CN101448951A

CN101448951A - 融合蛋白、其用途以及制备方法

Info

Publication number: CN101448951A
Application number: CNA2007800181965A
Authority: CN
Inventors: 尤姆·莱特; 卢尹·劳; 可弗·奥伍德
Original assignee: Teva Pharmaceutical Industries Ltd; Technion Research and Development Foundation Ltd
Current assignee: Teva Pharmaceutical Industries Ltd; Technion Research and Development Foundation Ltd
Priority date: 2006-05-19
Filing date: 2007-05-17
Publication date: 2009-06-03
Anticipated expiration: 2027-05-17
Also published as: AU2007254167A1; US20170211076A1; MX2008014722A; WO2007136778A3; AU2007254167B2; EP2024507A2; KR20090048397A; CA2652538A1; EP2024507B1; WO2007136778A2; CA2652538C; JP5225266B2; JP2009537175A; EA200870555A1; IL195191A0; US20080014208A1; HK1122335A1; EP2024507A4; IL195191A; US7977457B2

Abstract

本发明提供融合蛋白，包括在所述蛋白质氨基端起始的连续氨基酸，对应存在于(i)巨细胞病毒人类MHC－限制性肽、(ii)第一肽连接子、(iii)人类β－2微球蛋白、(iv)第二肽连接子、(v)人类MHC I类分子的HLA－A2链、(vi)第三肽连接子、(vii)抗体scFv片段重链的可变区和(viii)所述scFv片段轻链的可变区的连续氨基酸，其中对应(vii)和(viii)的连续氨基酸直接通过肽键或对应于第四肽连接子的连续氨基酸连接，所述scFv片段来源于与间皮素特异结合的抗体。本发明提供编码所述融合蛋白的核苷酸结构，制备融合蛋白及组合物的工艺和其用途。

Description

融合蛋白、其用途以及制备方法

发明背景

本发明参考了一些出版物。所有这些出版物的引用出处可直接在权利要求书部分之前找到。据此本发明将参考的这些公开的出版物整合综述，以便更全面的描述本发明在本领域所处的技术状态。

根据目前的免疫监督学说，免疫系统持续的识别和消除变异细胞。然而一些细胞能躲过看似有效的免疫反应，结果发展成肿瘤(1-4)。大多数研究已证明了肿瘤逃脱免疫反应为大家公认的现象，并由多种已提出的机制引起(1-4)。这些机制有：产生抑制性细胞因子，缺失免疫优势肽，耐受杀伤机制(细胞凋亡)及缺失MHC I类分子(1-4)。这些逃脱机制其中之一显示出与肿瘤发展密切相关，该机制是MHC I类分子缺失或下调。该逃脱机制普遍存在多数肿瘤中，可起因于多种不同的突变。一些研究揭示了MHC I类分子荷载和递呈途径的薄弱环节，包括β-2-微球蛋白缺失，TAP1/TAP2突变，LMP突变，MHC基因缺失杂合子，及特异性MHC等位基因下调。

现有的癌症免疫治疗方法典型地采取免疫系统的两个部分：体液免疫系统和细胞免疫系统。首先，全身注射高亲和性单克隆抗体(mAbs)可直接抑制细胞表面肿瘤相关抗原，并已证明抗肿瘤活性具有显著的临床试验统计学意义(5，6)。此外，目前携带有效应子如细胞因子或毒素的抗肿瘤mAbs正进行临床试验评价(7)。第二种关于特异性肿瘤免疫治疗的主要方法采取免疫系统的细胞免疫系统，主要是所述CD8+细胞毒性T细胞。目前两个用于提高免疫系统细胞免疫系统的抗肿瘤有效性的主要方法是：(i)给患者施用已知可被T淋巴细胞识别的肽进行主动免疫，及(ii)过继性转移治疗即能够选择、激活及扩增高活性的T细胞亚群，从而改善抗肿瘤作用。在第一个方法中，近来源自于已鉴定的肿瘤相关抗原(如gp100、MAGE家族、NY-ESO-I)的MHC限制性肽已用于给患者预防接种。由于这些肿瘤特异性抗原源肽在特定组织中特有的表达，因而它们具有高特异性(8-11)。第二方法，过继性细胞转移近来显示出令人瞩目的结果，即从转移性黑素瘤患者分离出高选择性、抗肿瘤活性T细胞抑制过度表达的自体分化抗原，进行体外扩增并再次给患者导入。在此方法中，人们已验证了T细胞的持续克隆性再增殖、体内增殖、功能性活动及运送T细胞到肿瘤位点(12-14)。

最近提出了一种新的免疫治疗方法，其采用两个已公认的区域：(i)CD8+细胞毒性T细胞消除递呈高致免疫MHC/肽复合物的细胞的已知有效性，和(ii)肿瘤特异的细胞表面抗原通过抗体重组体片段，主要是单链抗体片段(scFvs)的靶向作用。该方法利用由两个功能不同的实体组成的重组体融合蛋白：(i)携带高致免疫的肿瘤或病毒源肽的单链MHC I类分子，和(ii)肿瘤特异的高亲和性scFv片段(15)。一些家族已显示生物素酰化的MHC肽通过与肿瘤特异的抗体化学结合配对，在抗生物素蛋白链菌素或单体的HLA-A2/流行性感冒(Flu)基质肽复合物上多聚化，可在体外诱导T淋巴细胞介导被包覆的肿瘤细胞溶解(16-20)。然而，这些方法利用化学结合并使用全部的抗体或更大的片段，如Fab片段。然而，由于该结合方法的产量和同质性以及肿瘤穿透能力因为所述分子的大体积而受到限制。Lev等描述了在单链重组体HLA-A2和肿瘤特异性的scFvs之间产生的遗传融合物。这些融合物显示了体外体内均起作用，可特异地诱导T淋巴细胞介导的体外和体内包覆靶点的肿瘤细胞溶解(15)。该新的嵌合分子稳定性高度依赖于所述肽递呈于MHC的结合槽内。因此，当所述肽从所述嵌合分子的scHLA-A2区域解离会降低其稳定性。Oved等通过构建新的嵌合分子提出了该问题，其中所述肽通过短连接子与scHLA-A2/scFv结构连接。所述新的融合蛋白已测试其体外生物化学活性和生物活性(21)。

广泛公认新的融合蛋白必须能保持其双重活性：通过所述具有亲和性的和间接有效的、有效的及特异性细胞毒性的scFv部分与肿瘤靶细胞结合，及通过募集由共价键连接的HLA-A2-限制性肽调节其特异性的C D8+T细胞与肿瘤靶细胞结合。

适当的免疫应答的MHC I类限制性CD8+细胞毒T细胞(CTL)效应子部分能很好的识别肿瘤细胞为外来物，并开始级联反应最终致使肿瘤破坏。然而，肿瘤已经发展出复杂机制以逃避免疫效应机制，研究最深入的是递呈由CTLs识别的抗原的MHC I类分子下调。

为了避免现有方法的局限并开发新的免疫治疗方法，构建一种重组体分子，其中通过与癌症特异重组体抗体片段或与肿瘤细胞表达的受体结合的配体的融合作用，单链MHC特异定向于肿瘤细胞。

发明内容

本发明提供一种融合蛋白，包括在所述蛋白质氨基端起始的连续氨基酸，对应存在于(i)巨细胞病毒人类MHC-限制性肽、(ii)第一肽连接子、(iii)人类β-2微球蛋白、(iv)第二肽连接子、(v)人类MHC I类分子的HLA-A2链、(vi)第三肽连接子、(vii)抗体scFv片段重链的可变区和(viii)所述scFv片段轻链的可变区的连续氨基酸，其中对应(vii)和(viii)的连续氨基酸直接通过肽键或对应于第四肽连接子的连续氨基酸连接在一起，所述scFv片段来源于与间皮素特异结合的抗体。

本发明也提供组合物，包括所述融合蛋白和载体。

本发明进一步提供编码融合蛋白的核苷酸结构，包括在所述蛋白质氨基端起始的连续氨基酸，对应存在于(i)巨细胞病毒人类MHC-限制性肽、(ii)第一肽连接子、(iii)人类β-2微球蛋白、(iv)第二肽连接子、(v)人类MHC I类分子的HLA-A2链、(vi)第三肽连接子、(vii)抗体scFv片段重链的可变区和(viii)所述scFv片段轻链的可变区的连续氨基酸，其中对应(vii)和(viii)的连续氨基酸直接通过肽键或对应于第四肽连接子的连续氨基酸连接，所述scFv片段来源于与间皮素特异结合的抗体。

本发明进一步提供细菌表达的包涵体分离制备，包括按重量计，超过30％的本发明所述的融合蛋白。

本发明也提供一种制备融合蛋白的工艺，包括培养包含所述融合蛋白的转化细胞，以便所述融合蛋白被表达及回收表达的融合蛋白。

本发明进一步提供一种选择性杀伤肿瘤细胞的方法，包括将本发明所述融合蛋白以有效剂量与肿瘤细胞接触，引起CTL介导的抗肿瘤免疫反应，从而杀伤肿瘤细胞。

最后，本发明进一步提供一种治疗在其表面表达间皮素的肿瘤细胞的方法，包括将本发明所述的融合蛋白以有效剂量与肿瘤细胞接触，引起CTL介导的抗肿瘤免疫反应，从而治疗肿瘤细胞。

作为本发明典型的分子，单链MHC分子由β2微球蛋白通过短肽(15个氨基酸)连接子与HLA-A2的α1、α2和α3区域融合组成，并与定位于间皮素的scFv SSl融合。为了构建融合蛋白和共价结合的肽，源自CMV pp65蛋白NLVPMVATV(SEQ ID NO：4)的9个氨基酸的肽通过20个氨基酸的连接子GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：6)与所述scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白的N端融合。所述融合蛋白在大肠杆菌(E.coli)中表达，并在递呈CMV/scHLA-A2/SSl(scFv)时重新折叠，体外产生功能分子。流式细胞计量术研究显示了通过完全依赖于靶向抗体片段的特异性，由HLA-A2肽复合物修饰抗原阳性、HLA-A2阴性的人类肿瘤细胞的能力。

最重要的是，CMV/scHLA-A2/SSl(scFv)介导的包覆肿瘤靶细胞，使得肿瘤靶细胞易感于有效特异性的HLA-A2限制性CMV肽特异性的CTL介导的溶解。这些结果证明了MHC肽复合物对肿瘤细胞的抗体引导的肿瘤抗原特异的靶向作用，使得这些肿瘤细胞易感于CTL杀伤，并增强CTL杀伤。现在该新方法开创了发展新免疫治疗方法的道路，基于天然同源的MHC配体的抗体靶向作用和基于CTL细胞毒性机制。

结合本发明，新方法被开发用于将I类MHC肽复合物再定向于肿瘤细胞表面上，方法是不依赖于肿瘤靶细胞表达I类MHC的程度。为此目的，本发明的一个实施例中，采用了具有两个部分的分子。一个部分，即定向部分，包括定向于肿瘤或分化抗原的抗体的肿瘤特异重组体片段，分化抗原多年来一直用于将放射性同位素、毒素或药物定向癌细胞。第二个效应子部分是单链MHC分子(scMHC)，由人类β2微球蛋白结合HLA-A2重链三个胞外域组成(24，25，WO 01/72768)。通过连接基因编码的位于单个重组体基因的所述两个部分并表达所述基因，所述新分子可在E.coli中有效地表达和制备，例如，通过递呈HLA-A2-CMV肽时体外重新折叠。如本发明所述的该方法，可致使肿瘤靶细胞易感于细胞毒性T细胞介导的溶解，而不需考虑它们的MHC表达水平，因此可被采用作为一种新方法以增强CTL介导的抗肿瘤免疫力。该新方法将导致新一类重组体治疗药物的产生，这些重组体治疗药物能利用天然同源的MHC配体和基于CTL细胞毒性机制，选择性杀伤和清除肿瘤细胞。

附图简要说明

图1A-B

为scHLA-A2/SSl(scFv)和pep(CMV)/scHLA-A2/SSl(scFv)(化合物A)的示意图。

图1A表示scHLA-A2的C端通过4个氨基酸的连接子与SSl(scFv)的N端融合。图1B表示CMV pp65肽，如NLVPMVATV(SEQ ID NO：4)，通过20个氨基酸的连接子GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：6)与scHLA-A2/SSl(scFv)的N端融合。

图2

编码化合物A的核酸序列(SEQ ID NO：1)。

图3A-B

化合物A的表达和纯化。

图3A显示分离的包涵体进行SDS/PAGE分析。

图3B显示化合物A经过离子交换柱层析柱纯化后进行SDS/PAGE分析。

图4

将化合物A与重组体间皮素结合。

间皮素固定于酶标板，并由构象敏感的mAb W6监控其与化合物A剂量依赖的结合(33，34)。

图5A-D

化合物A与表达间皮素细胞结合。

图5A-B表示流式细胞计量术分析化合物A与间皮素阳性HLA-A2阴性A431K5细胞和间皮素阴性HLA-A2阴性A431细胞的结合。图5A显示所述Kl mAb(31，32)与A431K5细胞结合，图5B显示缺失Kl mAb(31，32)与A431细胞的结合。图5C显示化合物A与A431K5细胞结合，图5D显示缺失化合物A与A431细胞的结合。

所述结合由抗HLA-A2特异性抗体BB7.2(35)和FITC标记的第二抗体监控。

图6A-B

化合物A对CTL介导的HLA-A2阴性肿瘤细胞溶解的增强作用。在图6A，[S³⁵]蛋氨酸释放试验中，间皮素转染的A431K5细胞和亲代间皮素阴性A431细胞与化合物A(10μg)和CMV特异CTLs共同孵育。图6B表示在[S³⁵]蛋氨酸释放试验，当间皮素转染的A431K5细胞和亲代间皮素阴性A431细胞与不同浓度的化合物A和CMV特异CTLs共同孵育时，化合物A的剂量依赖活性。

图7

pep/scHLA-A2/SSl(scFv)(化合物B)的示意图。在化合物B中，所述肽NLVPMVATV通过15个氨基酸的连接子GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：8)与scHLA-A2/SSl(scFv)的N端融合。

图8

编码化合物B的核酸序列(SEQ ID NO：22)。

图9A-B

化合物B的表达和纯化。

图9A表示分离的包涵体的SDS/PAGE分析。图9B表示化合物在经过离子交换柱层析柱纯化后进行BSDS/PAGE分析。

图10A-F

化合物B与表达间皮素细胞结合。

图10A-F表示流式细胞计量术分析化合物B与间皮素阳性HLA-A2阴性A431K5细胞和间皮素阴性HLA-A2阴性A431细胞的结合。图10A显示Kl mAb与A431K5细胞结合，图10B显示缺失Kl mAb与A431细胞的结合(B)。图10C显示化合物B与A431K5细胞结合，图10D显示缺失化合物B与A431细胞结合。图10E显示比较化合物A与A431K5细胞的结合和化合物B与A431K5细胞的结合，图10F显示缺失化合物A与A431细胞的结合和化合物B与A431细胞。所述结合由抗HLA-A2特异性抗体BB7.2和FITC标记的第二抗体监控。

图11A-B

化合物B对CTL介导的HLA-A2阴性肿瘤细胞溶解的增强作用。

在图11A，[S³⁵]蛋氨酸释放试验中，间皮素转染的A431K5细胞和亲代间皮素阴性A431细胞与化合物B(10μg)和CMV特异CTLs共同孵育。图11B表示在[S³⁵]蛋氨酸释放试验，当间皮素转染的A431K5细胞和亲代间皮素阴性A431细胞与不同浓度的化合物A和CMV特异CTLs共同孵育时，化合物B的剂量依赖活性。

图12

化合物B和化合物A对CTL介导的HLA-A2阴性肿瘤细胞溶解的增强作用。[S³⁵]蛋氨酸释放试验中，间皮素转染A431K5细胞和亲代间皮素阴性A431细胞与不同浓度的化合物B或化合物A和CMV特异CTLs共同孵育。所述图显示了化合物A与A431K5细胞的孵育结果，化合物B与A431K5细胞的孵育结果，化合物A与A431细胞的孵育结果及化合物B与A431细胞的孵育结果。

图13A-B

scHLA-A2/SSl(scFv)和Mlcov/scHLA-A2/SSl(scFv)的示意图。

图13A显示scHLA-A2的C端通过4个氨基酸的连接子与scFv的N端融合。图13B显示Ml 58-66肽通过15氨基酸的连接子GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：8)与scHLA-A2/SSl(scFv)的N端融合。

图14

编码Mlcov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：23)。

图15A-B

Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白的表达和纯化。

图15A显示分离的包涵体的SDS/PAGE分析。图15B显示Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白在离子交换柱层析柱纯化后进行SDS/PAGE分析。

图16

Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白与重组体间皮素结合。间皮素固定于酶标板，并由构象敏感的mAb(W6)监控其与Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)剂量依赖的结合。

图17A-D

Ml-cov/scHI_A-A2/SSl(scFv)融合蛋白和表达间皮素细胞的结合。图17A-D显示流式细胞计量术分析Mi-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白与间皮素阳性HLA-A2阴性A431K5细胞和间皮素阴性HLA-A2阴性A431细胞的结合。图17A显示Kl mAb与A431K5细胞结合，图17B显示缺失Kl mAb与A431细胞结合。图17C显示Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白与A431K5细胞结合，图17D显示缺失Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白与A431细胞结合。所述结合由抗HLA-A2特异抗体BB7.2和FITC标记第二抗体监控。

图18

Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白对CTL介导的HLA-A2阴性肿瘤细胞溶解的增强作用。在[S^3S]蛋氨酸释放试验中，间皮素转染的A431K5细胞和亲代间皮素阴性A431细胞与不同浓度的Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)和Ml特异性HLA-A2限制性CTLs共同孵育。

发明详述

本发明提供一种融合蛋白，包括连续氨基酸，所述连续氨基酸起始于所述蛋白的氨基端，对应于存在于(i)巨细胞病毒人类MHC限制性肽、(ii)第一肽连接子、(iii)人类β-2微球蛋白、(iv)第二肽连接子、(v)人类MHC I类分子的HLA-A2链、(vi)第三肽连接子、(vii)抗体scFv片段重链的可变区、(viii)所述scFv片段轻链的可变区的连续氨基酸，其中所述对应于(vii)和(viii)的连续氨基酸直接通过肽键或通过对应于第四肽连接子的连续氨基酸结合在一起，所述scFv片段来源于特异结合间皮素的抗体。在一个实施例中，第一肽连接子的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：6)。在另一个实施例中，第二肽连接子的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：8)。在另一个实施例中，第三肽连接子的氨基酸序列为ASGG(SEQ ID NO：10)。在另一个实施例中，第四肽连接子的氨基酸序列为GVGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：19)。在另一个实施例中，巨细胞病毒人类MHC限制性肽的氨基酸序列为NLVPMVATV(SEQ ID NO：4)。

如这里所使用的“第一肽连接子”、“第二肽连接子”和“第四肽连接子”涉及肽，所述肽由单体肽组成，所述单体肽的氨基酸序列为GXGGS(SEQ ID NO：20)或它的多聚体，其中X可为任一氨基酸。这些肽连接子可为2—10个所述单体肽的多聚体。在任一所述多聚体，每一个单体肽可与所述多聚体的其它单体肽相同或不同，这依赖于氨基酸X的鉴定。在一个实施例中，单体肽中的X是缬氨酸(V)。在另一个实施例中，单体肽中的X是甘氨酸(G)。在目前优选的实施例中，所述肽连接子包括含有三个或四个单体肽的多聚体，尤其是含有三个单体肽的多聚体，所述三个单体肽的大部分X的N端是缬氨酸(V)，第二和第三个X是甘氨酸(G)。

在一个实施例中，所述对应于(vii)的连续氨基酸的序列，继之以所述第四肽连接子，再接着是(viii)，该序列在SEQ ID NO：12阐述。

在另一个实施例中，所述融合蛋白即化合物A的所述连续氨基酸的氨基酸序列在SEQ IDNO：2阐述。

本发明也提供一种组合物，包括本发明所述的融合蛋白和载体。在一个实施例中，所述融合蛋白以治疗有效剂量存在于所述组合物中，所述载体为可药用载体。

本发明也提供一种编码融合蛋白的核苷酸结构，包括起始于所述蛋白氨基端的连续氨基酸，对应于存在于(i)巨细胞病毒人类MHC限制性肽、(ii)第一肽连接子、(iii)人类β-2微球蛋白、(iv)第二肽连接子、(v)人类MHC I类分子的HLA-A2链、(vi)第三肽连接子、(vii)抗体scFv片段重链的可变区、(viii)所述scFv片段轻链的可变区的连续氨基酸，其中所述连续氨基酸对应于第四肽连接子，所述scFv片段来源于特异结合间皮素的抗体。在一个实施例中，所述核苷酸结构的核酸序列在SEQ IDNO：1中阐述。

本发明也提供一种载体，包括本发明所述核苷酸结构。所述载体为质粒、病毒、噬菌体等等。

本发明进一步提供一种表达载体，包括本发明所述核苷酸结构和有效连接其的启动子。

本发明也提供一种转化细胞，包括本发明所述的载体。所述转化细胞可为真核细胞，选自下列组包括如：哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞和原生动物细胞。选择地，所述转化细胞可为细菌细胞。

本发明提供细菌表达的包涵体的分离制备，包括重量百分数超过30％的本发明所述的融合蛋白。

本发明也提供一种制备融合蛋白的工艺，包括培养本发明所述的转化细胞以便表达所述融合蛋白，及回收表达的所述融合蛋白。在一个实施例中，回收所述融合蛋白包括将表达的融合蛋白用分子排阻色谱柱处理。在另一个实施例中，所述融合蛋白被表达在包涵体内。在一个实施例中，所述方法进一步包括为了分离和再折叠所述融合蛋白，处理所述包涵体，从而制备所述活性形式的融合蛋白。在另一个实施例中，处理所述包涵体以从其中分离所述融合蛋白，包括用变性剂处理所述包涵体。

如这里所使用的所述融合蛋白的“活性形式”表示所述融合蛋白的三维构象，当间皮素呈递于肿瘤细胞表面时，该构象允许所述融合蛋白特异结合间皮素。

本发明也提供一种选择性杀伤肿瘤细胞的方法，包括用本发明所述的融合蛋白以有效剂量接触该细胞，引起CTL介导的抗所述肿瘤细胞的免疫反应，从而杀伤所述肿瘤细胞。在一个实施例中，所述肿瘤细胞位于患者体内，且通过给患者施予所述融合蛋白使得所述接触有效。

本发明进一步提供治疗在其表面表达间皮素的肿瘤细胞的方法，包括用本发明所述的融合蛋白以有效剂量接触所述肿瘤细胞，引起CTL介导的抗所述肿瘤细胞的免疫反应，从而治疗所述肿瘤细胞。在一个实施例中，所述肿瘤细胞存在于实体瘤中。在另一个实施例中，所述实体瘤为与卵巢、肺、胰脏或头/颈癌症或间皮瘤相关的肿瘤。

本发明提供：(i)新的融合蛋白；(ii)制备所述融合蛋白的工艺；(iii)编码所述融合蛋白的核苷酸结构，和(iv)使用所述融合蛋白选择性杀伤细胞，尤其是癌症细胞的方法。

通过参考本发明所阐述的附图和说明书，可更好的理解本发明的原理和操作。

可以正确评价的是本发明并不限于说明书所阐述的细节应用或举例说明。本发明包含其它实施例，并能通过各种方法实施或实现。同样，可以正确评价的是这里所使用的措辞和术语是为了说明本发明，不应被视为限制。

肿瘤的演进通常与免疫抑制因子的分泌和/或MHC I类抗原递呈功能下调有关(2)。即便特异CTL应答在患者中被证实，但由于抗肿瘤CTL种群稀少，非常罕见，且在一些情况下所述CTLs没有功能或无细胞免疫反应性，因此所述应答低(26)。此外，在递呈特有肿瘤相关肽的肿瘤细胞表面的MHC肽复合物的数量少已为大家所公认(27)。关于开发能刺激抗肿瘤免疫应答的疫苗的显著进展包括有：识别给定肿瘤类型的相关抗原蛋白，鉴定针对MHC I类和MHC II类限制性结合基序的肿瘤抗原表位定位，这些进展目前被用于各种疫苗接种方案中(14，11，8)。为通过CTLs识别杀伤提供特异信号，递呈适当的肽的MHC I类分子是必需的。然而，肿瘤逃逸的主要机制是HLA结构丧失、下调或变更，可使靶细胞对CTL溶解无应答，即使所述细胞表达所述适当的肿瘤抗原。

本发明提供一种防止该问题的新方法。虽然减少本发明实施，但研究显示肿瘤细胞的I类MHC肽复合物的肿瘤特异靶器官是有效的和有效力的方法，该方法使得HLA-A2阴性细胞易感于相关的HLA-A2限制性CTLs介导的溶解。再定向CTLs抗肿瘤细胞的新方法利用使用重组体抗间皮素抗体片段和CMV配体，可定位于使肿瘤相对高度特异性表达的癌细胞。

所述抗间皮素抗体靶向片段和CMV配体与单链HLA-A2分子融合，可有效地功能地折叠。

本发明所述的结果涉及清楚论证本发明所述方法的有用性，通过癌症特异性抗体或配体引导的scMHC肽复合物靶向作用，以募集活化CTLs用于肿瘤细胞杀伤。这些结果为开发新的免疫治疗方法奠定基础，所述方法是基于天然产生的再定向抗肿瘤细胞的细胞免疫应答。

可以正确评价的是本发明所述的融合蛋白或它的部分可通过若干途径制备，包括固相合成蛋白质。然而，在本发明优选的实施例中，至少所述分子的主要部分，如scHLA-A2区域(包括或未包括所述CMV肽)和scFV区域，是通过翻译编码所述分子的各自的核苷酸结构而产生。

相应地，翻译合成图1B的分子需要一至三个开放阅读框。这些开放阅读框可位于单个、两个或三个核苷酸分子。因此，例如单个核苷酸结构可携带一个、两个或所有三个开放阅读框。一至三个顺式调控元件可用于控制所述一至三个开放阅读框的表达。例如，单个顺式调控元件可以类似顺反子的方式控制一、二或三个开放阅读框。备选地，三个独立的顺式调控元件可用于控制所述三个开放阅读框的表达。其它组合体也类似。

所述开放阅读框和顺式调控元件可由一至三个核苷酸分子携带。例如，每个开放阅读框和其顺式调控元件由不同的核苷酸分子携带，或所有所述开放阅读框和它们的相关的顺式调控元件由单个核苷酸分子携带。其它组合体也类似。

融合蛋白的表达可受携带任一所述核苷酸分子的单个细胞或多个细胞，作为转化/转染载体(如作为质粒、噬菌体、噬菌粒或病毒)，的转化/转染和/或共转化/共转染的影响。

可以正确评价的是所述融合蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO：2中阐述，包括N末端的蛋氨酸，很可能在细菌细胞表达时代表所述融合蛋白。依赖于采用的特异细菌细胞表达所述融合蛋白，N末端蛋氨酸可被分开和移除。相应地，预期本发明所述的融合蛋白都包括那些具有和那些不具有N末端蛋氨酸的融合蛋白。一般而言，当本发明所述融合蛋白在真核细胞表达，它将缺乏所述N末端蛋氨酸。因此，可以正确评价的是根据所述蛋白被表达的细胞类型，本发明所述的表达的融合蛋白的氨基酸序列可包括或不包括所述N末端蛋氨酸。

无论何时或无论在哪里使用，选择氨基酸序列内在易变的所述连接子肽，以使所述多肽在其被表达后，独立地连接并天然折叠，因此促进功能的或活性的单链(sc)人类β₂M/HLA复合物、抗体靶向或人类β₂M/HLA-CMV限制性抗原复合物的形成。

这里所描述的任一个核苷酸结构包括至少一个顺式调控元件，该顺式调控元件可操作连接其中所述编码多聚核苷酸。优选地，所述顺式调控元件在细菌中起作用。备选地，所述顺式调控元件在酵母菌中起作用。仍备选地，所述顺式调控元件在动物细胞中起作用。仍备选地，所述顺式调控元件在植物细胞中起作用。

所述顺式调控元件可包括启动子序列和额外转录的或翻译的增强子序列，这些用作在引入宿主细胞时促进表达所述多聚核苷酸。启动子的具体实例在不同的真核的和原核的表达系统内容及下面的具体实施例部分进行描述。

可以正确评价的是核苷酸结构中的单个顺式调控元件可被用于直接转录单个包括一个或多个开放阅读框的转录本。在随后的实例中，内核糖体进入位点(IRES)可被利用以允许翻译在内定位的核酸序列。

不论何时单个细胞的独立多肽的共同表达是经过选择的，采用的结构必须被装配以使独立多肽的表达水平达到最佳，从而获得最高比例的最终产物。

优选地，本发明所述核苷酸结构利用的启动子(是顺式调控元件的一个例子)是稳固构成的启动子，以使在宿主细胞转化后获得高水平表达的所述多聚核苷酸。

可以正确评价的是，高水平表达也可受下列因素影响，包括：由高拷贝数的所述核苷酸结构转化所述宿主细胞，或采用能稳定所述合成的转录本和减少所述转录本的降解或“代谢回转”的顺式作用元件。

如这里所使用的短语“转化细胞”表示向细胞中导入外源的核苷酸序列从而稳定地或短暂地遗传改变该宿主细胞。这可通过使用本领域所熟知的各种方法在自然的或人工的条件下实现，并将在随后的宿主具体实施例中详细描述。

所述转化的宿主细胞可为真核细胞，如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞和原生动物细胞，或备选地，该细胞可为细菌细胞。

当用于真核宿主细胞表达时，本发明所述核苷酸结构可以是穿梭载体，所述穿梭载体可同时在大肠杆菌(E.coll)中繁殖(其中所述结构包括适当的可选标记和复制起点)并适合于在真核宿主细胞表达。本发明所述核苷酸结构可以是，如质粒、杆粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。

合适的哺乳动物表达系统包括但不限于pcDNA3、pcDNA3.1(/-)、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1(由Invitrogen^TM公司(Carlsbad，CA USA)提供)，pCI(由Promega^TM公司(Madison WI USA)提供)，pBK-RSV、pBK-CMV(由

公司(La Jolla，CA USA)提供)，pTRES(由 Laboratories，Inc.(MountainView，CAUSA)提供)，以及它们的衍生物。

昆虫细胞培养也可被用于表达本发明所述核苷酸序列。适当的昆虫表达系统包括但不限于杆状病毒表达系统和其衍生物，这可从多数供应商购买，如maxBac^TM(Invitrogen^TM公司，Carlsbad，CA USA)、BacPak^TM(Clontech^* Laboratories，Inc.Mountain View，CA USA)或Bac-to-Bac^TM(Invitrogen^TM/Gibco^*，Carlsbad，CA USA)。

本发明所述的表达所述核苷酸序列也可在植物细胞中完成。如这里所使用的短语“植物细胞”可以是植物原生质体、植物组织培养细胞、植物衍生组织细胞或植物整体细胞。

已有各种方法将核苷酸结构导入植物细胞。所述方法依赖于所述核苷酸结构或其一部分稳定整合入所述植物细胞基因组，或短暂表达所述核苷酸结构，在这种情况下这些序列不能稳定整合入所述植物细胞基因组。

已有两种主要的方法实现外源性核苷酸序列稳定基因组整合，例如包括本发明所述核苷酸结构整合入植物细胞基因组的下列方法：

(i)土壤杆菌介导的基因转移：Klee等(1987)Annu.Rev.Plant Physiol.38：467-486；Klee和Rogers在植物细胞培养和植物体细胞遗传学，Vol.6，Molecular Biology of PlantNuclear Genes，eds.Schell，J.，和Vasil，L.K.，Academic Publishers，San Diego，Calif.(1989)p.2-25；Gatenby，在植物生物工程学，eds.Kung，S.和Arntzen，C.J.，Butterworth Publishers，Boston，Mass.(1989)p.93-112.

(ii)直接摄取DNA：Paszkowski等在植物细胞培养和植物体细胞遗传学，Vol.6，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds.Schell，J.，和Vasil，L K.，AcademicPublishers，San Diego，Calif.(1989)p.52-68；包括直接摄取DNA进入原生质体的方法，Toriyama，K.等(1988)Bio/Technology 6：1072-1074.通过短暂的电击植物细胞诱导的DNA摄取：Zhang等Plant Cell Rep.(1988)7：379-384.Fromm等Nature(1986)319：791-793.通过粒子轰击DNA注入植物细胞，Klein等Bio/Technology(1988)6：559-563；McCabe等Bio/Technology(1988)6：923-926；Sanford，Physiol.Plant.(1990)79：206-209；通过使用微量吸移管系统：Neuhaus等，Theor.Appl.Genet.(1987)75：30-36；Neuhaus和Spangenberg，Physiol.Plant.(1990)79：213-217；或者通过直接将DNA和发芽的花粉共同孵育，DeWet等，在胚珠组织的实验操作，eds.Chapman，G.P.和Mantell，S.H.和Daniels，W.Longman，London，(1985)p.197-209；和Ohta，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83：715-719.

所述土壤杆菌系统包括使用质粒载体，所述质粒载体包含整合入所述植物基因组DNA的确定的DNA片段。根据所述植物种类和所述土壤杆菌递送系统的不同，所述植物组织的培养方法也改变。广泛使用的方法是叶盘法，参见例如Horsch等，在植物分子生物学手册A5，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht(1988)p.1-9.补充的方法采用所述土壤杆菌递送系统联合真空渗入。所述土壤杆菌系统尤其可以稳定转化双子叶植物。

已有各种直接将DNA转移入植物细胞的方法。在电穿孔术中，原生质体被短暂处于强电场。在显微注射法中，通过使用非常小的微量吸移管将所述DNA直接机械地注入所述细胞。

在微粒轰击中，所述DNA被吸附在微粒上，如硫酸镁晶体、钨微粒或金微粒，所述微粒在细胞或植物组织被物理加速。直接DNA转移也可被用来短暂转化植物细胞。

无论如何适合的可用于植物细胞表达第一和第二核苷酸序列的植物启动子包括但不限于CaMV35S启动子、泛肽(ubiquitin)启动子和其它能以组成的或组织特异方式表达所述核苷酸序列的强启动子。

植物病毒也可用作转化载体。已知病毒对植物宿主细胞转化有益，所述病毒包括CaV，TMV和BV。利用植物病毒进行植物转化在下列出版物中公开：U.S.Pat.No.4,855,237(BGV)，EP-A 67,553(TMV)，日本公开申请号No.63-14693(TMV)，EPA 194,809(BV)，EPA 278,667(BV)；和Gluzman，Y.等，Communications in Molecular Biology：Viral Vectors，Cold Spring HarborLaboratory，New York，pp.172-189(1988)。WO87/06261中描述了假病毒微粒用于在许多宿主包括植物中表达外源DNA。

上述参考文献已证明构建植物RNA病毒用于植物引入和表达非病毒外源性核苷酸序列，同样还有Dawson，W.O.等，Virology(1989)172：285-292；Takamatsu等，EMBO J.(1987)6：307-311；French等，Science(1986)231：1294-1297；和Takamatsu等，FEBS Letters(1990)269：73-76.

当所述病毒为DNA病毒，所述结构可被用于病毒本身。备选地，所述病毒可首先被克隆进入细菌质粒，以减少用上述核苷酸序列构建希望的病毒载体。然后所述病毒可被从质粒中切断。如果所述病毒是DNA病毒，细菌复制起点可与所述病毒DNA接合，然后由细菌复制。该DNA的转录和翻译将产生外壳蛋白，所述外壳蛋白将使所述病毒DNA壳体化。如果所述病毒是RNA病毒，所述病毒通常被克隆成cDNA并插入质粒。然后该质粒被用于制造所有的结构。接着通过转录所述质粒的病毒序列和翻译病毒基因，产生用于使所述病毒RNA壳体化的外壳蛋白，从而制备该RNA病毒。

上述参考文献和美国专利5,316,931已证明了植物RNA病毒结构，用于在植物中引入和表达非病毒外源性核苷酸序列，如包含在本发明所述结构中的核苷酸序列。

酵母细胞在本发明也可被用作宿主细胞。已有很多酵母表达的载体，这些载体适用于在酵母中表达本发明所述核苷酸序列是本领域所熟知的，并能从商业渠道购买得到。所述酵母通常通过本领域所熟知的化学或电穿孔转化方法导入酵母宿主细胞。商业购买系统包括，如pYES^TM(Invitrogen^TM公司，Carlsbad CA，USA)或YEX^TM(Clontech^* Laboratories，MountainView，CA USA)表达系统。

可以正确评价的是当在真核生物表达系统(如上述系统)表达时，所述核苷酸结构优选地包括信号肽编码序列，以便从第一和第二核苷酸序列中产生所述多肽，所述多肽通过附着的信号肽定向进入分泌途径。例如，在哺乳动物、昆虫和酵母菌宿主细胞，所述表达的多肽可被分泌到菌种生长培养基上，而在植物表达系统，所述多肽可被分泌到质外体或直接进入亚细胞器。

细菌宿主可由核苷酸序列转化，通过使用本领域所熟知的转化方法包括例如化学转化(如CaCl₂)或电穿孔法。

用于表达本发明所述核苷酸序列的细菌表达系统的大多数实例已为本领域技术人员所熟知。商业可购买的细菌表达系统包括但不限于pET^TM表达系统(Novagen

，EMB Biosciences，San Diego，CA USA)，pSETM表达系统(Invitrogen^TM Corporation，Carlsbad CA，USA)或pGEX^TM表达系统(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ USA)。

正如随后的具体实施方式中进一步描述，细菌表达尤其有利，因为表达的多肽基本上形成纯包涵体，所述包涵体易于回收和纯化所述表达的多肽。

因此，本发明提供制备细菌表达的包涵体，所述包涵体由，按重量计超过30％，优选超过50％，更优选超过75％，最优选超过90％的本发明所述融合蛋白或融合蛋白的混合物组成。随后的具体实施方式将会详细描述分离所述包涵体并从中纯化所述融合蛋白。细菌表达所述融合蛋白，可得到高定量的纯的融合蛋白活性形式。

正如将在随后的具体实施方式中进一步描述，所述表达的融合蛋白基本上形成纯包涵体，所述包涵体容易通过本领域所熟知的分级分离技术分离，及通过如变性-复性步骤纯化。

本发明所述融合蛋白在递呈MHC限制性肽时可复性和再折叠，所述MHC限制性肽与本发明所述的其它多肽或者连接、或者共同表达、或者混合，并能接合所述单链MHC I类多肽。正如在实施例部分进一步所描述的，这样使能够产生基本上纯的MHC I类抗原肽复合物，所述MHC I类抗原肽复合物将通过分子排阻色谱柱进一步纯化。

可以正确评价的是，伴随(作为独立的肽)或融合所述MHC I类分子scHLA-A2链，用于再折叠的所述CMV肽可在所述细菌共同表达。在这种情况下，所述表达的融合蛋白和肽共同形成包涵体可被分离并用于MHC I类抗原肽复合物形成。

下述部分提供具体实施例说明本发明所描述的每个不同方面。这些实施例不应该被认为是以任意方式限制，因为本发明可通过相似的、然而有点不同的方式实现。然而，这些实施例可让本领域普通技术人员学习如何实现本发明的各种备选方案和具体实施例。

一般地，本发明所使用的术语和利用的实验操作包括分子的、生物化学的、微生物学的和重组DNA技术。所述技术在所述文献中充分说明。参见例如＂分子克隆：实验室手册＂Sambrook等(1989)；＂分子生物学现代实验设计＂Volumes I-III Ausubel，R.M.，等(1994)；Ausubel等，＂分子生物学现代实验设计＂，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989；Perbal，＂分子克隆实用指南＂，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等，＂重组DNA＂，ScientificAmerican Books，New York；Birren等.(eds)＂染色体组分析：实验室手册系列＂，VoIs.1-4，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；方法学如下列文献中所阐述：U.S.Pat.Nos.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057；＂细胞生物学：实验室手册＂，VolumesI-III Cellis，J.E.，ed.(1994)；＂动物细胞培养—基础技术手册＂by Freshney，wiley-Liss，N.Y.(1994)，第三版；＂现代免疫学实验设计＂Volumes I-III Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites等.(eds)，＂基础临床免疫学＂(8th Edition)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(eds)，＂细胞免疫学的选择方法＂，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；专利和科研文献中广泛描述通用的免疫测定法，参见，例如U.S.Pat.Nos.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4，098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；＂寡核苷酸合成＂Gait，M.J.，ed.(1984)；＂核酸杂交＂Hames，B.D.，和Higgins S.J.，eds.(1985)；＂转录与翻译＂Hames，B.D.，和Higgins S.J.，eds.(1984)；＂动物细胞培养＂Freshney，R.I.，ed.(1986)；＂固定化细胞和酶＂IRL Press，(1986)；＂分子克隆实用指南＂Perbal，B.，(1984)和＂酶学方法＂Vol.1-317，Academic Press；＂PCR实验设计：方法和应用指南＂，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等，＂蛋白纯化和鉴定方法—实验室课程手册＂CSHL Press(1996)；如这里全部阐述的所有这些通过参考文献合并。本发明所有各处可提供其它一般的参考文献。其中所述操作规程被认为是本领域所熟知的，并提供给读者以便利。其中包含的所有信息在此由参考文献合并。

具体实施方式

材料和方法

克隆化合物A

如前所述，通过短连接子ASGG(SEQ ID NO：4)连接scHLA-A2的C端和SSlscFv的N端，从而构建所述SCHLA-A2/SSl(scFv)(15)。为了构建所述scHLA-A2/SSl(scFv)与共价结合的MHC限制性肽，所述MHC限制性肽采用PCR重叠序列延伸反应和所述引物：

5′Ml-5′GGAAGCGTTGGCGCATATGGGCATTCTGGGCTTCGTGTTTACCCTGGGCGGAGGAGGATCCGGTGGCGGAGGTTCAGGAGGCGGTGGATCGATCCAGCGTACTCCAAAG3′(SEQID NO：13)和3′VLscSSl-5′GCAGTAAGGAATTCTCATTATTTTATTTCCAACTTTGT3′(SEQ IDNO：14)，通过所述肽连接子GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：6)与所述scHLA-A2/SSl(scFv)分子的N端融合，在所述5′Ml引物中，静默突变插入所述连接子序列，序列的改变产生BamH1限制酶切位点。

所述PCR产物被亚克隆到TA克隆载体(pGEM-T Easy Vector，Promega^TM Corporation，Madison，WI USA)，随后亚克隆到利用NdeI和EcoRI限制酶切位点的基于T7启动子的表达载体(PRB)。

为了制备化合物A，Ml/scHLA-A2/SSl(scFv)作为模板连接dsDNA引物。所述Ml/scHLA-A2/SSl(scFv)(在PRB质粒中)由NdeI和BamHI切割，所述质粒部分连接含有所述CMV肽序列的dsDNA引物，并延伸所述连接子序列5′CMVcovLL(框架)：

5′TATGAACCTGGTGCCGATGGTCGCGACCGTTGGAGGTGGCGGTTCTGGCGGAGGAG-3′(SEQ ID NO：15)和3′CMVcovLL(框架)：5′GATC CTCCTCCGCCAGAACCGCCACCTCCAACGGTCGCGACCATCGGCACCAGGTTCA3′(SEQ ID NO：16)。所述启动子(5′CMVcovLL(框架)and3′CMVcovLL(框架))在95℃孵育2分钟，然后在室温孵育1h，完成所述启动子的退火。所述粘合产物转化到E-coli DH5α，用于质粒扩增。质粒由

小量制备试剂(Inc.，Valencia，CAUSA)纯化，所得样品进行序列分析。

化合物A的表达再折叠和纯化

化合物A在E-coli LB21(λDE3)细胞(

Madison，WI USA)中表达成包涵体。化合物A结构通过热激转化到E-coli细胞，细胞均匀涂抹在LBAMP板上，37℃孵育过夜。菌落转移到丰富培养基(超级肉汤)以补充葡萄糖、MgSO₄、AMP和盐。细胞在37℃生长到DO＝2(600nm)，由IPTG(最终浓度1mM)诱导，并在37℃继续孵育3h。

加入0.2mg/ml溶菌酶，接着加入2.5％

X-100(Octylphenolpoly[ethylene glycolether]x，Roche Diagnostics GmbH，Roche Applied Science，Mannheim，Germany)和0.5M NaCl，使得细胞破碎，从细胞团提纯包涵体。离心并收集所述包涵体沉淀物(13,000rpm，60min at4℃)，用含有20mM EDTA的pH7.4的50mM Tris缓冲液洗三次。分离纯化的包涵体溶解于6M pH7.4的盐酸胍溶液，接着用65-mM DTE稀释。通过用包含0.1-M Tris、0.001M EDTA、0.5-MArginine和0.09-mM氧化谷胱甘肽的pH9的还原氧化-混洗(redox-shuffling)缓冲液以1:100的稀释度稀释所述溶解的稀释的包涵体，并在10℃孵育24h，实现所述包涵体再折叠。经过再折叠后，在pH 8透析所述蛋白以除去150-mM尿素、20-mMTris，接着用离子交换色谱仪以盐(NaCl)梯度洗脱纯化可溶的化合物A，该离子交换色谱仪采用

column(7.5mm I.D 60cm)(Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，0 MO USA)。然后洗脱峰含有化合物A时，更换缓冲液为PBS。

克隆化合物B

如前所述，通过短连接子ASGG(SEQ ID NO：15)连接scHLA-A2的C端和SSl scFv的N端，从而构建所述SCHLA-A2/SSl(scFv)。为了构建所述scHLA-A2/SSl(scFv)与共价结合的MHC限制性肽，所述MHC限制性肽和所述肽连接子GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：8)采用PCR重叠序列延伸反应和所述引物5′-Nde-209B2M：5′GGAAGCGTTGGCGCATATGATCATGGACCAGGTTCCGTTCTCTGTTGGCGAGGAGGGTCCGGTGGCGGAGGTTCAGGAGGCGGTGGATCGATCCAGCGTACTCCAAAG3′(SEQ ID NO：17)和3′VLscSSl-5′GCAGTAAGGAATTCTCATTATTTTATTTCCAACTTTGT3′(SEQ ID NO：18)，与所述scHLA-A2/SSl(scFv)分子的N端融合。209cov/scHLA-A2/SSl(scFv)分子被用作为化合物B结构的模板。在该分子中，通过PCR反应并利用引物5′GGAAGCGTTGGCGCATATGGTCGATCCAGCGTACTCCAAAG3′(SEQ ID NO：17)和3′VLscSSl-5′GCAGTAAGGAATTCTCATTATTTTAT TTCCAACTTTGT3′(SEQ ID NO：18)，将所述CMV肽NLVPMVATV(SEQ IDNO：4)引入所述209cov/scHLA-A2/SSl(scFv)序列(交换该209肽)。

化合物B的表达和纯化实验设计与化合物A的表达和纯化实验设计相同。

所有用来分析化合物B生物化学性质和生物学性质的方法与用于分析化合物A活性的方法相同。

构建Ml-COV/scHLA-A2/SSl(scFv)

为构建所述Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白，所述MI 58-66肽采用重组PCR反应和所述5′Ml-连接子引物：5′GGAAGCGTTGGCGCATATGGGCATTCTGGGCTTCGTGTTTACCCTGGGCGGAGGAGGATCCGGTGGCGGAGGTTCAGGAGGCGGTGGATCGATCCAGCGTACTCCAAAG3′(SEQ ID NO：13)和该3′VLscSSl-5′GCAGTAAGGAATTCTCATTATTTTATTTCCAACTTTGT3′(SEQ ID NO：14)，通过15个氨基酸的短连接子与所述scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白融合。所述Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白的表达和纯化实验设计与化合物A的表达和纯化实验设计相同。所有用来分析所述Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)的生物化学性质和生物学性质的方法与用于分析化合物A活性的方法相同。

流式细胞计量术

细胞与化合物A孵育(60min，4℃，100μl，10μg/ml)，洗涤，与抗HLA-A2MAb BB7.2孵育(60min，4℃，10μl/ml)。洗涤该细胞，与作为第二抗体的抗鼠FITC(60min，4℃，10μl/ml)孵育。接着洗涤该细胞，由FACS口径流式细胞测定器(Becton-Dickinson，San Jose，CA USA)进行分析。

酶联免疫吸附法

酶标板(Immunoplates)(

Becton-Dickinson Labware，Franklin Lakes，NJ USA)用10μg/ml纯化的细菌产生的重组体间皮素(0/N，4℃)包被。用含有2％脱脂乳的PBS封闭该酶标板，然后与不同浓度的化合物A孵育(60min，室温)，PBS洗涤三次。采用抗HLA构象依赖的抗体W6/32(60min，室温，1μg/ml)检测结合，酶标板用PBS洗涤三次，与抗鼠IgG-过氧化物酶(60min，室温，1μg/ml)共同孵育。使用TMB(DAKO)促进反应发生，并通过加入50μl 2N H₂SO₄使反应终止。抗间皮素抗体(Kl)用作阳性对照。由采用450nm过滤器的酶标仪(Anthos2001^TM，Anthos Labtech，Salzburg，Austria)分析所述酶标板。

细胞毒性试验

由S³⁵-蛋氨酸释放实验检测细胞毒性。在培养板上，在RPMI 10％ FCS蛋氨酸中随意培养靶细胞2h，接着与15μCi/ml的S³⁵-蛋氨酸(NEN)孵育过夜。由胰蛋白酶消化后收集靶细胞，40ml RPMI 10％ FCS洗涤两次。所述靶细胞用RMPI+10％ FCS在96孔板(每孔5×103个细胞)上37℃，5％ CO₂条件下孵育过夜。靶细胞与不同浓度的化合物A融合蛋白孵育2h，加入不同靶点的效应子CTL细胞：效应子比值及所述板在37℃，5％ CO₂条件下孵育8-12h。在孵育后，从培养上清液取25μl样本检测由靶细胞释放的S³⁵-蛋氨酸。所有实验重复三次，直接计算溶解：([实验释放—自发释放]/[最大释放—自发释放])×100。当缺失效应细胞时，S³⁵蛋氨酸从靶细胞释放，测量该自发释放，及S³⁵蛋氨酸从0.05M NaOH溶解的靶细胞释放，测量该最大释放。

细胞株

在含有10％ FCS、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的RPMI培养基中保持A431和A431K5细胞(表皮样癌)。所述A431K5细胞株是人类表皮样癌A431细胞株转染间皮素，所述转染细胞在700μg/ml G418(

Invitrogen^TM Inc.，Carlsbad，CA USA)中保持。

CMVpp65抗原表位(NLVPMVATV)特异的CTL′s由Dr Ditmar Zehn(Charitee，Berlin)提供。所述CTL′s通过与来源于健康HLA-A2阳性供体的肽脉冲的辐射的(4000rad)PBMCs孵育而扩增，并保持在AIMV培养基+8.9％ FCS+50μM-2-巯基乙醇+青霉素/链酶素1×10⁵U/L。

结果：

构建化合物A

编码单链MHC分子的结构由所述β2微球蛋白基因通过短肽连接子(15氨基酸)与所述HLA-A2基因的α1，α2和α3融合组成，所述结构与定向于间皮素的所述scFv SSl融合(图1A)。详细分析所述结构的生物化学活性和生物活性，发现该结构在体外和体内均有活性(15)。为构建融合蛋白与共价结合肽，来源于所述CMV pp65蛋白(NLVPMVATV)(SEQ ID NO：4)的9个氨基酸的肽通过20个氨基酸的连接子GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：6)与所述scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白的N端融合(图1B)。两步构建化合物A：首先通过重叠序列延伸PCR构建界定Ml/scHLA-A2/SSl(scFv)的共价融合蛋白。在该结构中，所述流行性感冒Ml 58-66肽GILGFVFTL(SEQ ID NO：21)和15个氨基酸的连接子与所述scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白的N端融合。在该结构中，通过静默突变将新的独特的限制性酶切位点(BamHI)插入所述连接子序列。在第二步，包含所述Ml/scHLA-A2/SSl(scFv)完整序列的所述PRB质粒由NdeI and BamHI限制性内切酶消化。该消化作用产生两个片段。一个片段包含所述肽和部分所述连接子序列，第二个片段包含所述质粒、部分所述连接子和所述scHLA-A2/SSl(scFv)序列。然后包含所述质粒、部分所述连接子和所述scHLA-A2/SSl(scFv)序列的所述片段粘合dsDNA引物，编码所述CMV pp65肽序列，延长连接子序列(图1B)。该新质粒转化到E-coliDH5α细胞，阳性菌落送做DNA序列分析(图2)。

化合物A的表达和纯化

在E.coli BL21细胞中表达化合物A，接着由异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside)诱导，大量的重组蛋白在细胞内的包涵体蓄积。SDS/PAGE分析分离纯化的包涵体，结果显示化合物A具有适当尺寸，组成包涵体总重量的80—90％(图3A)。该分离的可溶的包涵体在还原氧化-混洗(redox-shuffling)的缓冲液中进行体外简化和再折叠。单体的可溶的融合蛋白(化合物A)通过采用

的离子交换柱层析柱纯化。化合物A的SDS/PAGE分析显示高纯度单体分子具有期望大小为72KDa(图3B)。

化合物A的生物活性

ELISA

为检测纯化的化合物A与其靶抗原的结合能力，将所述重组体间皮素固定在酶标板。使用构象敏感的mAb W6/32监控化合物A的结合，该抗体识别与肽恰当在其槽内正确折叠的MHC分子。如图4所示，化合物A与重组体间皮素的结合具有剂量依赖性。这表示化合物A的两个功能域，所述scFv(SSl)域和所述肽/scHLA-A2域被正确折叠。此外，所述融合蛋白的scFv(SSl)域处于活性形式并能特异结合间皮素。

流式细胞计量术分析(FACS)

为了检测化合物A与表达间皮素细胞株的结合能力，采用FACS分析检测。使用HLA-A2阴性的靶细胞作为模型，因此抗HLA-A2mAb的反应性可被用于检测化合物A与在其表面表达间皮素的细胞的结合。间皮素阳性、HLA-A2-阴性细胞模型代表极端的案例，其中所述肿瘤细胞缺失表达它的HLA。因此HLA-A2阴性A431K5细胞用作FACS分析，其中该细胞是被间皮素固定转染的人类表皮样癌A431细胞。所述间皮素阴性、HLA-A2-阴性的亲代A431人类表皮样癌细胞用作阴性对照。采用抗HLA-A2mAb BB7.2作为初级抗体、FITC标记的第二抗体监控化合物A与靶细胞的结合。间皮素抗mAb Kl用于检测间皮素的表达水平。如图5A所示，A431K5细胞表达高水平的间皮素，然而亲代A431细胞不表达所述靶抗原。细胞株A431和A431K5也通过使用HLA-A2特异抗体(BB7.2)检测HLA-A2的表达，两个细胞株都是HLA-A2阴性。然而，当A431K5细胞与化合物A预孵育，它们被HLA-A2特异抗体BB7.2确实地染色(图5B)。抗原阴性A413细胞不受影响。所述化合物A与A431K5而不是A431细胞的特异结合进一步表明，所述结合特异的依赖于所述融合的靶向scFv域与间皮素之间的相互作用，和所述融合蛋白可结合它的在细胞表面天然地表达的靶抗原。

细胞毒性试验

为检测化合物A通过HLA-A2限制性CMV pp65NLVPMVATV(SEQ ID NO：4)特异性CTLs调节杀伤HLA-A2阴性间皮素阳性细胞的能力，采用S³⁵-蛋氨酸释放实验检测所述能力，细胞采用HLA-A2-阴性间皮素转染A431K5细胞和HLA-A2阴性间皮素阴性A431亲代细胞。为测定所述CMV特异性CTLs的杀伤可能性，采用细胞毒性试验检测所述杀伤可能性，细胞采用以MetS³⁵放射标记的和装载所述CMV肽NLVPMVATV的HLA-A2阳性JY细胞。通过CMV特异CTLs，JY细胞特异杀伤平均值为47％，E:T比例为10:1(数据未给出)。如图6a所示，化合物A有效地介导杀伤A431K5细胞(间皮素阳性、HLA-A2阴性)。对比肽-荷载JY细胞，特异杀伤能达到66％。因此，对比代表最适靶点的肽-脉冲的抗原递呈细胞，用所述融合蛋白杀伤甚至更有效。然而，当所述靶点A431K5细胞与所述CMV特异CTLs单独孵育时，不伴随化合物A预孵化或当靶细胞是A431间皮素阴性细胞伴随或不伴随化合物A预孵化，未观察到细胞毒性。然后，进行滴定实验检测化合物A的有效性，如图6b所示，杀伤间皮素阳性A431K5细胞是剂量依赖的，其IC50为0.5-1μg/ml。

这些结果表示杀伤间皮素阳性HLA-A2阴性A431K5细胞是特异的，并通过由化合物A的靶点域(scFv/SSl)识别间皮素及所述CMV CTLs与肽/scHLA-A2域的特异性控制。

化合物B的生物活性

流式细胞计量术分析(FACS)

为了检测化合物A与表达间皮素细胞株的结合能力，采用流式细胞计量术分析检测。使用HLA-A2阴性的靶细胞作为模型，因此抗HLA-A2mAb的反应性表明化合物B与该细胞表面抗原结合。A431K5细胞是人表皮样癌A431细胞，该人表皮样癌A431细胞被稳定地转染间皮素，且是HLA-A2阴性。所述间皮素阴性和HLA-A2阴性的亲代A431表皮样癌细胞被用作对照。采用抗HLA-A2mAb BB7.2作为初级抗体、FITC标记的第二抗体监控化合物B与靶细胞的结合。使用购买的抗间皮素mAb Kl作为阳性对照，以检测间皮素的表达水平。如图10A-B所示，A431K5细胞表达高水平间皮素，然而亲代A431细胞不表达靶抗原。细胞株A431和A431K5也通过使用HLA-A2特异抗体(BB7.2)检测HLA-A2的表达，两个细胞株都是HLA-A2阴性。然而，当A431K5细胞与化合物B预孵育，它们确实地被HLA-A2特异抗体BB7.2染色，而A431细胞对照不被染色(图10C-D)。所述化合物B与A431K5细胞而不是A431细胞的特异结合表明所述结合特异的依赖于所述靶向scFv域与间皮素之间的相互作用。

比较化合物A融合作用，为了分析化合物B的结合，在类似的条件和浓度下使用分子完成FACS分析。如图10E-F所示，当预孵化融合蛋白，仅间皮素阳性细胞A431K5被HLA-A2特异Ab确实地染色，然而，化合物A显示更好的结合。

细胞毒性试验

为检测化合物B通过HLA-A2限制性CMV NLVPMVATV(SEQ ID NO：4)特异性CTLs调节杀伤HLA-A2阴性间皮素阳性细胞的能力，采用S³⁵-蛋氨酸释放实验检测所述能力，细胞采用HLA-A2-阴性间皮素转染A431K5细胞和HLA-A2阴性间皮素阴性A431亲代细胞。为测定所述CMV特异性CTLs的杀伤可能性，采用细胞毒性试验检测所述杀伤可能性，细胞采用以MetS³⁵放射标记的和装载所述CMV肽NLVPMVATV的HLA-A2阳性JY细胞。通过CMV特异CTLs，JY细胞特异杀伤平均值为45-50％，E:T比例为10:1(数据未给出)。如图11A所示，化合物B有效地介导杀伤A431K5细胞(间皮素阳性、HLA-A2阴性)，对比肽-荷载JY细胞(-150％对比JY细胞)，特异杀伤能达到66％。然而，当所述靶点A431K5细胞与所述CMV特异CTLs单独孵育时，不伴随化合物B预孵化或当靶细胞是间皮素阴性(A431细胞)，伴随或不伴随化合物B预孵化，未观察到细胞毒性。检测所述融合蛋白有效性的滴定实验，如图11所示，表明杀伤间皮素阳性A431K5细胞是剂量依赖的。为比较化合物B和化合物A融合蛋白的细胞毒性，两者在用于共价连接所述抗原肽和所述β-2微球蛋白的肽的长度不同，在类似条件下使用两个融合蛋白完成S³⁵蛋氨酸释放试验。如图12所示，两个分子都有效地和特异地介导杀伤A431K5细胞，但不是A431细胞。当使用相对高浓度的融合蛋白(化合物B和化合物A)时，两个分子的杀伤活性相似。然而，当使用低浓度的融合蛋白时，化合物A的细胞毒性更高，很可能是由于所述更长连接子和所述MHC肽结合槽的CMV肽的更好的稳定性和定位。

MI-COV/scHLA-A2/SSl

通过重叠序列延伸PCR反应构建所述Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白，其中所述流行性感冒Ml 58-66肽和15个氨基酸的连接子GGGGSGGGGSGGGGS与所述scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白的N端融合(图13)。所述PCR产物与TA克隆载体(p-GEM，Protnega)连接，转化到E-coli DH5α细胞。选择阳性菌落，采用EcoRI和Ndel分离插入片段。连接所述插入片段与PRB表达载体，并转化到E-coli DH5α细胞。阳性菌落送做DNA序列分析(图14)。

化合物B的表达和纯化

在E.coli BL21细胞表达所述Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白，接着由异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside)诱导，大量的重组蛋白在细胞内的包涵体蓄积。SDS/PAGE分析分离纯化的包涵体，结果显示所述Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白具有适当尺寸，组成包涵体总重量的80—90％(图15A)。该分离的可溶的包涵体在还原氧化-混洗(redox-shuffling)的缓冲液中进行体外简化和再折叠。单体的可溶的融合蛋白(Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv))通过采用

的离子交换柱层析纯化。Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)的SDS/PAGE分析显示高纯度单体分子具有期望大小为72KDa(图15B)。

ELISA

为检测纯化的Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白与其靶抗原的结合能力，将所述重组体间皮素固定在酶标板。使用构象敏感的mAb W6/32监控Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白的结合，该抗体识别与肽恰当在其槽内正确折叠的MHC分子。如图16所示，所述Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白与重组体间皮素的结合具有剂量依赖性。这表示所述Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白的两个功能域、所述scFv(SSl)域和所述Ml-cov/scHLA-A2域被正确折叠。此外，所述融合蛋白的scFv(SSl)域处于激活型并能特异结合间皮素。

流式细胞计量术分析(FACS)

为了检测所述Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白与表达间皮素细胞株的结合能力，采用FACS分析检测。使用HLA-A2阴性的靶细胞作为模型，因而抗HLA-A2 mAb可被用于监控所述Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白与所述细胞表面抗原结合。因此间皮素转染A431K5细胞用于FACS分析。采用抗HLA-A2mAb BB7.2作为初级抗体、FITC标记的第二抗体监控所述Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白与所述靶细胞的结合。采用商业购买的间皮素抗mAb Kl作为阳性对照检测间皮素的表达水平。如图17A-B所示，A431K5细胞表达高水平的间皮素，然而亲代A431细胞不表达间皮素。细胞株A431和A431K5也通过使用HLA-A2特异抗体(BB7.2)检测HLA-A2的表达，两个细胞株都是HLA-A2阴性。然而，当A431K5细胞而不是A431细胞与所述Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白预孵育，它们被所述HLA-A2特异抗体BB7.2确实地染色(图17C-D)。所述Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白与A431K5细胞而不是A431细胞的特异结合表明，所述结合特异的依赖于所述靶向scFv域与间皮素之间的相互作用。

细胞毒性试验

为检测所述Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白通过HLA-A2限制性Ml58-66特异性CTLs调节杀伤HLA-A2阴性间皮素阳性细胞的能力，采用S³⁵-蛋氨酸释放实验检测所述能力，细胞采用HLA-A2-阴性间皮素转染A431K5细胞。如图18所示，Ml-cov/scHLA-A2/SSl(scFv)融合蛋白不显示介导A431K5细胞(间皮素阳性HLA-A2阴性)的溶解。然而，在其结合槽内结合有Ml 58-66肽的所述scHLA-A2/SSl(scFv)，通过所述HLA-A2限制性Ml 58-66特异CTLs介导杀伤间皮素阳性靶细胞。

讨论

本发明证实所述共价连接肽/scMHC/scFv融合蛋白靶向定位肿瘤细胞的能力可使HLA-A2阴性细胞易感于所述相关的HLA-A2限制性CTLs引起的溶解。如前面Lev等和Oved等(15，21)所说明的，该方法有两个主要的优点。第一，它采用重组体Ab片段，所述重组体Ab片段能相对高度特异地定位那些表达肿瘤标记，通常伴随所述转化表型(如生长因子和/或分化抗原)的癌细胞。第二，该方法具有能力募集特定种群的高反应性细胞毒性T细胞特异的到达所述定向的MHC肽复合物呈递的预选强抗原的肽表位。该平台方法产生多种带有许多能定位不同的肿瘤特异抗原的肿瘤特异scFv片段的分子，并具有定位多种类型的携带单一的、预选的强抗原的肽的MHC肽复合物，所述单一的、预选的强抗原的肽来源于肿瘤、病毒或细菌T细胞表位。这些实施例提出一种方法，增加一步是通过将与短连接子(20AA)连接的所述9个氨基酸肽和前述scHLA-A2/scFv融合蛋白(15AA)融合，然后，稳定在所述MHC结合槽内的肽，从而延长所述融合蛋白的总体稳定性。作为该新产生的融合蛋白的模型，本发明涉及一种所述CMVpp65衍生的(NLVPMVATV)与所述scHLA-A2/SSl(scFv)分子的N端融合的融合蛋白的结构，及其生物化学、生物学特性。结果表明所述新的融合蛋白的两个域能在体外再折叠，形成在所述HLA-A2结合槽内携带有所述肽的正确折叠的分子，和有效的能特异结合其靶抗原的靶向域(scFv)。此外，所述融合蛋白成功地通过HLA-A2限制性CTLs介导HLA-A2阴性间皮素阳性肿瘤细胞的溶解。

肿瘤的演进通常与免疫抑制因子的分泌和/或MHC I类抗原递呈功能下调有关(2)。即便特异CTL应答在患者中被证实，但由于抗肿瘤CTL种群稀少，非常罕见，且在一些情况下所述CTLs没有功能或无细胞免疫反应性，因此所述应答低(26)。此外，在肿瘤细胞表面的递呈特有肿瘤相关肽的MHC肽复合物的数量少已为大家所公认(27)。如这里所示，所述新方法解决了这些问题。首先，所述肿瘤细胞由MHC肽复合物包覆，而不依赖于它们的内生性MHC的表达。其次，应用通常为所述肿瘤表型(如生长因子受体和分化抗原)的一部分的肿瘤特异抗原，可预防那些抗原下调，并延长治疗有效性。第三也是最重要的，所述融合蛋白MHC肽复合物的效应子域能依靠包含在所述MHC结合槽内的肽而募集特定种群的CTLs。

可以正确评价的是，为清楚阐明，本发明的的一些在分开的具体实施例内容中进行描述的特征，也可单一具体实施例的组合中描述。相反地，为简洁，本发明的在单一具体实施例内容中描述的不同的特征，也可分别描述或在任一适当的亚组合中描述。虽然本发明已结合它的具体实施例进行说明，但很显然本领域内的技术人员可以有多种替换、修改和变化而实现本发明目的。因此，所有所述替换、修改和变化均落在本权利要求保护的精神和主要范围内。本发明提到的和说明书参考的所有出版物、专利和专利申请在这里整体合并，整合的程度与每个单独出版物、专利或专利申请被特别地单独地指出通过参考在这里整合的程度一样。另外，本发明的任何参考文献的引用或鉴定不应该被解释为承认所述参考文献作为本发明的现有技术。

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序列表

<110>Teva Pharmaceutical Industries，Ltd.

Teva Pharmaceuticals USA，Inc.

Technion Research and Development Foundation Ltd.

<120>Fusion Proteins，Uses Thereof And Processes For Producing Same

<130>76322-PCT/JPW/YC

<150>US 60/801,798

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Claims

1.一种融合蛋白，包括在所述蛋白质氨基端起始的连续氨基酸，对应于(i)巨细胞病毒人类MHC-限制性肽、(ii)第一肽连接子、(iii)人类β-2微球蛋白、(iv)第二肽连接子、(v)人类MHCI类分子的HLA-A2链、(vi)第三肽连接子、(vii)抗体scFv片段重链的可变区和(viii)所述scFv片段轻链的可变区存在的连续氨基酸，其中对应(vii)和(viii)的所述连续氨基酸直接通过肽键或对应于第四肽连接子的连续氨基酸连接在一起，所述scFv片段来源于与间皮素特异结合的抗体。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一肽连接子具有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：6)。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第二肽连接子具有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：8)。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第三肽连接子具有氨基酸序列ASGG(SEQ ID NO：10)。

5.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第四肽连接子具有氨基酸序列GVGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：19)。

6.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述细胞毒性人类MHC限制性肽具有氨基酸序列NLVPMVATV(SEQ ID NO：4)。

7.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述对应于(vii)的连续氨基酸序列后跟随第四肽连接子，跟随在SEQ ID NO：12中阐述的(viii)。

8.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述连续氨基酸具有在SEQ ID NO：2中阐述的氨基酸序列。

9.一种组合物，包括权利要求1-8任一项所述的融合蛋白和载体。

10.如权利要求9所述的组合物，其中所述融合蛋白以治疗有效剂量存在所述组合物中，所述载体是可药用载体。

11.一种编码融合蛋白的核苷酸结构，包括在所述蛋白氨基端起始的连续氨基酸，对应于(i)巨细胞病毒人类MHC-限制性肽、(ii)第一肽连接子、(iii)人类β-2微球蛋白、(iv)第二肽连接子、(v)人类MHC I类分子的HLA-A2链、(vi)第三肽连接子、(vii)抗体scFv片段重链的可变区和(viii)所述scFv片段轻链的可变区存在的连续氨基酸，其中对应(vii)和(viii)的所述连续氨基酸直接通过肽键或对应于第四肽连接子的连续氨基酸连接在一起，所述scFv片段来源于与间皮素特异结合的抗体。

12.如权利要求11所述的核苷酸结构具有在SEQ ID NO：1中阐述的所述核苷酸序列。

13.一种载体，包括权利要求11或12所述的核苷酸结构。

14.一种表达载体，包括权利要求11或12所述的核苷酸结构及一种与其有效连接的启动子。

15.一种转化细胞，包括权利要求14所述的载体。

16.如权利要求15所述的转化细胞，其中所述细胞是一种真核细胞，选自下列组：哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母细胞和原生动物细胞。

17.如权利要求15所述的转化细胞，其中所述细胞是细菌细胞。

18.一种细菌表达的包涵体的分离制备，包括按重量计，超过30％的权利要求1-8任一项所述的融合蛋白。

19.一种制备融合蛋白的工艺，包括培养权利要求15或16所述的转化细胞，以便表达所述融合蛋白，并回收表达的融合蛋白。

20.一种制备融合蛋白的工艺，包括培养权利要求17所述的转化细胞，以便表达所述融合蛋白，并回收表达的融合蛋白。

21.如权利要求19或20所述的工艺，其中所述融合蛋白的回收包括将所述表达的融合蛋白用分子排阻色谱柱处理。

22.如权利要求20所述的工艺，其中所述融合蛋白被表达在包涵体内。

23.如权利要求22所述的工艺，进一步包括处理所述包涵体，以便分离和再折叠所述融合蛋白，从而制备得到具有生物活性形式的所述融合蛋白。

24.如权利要求23所述的工艺，其中处理所述包涵体以从其中分离所述融合蛋白包括将所述包涵体与变性剂接触。

25.一种选择性杀伤肿瘤细胞的方法，包括将所述细胞与有效剂量的权利要求1-8任一项所述融合蛋白接触，以引起CTL介导的抗所述肿瘤细胞的免疫应答，从而杀伤所述肿瘤细胞。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述肿瘤细胞是在患者体内，并通过给所述患者施用所述融合蛋白使得所述接触有效。

27.一种治疗在其表面表达间皮素的肿瘤细胞的方法，包括将所述肿瘤细胞与有效剂量的权利要求1-8任一项所述融合蛋白接触，以引起CTL介导的抗所述肿瘤细胞的免疫应答，从而治疗所述肿瘤细胞。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述肿瘤细胞存在于实体瘤。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述实体瘤是一种与卵巢、肺、胰脏或头部/颈部癌症或间皮瘤相关的肿瘤。