CN112274577A

CN112274577A - 包含芭蕉属物种发酵物的组合物的用途及益生质组合物

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Publication number: CN112274577A
Application number: CN201910714710.3A
Authority: CN
Inventors: 林咏翔; 黄琡涵; 何政育
Original assignee: TCI Co Ltd
Current assignee: TCI Co Ltd
Priority date: 2019-07-22
Filing date: 2019-08-02
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2039-08-02
Also published as: TWI719549B; MY196168A; US20210023159A1; TW202104583A; US11478525B2; CN112274577B

Abstract

本发明涉及微生物发酵领域，特别是关于包含芭蕉属物种发酵物的组合物的用途及益生质组合物。本发明提供一种包含芭蕉属物种发酵物的组合物用于制备促进嗜黏蛋白艾克曼菌生长的益生质组合物的用途，及一种包含芭蕉属物种发酵物的益生质组合物。该益生质组合物促进肠道内嗜黏蛋白艾克曼菌的生长，并且能降低肥胖者的体重、体脂率、腰围、及臀围。

Description

包含芭蕉属物种发酵物的组合物的用途及益生质组合物

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，特别是关于包含芭蕉属物种发酵物的组合物的用途及益生质组合物。

背景技术

诸多医学研究显示肠道环境与身体正常机能的维持及疾病预防密切相关。肠道不仅是消化器官，而且驻扎大量免疫细胞以抵抗病原体由此侵入身体，并且密布神经分支以收集生理讯息反馈中枢神经，因此，肠道健康影响人体健康甚巨。最近十数年研究发现，肠道黏膜中居住着千种以上的肠道菌，它们与身体器官互相沟通并且给出适当反应，例如供应身体所需养分、调控肠道细胞发育、及诱导免疫系统发展，故肠道菌可谓是身体的一种必要器官。

肠道菌的构成细菌各有特定功用，当其组成因为不良生活习惯、疾病、使用抗生素等原因失去平衡，身体就可能失去健康。例如，若个人平日摄取高脂肪含量饮食，大肠中嗜吃脂肪的革兰氏阴性菌会大量增殖及产生脂多醣(lipopolysaccharides，LPS)，其可透过血液循环在身体各处引起慢性发炎，最终可能导致第二型糖尿病、心血管疾病、甚至神经退化疾病与癌症等慢性病。亦有研究显示，肠道菌组成被破坏的小鼠在压力情境下的记忆力衰退。因此，维持肠道菌的组成恒定有助于维持身心健康。

目前已知有益人体健康的肠道菌除了双歧杆菌属(Bifidobacterium)与乳酸杆菌属(Lactobacillus)细菌，嗜黏蛋白艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)亦是极具潜力的益生菌。该菌占成人肠道菌的1％至4％，是一种生长在大肠的绝对厌氧革兰氏阴性菌，可利用黏蛋白(mucin)作为唯一营养来源。艾克曼菌被报道为与醣类、脂肪代谢及肠道免疫相关。有研究发现艾克曼菌可分解黏蛋白及产生短链脂肪酸(如乙酸)以提供肠道杯状细胞(goblet cells)所需的能量，从而促进黏蛋白生成及增加肠道黏液层厚度。此外，艾克曼菌的外膜蛋白Amuc-1100被发现能活化肠道上皮细胞中类铎受体2(Toll-like receptor 2，TLR2)介导的细胞内讯号，进而促进肠道上皮细胞增生。该些艾克曼菌的作用皆有助于维持肠道屏障(gut barrier)完整性，因此能减少肠道中的有害物质进入血液，达到降低发炎反应的目的。另有研究发现，施用艾克曼菌的高脂饮食小鼠有较低的血液中脂多醣浓度，并且表现出胰岛素抗性的改善与脂肪堆积下降。

鉴于艾克曼菌对维持肠道健全乃至于身心健康的重要性，开发一种促进肠道内艾克曼菌生长的益生质组合物，实有其必要。

发明内容

缘此，本发明的一目的在提供一种包含芭蕉属物种发酵物的组合物用于制备促进嗜黏蛋白艾克曼菌生长的益生质组合物的用途。

在本发明的一实施例中，该芭蕉属物种发酵物是一芭蕉属物种果肉与水的混合物经过一嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)及一酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的前发酵，再经过一醋酸杆菌(Acetobacter aceti)的后发酵而获得。

在本发明的一实施例中，该芭蕉属物种果肉与水的混合物是芭蕉属物种果肉与水以1∶1至1∶20的重量比混合而得；该嗜热链球菌及该酿酒酵母在前发酵中的接种量分别为0.1％至0.4％(w/v)及0.2％至0.5％(w/v)，且该醋酸杆菌在后发酵中的接种量为2％至5％(w/v)。

在本发明的一实施例中，该包含芭蕉属物种发酵物的组合物进一步包含一寡糖，该寡糖是选自于木寡糖、异麦芽寡糖、及其组合。前述组合物可进一步包含一糖醇；该糖醇包括山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、及其任意组合。

在本发明的一较佳实施例中，该包含芭蕉属物种发酵物的组合物进一步包含木寡糖及乳醣醇，且该芭蕉属物种发酵物、该木寡糖、及该乳糖醇的重量比范围为3～5∶2～4∶2～4。在一最佳实施例中，该芭蕉属物种发酵物、该木寡糖、及该乳糖醇的重量比为4∶3∶3。

本发明的又一目的在提供一种促进嗜黏蛋白艾克曼菌生长的益生质组合物，包含一芭蕉属物种发酵物、一寡糖、及一糖醇，其中该寡糖是选自于木寡糖、异麦芽寡糖、及其组合。

本发明的又一目的在提供一种前述益生质组合物用于制备减少腰围的医药组合物的用途。

在本发明的一实施例中，该益生质组合物增加肥胖受试者肠道内嗜黏蛋白艾克曼菌的数量，并且降低肥胖受试者的体重、全身或躯干体脂率、腰围、及臀围。

本发明揭露有利于嗜黏蛋白艾克曼菌生长的多种益生质及其组合。该益生质组合可用于制备有效促进嗜黏蛋白艾克曼菌生长的益生质组合物，例如用作体外细菌培养的培养基添加物，或用作促进活体(如人体)肠道内嗜黏蛋白艾克曼菌增殖的益生质产品。该益生质组合物可具有粉末、颗粒、溶液、或胶囊的剂型，且可制成食品、饮品、医药品、或营养补充剂，藉由口服方式给予一个体。

由于维持人体肠道内嗜黏蛋白艾克曼菌的适当数量可以减少慢性发炎、改善醣类代谢、及抑制脂肪堆积，本发明的益生质组合物因促进嗜黏蛋白艾克曼菌的生长而具备缓解或预防代谢疾病(如糖尿病)、心血管疾病(如动脉粥样硬化)、及老化相关疾病(如失智症)的潜力。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明的发明特点及应用，而非以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1显示嗜黏蛋白艾克曼菌在含有或不含单一候选益生质的培养基中，经过厌氧培养48小时的相对菌数柱形图；

图2显示嗜黏蛋白艾克曼菌在含有或不含指定益生质组合物的培养基中，经过厌氧培养48小时后的相对菌数柱形图；

图3A显示受试者服用本发明一实施例的益生质组合物四周后，肠道内嗜黏蛋白艾克曼菌占比增加或未增加者的比例图；

图3B显示图3A中肠道内嗜黏蛋白艾克曼菌占比增加者的肠道内嗜黏蛋白艾克曼菌相对菌数柱形图；

图4显示受试者服用本发明一实施例的益生质组合物四周后的体重变化柱形图；

图5显示受试者服用本发明一实施例的益生质组合物四周后的全身体脂率变化柱形图；

图6显示受试者服用本发明一实施例的益生质组合物四周后的躯干体脂率变化柱形图；

图7显示受试者服用本发明一实施例的益生质组合物四周后的腰围变化柱形图；

图8显示受试者服用本发明一实施例的益生质组合物四周后的臀围变化柱形图。

具体实施方式

本发明提供一种包含芭蕉属物种发酵物的组合物用于制备促进嗜黏蛋白艾克曼菌生长的益生质组合物的用途。除了芭蕉属物种发酵物，该益生质组合物可进一步包含一选自于木寡糖、异麦芽寡糖、及其组合的寡糖，以及一糖醇，例如山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、及木糖醇。该益生质组合物较佳为包含芭蕉属物种发酵物、木寡糖、及乳糖醇，且其重量比范围较佳为3～5∶2～4∶2～4。以下实施例显示该益生质组合物中各组成物质及其组合对嗜黏蛋白艾克曼菌的生长促进效果，亦显示该益生质组合物能降低肥胖受试者的体重、全身或躯干体脂率、腰围、及臀围。

定义

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

本发明内使用的菌株均为现有菌株，可通过购买获得。

本文中所谓「芭蕉属物种」是指属于芭蕉属(Musa spp.)的所有物种，包括香蕉(Musa paradisiaca，又名大蕉)、小果野蕉(Musa acuminata)、及野蕉(Musa balbisiana)。

本文中所谓「木寡糖」是指包含3至10个木糖(xylose)单元的寡糖，其来源可为植物，或经微生物发酵、酵素转化、或化学合成等方式而制得。

材料与方法

芭蕉属物种发酵物的制备

芭蕉属物种富含酚类及果胶，对芭蕉属物种进行发酵将获得一组成分子更丰富的发酵物。

本文中实施例1-3所用芭蕉属物种发酵物是一香蕉发酵物，其制备方法简述如下。首先，将香蕉果肉与水依重量比1∶1至1∶20，较佳为1∶1至1∶5混合，以作为空培液。该空培液以巴斯德灭菌法处理后，接种一嗜热链球菌及一酿酒酵母，并于29至31℃进行前发酵72小时，其中该嗜热链球菌及该酿酒酵母的接种量分别为0.1％至0.4％(w/v)及0.2％至0.5％(w/v)。其后，该前发酵液再接种0.5％至1％(w/v)的醋酸杆菌，并于29至31℃进行后发酵21天，即可获得该香蕉发酵物。该香蕉发酵物可藉由如减压干燥、喷雾干燥等干燥方式制成一粉末状产物。

在一实施例中，该嗜热链球菌是自食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)取得的嗜热链球菌BCRC 910636菌株(中国台湾专利I519644专利寄存)。在另一实施例中，该酿酒酵母是自BCRC取得的酿酒酵母BCRC 21494菌株。在又一实施例中，该醋酸杆菌是自BCRC取得的醋酸杆菌BCRC 12324菌株或BCRC 11688菌株。

寡糖、多糖及糖醇

本文中实施例所用寡糖包括木寡糖(购自山东龙力生物科技股份有限公司)、异麦芽寡糖(购自山东百龙创园生物科技股份有限公司)、及果寡糖(购自MEIJI CO.，Ltd.)。所用多糖包括菊糖(购自Cosucra Groupe Warcoing SA)。所用醣醇包括乳糖醇(购自宏伟生物科技股份有限公司)、山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、及木糖醇。

细菌培养

以下实施例使用购自食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)的嗜黏蛋白艾克曼菌(Akkermansia muciniphila，BCRC 81048)。该细菌于解冻及活化后，在37℃与厌氧条件(10％二氧化碳、10％氢气、及80％氮气)下依3％的种菌接种量预培养于BHI培养基(15g脑心灌注肉汤(BD Difco Brain Heart Infusion broth；Thermo Fischer Scientific)，溶于1L去离子水，pH值约7.0)48小时，再用于益生质试验。

肠道菌数定量

采集受试者粪便，并利用粪便基因组DNA萃取套组(Stool Genomic DNAExtraction kit；图尔思生物科技公司)依厂商使用说明获得粪便基因组DNA萃取样本，其DNA浓度以Nanodrop分光亮度计(Thermo Fisher Scientific)测定。其后，基于定量聚合酶链锁反应(quantitative polymerase chain reaction，简称qPCR)测定该样本中各目标细菌的DNA含量。简言之，藉由目标细菌代表性序列及16S核糖体RNA(16S rRNA)基因的核酸引物对(表1)，利用qPCR套组(KAPA CYBR FAST qPCR Kit(2X)；KAPA Biosystems)在PCR反应仪(Step One Plus Real-Time PCR system；Applied Biosystems)对前述样本DNA进行qPCR，以取得各细菌代表性序列及16S rRNA基因的循环阈值(CT)，其差值可用于依2^-ΔCT公式计算倍数变化(fold change)。重复试验所得特定细菌代表性序列的倍数变化平均值相对于各细菌其值总和的百分比即为该菌在肠道内占比的估计值。

表1

实施例1

嗜黏蛋白艾克曼菌的益生质试验

为辨识有益于嗜黏蛋白艾克曼菌生长的营养物质，将预培养的嗜黏蛋白艾克曼菌依3％的接种量加入含有1％(w/w)候选益生质的BHI培养基，于37℃与厌氧条件下培养48小时，再将所得菌液涂布于BHI琼脂培养基并培养72小时以估计菌数。该候选益生质为木寡糖、异麦芽寡糖、乳糖醇、菊糖、果寡糖、或一香蕉发酵物。作为对照，另外将嗜黏蛋白艾克曼菌培养于不合候选益生质的BHI培养基(空白对照组)。

图1显示前述各种候选益生质对嗜黏蛋白艾克曼菌生长的影响，将空白对照组的菌数定义为100％。依据图1，相比空白对照组，使菌数有明显提升的益生质包括香蕉发酵物、木寡糖、异麦芽寡糖、及乳糖醇，其分别提升相对菌数至约283％、266％、276％、及258％。相对地，习知可促进乳酸杆菌生长的菊糖或可促进双歧杆菌生长的果寡糖无法显著提升嗜黏蛋白艾克曼菌的生长而使相对菌数保持在约110％(数据未显示)。此结果说明香蕉发酵物、木寡糖、异麦芽寡糖、及乳糖醇任一者皆可用作嗜黏蛋白艾克曼菌益生质，但并非任何有利乳酸杆菌生长的益生质(如果寡糖及菊糖)便可有效促进嗜黏蛋白艾克曼菌生长。

实施例2

促进嗜黏蛋白艾克曼菌生长的益生质组合物

为评估前述嗜黏蛋白艾克曼菌益生质的不同组合对嗜黏蛋白艾克曼菌生长的促进作用，将预培养的嗜黏蛋白艾克曼菌依3％的接种量加入含有不同益生质组合物的BHI培养基，于37℃与厌氧条件下培养48小时，再将所得菌液涂布于BHI琼脂培养基并培养72小时培养以估计菌数。各BHI培养基中的益生质组合物具有下列组成：(a)0.25％香蕉发酵物、0.25％异麦芽寡糖、0.25％木寡糖、及0.25％乳糖醇；(b)0.4％香蕉发酵物、0.3％木寡糖、及0.3％乳糖醇；(c)0.4％香蕉发酵物、0.3％异麦芽寡糖、及0.3％乳糖醇；或(d)0.4％香蕉发酵物、0.3％异麦芽寡糖、及0.3％木寡糖。作为对照，另外将嗜黏蛋白艾克曼菌培养于不含益生质的BHI培养基(空白对照组)。

图2显示前述益生质组合对嗜黏蛋白艾克曼菌生长的影响，将空白对照组的菌数定义为100％。依据图2，相比空白对照组，益生质组合物(a)、(b)、(c)、或(d)的添加显著提升嗜黏蛋白艾克曼菌的相对菌数至分别约为289％、331％、298％、及294％，且以香蕉发酵物、木寡糖、及乳糖醇的组合在重量比为3～5∶2～4∶2～4的情况下，能最有效促进嗜黏蛋白艾克曼菌的生长，即便乳醣醇在图1所示的促生长效果最低。

实施例3

益生质组合物的生理效果

本实施例探讨连续服用一含有200mg香蕉发酵物、150mg木寡糖、及150mg乳糖醇的益生质组合物胶囊对肥胖受试者的生理影响。使七位20至55岁肥胖受试者(包括男性及女性)连续四周在每日午餐后口服该益生质组合物，剂量为500mg/人/天，并于服用前及服用四周后评估该些受试者肠道内嗜黏蛋白艾克曼菌的占比，及以体组成计(TANITA BC-601FS)测量体重、全身体脂率、躯干体脂率、腰围、与臀围。所谓肥胖受试者具备以下条件：身体质量指数(BMI)大于24；男性全身体脂率大于25％，女性全身体脂率大于30％。

依据图3A及3B，服用该益生质组合物四周后，85.7％的受试者被发现肠道内嗜黏蛋白艾克曼菌的占比显著增加，且该菌菌数相对于服用前增加约80％。此结果证明本发明的益生质组合物可促进活体肠道内嗜黏蛋白艾克曼菌的生长。

依据图4至图8，相比服用前，持续四周服用益生质组合物使平均体重减少约0.39公斤，使全身体脂率平均值下降约0.4％，使躯干体脂率平均值显著下降约0.5％，使平均腰围显著减少约1.8公分，以及使平均臀围显著减少约0.5公分。此结果证实长期使用本发明的益生质组合物可改善肥胖者的体况。

综上所述，本发明揭露有利于嗜黏蛋白艾克曼菌生长的多种益生质及其组合。该益生质组合可用于制备促进嗜黏蛋白艾克曼菌生长的益生质组合物，例如用于体外细菌培养的培养基添加物，或用于促进人体肠道内嗜黏蛋白艾克曼菌增殖的益生质产品。该益生质组合物可具有粉末、颗粒、溶液、或胶囊的剂型，且可制成食品、饮品、医药品、或营养补充剂，藉由口服方式给予一个体。