，将葡聚糖支架主链与生物素化的IL-2和IL-21以1：8：8的摩尔比在4℃下在PBS缓冲液中孵育30分钟。此后，加入100μg/mL的Cys-突变型MHC(空)单体，并在4℃下孵育30分钟，得到摩尔比为1：8：8：8(支架：Cys-突变型MHC：IL-2：IL-21)的可负载的、先组装型aAPC支架。通过加入20μM D-生物素来封闭葡聚糖主链上任何剩余的空的链霉亲和素结合位点。由于这些aAPC支架不包含任何抗原特异性，因此将这些可负载的、HLA-A*02:01的aAPC支架大批保存在4℃，直至进一步使用。
然后评估可负载的、HLA-A*02:01的先组装型aAPC支架，以扩增来自健康供体PBMC的HLA-A*02:01 CMV pp65 NLVPMVATV(SEQ ID NO：22)特异性CD8 T细胞。在开始扩增培养的那天，通过将抗原肽直接添加到空aAPC支架上，而将空的HLA-A*02:01aAPC支架转化为HLA-A*02:01 CMV pp65NLVPMVATV特异性aAPC支架。简而言之，将100μM肽(用PBS稀释)与20μL空aAPC支架孵育，孵育30分钟。然后将这种通过一步法转化可负载的、先组装型aAPC支架而生成的aAPC支架用于设置扩增培养物。将3μL的特异型aAPC支架添加到2x106 PBMC中，并在48孔板中在补充有5％血清的X-vivo培养基中开始培养。然后将培养物维持两周，在两周的时间内再添加三次3μL aAPC支架。平行地，使用由野生型和Cys-突变型HLA-A*02:01单体制成的后组装型aAPC支架，开始了HLA-A*02:01 CMV pp65 NLVPMVATV特异性的相似扩增培养。将来自该设置的扩增培养物用于与可负载的aAPC支架的扩增效率进行比较性评估。10天后，收集样品，并使用pMHC四聚体针对每种特异性确定每种特异性的CD8 T细胞扩增(图5)。
从这些扩增的培养物中收集另一组扩增的细胞以评估功能性，并在所有三种类型的aAPC支架之间进行比较(使用Cys-突变型MHC的已负载的先组装型aAPC支架，使用Cys-突变型MHC的已负载的后组装型aAPC支架，以及使用野生型MHC的已负载的后组装型aAPC支架)。
为了进行功能评估，用HLA-A*02:01 CMV pp65 NLVPMVATV抗原攻击扩增的细胞，以诱导和检测抗原刺激的细胞因子TNFα和IFNγ(作为细胞毒性杀伤的标志物)。同时表达这些标志物的CD8 T细胞被解释为具有高杀伤能力。在补充有5％人血清的X-vivo培养基中，用5μM相关肽攻击细胞2小时，细胞浓度为300000个细胞/100μL。与抗原肽一起孵育后，将扩增的细胞洗涤，并先用相关细胞表面抗体(CD3、CD4、CD8和活力染料)染色，然后使用细胞透化缓冲液对TNFα(PE-Cy7)和IFNγ(APC)进行细胞内染色。然后将细胞固定并通过流式细胞仪进行分析(图6)。
在针对可负载的、先组装型aAPC支架的另一项验证实验中，通过使用可负载的、先组装型aAPC支架(1：8：8：8)扩增来自不同健康供体PBMC的HLA-A*02:01 EBV BMF1GLCTLVAML(SEQ ID NO：21)特异性CD8 T细胞。通过以下方法将这些支架转化为抗原特异性pMHC支架：向20μL可负载aAPC支架中添加100μM EBV BMF1 GLCTLVAML肽，并孵育30分钟，以生成HLA-A*02:01 EBV BMF1 GLCTLVAML特异性aAPC支架。如实施例2所述生成使用野生型或Cys-突变型MHC分子的HLA-A*02:01 EBV BMF1GLCTLVAML特异性aAPC支架。
在48孔板中，使用三种类型的aAPC支架，从健康供体PBMC开始启动对HLA-A*02:01EBV BMF1 GLCTLVAML具有特异性的扩增培养，并在补充有5％人血清的X-vivo培养基中维持2周，每第三天用相关aAPC支架进行刺激。如实施例3所述，在扩增10天后，通过收集每种特异性的300.000个细胞，并测量抗原肽攻击后细胞内细胞因子的释放，从而对扩增的CD8T细胞进行功能评估。简而言之，在补充有5％人血清的X-vivo培养基中，用5μM EBVBMF1GLCTLVAML肽攻击扩增的细胞2小时，细胞浓度为300.000个细胞/100μL。与抗原肽一起孵育后，将扩增的细胞洗涤，并先用相关细胞表面抗体(CD3、CD4、CD8和存活力染料)染色，然后使用细胞透化缓冲液对TNFα(PE-Cy7)和IFNγ(APC)进行细胞内染色。然后将细胞固定并通过流式细胞仪分析(图7)。
结论：(图5-7)该实验表明，使用可负载的、先组装型aAPC支架(该支架能够以抗原肽加载的单个步骤转化为抗原特异性aAPC支架)扩增具有低频率基线响应的抗原特异性CD8 T细胞是可行的。图5示出了这种特异性针对HLA-A*02:01CMV pp65 NLVPMVATV(SEQ IDNO：22)CD8 T细胞的可负载的、先组装型aAPC支架的扩增效率，所述CD8 T细胞从基线时的占总CD8+T细胞的0.18％(图5A)扩增至占总CD8+T细胞的25％(图5B)。效率与使用野生型和Cys-突变型MHC分子的后组装型aAPC支架相当。还发现，这些扩增的CD8 T细胞的功能性(如通过抗原特异性细胞因子释放测量的)在所有三种变体(使用Cys-突变型MHC的已负载的先组装型aAPC支架，使用Cys-突变型MHC的已负载的后组装型aAPC支架，以及使用野生型MHC的已负载的后组装型aAPC)中都相当(图6)。图7中的结果使用可负载的、先组装型aAPC支架进一步确定了来自不同供体PBMC的、对HLA-A*02:01 EBV BMF1GLCTLVAML(SEQ ID NO：21)具有特异型的扩增的CD8 T细胞的功能。这表明可负载的、先组装型aAPC支架可以提供有效的T细胞刺激并激活多功能T细胞，从而提供了一种有利的aAPC支架，因为它们可以以可负载的形式在4℃下储存直至使用，并且可以以添加抗原肽的单个步骤转化为任何特异性的aAPC支架。
将这些实施例放在一起表明，将空Cys-突变型MHC用于aAPC支架的快速生产和抗原多样化以扩增抗原特异性T细胞是可行的。这在过继性T细胞转移环境中是有利的，在该环境中，患者衍生的癌症特异性T细胞的快速扩增对于正面的临床结果至关重要。
本文给出了使用两种抗原肽的实施例。但是，本发明不限于抗原肽的限定组。其他相关的肽包括但不限于SEQ ID NO：25-28。
实施例5：二硫桥稳定的(Cys-突变型)pMHC四聚体的TCR识别
在本实施例中，我们比较了wt pMHC识别TCR的能力和Cys-突变型pMHC识别相同TCR的能力。这样做是为了验证Cys-突变型pMHC以与wt pMHC类似的方式将肽抗原呈递给TCR。
简而言之，由生物素化的wt pMHC单体制备pMHC四聚体，这些生物素化的wt pMHC单体与与荧光染料偶联的链霉亲和素结合。基本上如实施例2中所述制备生物素化的pMHC单体和Cys-突变型MHC单体。如实施例4所述制备使用wt HLA-A*02:01单体的抗原肽特异性MHC四聚体(pMHC)。
简而言之，通过在PBS缓冲液中以20μL反应体积将100μg/mL wt HLA-A02:01单体与200μM抗原肽一起在UV灯(366nm波长)下孵育1小时，从而将wt HLA-A*02:01单体(与UV不稳定肽KILGFVF-X-V(SEQ ID NO：24)预先结合的)交换成抗原肽。然后将这些交换后的抗原肽特异性单体与荧光团标记的链霉亲和素缀合，以制备抗原肽特异性四聚体，其中每种四聚体特异性用两种不同的荧光团制备，以检测带有两种不同颜色的每种特异性的CD8 T细胞，以进行构象分析。通过将200μM抗原肽与100μg/mL Cys-突变型MHC单体以20μL反应体积直接孵育1小时，来制备使用Cys-突变型MHC分子的pMHC四聚体，因为它们不含任何预先结合的抗原肽，因此不需要任何交换过程。然后通过与荧光团标记的链霉亲和素(对于每种特异性有两种不同的颜色)一起孵育，从而将抗原肽特异性Cys-突变型MHC单体四聚化。
为了对TCR识别进行比较性分析，针对四种不同的HLA-A*02:01抗原特异性制备了wt和Cys-突变型MHC四聚体：EBV LMP2 FLYALALLL(SEQ ID NO:26)、FLU 58-66GILGFVFTL(SEQ ID NO:20)、EBV LMP2 CLGGLLTMV(SEQ ID NO:25)和EBV BMF1 GLCTLVAML(SEQ IDNO:21)。使用wt和Cys-突变型MHC四聚体来检测来自健康供体的CD8 T细胞，并评估抗原肽特异性T细胞占总CD8 T细胞的百分比(图8)。
结论：该实施例证明，Cys-突变型MHC具有与wt MHC相同的结合抗原肽特异性T细胞的能力。两种形式的pMHC单体都可以转化为MHC四聚体，并显示可同等效率地检测相同种群的抗原肽特异性T细胞。
实施例6：aAPC支架扩增的T细胞在癌症模型中的功能能力
在本实施例中，我们从肿瘤材料中分离了人类癌症特异性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。使用aAPC支架扩增了TIL，并在癌症模型中测试了其功能能力。通过使用高剂量IL-2的快速扩增，将用aAPC支架扩增的T细胞与用最先进的(state-off-the-art)TIL扩增方案扩增的T细胞进行基准对比。
在3D微肿瘤模型中研究了aAPC支架扩增的T细胞的抗肿瘤活性。手术后24小时内处理新鲜的黑色素瘤组织。将组织样品洗涤、切碎并使用胶原酶的混合物温和地消化。此后，将微肿瘤制剂依次通过细胞过滤器过滤，以分离尺寸>50μm的3D微肿瘤。将这些3D微肿瘤在无血清条件下扩增。使用基于荧光染料的细胞毒性试验，与从同一患者建立的3D微肿瘤共培养，来评估aPC支架扩增的T细胞的抗肿瘤反应性。在长达96小时的时间内评估了3D微肿瘤细胞对自体细胞产物(对照)的细胞毒性响应。在上述细胞毒性分析的同时，使用活细胞3D共聚焦荧光显微镜分析各个细胞产物对3D微肿瘤的浸润程度。
结论：本实施例表明，使用aAPC支架扩增的T细胞对自体癌症微肿瘤具有抗肿瘤反应性。
实施例7：aAPC支架扩增的T细胞在人源化小鼠模型中的体内抗肿瘤活性
在本实施例中，我们证明了aAPC支架扩增的T细胞在人源化的huIL2-NOG小鼠中的体内抗肿瘤活性，最近有报道该小鼠模型可以模拟和预测过继转移的黑色素瘤来源的TIL的临床活性。
简而言之，将肿瘤植入NOD/SCID/IL2Rγ(NOG)小鼠中。植入后，将肿瘤连续移植到三到五只NOG小鼠或三到五只人IL-2转基因NOG小鼠(huIL2-NOG)中。通过注射入尾静脉，用aAPC扩增的T细胞治疗huIL2-NOG小鼠。通过卡尺测量或成像(取决于肿瘤类型)比较用过继性T细胞转移治疗或未治疗的荷瘤小鼠的肿瘤生长。对在小鼠中扩增的T细胞进行免疫表型分析，并分析其抑制信号和刺激信号。
结论：该实施例证明，aAPC支架扩增的T细胞具有体内抗肿瘤反应性。
实施例8：使用带有Neoleukin-2/15(Neo-2/15)的aAPC支架扩增抗原特异性CD8 T 细胞
在本实施例中，描述了使用针对A1 CMV pp65 YSEHPTFTSQY(SEQ ID NO：30)的野生型MHC I类HLA-A*01:01单体组装带有Neo-2/15的aAPC支架，以及使用这些aAPC支架对来自健康供体PBMC的特异性CD8 T细胞进行扩增(图9)。
通过与实施例2中所述类似的方法，制备野生型HLA-A*02:01单体，但是在对UV不稳定的HLA-A*01:01特异性肽STAPG-X-LEY(SEQ ID NO：31)的存在下进行，其中X表示对紫外线敏感的氨基酸3-氨基-2-(2-硝基苯基)丙酸，它在暴露于紫外线后会破坏全长肽，并且它对于野生型MHC的折叠和稳定性至关重要。因此，纯化的且生物素化的野生型HLA-A*01:01单体将始终处于这种肽缔合形式。
由于具有野生型HLA-A*01:01单体的aAPC支架与预先结合的肽相缔和，因此使用针对A1 CMV pp65 YSEHPTFTSQY的野生型HLA-A*01:01单体的aAPC支架需要用CMV pp65YSEHPTFTSQY特异性肽交换预先结合的肽。将100μg/ml野生型HLA-A*01:01单体与PBS中的200μM抗原肽混合，至总体积为20μL，并在UV灯(366nm)下孵育60分钟，以促进预先结合的UV不稳定肽与抗原特异性肽的交换。反应后，使用野生型HLA-A*01:01单体和细胞因子组装aAPC支架。将支架储存在4℃，直到用于T细胞扩增。
在补充有5％人血清的X-vivo培养基中在48孔平底细胞培养板中，以2x106个PBMC/特异性启动基于aAPC支架的T细胞扩增。每第二天或第三天添加四次3μl aAPC支架，并维持培养两周。收集10个样品，使用抗原特异性刺激诱导的细胞内细胞因子染色测试扩增。在补充有5％人血清的X-vivo培养基中，用5μM相关抗原肽攻击扩增的细胞2小时，细胞浓度为300.000个细胞/100μL。与抗原肽一起孵育后，将扩增的细胞洗涤，并先用相关细胞表面抗体(CD3、CD4、CD8和存活力染料)染色，然后使用细胞透化缓冲液对TNFα(PE-Cy7)和IFNγ(APC)进行细胞内染色。然后将细胞固定并通过流式细胞仪分析。
本文给出了使用一种抗原肽的实施例。但是，本发明不限于抗原肽的限定组。其他相关的肽包括但不限于SEQ ID NO：25-28。
结论：该实验表明，使用展示Neo-2/15以及HLA-A*01:01CMV pp65YSEHPTFTSQY抗原的aAPC支架以pMHC指导的方式扩增具有低频率基线响应的抗原特异性CD8 T细胞是可行的(图9)。该实施例证明，将展示Neo-2/15以及HLA-A*01:01的aAPC支架用于快速产生抗原特异性T细胞是可行的。
发现用Neo-2/15aAPC支架扩增的CD8 T细胞在功能上与用IL-2制备的aAPC支架相当，如通过针对HLA-A*01:01CMV pp65 YSEHPTFTSQY抗原的抗原肽特异性扩增的CD8 T细胞释放的细胞内细胞因子(TNFα和IFNγ)所显示的(图9)。功能分析还证实，带有Neo-2/15的aAPC支架仅扩增抗原特异性细胞，因为未观察到无关肽特异性CD8 T细胞的扩增。
在实施例1中显示，与使用游离抗原肽和T细胞影响分子的扩增和刺激相比，用wtMHC分子制备的aAPC支架刺激的细胞在特异性CD8 T细胞的频率和绝对数目方面显示出优异的扩增。在实施例3中证明，Cys-突变型MHC aAPC支架以与用wt MHC分子制备的aAPC支架相似的效率扩增和刺激CD8 T细胞。在本实施例中，证明了带有Neo-2/15的aAPC支架可有利地扩增和刺激抗原特异性CD8 T细胞。
参考文献
·WO2002072631
·WO2009003492
·WO2009094273
·US2011/318380
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225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
260 265 270
Arg Trp
<210> 8
<211> 274
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> Cys-突变型HLA-B 0801重链，不含 TM结构域
<222> (1)..(1)
<400> 8
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Asp Thr Ala Met Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Glu Glu Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn Thr
50 55 60
Gln Ile Phe Lys Thr Asn Thr Gln Thr Asp Arg Glu Ser Leu Arg Asn
65 70 75 80
Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln
85 90 95
Ser Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly
100 105 110
His Asn Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu
115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Cys Ala Gln Ile Thr Gln
130 135 140
Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Val Ala Glu Gln Asp Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Glu Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His
180 185 190
Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220
Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
260 265 270
Arg Trp
<210> 9
<211> 274
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> Cys-突变型HLA-B 1501重链，不含 TM结构域
<222> (1)..(1)
<400> 9
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Tyr Thr Ala Met Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Met Ala Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr
50 55 60
Gln Ile Ser Lys Thr Asn Thr Gln Thr Tyr Arg Glu Ser Leu Arg Asn
65 70 75 80
Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln
85 90 95
Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly
100 105 110
His Asp Gln Ser Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu
115 120 125
Asp Leu Ser Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Cys Ala Gln Ile Thr Gln
130 135 140
Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Glu Ala Glu Gln Trp Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Gly Leu Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His
180 185 190
Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220
Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
260 265 270
Arg Trp
<210> 10
<211> 274
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> Cys-突变型HLA-B 3501重链，不含 TM结构域
<222> (1)..(1)
<400> 10
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Tyr Thr Ala Met Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Thr Glu Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn Thr
50 55 60
Gln Ile Phe Lys Thr Asn Thr Gln Thr Tyr Arg Glu Ser Leu Arg Asn
65 70 75 80
Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Ile Ile Gln
85 90 95
Arg Met Tyr Gly Cys Asp Leu Gly Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly
100 105 110
His Asp Gln Ser Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu
115 120 125
Asp Leu Ser Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Cys Ala Gln Ile Thr Gln
130 135 140
Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Gly Leu Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His
180 185 190
Pro Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220
Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
260 265 270
Arg Trp
<210> 11
<211> 274
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> Cys-突变型HLA-B 4402重链，不含 TM结构域
<222> (1)..(1)
<400> 11
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Tyr Thr Ala Met Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Thr Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Leu
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Thr Ser Pro Arg Lys Glu Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr
50 55 60
Gln Ile Ser Lys Thr Asn Thr Gln Thr Tyr Arg Glu Asn Leu Arg Thr
65 70 75 80
Ala Leu Arg Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Ile Ile Gln
85 90 95
Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly
100 105 110
Tyr Asp Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu
115 120 125
Asp Leu Ser Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Cys Ala Gln Ile Thr Gln
130 135 140
Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Val Ala Glu Gln Asp Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His
180 185 190
Pro Ile Ser Asp His Glu Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220
Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
260 265 270
Arg Trp
<210> 12
<211> 274
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<220>
<221> Cys-突变型H-2Kb重链，不含 TM结构域
<222> (1)..(1)
<400> 12
Gly Pro His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Leu Gly Glu Pro Arg Tyr Met Glu Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Tyr Glu Pro Arg
35 40 45
Ala Arg Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Arg Glu Thr
50 55 60
Gln Lys Ala Lys Gly Asn Glu Gln Ser Phe Arg Val Asp Leu Arg Thr
65 70 75 80
Leu Leu Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Lys Gly Gly Ser His Thr Ile Gln
85 90 95
Val Ile Ser Gly Cys Glu Val Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly
100 105 110
Tyr Gln Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Cys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu
115 120 125
Asp Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Met Cys Ala Leu Ile Thr Lys
130 135 140
His Lys Trp Glu Gln Ala Gly Glu Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Lys Asn Gly Asn
165 170 175
Ala Thr Leu Leu Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr His His
180 185 190
Ser Arg Pro Glu Asp Lys Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Glu Leu
210 215 220
Ile Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Tyr
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Tyr His Gln Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu
260 265 270
Arg Trp
<210> 13
<211> 274
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> Cys-突变型H-2Db重链，不含 TM结构域
<222> (1)..(1)
<400> 13
Gly Pro His Ser Met Arg Tyr Phe Glu Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Leu Glu Glu Pro Arg Tyr Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asn Lys Glu
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Tyr Glu Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Arg Glu Thr
50 55 60
Gln Lys Ala Lys Gly Gln Glu Gln Trp Phe Arg Val Ser Leu Arg Asn
65 70 75 80
Leu Leu Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Ala Gly Gly Ser His Thr Leu Gln
85 90 95
Gln Met Ser Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Trp Arg Leu Leu Arg Gly
100 105 110
Tyr Leu Gln Phe Ala Tyr Glu Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu
115 120 125
Asp Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Met Cys Ala Gln Ile Thr Arg
130 135 140
Arg Lys Trp Glu Gln Ser Gly Ala Ala Glu His Tyr Lys Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Lys Asn Gly Asn
165 170 175
Ala Thr Leu Leu Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr His His
180 185 190
Pro Arg Ser Lys Gly Glu Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Glu Leu
210 215 220
Thr Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Asn
245 250 255
Tyr Thr Cys Arg Val Tyr His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu
260 265 270
Arg Trp
<210> 14
<211> 291
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> Cys-突变型HLA-A 0201重链 + Avi标签，不含 TM结构域
<222> (1)..(1)
<400> 14
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr
50 55 60
Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr
65 70 75 80
Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln
85 90 95
Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly
100 105 110
Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu
115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Cys Ala Gln Thr Thr Lys
130 135 140
His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His
180 185 190
Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220
Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
260 265 270
Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu
275 280 285
Trp His Glu
290
<210> 15
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> Beta-2微球蛋白(B2M)
<222> (1)..(1)
<400> 15
Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn
1 5 10 15
Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser
20 25 30
Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val
35 40 45
Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu
50 55 60
Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg
65 70 75 80
Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg
85 90 95
Asp Met
<210> 16
<211> 387
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> Cys-突变型HLA-A 0201 B2M + 接头 + 重链融合体，不含 TM结构域
<222> (1)..(1)
<400> 16
Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn
1 5 10 15
Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser
20 25 30
Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val
35 40 45
Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu
50 55 60
Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg
65 70 75 80
Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg
85 90 95
Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro
115 120 125
Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr
130 135 140
Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro
145 150 155 160
Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu
165 170 175
Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly
180 185 190
Thr Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val
195 200 205
Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg
210 215 220
Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys
225 230 235 240
Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Cys Ala Gln Thr Thr
245 250 255
Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr
260 265 270
Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly
275 280 285
Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His
290 295 300
His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser
305 310 315 320
Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp
325 330 335
Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly
340 345 350
Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln
355 360 365
Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr
370 375 380
Leu Arg Trp
385
<210> 17
<211> 291
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> WT HLA-A 0201重链 + Avi标签，不含 TM结构域
<222> (1)..(1)
<400> 17
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr
50 55 60
Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr
65 70 75 80
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln
85 90 95
Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly
100 105 110
Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu
115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys
130 135 140
His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His
180 185 190
Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220
Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
260 265 270
Arg Trp Glu Ala Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile
275 280 285
Glu Trp His
290
<210> 18
<211> 404
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> Cys-突变型HLA-A 0201 B2M + 接头 + 重链 + Avi标签，不含 TM
<222> (1)..(1)
<400> 18
Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn
1 5 10 15
Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser
20 25 30
Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val
35 40 45
Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu
50 55 60
Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg
65 70 75 80
Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg
85 90 95
Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro
115 120 125
Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr
130 135 140
Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro
145 150 155 160
Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu
165 170 175
Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly
180 185 190
Thr Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val
195 200 205
Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg
210 215 220
Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys
225 230 235 240
Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Cys Ala Gln Thr Thr
245 250 255
Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr
260 265 270
Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly
275 280 285
Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His
290 295 300
His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser
305 310 315 320
Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp
325 330 335
Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly
340 345 350
Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln
355 360 365
Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr
370 375 380
Leu Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile
385 390 395 400
Glu Trp His Glu
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于生物素化的Avi标签
<220>
<221> Avi-tag
<222> (1)..(1)
<400> 19
Ala Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His
1 5 10 15
Glu
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 流感病毒（Influenza virus）
<220>
<221> FLU MP 58-66 GIL
<222> (1)..(1)
<400> 20
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus）
<220>
<221> EBV BMF1 GLC
<222> (1)..(1)
<400> 21
Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 巨细胞病毒（Cytomegalovirus）
<220>
<221> CMV pp65 NLV
<222> (1)..(1)
<400> 22
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus）
<220>
<221> HIV Pol (C20)
<222> (1)..(1)
<400> 23
Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 对UV不稳定的肽
<222> (1)..(1)
<223> X表示对紫外线敏感的氨基酸3-氨基-2-(2-硝基苯基)丙酸
<400> 24
Lys Ile Leu Gly Phe Val Phe Xaa Val
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 爱泼斯坦-巴尔病毒
<220>
<221> EBV LMP2 CLG
<222> (1)..(1)
<400> 25
Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 爱泼斯坦-巴尔病毒
<220>
<221> EBV LMP2 FLY
<222> (1)..(1)
<400> 26
Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 爱泼斯坦-巴尔病毒
<220>
<221> EBV BRLF1 YVL
<222> (1)..(1)
<400> 27
Tyr Val Leu Asp His Leu Ile Val Val
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 巨细胞病毒
<220>
<221> CMV IE1 VLE
<222> (1)..(1)
<400> 28
Val Leu Glu Glu Thr Ser Val Met Leu
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 流感病毒
<220>
<221> FLU BP-VSD
<222> (1)..(1)
<400> 29
Val Ser Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 巨细胞病毒
<220>
<221> CMV pp65
<222> (1)..(1)
<400> 30
Tyr Ser Glu His Pro Thr Phe Thr Ser Gln Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 对UV不稳定的肽
<222> (1)..(1)
<223> X表示对紫外线敏感的氨基酸3-氨基-2-(2-硝基苯基)丙酸
<400> 31
Ser Thr Ala Pro Gly Xaa Leu Glu Tyr
1 5

Claims (21)

1.一种人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，其包含聚合物主链，所述聚合物主链上连接有以下模板分子：
i.至少一种T细胞影响分子，其选自由以下组成的组：细胞因子、共刺激分子、粘附分子和抗体，和
ii.至少一种MHC I类分子，
其中所述MHC I类分子包含重链，所述重链包含通过二硫桥连接的α-1结构域和α-2结构域。
2.根据权利要求1所述的aAPC支架，其中所述二硫桥在位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基与位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基之间形成。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的aAPC支架，其中所述重链包含选自以下的氨基酸序列：
a.SEQ ID NO：1，或
b.与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述氨基酸序列包含位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基和位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基。
4.根据权利要求3所述的aAPC支架，其中位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基在氨基酸残基84或85处，并且位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基在氨基酸残基139处。
5.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述重链包含选自以下的氨基酸序列：
a.SEQ ID NO：2-13中的任一个，或
b.与(a)中任一序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述聚合物主链包含至少5个MHCI类分子，例如至少8个，例如至少10个，例如至少20个，例如至少30个，例如至少40个，例如至少50个，或例如至少100个MHC I类分子。
7.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述aAPC支架包含至少两种不同的T细胞影响分子。
8.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述T细胞影响分子是细胞因子。
9.根据权利要求8所述的aAPC支架，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：IL-21、IL-2、IL-15、IL-1、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-17、IL-22和IL-23。
10.根据权利要求8或9中任一项所述的aAPC支架，其中所述细胞因子是γ链受体细胞因子。
11.根据权利要求10所述的aAPC支架，其中所述γ链受体细胞因子选自由以下组成的组：IL-21、IL-2、IL-15、IL-4、IL-7和IL-9。
12.根据权利要求10或11中任一项所述的aAPC支架，其中所述γ链受体细胞因子选自由以下组成的组：IL-21、IL-2和IL-15。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的aAPC支架，其中所述aAPC支架包含至少两种γ链受体细胞因子。
14.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述MHC I类分子包含不含抗原肽的肽结合槽。
15.根据权利要求1-13中任一项所述的aAPC支架，其中所述MHC I类分子包括含抗原肽的肽结合槽(pMHC)。
16.一种同时体外刺激和扩增T细胞的方法，其包括以下步骤：
i.提供包含T细胞的样品，
ii.使所述样品与包含根据权利要求15所述的aAPC支架的扩增溶液接触，
iii.刺激并扩增培养中的对所述aAPC支架具有特异性的T细胞，以及
iv.从培养物中收获步骤iii)的T细胞，以获得扩增的抗原特异性T细胞群。
17.通过权利要求16所述的方法获得的扩增的T细胞群。
18.根据权利要求17所述的扩增的T细胞群，其中扩增的T细胞群具有选自以下的特征中的至少一种，例如至少两种，例如至少三种：
i.培养2周后，抗原特异性T细胞扩增至少10倍，
ii.经过后来的抗原攻击后，会分泌INF-γ和TNF-α，
iii.高表达CD28，以及
iv.低表达PD1。
19.根据权利要求17或18中任一项所述的扩增的T细胞群，其用作药物。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的扩增的T细胞群，其用于治疗癌症或病毒病况。
21.一种用于T细胞扩增的试剂盒，所述试剂盒包括：
i.第一存储构件，其包括至少一种根据权利要求1-14中任一项所述的aAPC支架，和
ii.第二存储构件，其包含至少一种抗原肽，
其中，所述第一存储构件和所述第二存储构件的内容物被配置为相组合。
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