CN112266907B - 齐整小核菌内源小核菌胶水解酶及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了齐整小核菌内源小核菌胶水解酶及应用，属于酶工程技术领域。本发明从齐整小核菌中挖掘出14个潜在的β‑葡聚糖酶基因，在毕赤酵母中对潜在的水解酶基因进行异源表达并进行功能验证，筛选获得了对小核菌胶具有正向水解效果的小核菌胶水解酶及其编码基因。该小核菌胶水解酶能够在pH 6.0的条件下对小核菌胶进行水解，使数均分子量由2.748×10⁷Da降低至1.923×10⁷Da，克服小核菌胶三维结构的束缚直接对糖苷键进行切割。

Description

齐整小核菌内源小核菌胶水解酶及应用

技术领域

本发明涉及齐整小核菌内源小核菌胶水解酶及应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

小核菌胶(又称硬葡聚糖，Scleroglucan)是一种非离子型的水溶性微生物胞外多糖，由β-D-1,3吡喃葡萄糖和β-D-1,6吡喃葡萄糖残基交替连接而成，平均每3个β-1,3糖苷键连接的主链单元连接1个β-1,6糖苷键的侧链。这种重复单元结构使小核菌胶分支度达0.33左右。小核菌胶除了具有大多数β-1,3葡聚糖共有的生物活性特征外，高分支化频率使其具有高水溶性特点。由于独特的化学结构和高分子量特性，小核菌胶具有良好的水溶性、假塑性、保湿性、耐盐性和粘度稳定性，广泛应用于食品、生物医药、石油化工和化妆品等行业。

目前，小核菌胶主要以微生物发酵的方式生产。齐整小核菌Sclerotium rolfsii是最主要的生产菌株，其可以利用葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖和糖蜜等进行发酵生产。针对齐整小核菌生产小核菌胶的研究主要集中在提高小核菌胶产量和产率等方面。小菌核属真菌发酵法生产的小核菌胶分子量较高，从而导致其溶解性、流动性、分散性较差，为其工业应用带来困难。小核菌胶的活性通常与粘度及分子量密切有关，分子量过大时水溶性差，分子量过低则会使小核菌胶失去生理活性。如何选择合适的降解方法对小核菌胶进行改性，获得理想的分子量，在保持活性的基础上提高其水溶性，从而扩大其工业应用是目前亟待解决的问题。

已有研究表明，将来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和嗜碱拟诺卡氏菌(Alkaliphilic nocardiopsis)的β-1,3葡聚糖酶基因BGLM、PGLA、EXG1和BGLF在大肠杆菌和毕赤酵母中的重组表达，经4个酶粗酶液处理过后对小核菌胶几乎没有水解作用。另外，小核菌胶在水中溶解会形成刚性的三重螺旋结构，侧链的葡萄糖基均匀分布于螺旋结构的外侧，通过静电力作用防止螺旋聚集，这样既可以稳定多糖结构，同时还能降低小核菌胶的胶凝能力。三重螺旋结构对热非常稳定，只有当分散在二甲亚砜(DMSO)中或在pH值大于12.5时，小核菌胶才可溶解形成无规则卷曲的单链结构。小核菌胶的这种三维结构使糖苷连接键被包裹，大大影响了葡聚糖水解酶的结合和水解作用效率，前期研究发现，常规β-葡聚糖酶都不能起到水解小核菌胶从而改善其分子量的效果。因此，筛选具有小核菌胶降解能力的水解酶对于制备低分子量的小核菌胶具有重要的意义。

发明内容

本发明从保藏编号为CCTCC NO：M2017646的齐整小核菌WSH-G01中筛选获得了具有小核菌胶水解能力的小核菌胶水解酶及编码该酶的基因，为小分子量小核菌胶的大规模生产提供了研究基础。

本发明的第一个目的是提供一种小核菌胶水解酶，含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述小核菌胶水解酶的基因。

在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的表达载体。

在一种实施方式中，所述表达载体为pPIC9K。

本发明的第四个目的是提供表达所述小核菌胶水解酶的重组微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物为毕赤酵母。

在一种实施方式中，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。

本发明还要求保护所述小核菌胶水解酶在制备低分子量小核菌胶方面的应用。

本发明还提供一种水解小核菌胶的方法，是将所述小核菌胶水解酶加入至含小核菌胶的体系中，于28～30℃反应至少2h。

本发明还提供含有所述小核菌胶水解酶的酶制剂。

本发明还提供所述小核菌胶水解酶在食品、生物医药、石油化工和化妆品领域的应用。

在一种实施方式中，所述应用包括但不限于制备多糖、药物或日化产品。

有益效果：本发明从齐整小核菌中挖掘出14个潜在的β-葡聚糖酶基因，在毕赤酵母中对成功扩增的10个潜在的水解酶基因进行异源表达并进行功能验证，筛选获得了对小核菌胶具有正向水解效果的小核菌胶水解酶及其编码基因。该小核菌胶水解酶在毕赤酵母中表达的β-1,3-葡聚糖酶酶活达8.64U/mL，能够对小核菌胶进行正向水解，使数均分子量由2.748×10⁷Da降低至1.923×10⁷Da，表明在酸性条件(pH 6左右)下该酶能克服小核菌胶三维结构的束缚直接对糖苷键进行切割。

附图说明

图1齐整小核菌WSH-G01的进化树分析；

图2两种产酶培养基体系中的胞外酶活；

图3差异基因GO富集和KEGG数据库富集；

图4目标多糖水解酶的SDS-PAGE凝胶图；1,pPIC9K；2,GME9629_g；3,GME9263_g；4,GME2879_g；5,GME10818_g；6,GME8597_g；7,GME7035_g；8,GME9860_g；9,GME3016_g；10,GME9076_g；11,GME2686_g；

图5内源β-1,3-葡聚糖酶对小核菌胶分子量的影响；1,GME7035；2,GME2686；3,GME9076；4,GME9263；5,GME9860；6,2g/L小核菌胶。

具体实施方式

(1)菌株与质粒

齐整小核菌WSH-G01为发明人所在课题组筛选获得，现保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017646，并于公开号为CN108441429B的专利中公开。

大肠杆菌Escherichia coli JM109为商业化菌株，用于重组酶表达时质粒的复制。

毕赤酵母GS115为商业化菌株，用于重组酶的表达与发酵，

质粒pPIC9K为商业化质粒，用于毕赤酵母中蛋白的分泌表达。

(2)培养基

齐整小核菌种子培养基(g/L)：葡萄糖30.0，KH₂PO₄ 1.0，NaNO₃ 3.0，酵母粉1.0，KCl 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.5，pH 4.0。

齐整小核菌发酵培养基(g/L)：葡萄糖55.0，KH₂PO₄ 1.0，NaNO₃ 3.0，酵母粉0.5，KCl 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.5，柠檬酸1.5，pH 4.0。

毕赤酵母MD培养基(1L)：琼脂20g，10×YNB溶液100mL(YNB溶液终浓度为13.4g/L)，10×葡萄糖溶液100mL(葡萄糖终浓度为20g/L)，500×生物素2mL(生物素终浓度为4×10^-4g/L)。

毕赤酵母诱导表达BMGY培养基(1L)：酵母提取物10g，蛋白胨20g，K₂HPO₄ 3g，KH₂PO₄ 11.8g，10×YNB溶液100mL(YNB溶液终浓度为13.4g/L)，500×生物素1mL(生物素终浓度为4×10^-4g/L)，甘油10mL。

毕赤酵母诱导表达BMMY培养基(1L)：酵母提取物10g，蛋白胨20g，K₂HPO₄ 3g，KH₂PO₄ 11.8g，100×YNB溶液100mL(YNB溶液终浓度为13.4g/L)，500×生物素1mL(生物素终浓度为4×10^-4g/L)，甲醇5mL。

(3)主要试剂

柱式RNA快速抽提试剂盒、柱式质粒小量提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒、T4 DNA连接酶及所有限制性内切酶、卡纳抗生素、氨苄抗生素和G418硫酸盐等购于生工生物工程(上海)股份有限公司。其他化学试剂均购自上海国药集团。

(4)检测方法

β-葡聚糖酶粗酶液酶活的检测：量取一定发酵液，4℃、4 000r/min离心10min，收集上清液，即粗酶液。1mL反应液含粗酶液500μL、0.5％昆布多糖500μL和20mmol HAc-NaAc缓冲液(pH 6.0)，30℃水浴30min，加入1mL DNS溶液终止反应，100℃加热5min，冷却至室温，取上清测定OD₅₄₀，以灭活的酶作为对照计算酶活力。1个酶活力单位定义为在反应条件下每分钟释放1.0μmol还原糖(以葡萄糖为标准)所需要的酶量。

齐整小核菌菌体干重和粗多糖的提取及产量测定见参考文献Liu L,Zang YJ,XuCZ,et al.A modified CTAB method for isolating genome DNA from fungus withabundant polysaccharose.Chin Biotechnol,2014,34(5):75–79。

重组蛋白SDS-PAGE检测：取1mL重组蛋白发酵液，12 000r/min离心5min，去上清，加入适量蒸馏水使菌液OD₆₀₀为5.0左右，超声破碎，取30μL蛋白破碎液与10μL上样缓冲液混合，99℃加热15min。使用10％的Bis-Tris Protein Gels与MES缓冲液进行电泳，电压120V。

实施例1齐整小核菌WSH-G01中多糖降解酶基因分析

1、齐整小核菌培养

挑取齐整小核菌WSH-G01的单个菌核接种于PDA平板，30℃静置培养4d至长出丰富菌丝。刮取1cm²的菌丝接种于装有50mL小核菌种子培养基的250mL摇瓶中，28℃、220r/min条件下培养72h获得一级种子液。将一级种子液以5％的接种量转接至装有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，30℃、220r/min条件下培养72h获得二级种子液。将二级种子液以5％的接种量接种至发酵培养基中发酵。

2、齐整小核菌基因组提取

将菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)活化4d，刮取新鲜菌丝转接至覆盖有玻璃纸的PDA培养基，5d后刮取玻璃纸上的新鲜菌丝进行DNA提取。由于齐整小核菌产生大量胞外多糖，DNA提取较困难，本实验参考刘丽等改良的十六烷基三甲基溴化铵法(Cetyltrimethylammonium ammonium bromide,CTAB)进行DNA提取。

3、齐整小核菌基因分析

选取步骤2提取获得的浓度范围在50–150μg/μL之间，OD₂₆₀/OD₂₈₀范围在1.8–2.0之间的DNA样品进行基因组测序。利用PacBio平台进行全基因组测序，结合Illumina平台测序结果进行基因组拼接，获得大小为38Mb的齐整小核菌WSH-G01基因组，包括116个Contigs和42个Scaffolds，GC含量为46.51％。基于获得的全基因组序列，根据NCBI检索与数据处理，分析出了齐整小核菌WSH-G01与其他典型白腐菌的近源关系(图1)。

对比典型的具有多糖降解活性的白腐菌，发现齐整小核菌WSH-G01与裂褶菌Schizophyllum commune和灰盖鬼伞菌Coprinopsis cinerea okayama亲缘关系较近，裂褶菌产生的胞外多糖在结构上与小核菌胶高度相似。对菌株WSH-G01葡聚糖降解酶相关基因进行功能注释后，发现其拥有与葡聚糖降解酶相关的基因200个，包括碳水化合物结合域(Carbohydrate-binding modules)家族基因68个、碳水化合物酯酶(Carbohydrateesterase)基因14个、糖苷水解酶(Glycoside hydrolase)基因82个、糖苷转移酶(Glycosyltransferase)基因30个、糖苷裂解酶(Polysaccharide lyase)基因6个(表1)。结果表明齐整小核菌WSH-G01具有小核菌胶降解潜力。

表1齐整小核菌WSH-G01多糖降解酶基因分布

实施例2齐整小核菌WSH-G01在不同产酶体系下的酶活分析

设计表2所示的两种不同的齐整小核菌的培养体系，将按照实施例1步骤1培养的齐整小核菌WSH-G01种子液分别以5％的接种量接种至高产酶体系和低产酶体系中，在相同的环境下(30℃)培养。

表2不同产酶培养体系

检测发酵过程β-葡聚糖酶活性发现，在保证不同培养体系中生物量相同的前提下，培养至3d时，胞外β-葡聚糖水解酶的酶活差异显著，低产酶培养体系中几乎未检测出酶活，高产培养体系中β-葡聚糖酶酶活达8.62U/mL(图2)。表明在高产酶培养体系中，菌体在以多糖为唯一碳源时易被诱导表达多糖水解酶以获得足够的能源物质。两种产酶活性具有明显差异的培养体系的设计为小核菌胶水解酶基因挖掘提供了理论依据。

实施例3在两种产酶体系中齐整小核菌WSH-G01的转录组测序及分析

选取实施例2培养3d时产酶差异显著的高酶活(HE)与低酶活(LE)样本，分别提取总RNA并构建原始cDNA文库。

齐整小核菌RNA提取：参照生工生物工程(上海)股份有限公司柱式RNA提取试剂盒的提取方法进行提取。

齐整小核菌cDNA文库的构建：以高质量的齐整小核菌WSH-G01 RNA为模板，参照TaKaRa公司的反转录试剂盒的方法进行反转录操作。

测序并对数据进行优化，以得到的基因组为参照进行序列分析，HE和LE样本的比对率分别达69.28％和70.95％。通过比对HE和LE样本的基因表达水平差异性，最终从9 086个基因中，筛选出2 584个具有显著差异的基因(P<0.01&|log₂FC|≥1)，其中显著上调表达基因1 054个，显著下调表达基因1 530个。

应用GO富集对获得的2 584个显著差异基因进行功能注释，获得GO富集词条32个。由图3A可知，具有最显著富集差异的基因具有分子活性功能，富集率最高的两类基因具有分子催化功能与分子结合功能。葡聚糖水解酶通常在结构上同时具备糖苷键水解的催化活性以及底物结合活性，这两类基因的显著差异富集说明两种不同培养体系的样本中具有差异表达的小核菌胶水解酶基因。应用KEGG进行分析，发现差异基因富集到KEGG的Pathway共130条，显著富集的有21条，其中最显著富集的代谢途径为碳水化合物代谢途径(图3B)。说明不同培养体系中齐整小核菌WSH-G01碳源代谢途径发生改变，可能是HE样品中的菌丝产生了更多的小核菌胶水解酶所引起的。

表3齐整小核菌WSH-G01中预测的内源小核菌胶水解酶基因

注：FPKM,Fragments Per Kilobase per Million。

基于齐整小核菌WSH-G01转录组测序结果，对比基因组多数据库的基因注释以及两种产酶条件下的转录组差异性分析，从转录组数据中分析得到的具有显著差异的2 584个基因中，挖掘出了14个疑似的小核菌胶糖苷水解酶基因，包括1个外切葡聚糖酶(Exo-glucanase)基因和13个内切葡聚糖酶(Endo-glucanase)基因(表3)。

实施例4小核菌胶水解酶在毕赤酵母中重组表达

提取高产酶培养体系中菌株的总RNA，利用反转录酶构建cDNA文库。根据预测获得的14个水解酶的CDS序列，设计引物扩增14个水解酶的基因片段，成功扩增出10个基因片段(分别如SQE ID NO.2～11所示)。将得到的10个片段DNA同源重组至毕赤酵母表达载体pPIC9K，重组载体线性化后，电转化法转化毕赤酵母GS115。

毕赤酵母的转化及转化子筛选：将含有目标多糖水解酶基因的毕赤酵母表达载体pPIC9K线性化，采用电转化方式转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，在MD平板上进行筛选，30℃培养3d。将生长良好的单菌落挑选至最高2mg/mL G418的YPD平板进行筛选，筛选抗高浓度G418的His⁺转化子，再经Mut⁺型筛选后，PCR验证阳性转化子。

挑取阳性转化子接种于装有2mL YPD培养基的试管中，30℃、220r/min培养24h，以2％接种量转接至含50mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，30℃、220r/min培养至OD₆₀₀＝2–6，离心收集菌体，生理盐水洗涤两次后，全部接入至含50mL BMMY培养基的250mL摇瓶中，30℃、220r/min培养，每24h向培养基中添加甲醇至终浓度为0.5％，取样、离心，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和蛋白最佳收获时间，用SDS-PAGE及活性实验检测并鉴定重组蛋白的表达。

结果如图4所示，共获得10个具有表达能力的重组菌株。将所有获得的胞外表达蛋白以昆布多糖为底物进行水解酶活性的测定，发现10个可溶表达的重组酶中有5个具有昆布多糖水解活性，均为β-1,3-葡聚糖酶，根据其基因序列分别翻译获得氨基酸序列，如表4所示。

表4潜在的内源小核菌胶水解酶对昆布多糖水解活性

N.A表示未检测到酶。

实施例5齐整小核菌内源水解酶对小核菌胶的水解

利用实施例4制备的5个具有昆布多糖水解活性的内源葡聚糖酶对小核菌胶进行水解，具体步骤为：1mL反应液含粗酶液500μL和500μL小核菌胶，反应体系初始pH＝6，30℃水浴6h，100℃沸水浴5min灭活，以灭活酶作对照，用高效液相色谱(HPGPC)测定多糖分子量。利用Shodex SB-806M HQ凝胶色谱柱检测，检测条件为：示差检测器，流动相0.1mol/LNaNO₃溶液，流速0.6mL/min，柱温40℃，进样量50μL。

结果如图5所示。水解酶GME9860对小核菌胶水解后，小核菌胶的平均分子量有一定降低，出峰时间由10.382min推迟至11.036min，数均分子量由2.748×10⁷Da降低至1.923×10⁷Da，而其他4个水解酶(SEQ ID NO.12～15所示)对小核菌胶没有降解作用。此外，SEQID NO.1所示的GME9860酶水解后的小核菌胶的分散度较处理前更高，表明酶反应体系中发生了高分子量多糖的降解和部分低分子量多糖的产生，使得多糖的分子量分布变得更宽。

实施例6齐整小核菌内源水解酶制备酶制剂

收集实施例4表达的小核菌胶水解酶GME9860，浓缩，再将浓缩酶液与辅料和/或保护剂混合后进行喷雾干燥，即可得到小核菌胶水解酶的固体酶制剂。

所述辅料和/或保护剂为：麦芽糊精、水溶性淀粉、蔗糖、海藻糖或山梨醇中的一种或多种的混合，其添加量为100～300g/L浓缩酶液。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 齐整小核菌内源小核菌胶水解酶及应用

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 233

<212> PRT

<213> Sclerotium rolfsii WSH-G01

<400> 1

Met Tyr Phe Phe Ser Leu Lys Thr Ala Val Pro Thr Leu Val Ala Ile

1 5 10 15

Gln Gly Leu Ile Thr Ala Ser Leu Ala Gln Thr Ser Gly Thr Thr Thr

20 25 30

Thr Thr Trp Asp Cys Cys Glu Pro Ala Cys Gly Tyr Thr Ser Asn Leu

35 40 45

Ser Pro Gly Ala Ser Gly Pro Val Arg Ser Cys Asn Ala Asn Asn Gly

50 55 60

Pro Ala Ala Ser Gly Ala Gln Asn Ala Cys Phe Ala Ser Gly Gly Asn

65 70 75 80

Leu Ala Phe Ser Cys Ser Asp Tyr Gln Pro Ile Ile Ile Ser Asn Thr

85 90 95

Leu Ser Tyr Gly Phe Ala Gly His Gly Asp Thr Ala Thr Asp Ser Cys

100 105 110

Cys Lys Cys Tyr Gln Phe Thr Trp Thr Ser Gly Ala Gly Ala Gly Lys

115 120 125

Ser Met Ile Val Gln Ala Ile Asn Ala Gly Gly Ile Thr Ala Thr Asp

130 135 140

Phe Asp Ile Tyr Thr Pro Gly Gly Gly Val Gly Asp Tyr Asn Ala Cys

145 150 155 160

Thr Ala Gln Tyr Gly Ala Pro Ser Gln Gly Trp Gly Ala Gln Tyr Gly

165 170 175

Gly Val Ser Ser Asp Ser Gln Cys Asp Glu Leu Pro Ser Val Leu Gln

180 185 190

Ala Gly Cys His Trp Arg Trp Glu Trp Ala Gly Gly Gly Ile Asn Glu

195 200 205

Trp Thr Ile Glu Tyr Glu Gln Val Asn Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser

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Ile Ser Gly Cys Tyr Pro Ala Ser Ile

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<212> DNA

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gaaatcattc catttgtcac tctttatcac tgggaccttc cccaaggatt gcatgataga 420

tatggtggat ggcttaacaa agacgaaatt gcagcagatt atgagaatta cgctcgcgtc 480

tgcttcaaag ccttcggcga ccgcgtaaaa tactggctca ccatgaatga gccatggtgc 540

atttcaattc ttggctatgg ccgtggcgtc tttgctcccg gacggtcgtc tgaccgcgag 600

cgctctgccg aaggtaacag cagcacagag ccctggatcg tcggccacag cgtgcttctt 660

gcccatgcac gagcggtcgc tgcctatagg aaggacttca aacccacaca gaagggtgtc 720

attggtatca cgcttaacgg agatatggcc ttgccttgga atgatgagca aaagaacatc 780

gatgctgctc agcatgctct cgattacgca atcggatggt ttgctgaccc catttatctg 840

ggccattacc ccgagtatat gcgctcaatt ctcggtgatc gcctaccaga atttactccc 900

gaagaatggg ccgttgtcaa gggctcgagt gacttctatg ggatgaacac gtatacaaca 960

aatctctgca aggccggtgg cgatgacgag ttccagggct ttgtcgaata caccttcact 1020

cgtcccgatg gcactcagct tggcacacaa gcgcactgcg cctggttgca ggactatgcc 1080

cccggattca ggatgctctt gaattacctt tggaagaaat ataaacaccc catctacgtc 1140

accgaaaatg gattcgccgt ccgcaacgag gatgccatgc ctcgcgatca ggctattcat 1200

gacgccgacc gagtggccta cttcaagggt acgaccaagg ccctctggga ggctgtgaaa 1260

ttggatggcg tcgaagtcaa ggcatatttc ccgtggagct tcttggacaa tttcgagtgg 1320

gctgatggct acgttactcg cttcggcgta acatatgtag actatgaaac ccaggagcgc 1380

ttcccgaagg acagtggcaa gttcttggta gactggcaca aggcttacgt tgccaaagag 1440

tcagaggcgt catcatcatc atcatcgaag acctcggcaa aaccggcggg ggccaagaca 1500

gcaaacaagc gcaacagcat cccctttacc actcctcttg ccccgctgtg gaaaaagctt 1560

ttctcgttga aggccaaggc gtga 1584

<210> 5

<211> 1926

<212> DNA

<213> Sclerotium rolfsii WSH-G01

<400> 5

atggtctctc tgcttttcac gtatgcggct cttgccagca cttggctttt tggatctgtt 60

ctcggagcga cgaccgtaac tatcagttcg agtgcgagtc attcaattcc tacgacgtta 120

tgggggcaga tgtttgagag tggcgacgga gggctttatg gcgagctcct acagaacaga 180

gctttccagc aggtgactcc gggcagcggc gcagcgctga acgcctggtc tgcggtcaac 240

agctccagca tctctgtggt gtcagatgct gtttctagtg ccctaccaaa cgcgcttcaa 300

gtctccgtgc ctagcggtca cactggttat tccgggtttg ccaacagcgg ctactggggt 360

atcaaggtca attcagcctg gacatacacc gcctctttct actaccgctt cccgtcatac 420

tcaacctggt ccggatccgc cgtggttgct ctgacaggca gtagcggcac cgtctacggc 480

tcggccgtgg tgaacctgca aggcagccag acctcatgga aacaggtcac ggtcaccttc 540

acaccccaca cgtcggcgag ctcaacaagc aactcattca cggtctcact cctcaatgcg 600

ggtggccaga cggttcactt tgctatgttt tctttgttcc caccgaccta caacaatagg 660

gcaaatggaa tgcgaatcga tatcgcagag acgttggcgg ctgctaagcc gactttcttc 720

aggttcccag gtggaaacaa cttgggccag actcctgcga cgaggtggca gtggaatgca 780

acggtcggcc cccttgttaa ccgtcctggt cgtgccggtg attggggtta tgttaacaca 840

gacggacttg gactccttga atacttgtac ttcatcgagg atgcgggcat ggaacccatc 900

atggcagttt attcgggcta ttcactagga gggaccagca tcgcccagaa tgatctcggc 960

ccatacgttc aacaagccat tgatcaaatc aatttcgtca ttggagaccc cagtcaaagc 1020

tctgctgccg cattaagagc ttctcttgga cgttctgaac cattcagctt aacatatgtg 1080

gagattggca atgaagattt tgccgaccag tcaacctatg tttataggtg gcaaacaatt 1140

gtcgatgcat tatctagcga gttcccaaat ctcaaattta ttgctacctc ctactcgacg 1200

ggacctaccc ttacgcccaa acccctgcag tgggataacc atgtgtatca atcacctaca 1260

tggtttgctc agaatgtttt cctgtatgac agctatgcga gaaacggcgt tacatatttc 1320

caaggagaat atgcagccat gcaagtcgcc tctaccaata cagctaacgt ctggggttcc 1380

actggtcgcc tttcttatcc cactattcag agcagtgttt ccgaggccgc ttatatgact 1440

ggtctcgaga gaaactctga catagtgttc gcggcttctt atgcgccttt gctcatgaac 1500

accaactatc agtcctggac acccaacatg gtcaatttcg atgctggcaa cgtctacccg 1560

tcgacatctt actacgttca acaactcttc ggagaatatc gaggagacgt tttccttccc 1620

agcactctcc catcttcttc aggaacatta ttctggagcg tcgtgaggaa ccagtcttcc 1680

aaccaggtct acattaagat tgccaacgtc ggatcctcca ccagcacctt gaactttgtt 1740

ctgccatact cgactgtttc ttctactggc acggctgtcg tcctaacagg gtctgagacc 1800

gcctcgaaca cgcccagcaa cccgaatgca gctgttccga gcacctcgac gatctccacc 1860

gggaagtctt tcagctacaa cagtcccgcg tggtctttca gcgtattggt tgtgaccgca 1920

tactag 1926

<210> 6

<211> 1653

<212> DNA

<213> Sclerotium rolfsii WSH-G01

<400> 6

atgcctcgaa ctagtttcat attactgtgg gcatctatcc taggtttgtc tgggcaaggt 60

ttggggtgga ccggaggaac ccgtctggtt ctccagcccg gtgcaacatc cacaccggtt 120

cagcttcgct cagatttcct atcttttagc atagaacccg cctactgggt cgaatttttt 180

gggacggcca gcgagccaaa ttcattcagc ttgagactgc ttgagtacat tgctaatcgc 240

actgggaccc cacctatcat ccggccagga ggaatcacga tggactccat gatttttgag 300

tcaaatggaa cagatcctac tagagtcagc tcaccgaatg gcggtgttta tgaaactatc 360

tacggtccag cctggttcaa atcgtttgat aatttcccaa atggcactcg ctttgttggt 420

actcttaatt tcgggaacaa ctcgcttgag attgcaaaca acgaagcact ggcttgggct 480

cagtatgtcg gttctgagaa gatttttgtt tttgagttgg gaaacgagcc tacaaattat 540

gcacgatgga cacaagacag tcctcttggc accttggaat acgtggacga gtggacaaac 600

tggaccaaag ccatcgacaa caatttgcct gcaggacaag ttccagcgga accccgctgg 660

tggggttcta gcgcaacaac tgataccggc tcagggacaa cagatgtcct tcctgcggcc 720

atcatacctc tgggaattga caatagcagc aacatcctgg aatattctat tcacagttat 780

gcatggtcca catgtgatcc cactaggaat gcgcttgcga ctatcccaaa cctgctaaat 840

catagcagta ttgttgcata tgcgaacacg ttcatgagac cgagcgagac ggtggcactg 900

gcgtcaggat ctggcatctg tatcggcgag ttcaatagtg tcagctgcag cggcaagccc 960

aacgtcacag acactttcac ccaagcactt tggactgtag acacttcttt taactatgcc 1020

gccatcaacg cttcacatgt ctttctccat caaggggcaa ctttagtctt ccaatctggc 1080

agccagagca ataccgcagg ggcagacggc actcctggct ggagcgcata tgatttatgg 1140

taccctgtca atagtactct tcgcggacct caacgggtca atccgggcta cgtttctcag 1200

ctactaatgg ccgaagccat cggtgatagt ggcaatagcc atttggctac cctggctact 1260

cctcaaggga tctctaacga ttcattttca gcgtacgcca tatatgacaa ttctgccacc 1320

tctaattcaa cggatcccgc tcgtctggtt cttttgaata tgtctccata tctacttaat 1380

gtgacctcac ccgcaccgcg tcaatatgtg acgatcgata tatcagcttt tgctggtgca 1440

catggcgcaa cactcaagag gatgacagct cctagtgccg atgaattgaa ttctacctta 1500

gttacgtggg caggacagag ctggggaact ggggaacctc aaggtgatgt acatgtggag 1560

gatgttcatg gaggtcaagt cgtcattcaa caatcggagg ccgtgcttgt tttcctctct 1620

cgtgaccctt cagaaaaata tcgtcaatat tag 1653

<210> 7

<211> 2280

<212> DNA

<213> Sclerotium rolfsii WSH-G01

<400> 7

atggggcttg ggtcgtcctg ctcggcggaa gtaaactctg gcactgctgc tgccagtgac 60

cccttctggt tgcagaatat taaacaccag ggaacgtctg cattcaactc caacccctcc 120

tcttataccg tcttcagaaa cgtcaaggac tatggtgcca agggtgatgg tgtaaccgac 180

gatacagctg cgatcaactc tgccatctct tcaggcagcc gctgcggtgg cggaacatgc 240

ggttcttcta ccgtgacccc tgctgttgtc tttttcccgc aaggcaccta cgtcgtctca 300

tcaccaatca ttgcttatta ctttactcaa ctcattggtg acgcaagaca tcctcccacc 360

atcaaagctt cttccagctt ctctggtatt gctgtcatag atgctgatcc atacatggcc 420

ggtggtgcca attggtacac aaatcaaaac aatttcttcc gttctgtgcg caatttcgtc 480

atcgatctta ccgccgtgcc tgcctcggcc tctgccactg ggttacattg gcaggtttcg 540

caggcgacct cgttaatcaa catcgtcgtc aacatgtcca ctgcatcagg aaacaaccac 600

caaggcatct tcatggaaaa cggaagcggt ggatacatgg gcgacatcgt ctttaatggt 660

ggcaaatacg gtgtttggct tggcaatcag caattcactg tccgcaacat caccgtcaac 720

aacgcagcca cagctatctt tgctgactgg aattggggct ggactttcca gggcgttacc 780

attagcaact gtcaagtcgg attcgatata ttgactggcg ggactaccca ggccaatcaa 840

ggtgtcggag cggaggccat catcgacgct gtcgttacaa acacccctat ctttgttcgc 900

agctcgaaag cgtccagcgg atcagtaaca gggtctctcg taatcaacaa tgcgaagctg 960

aacaacgttc ccaccgcagt tggcgttgtc ggcggtgctg tcgttctctc tggtactact 1020

ggaacaacga cgatctcctc ctggggccag ggcaacatct acaagggcac atctacctct 1080

ggaacgttca ctcaaggctc gattgctgct cctacaaaag ccagctccct cctagacagt 1140

gcgggacgca tcgtgcagaa gacccaccct cagtactctg actgggcggt atcacaattc 1200

gtgagcgtca agagcaacgg tgccaagggt gacggatcca cagatgacac cgcggctttg 1260

caagccatct tcaaccagta tgccggatgc aagatcatct tcttcgatgc cggaacttac 1320

attgtcactt caacactcaa aatcccggct ggcgtccgaa tcgttggaga ggcctggtcc 1380

gttatcgccg gcaaaggctc cgctttccag aatatcaaca acccgactcc agttgtgcaa 1440

attggtacct ccggctctac cggtatcgtc gagatcacgg acatcatctt caaaaccatc 1500

ggctacgcgc ccggagctat cattgttgaa tggaacgtac acgaaccatc tggccaacag 1560

gccggtgcag gtacatggga tacccacatc atcctcggtg gcactgctgg tacccagctt 1620

cagacatcac aatgcccgtc cggttcccag aataccggaa cctgtaccac ggcctatctc 1680

ggtctacatc ttaccactag ctcatctgcg tacctcgagg gcatgtgggt ctggctcgcc 1740

gaccatgatc tcgacagcag tgggcaaaca cagctgacga tattcagtgg ccgtggtatt 1800

ctctctgagt ctcaaggacc agtctggctc gttggaacag cgtcggaaca ccacgtcctc 1860

taccagtaca acctcgttaa tgcaaagaac cactacatgg gtctcatcca gactgagacg 1920

ccgtactatc agccatcacc cgccccgccc gctcccttct ccatcaacag cgcgtaccat 1980

gacccgtcat tcgctagcga caccccagca gcctggggac taaacgtaca gtcatcgaca 2040

gacattattg tcttcggggc tggccactac tcgttcttcc aaaactacgg acaaaactgc 2100

ctcaccacct tcaattgcca aaaccagatc gtcaatgtcg attcggcatc ttcgatctgg 2160

atctactccc tcgcgaccgt cgccactact aagcaggtca gcatgagcgg gacgggtatc 2220

attccggaga gcgccaacct taacggcttc caagaaactg taacattctg ggagccttga 2280

<210> 8

<211> 1077

<212> DNA

<213> Sclerotium rolfsii WSH-G01

<400> 8

atgaaatcac tcatctatac tgcattatca tcgttgcttg ggctgtcata cgcctaccct 60

gcgccttcaa acgctgagtc attgggagtg tctacaaaca taagcctaga cgccggctcg 120

ttcttcccac ctcccggggc accatgcttc cctgctcttg gatttcagac gccttctaat 180

gtccccagcc acctgaacgg atggtggtgt gatcccgtca ccgagcatgc tttcctgggc 240

tttagctatg aagttactgc ttgtcaagat atatcaaccc tcaaaaagga atttgcagat 300

attcgttatc atttcaacag tcgatacatt cgtctgtacg gtgtctgtga taatgatggc 360

ttctacgatg atattgttga agctgcttgg gaaaataact tgggcgttca tgctcttgtc 420

tggtttggat ttgatggcac tgatcaatgg atcggacgcc gcgataccct atttgctacc 480

ctacactcga atcccaaggc taaatttgtc acccgtgttg tccaattcgg gtctgagccc 540

ctctttgatg acgtgctacc acaccagcaa cttgcagagc aagtgatact ggcaaaacag 600

aatctgtcgt ccttgcacat caacgtcact gtcagcgaac ttgcttatgg ataccaggag 660

cgcggcggcg ccgaggatgt cttgtccgcc atcgatagca ttaacgcgca catgttgccc 720

ttctttgcgc agaatgcttc tactgccttc aattcgtggc cgagcgttct tgacgacatg 780

gactggtttg tcaacaatgg tcaaggcaag aagatctact tcgacgagaa cggctggccg 840

tctgttacct cacctagcgt acaaaataac tcgatatatg ctgttgctga tgttcagcag 900

gaacaggact acttcctcct cctcgagtca aaatgcgaat acctccggga taacgcaccc 960

gttggcggcg tcggctggtt cgctcacatc tacagcgaca acatggagcc tggttatggc 1020

atctacgata cgtcgggcca gatgaaattc ccattcaacc caaagcctca ctgctag 1077

<210> 9

<211> 750

<212> DNA

<213> Sclerotium rolfsii WSH-G01

<400> 9

atgagctgcg acgactgcta ttcaggtgcc cgtcacgagg gccacttcga ggtaatcgga 60

ggtgtaaact gttatgttgc cactcccgaa aaggagtatg acgaaagcgc tgttataatc 120

ttcctgtccg atgtctttgg tgttcagttc attaacaatc agctgcttat atccgacttc 180

gcaaagaacg ggtttaagac agtggcgccg gacatgtttg atggggaccc tgtaccagca 240

atcgtagtag aaggcaacct aagcacacca caaaactggg acagagccac ctggactgct 300

aagcatggtt tcgaagtcac taggccgctt gttgacaagg ttattgatga cctcaaatcg 360

aaaggcataa ctagatttgc cgccaacggc tactgctacg gcgctagaat tggtttcgat 420

ctcgcttttg agaacattgt caaagccgta gttgtatcac atccctcacg cctaactgtt 480

cccgacgatt ttgagaaata caaatccacg tcgaatgcac ctctgctgat caactcttgc 540

accatagacc agcaatttga tcatgacgcc cagaagggag cagacgccat tatgggtgcg 600

ggccaattcg aacctggata tctgagagaa tatttcgatg gatgcagaca cggcttcgct 660

gtgagagctg acttgaataa ccctcaggct gtggctggaa aagagggcgc attcaaagca 720

acagtccaat tcttgcaaaa acacctatga 750

<210> 10

<211> 762

<212> DNA

<213> Sclerotium rolfsii WSH-G01

<400> 10

atgaagctca ccacttccca tgtccttgct ctcctggctg cggccacggg cgcgtcagct 60

cgtcagatta cagtgtacaa tggctgcccg ttcactatct ggcccgctat gttcactggt 120

gtcctttcaa cggcgccctc ttacactacc ggttgggagg ccgcggccta cacccatgtc 180

acctttgatg tcccagacaa ctggactgca ggtcgcatct ggggtcgtcg tgactgtgac 240

ttcagctcag tccaaggccc aacttcctgc cttgatggag gttgcaatgg cggtctcgtc 300

tgcgatcttt ccacgggcac gggtgttccc cccgcgaccc tcgccgagtt cactctctcg 360

acgtccatcg acaactatga tgtctctctt gtcgacggtt acaatttgcc catgagaatc 420

gacaacacca acggctgcgg tgtagcttct tgccccgttg atctcggccc cgactgtccc 480

gctgctctcc agggtcctta cgactctact ggttttcctg ttggctgcaa gagtgcttgc 540

gatgctaacc tcagcggaga tccctccaac tcccctaact gctgctcggg tcaatatgac 600

acgcctgcga catgccccag ctccggcgtg gcatactact cctacttcaa ggacaactgc 660

ccagactcgt acgcatacgc ttacgatgag tcgagcggca ccgctctctg gacctgcacg 720

ggcctgccca actacaccgt caccttctgc cctgccagtt ag 762

<210> 11

<211> 810

<212> DNA

<213> Sclerotium rolfsii WSH-G01

<400> 11

atgttgttca agtcgctctt cgctgttgtt tctctttctg tatcagctgt ctccgctggc 60

aaacgtggtc ttgcatggcc atggtacaac agtcctttgg accctggtgt cttcaacaac 120

ggagacggtg aagtggtagc catctacgat tgggagacct atgctcctcc ctctaccaat 180

ggcaatggtg gactgggctt catcggcacg cagcgttgca tggattgctc ctctagccca 240

atcgatgagc ttcagtcccg gtggaaagca cagggatggg caaccgtctt tagcttgaac 300

gagcccgacc agaacggcat ctctgccagc gaggcagcct cttggtacat cgaatacatc 360

aacccgttgg atatcaagaa ggccctccct gctatcagct ccagcacatc atcgggtcaa 420

ggcctttcct ggctagcaga aatggtctcc gcttgcgctg gagcctgtta tgccgattat 480

atcaatcttc actggtatgg taactccttc tcagagttcg agagctatgt caccgaggcg 540

cacaaccaat tccctcaata caccgtcgtc gtctcagagt ttgctcttca gaacccctct 600

ggtggtgcaa ctgcccagta cgacttcttc caacaagcct ttgcttggct tgatgatcaa 660

gaatgggtga cgctgtactt ccccttcgtg gcaacgtcgc cttcgctcat gcaggccaac 720

gatgcctcga gttactccta tgttggcacg ggctcctgct tgttcaccaa cgcaggtcaa 780

ccttcgagtg tgggtgacct tatgtactaa 810

<210> 12

<211> 527

<212> PRT

<213> Sclerotium rolfsii WSH-G01

<400> 12

Met Ser Ser Val Pro Glu Pro Glu Ile Lys Asp Lys Leu Pro Ser Asp

1 5 10 15

Phe Ile Trp Gly Phe Ala Thr Ala Ser Phe Gln Ile Glu Gly Ser Thr

20 25 30

Asp Arg Asp Gly Arg Gly Pro Ser Ile Trp Asp Glu Phe Ser Arg Thr

35 40 45

Pro Gly Lys Ile Gln Asp Gly Arg Asn Gly Asp Val Ala Thr Asp Ser

50 55 60

Tyr Asn Arg Tyr Lys Glu Asp Ile Gln Leu Leu Lys Asp Tyr Gly Val

65 70 75 80

Lys Ser Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ser Arg Ile Ile Pro Leu Gly

85 90 95

Gly Arg Asn Asp Pro Ile Asn Glu Ala Gly Ile Lys Phe Tyr Ser Asp

100 105 110

Leu Ile Asp Gly Leu Leu Glu Ala Glu Ile Ile Pro Phe Val Thr Leu

115 120 125

Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Gly Leu His Asp Arg Tyr Gly Gly Trp

130 135 140

Leu Asn Lys Asp Glu Ile Ala Ala Asp Tyr Glu Asn Tyr Ala Arg Val

145 150 155 160

Cys Phe Lys Ala Phe Gly Asp Arg Val Lys Tyr Trp Leu Thr Met Asn

165 170 175

Glu Pro Trp Cys Ile Ser Ile Leu Gly Tyr Gly Arg Gly Val Phe Ala

180 185 190

Pro Gly Arg Ser Ser Asp Arg Glu Arg Ser Ala Glu Gly Asn Ser Ser

195 200 205

Thr Glu Pro Trp Ile Val Gly His Ser Val Leu Leu Ala His Ala Arg

210 215 220

Ala Val Ala Ala Tyr Arg Lys Asp Phe Lys Pro Thr Gln Lys Gly Val

225 230 235 240

Ile Gly Ile Thr Leu Asn Gly Asp Met Ala Leu Pro Trp Asn Asp Glu

245 250 255

Gln Lys Asn Ile Asp Ala Ala Gln His Ala Leu Asp Tyr Ala Ile Gly

260 265 270

Trp Phe Ala Asp Pro Ile Tyr Leu Gly His Tyr Pro Glu Tyr Met Arg

275 280 285

Ser Ile Leu Gly Asp Arg Leu Pro Glu Phe Thr Pro Glu Glu Trp Ala

290 295 300

Val Val Lys Gly Ser Ser Asp Phe Tyr Gly Met Asn Thr Tyr Thr Thr

305 310 315 320

Asn Leu Cys Lys Ala Gly Gly Asp Asp Glu Phe Gln Gly Phe Val Glu

325 330 335

Tyr Thr Phe Thr Arg Pro Asp Gly Thr Gln Leu Gly Thr Gln Ala His

340 345 350

Cys Ala Trp Leu Gln Asp Tyr Ala Pro Gly Phe Arg Met Leu Leu Asn

355 360 365

Tyr Leu Trp Lys Lys Tyr Lys His Pro Ile Tyr Val Thr Glu Asn Gly

370 375 380

Phe Ala Val Arg Asn Glu Asp Ala Met Pro Arg Asp Gln Ala Ile His

385 390 395 400

Asp Ala Asp Arg Val Ala Tyr Phe Lys Gly Thr Thr Lys Ala Leu Trp

405 410 415

Glu Ala Val Lys Leu Asp Gly Val Glu Val Lys Ala Tyr Phe Pro Trp

420 425 430

Ser Phe Leu Asp Asn Phe Glu Trp Ala Asp Gly Tyr Val Thr Arg Phe

435 440 445

Gly Val Thr Tyr Val Asp Tyr Glu Thr Gln Glu Arg Phe Pro Lys Asp

450 455 460

Ser Gly Lys Phe Leu Val Asp Trp His Lys Ala Tyr Val Ala Lys Glu

465 470 475 480

Ser Glu Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Thr Ser Ala Lys Pro Ala

485 490 495

Gly Ala Lys Thr Ala Asn Lys Arg Asn Ser Ile Pro Phe Thr Thr Pro

500 505 510

Leu Ala Pro Leu Trp Lys Lys Leu Phe Ser Leu Lys Ala Lys Ala

515 520 525

<210> 13

<211> 358

<212> PRT

<213> Sclerotium rolfsii WSH-G01

<400> 13

Met Lys Ser Leu Ile Tyr Thr Ala Leu Ser Ser Leu Leu Gly Leu Ser

1 5 10 15

Tyr Ala Tyr Pro Ala Pro Ser Asn Ala Glu Ser Leu Gly Val Ser Thr

20 25 30

Asn Ile Ser Leu Asp Ala Gly Ser Phe Phe Pro Pro Pro Gly Ala Pro

35 40 45

Cys Phe Pro Ala Leu Gly Phe Gln Thr Pro Ser Asn Val Pro Ser His

50 55 60

Leu Asn Gly Trp Trp Cys Asp Pro Val Thr Glu His Ala Phe Leu Gly

65 70 75 80

Phe Ser Tyr Glu Val Thr Ala Cys Gln Asp Ile Ser Thr Leu Lys Lys

85 90 95

Glu Phe Ala Asp Ile Arg Tyr His Phe Asn Ser Arg Tyr Ile Arg Leu

100 105 110

Tyr Gly Val Cys Asp Asn Asp Gly Phe Tyr Asp Asp Ile Val Glu Ala

115 120 125

Ala Trp Glu Asn Asn Leu Gly Val His Ala Leu Val Trp Phe Gly Phe

130 135 140

Asp Gly Thr Asp Gln Trp Ile Gly Arg Arg Asp Thr Leu Phe Ala Thr

145 150 155 160

Leu His Ser Asn Pro Lys Ala Lys Phe Val Thr Arg Val Val Gln Phe

165 170 175

Gly Ser Glu Pro Leu Phe Asp Asp Val Leu Pro His Gln Gln Leu Ala

180 185 190

Glu Gln Val Ile Leu Ala Lys Gln Asn Leu Ser Ser Leu His Ile Asn

195 200 205

Val Thr Val Ser Glu Leu Ala Tyr Gly Tyr Gln Glu Arg Gly Gly Ala

210 215 220

Glu Asp Val Leu Ser Ala Ile Asp Ser Ile Asn Ala His Met Leu Pro

225 230 235 240

Phe Phe Ala Gln Asn Ala Ser Thr Ala Phe Asn Ser Trp Pro Ser Val

245 250 255

Leu Asp Asp Met Asp Trp Phe Val Asn Asn Gly Gln Gly Lys Lys Ile

260 265 270

Tyr Phe Asp Glu Asn Gly Trp Pro Ser Val Thr Ser Pro Ser Val Gln

275 280 285

Asn Asn Ser Ile Tyr Ala Val Ala Asp Val Gln Gln Glu Gln Asp Tyr

290 295 300

Phe Leu Leu Leu Glu Ser Lys Cys Glu Tyr Leu Arg Asp Asn Ala Pro

305 310 315 320

Val Gly Gly Val Gly Trp Phe Ala His Ile Tyr Ser Asp Asn Met Glu

325 330 335

Pro Gly Tyr Gly Ile Tyr Asp Thr Ser Gly Gln Met Lys Phe Pro Phe

340 345 350

Asn Pro Lys Pro His Cys

355

<210> 14

<211> 253

<212> PRT

<213> Sclerotium rolfsii WSH-G01

<400> 14

Met Lys Leu Thr Thr Ser His Val Leu Ala Leu Leu Ala Ala Ala Thr

1 5 10 15

Gly Ala Ser Ala Arg Gln Ile Thr Val Tyr Asn Gly Cys Pro Phe Thr

20 25 30

Ile Trp Pro Ala Met Phe Thr Gly Val Leu Ser Thr Ala Pro Ser Tyr

35 40 45

Thr Thr Gly Trp Glu Ala Ala Ala Tyr Thr His Val Thr Phe Asp Val

50 55 60

Pro Asp Asn Trp Thr Ala Gly Arg Ile Trp Gly Arg Arg Asp Cys Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Val Gln Gly Pro Thr Ser Cys Leu Asp Gly Gly Cys Asn

85 90 95

Gly Gly Leu Val Cys Asp Leu Ser Thr Gly Thr Gly Val Pro Pro Ala

100 105 110

Thr Leu Ala Glu Phe Thr Leu Ser Thr Ser Ile Asp Asn Tyr Asp Val

115 120 125

Ser Leu Val Asp Gly Tyr Asn Leu Pro Met Arg Ile Asp Asn Thr Asn

130 135 140

Gly Cys Gly Val Ala Ser Cys Pro Val Asp Leu Gly Pro Asp Cys Pro

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gln Gly Pro Tyr Asp Ser Thr Gly Phe Pro Val Gly Cys

165 170 175

Lys Ser Ala Cys Asp Ala Asn Leu Ser Gly Asp Pro Ser Asn Ser Pro

180 185 190

Asn Cys Cys Ser Gly Gln Tyr Asp Thr Pro Ala Thr Cys Pro Ser Ser

195 200 205

Gly Val Ala Tyr Tyr Ser Tyr Phe Lys Asp Asn Cys Pro Asp Ser Tyr

210 215 220

Ala Tyr Ala Tyr Asp Glu Ser Ser Gly Thr Ala Leu Trp Thr Cys Thr

225 230 235 240

Gly Leu Pro Asn Tyr Thr Val Thr Phe Cys Pro Ala Ser

245 250

<210> 15

<211> 269

<212> PRT

<213> Sclerotium rolfsii WSH-G01

<400> 15

Met Leu Phe Lys Ser Leu Phe Ala Val Val Ser Leu Ser Val Ser Ala

1 5 10 15

Val Ser Ala Gly Lys Arg Gly Leu Ala Trp Pro Trp Tyr Asn Ser Pro

20 25 30

Leu Asp Pro Gly Val Phe Asn Asn Gly Asp Gly Glu Val Val Ala Ile

35 40 45

Tyr Asp Trp Glu Thr Tyr Ala Pro Pro Ser Thr Asn Gly Asn Gly Gly

50 55 60

Leu Gly Phe Ile Gly Thr Gln Arg Cys Met Asp Cys Ser Ser Ser Pro

65 70 75 80

Ile Asp Glu Leu Gln Ser Arg Trp Lys Ala Gln Gly Trp Ala Thr Val

85 90 95

Phe Ser Leu Asn Glu Pro Asp Gln Asn Gly Ile Ser Ala Ser Glu Ala

100 105 110

Ala Ser Trp Tyr Ile Glu Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Ile Lys Lys Ala

115 120 125

Leu Pro Ala Ile Ser Ser Ser Thr Ser Ser Gly Gln Gly Leu Ser Trp

130 135 140

Leu Ala Glu Met Val Ser Ala Cys Ala Gly Ala Cys Tyr Ala Asp Tyr

145 150 155 160

Ile Asn Leu His Trp Tyr Gly Asn Ser Phe Ser Glu Phe Glu Ser Tyr

165 170 175

Val Thr Glu Ala His Asn Gln Phe Pro Gln Tyr Thr Val Val Val Ser

180 185 190

Glu Phe Ala Leu Gln Asn Pro Ser Gly Gly Ala Thr Ala Gln Tyr Asp

195 200 205

Phe Phe Gln Gln Ala Phe Ala Trp Leu Asp Asp Gln Glu Trp Val Thr

210 215 220

Leu Tyr Phe Pro Phe Val Ala Thr Ser Pro Ser Leu Met Gln Ala Asn

225 230 235 240

Asp Ala Ser Ser Tyr Ser Tyr Val Gly Thr Gly Ser Cys Leu Phe Thr

245 250 255

Asn Ala Gly Gln Pro Ser Ser Val Gly Asp Leu Met Tyr

260 265

Claims (10)

1.一种小核菌胶水解酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述小核菌胶水解酶的基因。

3.携带权利要求2所述基因的表达载体。

4.表达权利要求1所述小核菌胶水解酶的微生物细胞。

5.一种重组毕赤酵母，其特征在于，表达权利要求1所述的小核菌胶水解酶。

6.根据权利要求5所述的重组毕赤酵母，其特征在于，以毕赤酵母GS115为宿主，以pPIC9K为载体，表达权利要求1所述的小核菌胶水解酶。

7.权利要求1所述的小核菌胶水解酶在制备低分子量小核菌胶方面的应用。

8.一种水解小核菌胶的方法，其特征在于，将权利要求1所述的小核菌胶水解酶加入至含小核菌胶的体系中，于28～30℃反应至少2h。

9.含有权利要求1所述小核菌胶水解酶的酶制剂。

10.权利要求1所述的小核菌胶水解酶在食品、生物医药、石油化工和化妆品领域的应用。

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