CN111041017B

CN111041017B - 一种壳聚糖酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN111041017B
Application number: CN201911409831.3A
Authority: CN
Inventors: 公衍军; 石琨
Original assignee: Weifang Macaaji Biotechnology Co ltd
Current assignee: Weifang Macaaji Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN111041017A

Abstract

本发明涉及基因工程改造，具体的说是一种壳聚糖酶突变体及其应用。壳聚糖酶突变体为壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的络氨酸Y突变成丙氨酸A，所述壳聚糖酶BC345突变体氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A，或，壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的络氨酸Y突变成丙氨酸A，且壳聚糖酶BC345突变体氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A。本发明所用的壳聚糖酶突变体活性高，耐高温。并对该壳聚糖酶进行理性改造，通过定点突变和增加柔性片段的方法大大提高了其酶活及其热稳定性，使得该酶具有了工业化生产壳寡糖的潜力。

Description

一种壳聚糖酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程改造，具体的说是一种壳聚糖酶突变体及其应用。

背景技术

壳聚糖是甲壳素脱去乙酰基后的产物，是自然界中唯一存在的碱性多糖，具有生物可降解、对动物无毒害、可溶于酸性溶液、可获得多种物理形式并且更容易处理等特点。壳聚糖在多种领域都有应用，但一般制得的壳聚糖分子量都很大，而大分子壳聚糖不溶于水且不能发挥壳寡糖的一些特殊功能，因此，壳聚糖需要进一步通过化学法或酶法降解成壳寡糖。壳寡糖具有水溶性好、无毒性、与生物体兼容、环境友好型、易被生物体降解等特性，目前广泛用于医药卫生、保健食品、食品加工、化妆品、纺织、环保、农业、饲料等领域。

壳聚糖酶可以水解壳聚糖中的β-1，4-糖苷键，将壳聚糖降解。已发现的壳聚糖酶绝大部分为内切酶，可以将壳聚糖降解为壳寡糖。目前研究最多的是来源于细菌和真菌的壳聚糖酶。并且现阶段，制备壳寡糖的方法主要有化学降解法、物理降解法和酶降解法等。化学降解法产生的衍生物较多，低聚糖得率低且环境污染严重；物理降解法生产成本较高，难以实现工业化；酶法因条件温和、选择性高，对环境污染小，产物安全性好，受到了越来越多的重视与关注。如今，酶法水解壳聚糖制备壳寡糖已成为甲壳素领域的一个研究热点。

酶法降解壳聚糖有诸多的优点，但是这种方法还是存在有待提高的方面，第一方面是壳聚糖酶的酶活力普遍较低；第二方面是酶的热稳定性有待提高。这两方面制约了酶法降解壳聚糖向大规模工业发展。本发明涉及的一种来自人体肠道微生物菌株产生的降解壳聚糖的壳聚糖酶，其特征在于酶活力高，热稳定性强，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的不足的之处，提供一种热稳定性好、酶活高的壳聚糖酶突变体。

一种壳聚糖酶突变体，突变体为壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的络氨酸Y突变成丙氨酸A，所得突变体(BC345/Y116A)，其氨基酸序列如下SEQ ID NO:4所示；

或，所述壳聚糖酶BC345突变体氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A，所得突变体(BC345PA)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

或，壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的络氨酸Y突变成丙氨酸A，且壳聚糖酶BC345突变体氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A，所得突变体(BC345/Y116A/PA)其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

所述壳聚糖酶BC345为人肠道菌Bacteroides clarus YIT 12056菌株基因组DNA中壳聚糖酶BC345。

一种壳聚糖酶突变体用于降解壳聚糖生产壳寡糖的应用。

一种重组质粒，所述重组为含所述壳聚糖酶的基因的质粒。

所述质粒载体为pPCIZα。

一种含所述重组质粒的基因工程菌株。

所述重组质粒转化至毕赤酵母中获得。

一种所述基因工程菌株壳聚糖酶用于降解壳聚糖生产壳寡糖的应用。

本发明所述壳聚糖酶由肠道菌Bacteroides clarus YIT 12056(＝DSM 22519)获得(该菌株购自日本菌种保藏中心(Japan Collection of Microorganism，JCM))，该菌株的基因组数据可以由GenBank:AFBM00000000.1查阅。

壳聚糖酶可水解壳聚糖中的β-1,4-糖苷键，将壳聚糖降解。同时，对该酶进行基因改造获得其突变体通过PCR的方法克隆了这种菌基因组DNA上该壳聚糖酶的全长基因，然后转到毕赤酵母中表达该壳聚糖酶，接着通过Ni-柱亲和层析和分子筛方法得到纯化的壳聚糖酶。本发明所用的壳聚糖酶活性高，耐高温。同时通过进一步的改造所获得突变体与野生型比较，大大提高其酶活及其热稳定性，具有更优良的热稳定性与更高的酶活，从而具有更广阔的应用前景。本发明通过对该壳聚糖酶进行改造，能够大大提高其酶活及其热稳定性。本发明涉及的突变体与野生型比较，具有更优良的热稳定性与更高的酶活，从而具有更广阔的应用前景。

本发明所具有的优点：

本发明所述壳聚糖酶活性高，耐高温；同时通过进一步的改造所获得突变体与野生型比较，大大提高其酶活及其热稳定性，具有更优良的热稳定性与更高的酶活，从而具有更广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例提供的所得壳聚糖酶基因DNA琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明实施例提供的壳聚糖酶聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图3为本发明实施例提供的所得壳聚糖酶BC345最适pH。

图4为本发明实施例提供的所得壳聚糖酶TLC产物分析图。

图5为本发明实施例提供的所得壳聚糖酶及其突变体热稳定性图。

图6为本发明实施例提供的所得壳聚糖酶及其突变体热稳定性图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

实施例1

(1)壳聚糖酶基因的获取

根据人肠道菌Bacteroides clarus YIT 12056菌株基因组DNA(由GenBank:AFBM00000000.1查阅)中的壳聚糖酶BC345的基因序列，对其进行密码子优化和基因合成。

壳聚糖酶BC345的基因序列如SEQ ID NO:1所示；对原始序列进行优化后的序列由华大青兰生物科技(无锡)有限公司完成，密码子优化后序列如SEQ ID NO:2所示，该壳聚糖酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示：

SEQ ID NO:1:

ATGAAAACATGGAAAGCAGAAGCCGCCATTATTGCTGTCGGTATGGTTTTGTTGGGAGTGGTAATAAAATGGGGTATAAACGATTTTATAGATAAGGAGCGTATTGTCAGCGTAAAAGGGCTGGCTGAGATGGAAGTCCCCGCCGATAAGGTAATATGGCCTTTGATGTATAAGGATATCGGGAACGACCCGTCTTTGCTTTATGCCAATATGGAGCAGAAGAACAAAGTTATTGTAAAGTTTCTGGAAAGTAACGGCATCGCTAAAGAAGAAATCAGCATTGCTCCGCCCGAAGTGATAGACATGCAGGCCGAACGTTACGGAAACCGTGATATAGCTTATCGGTACAATGCCACATCGGTCATTACGGTCACTTCAAAGAATGTAGACAAGGTGCGGAAGTTGATGTCGGAACAAGCCGAGCTGCTGAAACAGGGTATTGCCATCAGCGGGGGCGATTACCGCTATAACGTGGTATACGAGTTTACGGGCTTGAATGACGTGAAACCGCAAATGATAGAAGAAGCTACGAAGAATGCCCGTGCCGCAGCCGAGAAGTTTGCGAAAGACTCGGACAGCAGTCTGGGTAAGATACGGAATGCTTCGCAGGGACAATTCTCCATTTCGGACAGAGATGCCAATACACCTTATATTAAGAGCATACGCGTAGTGACTACCGTGAACTATTATCTGAAACGATAG

(a)序列特征：

●长度：702

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Bacteroides clarus YIT 12056

SEQ ID NO:2:

ATGAAGACTTGGAAGGCTGAAGCTGCTATCATCGCTGTTGGTATGGTTTTGTTGGGTGTTGTTATCAAGTGGGGTATCAACGACTTCATCGACAAGGAAAGAATCGTTTCTGTTAAGGGTTTGGCTGAAATGGAAGTTCCAGCTGACAAGGTTATCTGGCCATTGATGTACAAGGACATCGGTAACGACCCATCTTTGTTGTACGCTAACATGGAACAAAAGAACAAGGTTATCGTTAAGTTCTTGGAATCTAACGGTATCGCTAAGGAAGAAATCTCTATCGCTCCACCAGAAGTTATCGACATGCAAGCTGAAAGATACGGTAACAGAGACATCGCTTACAGATACAACGCTACTTCTGTTATCACTGTTACTTCTAAGAACGTTGACAAGGTTAGAAAGTTGATGTCTGAACAAGCTGAATTGTTGAAGCAAGGTATCGCTATCTCTGGTGGTGACTACAGATACAACGTTGTTTACGAATTCACTGGTTTGAACGACGTTAAGCCACAAATGATCGAAGAAGCTACTAAGAACGCTAGAGCTGCTGCTGAAAAGTTCGCTAAGGACTCTGACTCTTCTTTGGGTAAGATCAGAAACGCTTCTCAAGGTCAATTCTCTATCTCTGACAGAGACGCTAACACTCCATACATCAAGTCTATCAGAGTTGTTACTACTGTTAACTACTACTTGAAGAGATAA

(a)序列特征：

●长度：702

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Bacteroides clarus YIT 12056

SEQ ID NO:3：

MKTWKAEAAIIAVGMVLLGVVIKWGINDFIDKERIVSVKGLAEMEVPADKVIWPLMYKDIGNDPSLLYANMEQKNKVIVKFLESNGIAKEEISIAPPEVIDMQAERYGNRDIAYRYNATSVITVTSKNVDKVRKLMSEQAELLKQGIAISGGDYRYNVVYEFTGLNDVKPQMIEEATKNARAAAEKFAKDSDSSLGKIRNASQGQFSISDRDANTPYIKSIRVVTTVNYYLKR

(a)序列特征：

●长度：233

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Bacteroides clarus YIT 12056

根据上述优化后获得壳聚糖酶BC345基因序列和毕赤酵母穿梭质粒pPCIZα(Invirogene公司)上的酶切位点，方便将基因连接到载体上，设计如下克隆基因的引物，具体为：

正向引物是5’-TCTAGAATGAAAACATGGAAAGCAGAAGCCG-3’(下划线为XhoI酶切位点)；

反向引物是5’-CTCGAGTCGTTTCAGATAATAGTTCA-3’(下划线为XbaI酶切)。

为了使蛋白融合表达时带上6×His标签，去除了终止密码子。

采用上述人工合成上述两个引物，以人肠道菌Bacteroides clarus YIT12056菌株基因组DNA为模板采取PCR的方法扩增壳聚糖酶BC345基因待用；

PCR反应体系如下：

(2)表达载体的构建

将上述扩增出来的基因通过1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行切胶回收700bp左右大小的DNA片段(图1)，然后将回收的基因片段用快速性限制核酸内切酶XhoI和XbaI进行双酶切反应，同时，也对表达载体pPCIZα由XbaI和XhoI进行双酶切反应，酶切反应条件为37℃的水浴锅中反应1h。

酶切的反应体系如下：

双酶切反应后，得到了末端残基互补的载体和基因，然后通过T4连接酶就能将上述两个DNA片段特异性地连接起来。

T4连接反应体系如下：

连接反应在22℃条件下反应1h。

将上述通过T4连接酶连接后的质粒转入到Trans T1感受态细胞中，具体的操作方法如下：取100μL冰上融化的Trans T1感受态细胞，加入上述连接过的质粒5μL并用指尖轻轻拨打管底混匀(避免用枪吸打)，冰上静置25分钟；42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率；向离心管中加入700μL不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟；5000rpm离心一分钟收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含200μg/mL的Zeocin的LB培养基平板上；将平板倒置放于37℃培养箱培养12-18小时待长出单克隆后，得重组质粒pPICAɑ-BC345。

挑选相应单克隆菌落用于PCR反应，反应所用的引物为5′-AOX和3′-AOX引物，引物如下：

5′-AOX：GACTGGTTCCAATTGACAAGC

3′-AOX：GCAAATGGCATTCTGACATC

将上述PCR产物通过1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，挑取条带在700bp左右大小的菌落送去测序，经测序结果与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列一致，即含壳聚糖酶BC345；

(3)表达宿主的构建

将上述获得含壳聚糖酶BC345基因的表达载体pPCIZα重组质粒(pPICAɑ-BC345)通过电转化方法转入毕赤酵母GS115中。电穿孔转化电击条件：电压：1200V；电阻：300Ω；电容：25μF；脉冲时间：10mS；1-2次电击。

(4)蛋白表达及表达

将含有BC345基因的转化子接入到BMGY液体培养基中，250rpm，28℃培养OD600至12-16之间时；5000rpm，离心2分钟，弃上清，收集细胞沉淀转移到50mL BMMY液体培养基中，250rpm28℃继续培养；每隔24小时在培养基中加入浓度为100wt％的甲醇至培养基中甲醇终浓度为0.5％。培养96小时，将发酵上清液离心，用10KDa超滤膜浓缩，经Ni-柱与分子筛进行纯化，得到了电泳纯的BC345蛋白样品。

实施例2壳聚糖酶BC345酶学性质的测定

①该壳聚糖酶分子量大小确定：将纯化后的BC345蛋白样品按照常规方式进行不连续十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图2所示。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为一条电泳带，根据已知分子量的标准蛋白质SDS-PAGE电泳图谱进行比较，BC345蛋白的分子量约为26000道尔顿(26kDa)，该酶为单体蛋白。

②壳聚糖酶的活力测定：

壳聚糖酶的活力测定采用二硝基水杨酸(DNS)方法。酶活单位定义：1U表示在上述条件下每分钟释放1μmol还原糖所需要的酶量。为测定壳聚糖酶BC345对壳聚糖的Km和Vmax，将0.5mL不同浓度的壳聚糖溶液(0.2、1、2、5、10mg/mL)分别与0.1mL壳聚糖酶BC345(最终酶浓度5.0U/mL)混合。37℃反应20min，加入4.0mL 10％TCA溶液终止反应。根据双倒数作图法(Lineweaver-Burk)以1/[S]为横坐标1/v为纵坐标作图，直线的的斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax，计算出动力学常数Km和最大反应速度Vmax。结果如表1所示，BC345的Vmax为10.53μmol min^-1ml^-1，Km为4.51μM，k_cat为2.45s^-1，k_cat/Km为0.54μM s^-1。

③壳聚糖酶BC345最适pH:

在pH梯度为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0条件下分别测定该壳聚糖酶的活性，所用的壳聚糖浓度为5mg/mL,壳聚糖酶的浓度为0.1mg/mL,反应体系和方法如上述②中一样。如图3所示，该壳聚糖酶的最适pH为7.0～7.5之间。壳聚糖单糖是唯一的碱性单糖，当壳聚糖被壳聚糖酶降解后，生成的单糖会导致pH升高，如果是偏好酸性的壳聚糖酶则会出现底物抑制效应，但是本发明涉及的偏好碱性的壳聚糖酶不会出现这种底物抑制效应，这是本发明涉及的壳聚糖酶酶活高的一个原因。

④壳聚糖酶BC345降解壳聚糖的作用模式

用如上述③所述的反应体系，37℃反应24h后，将产物进行TLC鉴定，所用的展层剂为H₂O：乙酸：甲醇为2:1:1，展层1h，然后用20％硫酸显色(参见图4)，如图4可见该壳聚糖酶的产物为2～4糖，产物比较单一，具有生产低聚合度壳寡糖的工业应用前景。

⑤壳聚糖酶热稳定性：

将该壳聚糖酶BC345置于55℃条件下孵育不同时间，每隔20min取样转移至冰上5min，检测残余酶活。37℃条件下测定剩余的壳聚糖酶活力(参见图5)，如图5所示，BC345在45℃的温度下的半衰期为22min，100min后酶活力基本完全丧失。

将该壳聚糖酶置于不同温度条件下(40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃)孵育10min，取孵育后的壳聚糖酶，测定其剩余的酶活力(参见图6)。如图6所示BC345在55保温10min，酶活丧失50％。

实施例3

壳聚糖酶突变体的构建

1)突变体BC345/Y116A是将壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的络氨酸Y突变成丙氨酸A，如下SEQ ID NO:4所示。具体实施方法为，通过定点突变的引物，使用上述实施例获得质粒pPICAɑ-BC345为模板，突变体引物如下所示，经PCR获得突变株。

PCR反应体系如下：

正向引物(10pM)	1μL
		反向引物(10pM)	1μL
模板DNA	1μL
		2×TransStart FastPfu PCR SuperMix	50μL
H<sub>2</sub>O	43μL

PCR扩增条件如下：预变性，变性，退火，延伸，循环33次，延伸。Length:27上游引物:

5'-AGAGCCAACGCTACTTCTGTTATCACT-3'

Length:29

下游引物:

5'-AGCGTTGGCTCTGTAAGCGATGTCTCTGT-3'

2)突变体BC345PA是在壳聚糖酶BC345氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A，序列如SEQ ID NO:5所示。具体实施方法为，通过定点突变的引物，使用上述实施例获得质粒pPICAɑ-BC345为模板，突变体引物如下所示，经PCR获得突变株pPICAɑ-BC345PA。

PCR反应体系如下：

PCR扩增条件如下：预变性，变性，退火，延伸，循环33次，延伸。

上游引物：

5’-ATGAAGACTTGGAAGGCTGAAGCTGCTATCATCGCT-3’

下游引物：

5’-CTCGAGTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCGTTTCAGATAATAGTTCA-3’(下划线处为所增加的柔性片段)

3)突变体BC345/Y116A/PA是在壳聚糖酶BC345氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A的柔性区域，同时把116位的酪氨酸突变成了丙氨酸，序列如SEQ ID NO:6所示。具体实施方法为，通过定点突变的引物，使用上述实施例获得质粒pPICAɑ-BC345为模板，突变体引物如下所示，经PCR获得突变株。

PCR反应体系如下：

使用pPICAɑ-BC345PA为模板

引物为：

上游引物：

5’-ATGAAGACTTGGAAGGCTGAAGCTGCTATCATCGCT-3’

下游引物：

SEQ ID NO:4

MKTWKAEAAIIAVGMVLLGVVIKWGINDFIDKERIVSVKGLAEMEVPADKVIWPLMYKDIGNDPSLLYANMEQKNKVIVKFLESNGIAKEEISIAPPEVIDMQAERYGNRDIAYRANATSVITVTSKNVDKVRKLMSEQAELLKQGIAISGGDYRYNVVYEFTGLNDVKPQMIEEATKNARAAAEKFAKDSDSSLGKIRNASQGQFSISDRDANTPYIKSIRVVTTVNYYLKR

(a)序列特征：

●长度：233

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Bacteroides clarus YIT 12056

SEQ ID NO:5

MKTWKAEAAIIAVGMVLLGVVIKWGINDFIDKERIVSVKGLAEMEVPADKVIWPLMYKDIGNDPSLLYANMEQKNKVIVKFLESNGIAKEEISIAPPEVIDMQAERYGNRDIAYRYNATSVITVTSKNVDKVRKLMSEQAELLKQGIAISGGDYRYNVVYEFTGLNDVKPQMIEEATKNARAAAEKFAKDSDSSLGKIRNASQGQFSISDRDANTPYIKSIRVVTTVNYYLKRAAAAAAAA(插入的序列共8个丙氨酸)

(a)序列特征：

●长度：241

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Bacteroides clarus YIT 12056

SEQ ID NO:6

MKTWKAEAAIIAVGMVLLGVVIKWGINDFIDKERIVSVKGLAEMEVPADKVIWPLMYKDIGNDPSLLYANMEQKNKVIVKFLESNGIAKEEISIAPPEVIDMQAERYGNRDIAYRANATSVITVTSKNVDKVRKLMSEQAELLKQGIAISGGDYRYNVVYEFTGLNDVKPQMIEEATKNARAAAEKFAKDSDSSLGKIRNASQGQFSISDRDANTPYIKSIRVVTTVNYYLKRAAAAAAAA(插入的序列共8个A)

(a)序列特征：

●长度：241

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Bacteroides clarus YIT 12056

实施例4壳聚糖酶BC345突变体BC345/Y116A、BC345PA和BC345/Y116A/PA酶学性质的测定：

按实施例2中记载的方法对突变体BC345/Y116A、BC345PA和BC345/Y116A/PA测定其酶活、热稳定性，结果参见表1、图5和图6。

如表1所示，突变体BC345/Y116A相比于野生型蛋白BC345酶活提高了70％，说明116号氨基酸位点突变能够提高该壳聚糖酶的活力。突变体BC345PA，在该壳聚糖酶BC345的氨基酸末端加上一段柔性的氨基酸片段，相比于野生型蛋白BC345提高其酶活力50％左右。

如图5、图6所示，突变体BC345/Y116A突变116号位点的氨基酸与野生型相比其热稳定性相当；但与现有的壳聚糖酶相比本发明酶以及突变体的热稳定性效果显著；

而突变体BC345PA随着孵育时间的延长，图上所示野生型BC345蛋白的活力下降很多，而突变体BC345PA稍有下降，相比于野生型蛋白BC345，该突变体BC345PA的热稳定性大大的提高了，说明末端的柔性片段对蛋白结构的稳定起到了重要的作用。

同时突变株BC345/Y116A/PA酶活力提高了62.8％，如图表1所示。突变体BC345/Y116A/PA的稳定性相比野生型半衰期从22min提高到了100min，提高了近5倍。突变体的热稳定性与更高的酶活，具有工业化应用的潜力。

表1.BC345与各突变体动力学参数表

序列表

<110> 潍坊麦卡阿吉生物科技有限公司

<120> 一种壳聚糖酶突变体及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaaacat ggaaagcaga agccgccatt attgctgtcg gtatggtttt gttgggagtg 60

gtaataaaat ggggtataaa cgattttata gataaggagc gtattgtcag cgtaaaaggg 120

ctggctgaga tggaagtccc cgccgataag gtaatatggc ctttgatgta taaggatatc 180

gggaacgacc cgtctttgct ttatgccaat atggagcaga agaacaaagt tattgtaaag 240

tttctggaaa gtaacggcat cgctaaagaa gaaatcagca ttgctccgcc cgaagtgata 300

gacatgcagg ccgaacgtta cggaaaccgt gatatagctt atcggtacaa tgccacatcg 360

gtcattacgg tcacttcaaa gaatgtagac aaggtgcgga agttgatgtc ggaacaagcc 420

gagctgctga aacagggtat tgccatcagc gggggcgatt accgctataa cgtggtatac 480

gagtttacgg gcttgaatga cgtgaaaccg caaatgatag aagaagctac gaagaatgcc 540

cgtgccgcag ccgagaagtt tgcgaaagac tcggacagca gtctgggtaa gatacggaat 600

gcttcgcagg gacaattctc catttcggac agagatgcca atacacctta tattaagagc 660

atacgcgtag tgactaccgt gaactattat ctgaaacgat ag 702

<210> 2

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaagactt ggaaggctga agctgctatc atcgctgttg gtatggtttt gttgggtgtt 60

gttatcaagt ggggtatcaa cgacttcatc gacaaggaaa gaatcgtttc tgttaagggt 120

ttggctgaaa tggaagttcc agctgacaag gttatctggc cattgatgta caaggacatc 180

ggtaacgacc catctttgtt gtacgctaac atggaacaaa agaacaaggt tatcgttaag 240

ttcttggaat ctaacggtat cgctaaggaa gaaatctcta tcgctccacc agaagttatc 300

gacatgcaag ctgaaagata cggtaacaga gacatcgctt acagatacaa cgctacttct 360

gttatcactg ttacttctaa gaacgttgac aaggttagaa agttgatgtc tgaacaagct 420

gaattgttga agcaaggtat cgctatctct ggtggtgact acagatacaa cgttgtttac 480

gaattcactg gtttgaacga cgttaagcca caaatgatcg aagaagctac taagaacgct 540

agagctgctg ctgaaaagtt cgctaaggac tctgactctt ctttgggtaa gatcagaaac 600

gcttctcaag gtcaattctc tatctctgac agagacgcta acactccata catcaagtct 660

atcagagttg ttactactgt taactactac ttgaagagat aa 702

<210> 3

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Lys Thr Trp Lys Ala Glu Ala Ala Ile Ile Ala Val Gly Met Val

1 5 10 15

Leu Leu Gly Val Val Ile Lys Trp Gly Ile Asn Asp Phe Ile Asp Lys

20 25 30

Glu Arg Ile Val Ser Val Lys Gly Leu Ala Glu Met Glu Val Pro Ala

35 40 45

Asp Lys Val Ile Trp Pro Leu Met Tyr Lys Asp Ile Gly Asn Asp Pro

50 55 60

Ser Leu Leu Tyr Ala Asn Met Glu Gln Lys Asn Lys Val Ile Val Lys

65 70 75 80

Phe Leu Glu Ser Asn Gly Ile Ala Lys Glu Glu Ile Ser Ile Ala Pro

85 90 95

Pro Glu Val Ile Asp Met Gln Ala Glu Arg Tyr Gly Asn Arg Asp Ile

100 105 110

Ala Tyr Arg Tyr Asn Ala Thr Ser Val Ile Thr Val Thr Ser Lys Asn

115 120 125

Val Asp Lys Val Arg Lys Leu Met Ser Glu Gln Ala Glu Leu Leu Lys

130 135 140

Gln Gly Ile Ala Ile Ser Gly Gly Asp Tyr Arg Tyr Asn Val Val Tyr

145 150 155 160

Glu Phe Thr Gly Leu Asn Asp Val Lys Pro Gln Met Ile Glu Glu Ala

165 170 175

Thr Lys Asn Ala Arg Ala Ala Ala Glu Lys Phe Ala Lys Asp Ser Asp

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Lys Ile Arg Asn Ala Ser Gln Gly Gln Phe Ser Ile

195 200 205

Ser Asp Arg Asp Ala Asn Thr Pro Tyr Ile Lys Ser Ile Arg Val Val

210 215 220

Thr Thr Val Asn Tyr Tyr Leu Lys Arg

225 230

<210> 4

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Lys Thr Trp Lys Ala Glu Ala Ala Ile Ile Ala Val Gly Met Val

1 5 10 15

Leu Leu Gly Val Val Ile Lys Trp Gly Ile Asn Asp Phe Ile Asp Lys

20 25 30

Glu Arg Ile Val Ser Val Lys Gly Leu Ala Glu Met Glu Val Pro Ala

35 40 45

Asp Lys Val Ile Trp Pro Leu Met Tyr Lys Asp Ile Gly Asn Asp Pro

50 55 60

Ser Leu Leu Tyr Ala Asn Met Glu Gln Lys Asn Lys Val Ile Val Lys

65 70 75 80

Phe Leu Glu Ser Asn Gly Ile Ala Lys Glu Glu Ile Ser Ile Ala Pro

85 90 95

Pro Glu Val Ile Asp Met Gln Ala Glu Arg Tyr Gly Asn Arg Asp Ile

100 105 110

Ala Tyr Arg Ala Asn Ala Thr Ser Val Ile Thr Val Thr Ser Lys Asn

115 120 125

Val Asp Lys Val Arg Lys Leu Met Ser Glu Gln Ala Glu Leu Leu Lys

130 135 140

Gln Gly Ile Ala Ile Ser Gly Gly Asp Tyr Arg Tyr Asn Val Val Tyr

145 150 155 160

Glu Phe Thr Gly Leu Asn Asp Val Lys Pro Gln Met Ile Glu Glu Ala

165 170 175

Thr Lys Asn Ala Arg Ala Ala Ala Glu Lys Phe Ala Lys Asp Ser Asp

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Lys Ile Arg Asn Ala Ser Gln Gly Gln Phe Ser Ile

195 200 205

Ser Asp Arg Asp Ala Asn Thr Pro Tyr Ile Lys Ser Ile Arg Val Val

210 215 220

Thr Thr Val Asn Tyr Tyr Leu Lys Arg

225 230

<210> 5

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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1 5 10 15

Leu Leu Gly Val Val Ile Lys Trp Gly Ile Asn Asp Phe Ile Asp Lys

20 25 30

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65 70 75 80

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165 170 175

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Ser Ser Leu Gly Lys Ile Arg Asn Ala Ser Gln Gly Gln Phe Ser Ile

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Ser Asp Arg Asp Ala Asn Thr Pro Tyr Ile Lys Ser Ile Arg Val Val

210 215 220

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225 230 235 240

Ala

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<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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1 5 10 15

Leu Leu Gly Val Val Ile Lys Trp Gly Ile Asn Asp Phe Ile Asp Lys

20 25 30

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35 40 45

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85 90 95

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100 105 110

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Glu Phe Thr Gly Leu Asn Asp Val Lys Pro Gln Met Ile Glu Glu Ala

165 170 175

Thr Lys Asn Ala Arg Ala Ala Ala Glu Lys Phe Ala Lys Asp Ser Asp

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Lys Ile Arg Asn Ala Ser Gln Gly Gln Phe Ser Ile

195 200 205

Ser Asp Arg Asp Ala Asn Thr Pro Tyr Ile Lys Ser Ile Arg Val Val

210 215 220

Thr Thr Val Asn Tyr Tyr Leu Lys Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

225 230 235 240

Ala

Claims

1.一种壳聚糖酶突变体，其特征在于：壳聚糖酶突变体为壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的酪氨酸Y突变成丙氨酸A，所得突变体BC345/Y116A的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

或，所述壳聚糖酶BC345氨基酸的末端加上8个丙氨酸，所得突变体BC345PA的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

或，壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的酪氨酸Y突变成丙氨酸A，且壳聚糖酶BC345氨基酸的末端加上8个丙氨酸，所得突变体BC345/Y116A/ PA的其氨基酸序列如SEQID NO:6所示；

所述壳聚糖酶BC345来源于人肠道菌Bacteroides clarus YIT 12056菌株，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种权利要求1所述壳聚糖酶突变体用于降解壳聚糖生产壳寡糖的应用。

3.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒为含有编码权利要求1所述壳聚糖酶突变体的基因的质粒。

4.按权利要求3所述的重组质粒，其特征在于：所述质粒载体为pPCIZα。

5.一种权利要求3所述重组质粒转化至毕赤酵母（Pichia pastoris）中获得的基因工程菌株。

6.一种权利要求5所述基因工程菌株产的壳聚糖酶突变体在用于降解壳聚糖生产壳寡糖中的应用。