CN112292601B

CN112292601B - 蛋白定量分析

Info

Publication number: CN112292601B
Application number: CN201980034937.1A
Authority: CN
Inventors: K·B·雷; P·加利利; J·L·特纳; N·卡法雷利; Y·卢
Original assignee: Sigma Aldrich Co LLC
Current assignee: Sigma Aldrich Co LLC
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2019-05-08
Publication date: 2024-07-02
Anticipated expiration: 2039-05-08
Also published as: EP3803407A1; CN112292601A; US12292448B2; WO2019226347A1; JP7165210B2; JP2021523378A; US20200378986A1

Abstract

用于检测和/或定量生物样品中的靶蛋白的方法和试剂盒。特别地，该方法包括靶蛋白的捕获和固定、蛋白变性、蛋白水解消化以及使用基于质谱法的技术的分析。

Description

蛋白定量分析

领域

本公开内容涉及用于检测和/或定量复杂生物样品中的蛋白的方法。

背景

蛋白和抗体已成为用于广泛范围的人疾病的关键治疗剂和诊断生物标记物。因此，开发稳固的生物分析测定变得越来越重要，所述生物分析测定能够定量复杂生物基质（如血清和血浆）中的蛋白。免疫亲和质谱方法对于此类测定继续得到普及。迄今为止，已有大量文献引文报告了免疫亲和质谱方法用于准确定量蛋白和抗体。然而，许多方法利用基于磁珠的形式用于免疫亲和富集，经常随后为还原和烷基化、过夜消化和消化后清除步骤。基于珠的形式受高成本限制，并且需要小心注意，以避免在洗涤步骤过程中珠的丢失以及在收集步骤过程中珠的抽吸，以防止液相色谱针和柱的堵塞。因此，需要更便宜、更快速和更灵敏的高通量分析蛋白组学测定。

概述

在本公开内容的各个方面中，提供的是用于检测和/或定量生物样品中的靶蛋白的方法。该方法包括（a）将生物样品加入至固定化抗体，以捕获靶蛋白，从而形成固定化抗体-蛋白复合物；（b）将包含有机溶剂的变性溶液加入至固定化抗体-蛋白复合物，以形成变性的固定化抗体-蛋白复合物；（c）将包含蛋白酶的消化溶液加入至变性的固定化抗体-蛋白复合物，以形成包含蛋白水解肽的溶液；并且（d）通过基于质谱法的技术来分析包含蛋白水解肽的溶液，以检测和/或定量生物样品中的靶蛋白，其中所述分析利用了在该方法的一个步骤过程中添加的至少一种内部标准蛋白或肽。

下文更详细地描述了本公开内容的其它方面和迭代。

附图简述

图1显示了使用三种不同的消化条件/方案的消化效率。方案1是不含变性方案的快速高温消化。方案2是常规的还原、烷基化和在37℃下的过夜消化。方案3是本文公开的方案，即变性和快速高温消化。

图2A呈现了使用100 μL猴血清，使用不含还原和烷基化步骤的常规方案制备的消化标准的校准曲线。

图2B显示了使用本文公开的方法和100 μL猴血清制备的消化标准的校准曲线。

图2C呈现了使用本文公开的方法和5 μL猴血清制备的消化标准的校准曲线。

图3显示了使用与快速高温消化结合的不同变性有机溶剂的消化效率。

详述

本公开内容提供了用于检测和/或定量复杂生物样品中的靶蛋白的方法。该方法利用靶蛋白的捕获和富集以及基于质谱法的分析。特别地，在升高的温度下的蛋白水解消化之前或期间，通过与有机溶剂接触，使捕获的靶蛋白变性。本文公开的方法导致完全、一致、可再现的蛋白水解消化，这对于通过质谱法的蛋白准确定量是至关重要的。结果，相对于常规的蛋白组学方法，蛋白的定量极限降低至约十分之一。

（I）用于检测/定量生物样品中的蛋白的方法

本公开内容的一个方面涵盖了用于检测和/或定量复杂生物样品中的靶蛋白的方法。该方法从捕获步骤开始，在该步骤过程中，使包含靶蛋白的生物样品与固定化捕获实体接触，所述捕获实体结合并捕获来自生物样品的靶蛋白，从而形成固定化靶蛋白。该方法的下一步是蛋白变性步骤，在该步骤过程中，使固定化靶蛋白与包含有机溶剂的变性溶液接触，以形成变性的固定化靶蛋白。该方法的第三步包括蛋白水解消化步骤，在该步骤过程中，使变性的固定化靶蛋白与包含蛋白酶的消化溶液接触，以形成包含蛋白水解肽的溶液。该方法的最后一步包括通过基于质谱法的技术，来分析包含蛋白水解肽的溶液，以检测和/或定量生物样品中的靶蛋白，其中所述分析利用了在该方法的一个步骤过程中添加的至少一种内部标准蛋白或肽。尽管下文描述的方法详述了一种靶蛋白的检测和/或定量，但所述方法可以容易地修改用于多种靶蛋白的多重检测和/或定量。

（a）步骤A - 靶蛋白捕获

本文公开的方法的第一步包括从生物样品中捕获和富集靶蛋白。该步骤包括将包含靶蛋白的生物样品加入至固定化捕获实体，其中所述固定化捕获实体识别并结合靶蛋白，从而捕获并固定靶蛋白。

（i）靶蛋白

使用本文公开的方法可以检测和/或定量各种靶蛋白。合适的靶蛋白包括但不限于抗体（例如，多克隆抗体、单克隆抗体、IgG分子、IgA分子、IgD分子、IgE分子、IgM分子、重组抗体、改造抗体、嵌合抗体等等）、抗体片段（例如，重链、轻链、Fab片段、F(ab)₂片段、Fc片段、Fab'片段、单链可变片段、以及前述任一种的融合物例如Fc融合蛋白）、抗体模拟物、生长因子、干扰素、白介素、其它细胞因子、蛋白或肽激素、凝血因子、抗凝剂、骨形态发生蛋白、溶栓剂、疫苗、酶、改造蛋白支架、融合蛋白、治疗性蛋白、诊断蛋白、前述任一种的片段、或前述任一种的衍生物。在具体实施方案中，靶蛋白可以是单克隆抗体、其片段或包含抗体片段的融合蛋白。

（ii）生物样品

可以在各种生物样品中检测和/或定量靶蛋白。一般地，生物样品包含靶蛋白、其它蛋白和/或其它生物实体（例如脂质、核酸等）的混合物。合适的生物样品的非限制性实例包括血液、血清、血浆、羊水、腹水、活组织检查提取物、活组织检查流体、骨提取物、骨髓穿刺物、乳房分泌物、支气管分泌物、细胞培养基、细胞提取物、细胞匀浆、脑脊髓液、宫颈分泌物、子宫内膜分泌物、粪便、胃肠道分泌物、血液过滤液、泪液、淋巴液、卵巢囊肿分泌物、胸膜液、预射精液（考珀液）、前列腺液、唾液、精子、精液、精浆、痰、汗、滑液、组织提取物、组织液、组织匀浆、泪、肿瘤抽吸物、肿瘤提取物、尿和阴道分泌物。在具体实施方案中，生物样品可以是血清或血浆。

生物样品可以按原样使用，或者生物样品可以在用于该方法之前进行纯化或半纯化。在一些实施方案中，生物样品可以在收集后立即使用。在其它实施方案中，生物样品可以在用于该方法之前进行贮存（例如，通过冷冻）。

一般而言，生物样品为液体形式。在一些实施方案中，生物样品可以与工作溶液混合或用工作溶液稀释，其中所述工作溶液与蛋白结合（即，靶蛋白与捕获实体的结合）相容。例如，工作溶液可以是Tris缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液或其它合适的工作溶液。

（iii）固定化捕获实体

固定化捕获实体可以是抗体或其片段、蛋白或其片段、配体或适体，其中所述捕获实体能够结合靶蛋白。在一些实施方案中，捕获实体可以是识别并结合靶蛋白的抗体或其片段。例如，捕获实体可以是结合人IgG的抗人IgG抗体。在其它实施方案中，捕获实体可以是结合靶蛋白的蛋白，例如细胞因子、生长因子、激素、凝集素、信号传导蛋白等。例如，捕获实体可以是结合阿达木单抗或英夫利昔单抗的肿瘤坏死因子α。另外的捕获实体的实例包括但不限于蛋白相互作用结构域，例如SH2、SH3、PTB、14-3-3、FHA、WW、SAM、LIM结构域、蛋白结合结构域、肽配体、小分子配体、碳水化合物配体、脂质配体、核酸配体（即适体）。

固定化捕获实体通过直接键、接头或亲和相互作用连接至固体支持物。一般而言，直接键是共价键。合适的接头包括氨基酸、肽、核苷酸、核酸、有机接头分子（例如，马来酰亚胺衍生物、N-乙氧基苄基咪唑、联苯-3,4',5-三甲酸、对氨基苄氧羰基等等）、二硫化物接头和聚合物接头（例如，PEG）。接头可以包括一个或多个间隔基团，包括但不限于亚烷基、亚烯基、亚炔基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基等等。亲和相互作用可以基于链霉抗生物素蛋白-生物素、抗生物素蛋白-生物素、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、适体、配体、胶原、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白、凝集素或金属。

各种固体支持物可以用于固定捕获实体。合适的固体支持物包括板、孔板、微孔板、珠、树脂、芯片、纤维和反应管。固体支持物可以是塑料、聚合物、包含嵌入磁性微粒的聚合物、膜（例如硝化纤维素）、玻璃、硅、碳、金、不锈钢或其它惰性金属。

在具体实施方案中，固定化捕获实体可以是附着至链霉抗生物素蛋白包被的固体表面的生物素化抗体。链霉抗生物素蛋白包被的固体表面可以是多孔塑料板的孔。

（iv）捕获步骤

将包含靶蛋白的生物样品加入至固定化捕获实体，并且允许温育一段时间，在此期间，固定化捕获实体捕获来自生物样品的靶蛋白，以形成固定化靶蛋白。一般而言，温育期范围为约30分钟至约18小时。在一些实施方案中，温育期范围可以为约0.5小时至约8小时、约1小时至4小时、或约1.5至约2.5小时。在其它实施方案中，温育期范围可以为约8小时至约18小时。温育温度范围可以为约4℃至约40℃、约10℃至约35℃、约20℃至约30℃、或约室温（即，22-25℃）。在具体实施方案中，温育可以在室温下进行约2小时。固定化捕获实体和包含靶蛋白的生物样品可以在温育期过程中通过振荡、旋转和/或涡旋进行混合。

（v）洗涤步骤

一般而言，捕获步骤随后为一个或多个洗涤步骤。为此，从固定化靶蛋白去除（通过倾析或倒转）包含未结合蛋白的生物样品，并且将一定体积的洗涤溶液加入至固定化靶蛋白。将固定化靶蛋白和洗涤溶液混合，然后去除洗涤溶液。洗涤步骤可以重复一次或多次。洗涤溶液可以与上文提到的工作溶液等同，其任选地可以进一步包含非离子型表面活性剂。合适的非离子型表面活性剂的非限制性实例包括聚山梨酸酯20和聚乙二醇叔辛基苯基醚。

（b）步骤B - 蛋白变性

该方法的下一步包括将包含有机溶剂的变性溶液加入至固定化靶蛋白，以形成变性的固定化靶蛋白。

各种有机溶剂可以包括在变性溶液中。合适的有机溶剂的非限制性实例包括甲醇、乙醇、异丙醇、三氟乙醇、乙腈、甲酰胺、二甲基甲酰胺或其组合。在一些实施方案中，有机溶剂可以是甲醇。在其它实施方案中，有机溶剂可以是乙醇。

存在于变性溶液中的有机溶剂的量的范围可以为按体积计约30%至按体积计约100%。变性溶液的余量可以是水或缓冲溶液。在各种实施方案中，存在于变性溶液中的有机溶剂的量的范围可以为按体积计约30-35%、按体积计约35-40%、按体积计约40-45%、按体积计约45-50%、按体积计约50-55%、按体积计约55-60%、按体积计约60-65%、按体积计约65-70%、按体积计约70-75%、按体积计约75-80%、按体积计约80-85%、按体积计约85-90%、按体积计约90-95%、或按体积计约95-100%。在具体实施方案中，存在于变性溶液中的有机溶剂的量的范围可以为按体积计约40%至约60%、或按体积计约45%至约55%。

允许变性步骤进行足够的时间段，在此期间使固定化靶蛋白以及任何基于蛋白的捕获实体变性。在此步骤期间，非共价相互作用被破坏，从而使蛋白解折叠并且破坏二级结构和三级结构。变性步骤的持续时间范围可以为约5分钟至约60分钟、约6分钟至约45分钟、约8分钟至约30分钟、约10分钟至约20分钟、约12分钟至约18分钟、或约14分钟至约16分钟。变性步骤的温度范围可以为约4℃至约40℃、约10℃至约35℃、约20℃至约30℃、或约室温。在具体实施方案中，温育可以在室温下进行约15分钟小时。固定化靶蛋白和包含有机溶剂的变性溶液可以在温育期过程中通过振荡、旋转和/或涡旋进行混合。

本文公开的方法缺乏在变性步骤之后的任何洗涤和/或倾析步骤。相反，包含变性的固定化靶蛋白和包含有机溶剂的变性溶液的混合物直接用于下文第（I）（c）节详述的消化步骤中。

本文公开的方法还缺乏在变性步骤和消化步骤之间的还原和/或烷基化步骤。换言之，变性的蛋白不与破坏二硫键的还原剂和/或修饰半胱氨酸残基的烷基化剂接触，以防止二硫键形成。

（c）步骤C - 蛋白消化

该方法的下一步包括将包含蛋白酶的消化溶液加入至变性的固定化靶蛋白，以形成包含蛋白水解肽的溶液。

各种蛋白酶可以存在于消化溶液中。一般而言，在本文公开的方法中利用的蛋白酶是将蛋白切割成离散数目的可预测片段的蛋白酶。此类蛋白酶包括氨肽酶M、Arg-C蛋白酶、Asp-N内肽酶、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶Y、半胱天冬酶1-10、胰凝乳蛋白酶、梭菌肽酶B、弹性蛋白酶、肠激酶、Glu-C内蛋白酶、因子Xa、谷氨酰内肽酶、粒酶B、Lys-C内肽酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、脯氨酸内肽酶、链霉蛋白酶、蛋白酶K、葡萄球菌肽酶1、嗜热菌蛋白酶、凝血酶、胰蛋白酶和V8蛋白酶。蛋白酶可以是野生型蛋白、重组蛋白或改造重组蛋白。在具体实施方案中，蛋白酶可以是胰蛋白酶，且特别是哺乳动物胰蛋白酶。可以用N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）处理胰蛋白酶，以灭活无关的胰凝乳蛋白酶活性。在具体实施方案中，胰蛋白酶可以来自猪胰腺。在其它实施方案中，胰蛋白酶可以来自牛胰腺。

消化溶液中的蛋白酶的量可以并且将取决于蛋白酶的身份而变。本领域技术人员知道如何确定蛋白酶的适当量。消化溶液可以包含缓冲液，例如Tris、HEPES、磷酸盐、碳酸氢盐或其它合适的缓冲液。在一些实施方案中，消化溶液可以进一步包含盐（例如钠盐、钾盐和/或钙盐）、螯合剂（例如EDTA等等）、和/或非离子型表面活性剂。消化缓冲液的pH范围可以为约6.5至约9.0。

允许消化步骤在约40℃至约80℃、约50℃至约70℃、或约55℃至约65℃的温度下进行。消化步骤的持续时间范围可以为约0.5小时至约8小时、约1小时至4小时、或约1.5至约2.5小时。在具体实施方案中，允许消化步骤在约60℃下进行约2小时。在温育期过程中，蛋白酶消化固定化靶蛋白，并且在周围的消化溶液中释放蛋白水解肽。

在一些实施方案中，可以通过在捕获步骤之后，将包含有机溶剂的变性溶液和包含蛋白酶的消化溶液同时加入至固定化靶蛋白，来组合变性步骤和消化步骤。可替代地，可以通过将适当量的有机溶剂和蛋白酶混合成消化溶液来制备组合的变性和消化溶液，并且可以在捕获步骤之后，将组合溶液加入至固定化靶蛋白。固定化靶蛋白和组合的变性/消化溶液在如上文详述的消化条件下温育。

在消化步骤之后，将包含蛋白水解肽的溶液直接用于基于质谱法的分析技术。包含蛋白水解肽的溶液不经受清除过程，例如固相提取。

（d）内部标准

本文公开的方法是定量的，因为在该方法的一个步骤期间添加至少一种内部标准。如本文使用的，内部标准是稳定同位素标记的蛋白或肽，其包含靶蛋白特有的至少一个肽序列。此类特有的序列被称为“替代”或“报道”肽，并且在基于质谱法的分析过程中用于定量和监测。

在一些实施方案中，内部标准是靶蛋白的稳定同位素标记的全长形式，其中所述内部标准蛋白在该方法的步骤（a）期间添加。在捕获步骤期间添加内部标准蛋白标准化整个方法中的所有处理变异。在其它实施方案中，内部标准是包含存在于靶蛋白中的通用肽序列的稳定同位素标记的蛋白。此类内部标准称为“通用”内部标准，并且在该方法的步骤（a）期间添加。在捕获步骤期间添加的内部标准也被固定化捕获实体捕获。

在另外其它实施方案中，内部标准是替代肽的稳定同位素标记的和可切割的形式。替代肽的可切割形式包含替代物序列在每个端部处连结的额外氨基酸，使得通过蛋白酶的切割产生替代肽的稳定同位素标记的形式。替代肽的可切割形式也称为“翼状”肽内部标准，并且在用步骤（c）的蛋白酶消化之前添加。

在另外的实施方案中，内部标准是替代肽的稳定同位素标记的形式。替代肽的稳定同位素标记的形式在步骤（c）的蛋白酶消化之前或之后。

（e）步骤D - 质谱分析

该方法的最后一步包括通过基于质谱法的技术来分析蛋白水解肽，以检测和/或定量生物样品中的靶蛋白。此类分析取决于用于定量和监测的一种或多种适当的替代肽的鉴定。替代肽是靶蛋白特有的，并且在质谱法中良好响应（例如，良好电离等）。通过使用常规的稳定同位素稀释方法，相对于在该方法期间添加的一种或多种稳定同位素标记的内部标准，测量一种或多种替代肽来执行定量。

合适的基于质谱法的技术包括液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）、伴有多重反应监测（MRM）的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）、伴有选择性反应监测（SRM）的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）、二维液相色谱-串联质谱法（2D-LC-MS/MS）、液相色谱-质谱法（LC-MS）、或毛细管区带电泳-电喷雾电离-串联质谱法（CZE-ESI-MS/MS）。在具体实施方案中，分析方法是伴有多重反应监测（MRM）的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）。色谱条件和质谱法设置可以并且将取决于待分析的肽而变。

通过将包含蛋白水解肽的溶液直接引入分析系统内，来分析蛋白水解肽。例如，可以将包含蛋白水解肽的溶液的等分试样注入液相色谱-质谱法系统内。分析中还包括适当的校准和质量控制标准。

本文公开的方法具有生物样品中小于约100 ng/mL的靶蛋白的定量下限（LLOQ）。在一些实施方案中，LLOQ可以是生物样品中小于约30 ng/mL、小于约10 ng/mL、小于约3ng/mL、小于约1 ng/mL、小于约0.3 ng/mL、小于约0.1 ng/mL、小于约0.03 ng/mL、或小于约0.01 ng/mL的靶蛋白。

在一些实施方案中，所测量的肽可以与使用合适的蛋白搜索引擎来自蛋白数据库的生物信息学消化的肽质量、产物离子谱或序列查询进行比较，以鉴定生物样品中的蛋白。

（II）试剂盒

本公开内容的另一个方面提供了用于检测和/或定量生物样品中的靶蛋白的试剂盒。一般而言，试剂盒可以包含变性溶液或组分，以制备如上文第（I）（b）节中所述的变性溶液，以及消化溶液或组分，以制备如上文第（I）（c）节中所述的消化溶液。试剂盒可以进一步包含针对目的靶蛋白的捕获实体（如上文第（I）（a）（iii）节中所述）。捕获实体可以连接至固体支持物，并且在试剂盒中原样提供。可替代地，捕获实体可以以自由形式，连同用于将捕获实体连接至固体支持物的手段一起提供。例如，捕获实体可以是生物素化抗体，其可以连同链霉抗生物素蛋白包被的固体支持物（例如96孔板）、或用于包被固体支持物的链霉抗生物素蛋白一起提供。试剂盒还可以含有至少一种稳定同位素标记的内部标准蛋白，如上文第（I）（d）节中所述。在另外的实施方案中，试剂盒可以进一步包含工作溶液和洗涤溶液，用于在该方法的靶蛋白捕获步骤期间使用（分别参见第（I）（a）（ii）和（I）（a）（v）节）。

本文提供的试剂盒一般包括用于捕获和检测/定量目的蛋白的说明书。试剂盒中包括的说明书可以粘贴至包装材料，或可以作为包装插页包括在内。尽管说明书通常是书面材料或印刷材料，但它们并不限于此。本公开内容考虑了能够贮存此类说明书，并且将其传达给最终用户的任何介质。此类介质包括但不限于电子贮存介质（例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片）、光学介质（例如，CD ROM）等等。如本文使用的，术语“说明书”可以包括提供说明书的互联网站的地址。

（III）应用

本文提供的方法和试剂盒具有各种用途或应用。合适应用的非限制性实例包括生物标记物的临床前验证、生物治疗测定、临床测定、诊断测定、治疗监测测定、药代动力学研究、非临床研究等等。该方法可以用于诊断、治疗、临床、工业和/或研究应用。

定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。下述参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology（1994年第2版）；The Cambridge Dictionary of Science and Technology（Walker编辑，1988）；TheGlossary of Genetics，第5版，R. Rieger等人（编辑），Springer Verlag（1991）；以及Hale& Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology（1991）。如本文使用的，除非另有说明，否则下述术语具有赋予其的含义。

当介绍本公开内容或其优选实施方案的要素时，冠词“a”、“an”、“the”和“所述”预期意指存在一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”预期是包括性的，并且意指可以存在除所列要素外的另外要素。

术语“约”，特别是提及给定数量时，意欲涵盖正或负百分之五的偏差。

术语“捕获实体”指能够结合并捕获靶蛋白的实体。

术语“蛋白”和“多肽”指通过肽键连接的氨基酸链，而不管翻译后修饰（例如，磷酸化、糖基化、乙酰化等等）如何。

由于在不脱离本发明的范围的情况下可以在上述细胞和方法中进行各种改变，因此预期上文描述和下文给出的实施例中包含的所有内容都应该解释为说明性的，而不是以限制性含义解释。

实施例

下述实施例示出了本发明的某些方面。

实施例1：蛋白水解消化的优化

为了评估几种不同的消化方案的效率，首先，执行在猴血清中的100 µL 0.64 µg/ml未标记的阿达木单抗抗体的免疫亲和富集。然后，使用三种不同的消化方案来消化抗体。

# 1 - 不含变性方案的快速高温消化。向孔1中加入190 µL 50mM碳酸氢铵消化缓冲液和10 µg胰蛋白酶。使样品在70℃下温育2小时（不执行变性）。

# 2 - 常规还原、烷基化和消化方案。向孔2中加入100 µL 10 mm三（2-羧乙基）膦盐酸盐，并且在37℃下温育30分钟。在还原后，通过加入20 µL 100mM IAA将样品烷基化，并且在RT下温育30分钟。然后，加入70 µL 50 mM碳酸氢铵消化缓冲液和10 µg胰蛋白酶，并且在37℃下温育16小时。

# 3 – 伴有变性方案的快速高温消化（即，优化方案）。向孔3中加入50 µL 50%MeOH，并且温育15分钟。然后加入136 µL 50 mM碳酸氢铵消化缓冲液、4 µL 1 M CaCl₂和10µg胰蛋白酶，并且在60℃下温育1小时。

在胰蛋白酶消化后，将总量25 ng的预消化的SIL-阿达木单抗内部标准加入每个孔中。所有样品都一式两份制备，并且经由LC-MS/MS进行分析。如图1中所示，与常规方案相比，抗体的变性（方案#3）显著改善了信号强度，并且致使样品制备更快速和简化。

使用不含还原和烷基化步骤的常规方案或优化方案来制备消化标准的校准曲线。图2A呈现了使用100 µL猴血清，使用不含还原和烷基化步骤的常规方案制备的消化标准（VVSVLTVLHQDWLNGK；SEQ ID NO：1）的校准曲线。所有%CV都不合适。图2B显示了使用优化方案和100 µL猴血清的消化标准（TTPPVLDSDGSFFLYDK；SEQ ID NO：2）的校准曲线。测定范围为0.005 - 1.28 µg/ml，具有%CV<20和±20的准确度。1.28 -12.5 µg/ml（准确度> ±20）的更高浓度中的非线性。图2C呈现了使用优化的消化方案和5 µL猴血清的消化标准（TTPPVLDSDGSFFLYDK；SEQ ID NO：2）的校准曲线。测定范围为0.1-12.5 µg/ml，具有%CV<20和±20的准确度。因此，使用优化的消化方案，用仅5 µL血清证实了0.1至12.5 µg/ml的线性定量范围，具有%CV<20（对于一式三份的样品）和±20的准确度。

实施例2. 使用各种有机溶剂的变性

在猴血清中免疫亲和富集5 µL 1.25 µg/ml未标记的阿达木单抗抗体后，在各种有机溶剂的存在下执行优化的消化方案。加入体积50 µL的50%有机溶剂（即，甲醇、乙醇、三氟乙醇（TFE）或乙腈（ACN））、150 µL碳酸氢铵消化缓冲液、5 µg胰蛋白酶。消化在60℃下执行2小时。在胰蛋白酶消化后，将预消化的SIL-阿达木单抗内部标准（25 ng）加入每个孔中。样品一式两份进行制备。一式两份样品的%CV为<5%。如图3中所示，结果证实在优化的消化方案中，所测试的有机溶剂表现与变性溶液（50% MeOH）相同。该实验在50mM Tris和50mM碳酸氢铵两者中执行，并且结果是相似的。

Claims

1.一种用于检测和/或定量生物样品中的靶蛋白的方法，所述方法包括：

a)将包含靶蛋白的生物样品加入至固定化捕获实体，以捕获靶蛋白，从而形成固定化靶蛋白；

b)将包含有机溶剂的变性溶液加入至固定化靶蛋白，以形成变性的固定化靶蛋白；

c)将包含蛋白酶的消化溶液加入至变性的固定化靶蛋白并允许消化在50℃至80℃的温度下进行，以形成包含蛋白水解肽的溶液；和

d)通过基于质谱法的技术来分析包含蛋白水解肽的溶液，以检测和/或定量生物样品中的靶蛋白，其中所述分析利用了在所述方法的一个步骤过程中添加的至少一种内部标准蛋白或肽，

其中所述方法缺乏在步骤(c)之前的还原步骤和烷基化步骤，

其中在步骤(b)处的变性溶液中的有机溶剂是甲醇、乙醇、异丙醇、三氟乙醇、乙腈、甲酰胺、二甲基甲酰胺或其组合，并且

其中所述靶蛋白是抗体、抗体片段或包含抗体片段的融合蛋白，且

其中所述至少一种内部标准蛋白或肽在步骤(a)期间添加，并且是所述靶蛋白的稳定同位素标记的形式、或包含所述靶蛋白中存在的通用肽序列的稳定同位素标记的蛋白；或其中所述至少一种内部标准蛋白或肽在步骤(c)之前添加，并且是替代肽的稳定同位素标记的和可切割的形式；或其中所述至少一种内部标准蛋白或肽在步骤(c)之前或之后添加，并且是替代肽的稳定同位素标记的形式。

2.权利要求1的方法，其中所述固定化捕获实体是蛋白、蛋白片段、配体或适体。

3.权利要求1的方法，其中所述固定化捕获实体是抗体或抗体片段。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述固定化捕获实体通过直接键、接头或亲和相互作用连接至固体支持物。

5.权利要求4的方法，其中所述亲和相互作用包括链霉抗生物素蛋白-生物素、蛋白A、蛋白G、蛋白L、适体或配体。

6.权利要求4的方法，其中所述固体支持物是孔板、珠、树脂、芯片、纤维或反应管。

7.权利要求4的方法，其中所述固体支持物是微孔板。

8.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述固定化捕获实体是附着至链霉抗生物素蛋白包被的固体支持物的生物素化抗体。

9.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述生物样品是血清或血浆。

10.权利要求1至3中任一项的方法，其中允许步骤(a)在室温下进行1小时至4小时。

11.权利要求1至3中任一项的方法，其中步骤(a)随后为至少一个洗涤步骤。

12.权利要求1至3中任一项的方法，其中在步骤(b)处的变性溶液中的有机溶剂以按体积计30％至100％存在。

13.权利要求12的方法，其中所述有机溶剂是甲醇或乙醇，并且以按体积计40％至60％存在。

14.权利要求1至3中任一项的方法，其中允许步骤(b)在室温下进行5分钟至60分钟。

15.权利要求1至3中任一项的方法，其中在步骤(c)处的消化溶液中的蛋白酶是胰蛋白酶。

16.权利要求15的方法，其中所述胰蛋白酶是哺乳动物胰蛋白酶。

17.权利要求1至3中任一项的方法，其中允许步骤(c)在50℃至70℃下进行1小时至4小时。

18.权利要求1至3中任一项的方法，其缺乏在步骤(b)和(c)之间的洗涤步骤和/或倾析步骤。

19.权利要求1至3中任一项的方法，其中通过将包含有机溶剂的变性溶液和包含蛋白酶的消化溶液同时加入至所述固定化靶蛋白，来组合步骤(b)和(c)。

20.权利要求19的方法，其中允许步骤(c)中的消化在50℃至70℃进行1小时至4小时。

21.权利要求1至3中任一项的方法，其中在步骤(d)处的基于质谱法的技术是液相色谱串联质谱法。

22.权利要求1至3中任一项的方法，其具有小于50ng/ml的定量下限。

23.权利要求22的方法，其中所述定量下限为小于10ng/ml。