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CN112198233B - 用于糖尿病人群中视网膜病变诊断的联合标志物及试剂盒 - Google Patents

用于糖尿病人群中视网膜病变诊断的联合标志物及试剂盒 Download PDF

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CN112198233B CN201910609167.0A CN201910609167A CN112198233B CN 112198233 B CN112198233 B CN 112198233B CN 201910609167 A CN201910609167 A CN 201910609167A CN 112198233 B CN112198233 B CN 112198233B
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Abstract

本发明涉及血样中代谢物2‑氮己环酮和12‑羟基‑花生四烯酸作为组合标志在制备用于诊断糖尿病人群中的视网膜病变患者的试剂盒中的新应用。本发明还涉及检测糖尿病患者中的视网膜病变的试剂盒，检测来自受试者的血样中的上述两种代谢物的组合标志物的各自相对浓度。基于二元逻辑回归方程计算所述组合标志物变量Prob以及判断节点值，判断糖尿病受试者是否有视网膜并发症。所述试剂盒具有检测成本低，特异性和敏感度高的特点。上述两种小分子代谢物的联合使用，可以在辅助诊断糖尿病人群中视网膜并发症中得到应用，且在早期的糖尿病视网膜病变的诊断中效果同样良好。

Description

用于糖尿病人群中视网膜病变诊断的联合标志物及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种新的组合标志物在诊断糖尿病人群的视网膜并发症中的应用。属于分析化学及临床医学及医学领域。
背景技术
糖尿病是全球高发性的慢性代谢疾病。糖尿病患者由于胰岛素代谢异常，引起全身各器官的微血管病变。糖尿病视网膜病变是糖尿病微血管病变中最重要的并发症之一，也是糖尿病造成失明的主要原因。糖尿病视网膜病变分为非增殖型和增殖型两种。非增殖期病变相对较轻，可以具体分为三期。对于非增值型一期眼底主要表现为微血管瘤；二期眼底可观察到眼底出血及硬性渗出；三期可观察到出现眼底棉绒斑。对于非增殖型糖尿病视网膜病变及时采用眼底激光治疗，治疗效果相对理想。否则疾病很快的进入到增殖型。增殖期患者视力会极大减退，甚至导致失明。目前的诊断技术需要患者定期去眼科进行眼底荧光血管造影等检查，成本较高，过程繁琐，且对于早期的视网膜病变的确诊较为困难。因此开发具新的临床诊断方法势在必行。
代谢组学是一门致力于检测内源性代谢物种类和含量的变化的学科，它可以通过发现潜在的生物标志物来进行临床疾病的诊断和个性化治疗(P.Luo,P.Y.Yin,etal.Alarge-scale,multi-center serum metabolite biomarkers identification studyfor the early detection of hepatocellular carcinoma,Hepatology，2017)。为了增强判断的准确性，可以将血样中检测到的多种代谢物联合得到组合型的代谢标志物。通过二元逻辑回归模型得到判别公式，计算判别可能性的Prob值，提高检测的敏感度和特异性。目前已有多种分析方法应用于代谢组学血液检测，如毛细管电泳色谱、气相色谱、液相色谱等。其中液相色谱的应用较为广泛，且通常与质谱仪串联使用。
本发明利用超高液相色谱串联高分辨质谱检测血样代谢谱，优选出了2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸的联合使用，以作为一种联合型代谢标志物判别糖尿病人群中有无视网膜病变。12-羟基-花生四烯酸能调控血管内皮生长因子和色素上皮衍生因子的表达，是视网膜新生血管化的重要调节因子(Al-Shabrawey M1,Mussell R，et al.IncreasedExpression and Activity of 12-Lipoxygenase in Oxygen-Induced IschemicRetinopathy and Proliferative Diabetic Retinopathy.Diabetes,2011)。2-氮己环酮是生命体内小分子代谢物，但其参与的代谢通路尚不明确，其与糖尿病及视网膜病变机理的关联尚也有待进一步研究。目前尚无将此两种代谢物联合用于诊断糖尿病视网膜病变的报道。
发明内容
本发明的目的是针对糖尿病人群中视网膜病变诊断困难尤其是早期的视网膜病变患者难以区分的临床实际问题，提供了一种新的代谢组合能够应用于糖尿病人群中视网膜病变的诊断，上述代谢物组合的特征和检测方法如下：
该代谢物联合标志物包括两种代谢物：2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸。其中2-氮己环酮在质谱正离子模式下检测，12-羟基-花生四烯酸在负离子模式下检测。
标准品包括2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸，所述标准品分别用于对应的血样代谢物2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸的定性；用于预处理来自受试者的血样提取液：包含内标4.25ug/mLD5-色氨酸和2.5ug/mLD3-硬脂酸的甲醇溶液。
分离系统为waters超高液相色谱系统，柱60℃；流速0.4mL/min，(也可以采用柱25-60℃，流速0.2-1.0mL/min，但因为分离速度慢或者分离较差而未被采用)进样室温度为6℃；进样体积为5μL(也可以采用5-10ul)。检测器采用的质谱为高分辨的Q Exactive HF质谱(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL,USA)。
对于2-氮己环酮的分离，色谱柱为waters C8色谱柱(也可以采用C18柱)，流动相为0.1％(v/v)甲酸的水，B相为0.1％(v/v)甲酸的乙腈(也选择0.1％(v/v)甲酸的水溶液和乙腈(甲醇)溶液洗脱，但灵敏度相对要低一些)；质谱采用正离子检测模式。
对于12-羟基-花生四烯酸的分离，色谱柱为waters T3色谱柱，流动相A为6.5mM的碳酸氢铵水溶液，流动相B为6.5mM的碳酸氢铵甲醇水溶液，甲醇:水＝95:5(v/v),(也可以选择醋酸铵水溶液和甲醇(乙腈)洗脱液，或者甲酸水溶液和甲醇(乙腈)洗脱液，但6.5mM的碳酸氢铵水溶液和6.5mM碳酸氢铵甲醇水溶液，甲醇:水＝95:5(v/v)的灵敏度较高)。质谱采用负离子检测模式。
血样预处理方法：
血样在4℃解冻，取50-100uL血样样本加入96孔除蛋白板中，加入200-400uL含内标的提取液(如甲醇，乙醇等)，涡旋30-90s混合均匀。采用正压过滤或者离心机过滤(转速为400g，时间为5-15min)的方式去除蛋白。冷冻干燥。然后用甲醇:水＝1:4(v/v)复溶。
将96孔板直接转移到液相色谱的自动进样箱中进行液相色谱质谱联用的检测分析。根据标准品的保留时间辅助定性出样本其中的2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸，并提取其洗脱峰强度。将2-氮己环酮与内标D5-色氨酸的洗脱峰强度比较，即可获得2-氮己环酮的相对浓度。将12-羟基-花生四烯酸，与内标D3-硬脂酸的洗脱峰强度比较，即可获得12-羟基-花生四烯酸的相对浓度。
分别采集两批次的糖尿患者(其中包括无视网膜病变，1期视网膜病变、2期视网膜病变、3期视网膜病变和增生期视网膜病变)的样本。以第一批次作为训练集建模，得到联合标志物变量的Prob值和截点值，第二批次样本作为测试集用于验证。
训练集中将2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸通过SPSS软件进行二元逻辑回归分析。所建模型获得的回归方程如下：
X＝2.962*A+156.350*B-2.700
Prob(糖尿病有视网膜病变)＝1/(1+e-x)；
其中A、B分别为2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸的内标校正后的相对浓度。2-氮己环酮采用质谱正离子模式检测，并用内标D5-色氨酸校正(相除)，12-羟基-花生四烯酸采用质谱负离子模式检测，并用内标D3-硬脂酸校正(相除)。所得变量Prob在有视网膜病变的糖尿病人群中增高，该变量值可用于辅助判断糖尿病人群中的视网膜病变。本发明确定的该联合标志物的对糖尿病人群中是否有视网膜病变的最佳截点值(cut-off值)设为0.863。对于糖尿病人群，Prob值高于该截点值的则判断可能为有视网膜病变，而低于该截点值则表明目前暂无视网膜病变。也可以根据实验者的实验结果通过二元逻辑回归得到新的方程，并定义该实验室的最佳截点值。截点值的确认依据为根据联合标志物变量Prob值作受试者工作曲线(ROC曲线)。ROC曲线的纵坐标为敏感度，横坐标为(1-特异性)，计算得到曲线上敏感度与特异性之和最大的点，该点对应的Prob值即为最佳截点值。该点对应的敏感度和特异性即为组合标志物对疾病判别的敏感度和特异性。
所建立模型中2-氮己环酮、12-羟基-花生四烯酸及其组合标志物对糖尿病视网膜病的判别敏感度和特异性均较高(见表1)。其中组合标志物的AUC＝0.948，敏感度为0.920，特异性为0.918。组合标志物在训练集和测试集中对糖尿病人群中有无视网膜病变具有良好的判断能力(见图2),正确诊断率分别为0.852和0.827(见表2和图4)。同时糖尿病样品包含无视网膜病变和1期的早期视网膜病变，采用两代谢物判断此两组的效果也很好(图3)。优异的ROC曲线结果和训练集、测试集中良好的正确诊断率使得组合标志物具有糖尿病中视网膜病变的诊断潜力。
本发明涉及试剂盒通过检测来自受试者的血样中2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸联合标志物的相对浓度，基于二元逻辑回归计算所述联合标志物变量Prob值，再基于确定的截点值，判断所述糖尿病受试者是否患有视网膜病变。
所述试剂盒具有检测成本低，特异性和敏感度高的特点。上述两种小分子代谢物的联合使用，可以在辅助诊断糖尿病人群中视网膜并发症中得到应用，且在早期的糖尿病视网膜病变的诊断中效果同样良好。
附图说明：
图1.采集两批次的糖尿患者的样本。以第一批次作为训练集建模，第二批次样本作为测试集用于验证。图1A，图1B分别为训练集和测试集中2-氮己环酮在糖尿病视网膜病变各个时期的血清样本中的相对浓度的变化(均值±标准误差)。图1C，图1D分别为训练集和测试集中12-羟基-花生四烯酸在糖尿病视网膜病变各个时期的血清样本中的相对浓度的变化(均值±标准误差)。纵坐标代表相对浓度，横坐标0，1，2，3，4，5分别代表无视网膜病变糖尿病组，1期视网膜病变糖尿病组，2期视网膜病变糖尿病组，3期视网膜病变糖尿病组以及增生期视网膜病变糖尿病组。
图2.联合标志物在判别糖尿病人群中有无视网膜病变的ROC曲线。图2A为训练集，图2B为测试集。
图3.联合标志物在判别糖尿病人群中无视网膜病变以及早期视网膜病变的ROC曲线。图3A为训练集，图3B为测试集。
图4.糖尿病人群的联合标志物变量Prob值分布。截点值0.863用横线表示。图4A为训练集，图4B为测试集。纵坐标代表相对浓度，横坐标0，1，2，3，4，5分别代表无视网膜病变糖尿病组，1期视网膜病变糖尿病组，2期视网膜病变糖尿病组，3期视网视膜病变糖尿病组以及增生期视网膜病变糖尿病组。
具体实施方式
实施例1
1.血清样品收集
所有纳入研究的志愿者在血样收集前签署知情同意书。
相同条件下采集血清样本：73例无视网膜病变的糖尿病人和224例有视网膜病变的糖尿患者(其中，1期早期视网膜病变65例，2期视网膜病变60例，3期视网膜病变55例及增生期视网膜病变44例)的血清样本，置于-80℃冰箱保存备检。
2.分析方法
2.1血清样本预处理：
血样在4℃解冻，分别取50uL血清样本加入96孔除蛋白板中，分别加入200uL含4.25ug/mLD5-色氨酸和2.5ug/mLD3-硬脂酸的甲醇提取液，涡旋60s混合均匀。采用正压过滤或者离心机过滤(转速为400g，10min)的方式去除蛋白。冷冻干燥。然后用甲醇:水＝1:4(v/v)复溶。将96孔板直接转移到液相色谱的自动进样箱中以待液相色谱质谱联用的检测分析。
2.2超高液相色谱质谱分析
(1)液相色谱：色谱仪为Waters AcQuity超高液相色谱(Waters,Ireland)；柱60℃；流速0.4mL/min；总的分离检测时间为12min；进样室温度为6℃；进样体积为5μL。
正离子模式分离条件为：Waters BEH C8色谱柱2.1mm×50mm,1.7μm；流动相：A相为0.1％(v/v)甲酸的水，B相为0.1％(v/v)甲酸的乙腈；洗脱梯度为：0～0.5min，95％A(v/v)，0.5～2min，梯度线性减少至60％A(v/v)，2～8min线性减少至0％A(v/v)，8～10min，以0％A(v/v)的体积比保持2分钟，10～10.1min，梯度从0％A(v/v)线性增至95％A(v/v)，10.1～12min，维持95％A(v/v)的梯度平衡系统；
负离子模式分离条件为：Waters BEH T3色谱柱2.1mm×50mm,1.8μm；流动相A为6.5mM的碳酸氢铵水溶液，流动相B为6.5mM的碳酸氢铵甲醇水溶液，甲醇:水＝95:5(v/v)；洗脱梯度为：0～0.5min，98％A(v/v)，0.5～2min，梯度线性减少至60％A(v/v)，2～8min线性减少至0％A(v/v)，8～10min，以0％A(v/v)的体积比保持2分钟，10～10.1min，梯度从0％A(v/v)线性增至98％A(v/v)，10.1～12min，维持98％A(v/v)的梯度平衡系统；
(2)质谱条件
正、负离子模式下的喷雾电压分别为3.5kV和3.0kV，离子传输管的温度为300℃，鞘气和辅助气的流速分别为45和10(in arbitrary units)，辅助气的加热器温度为350℃，S-lens设置为50.0。质谱全扫加二级质谱采集模式下，全扫质谱和二级质谱：分辨率分别为120 000和30 000，自动增益控制目标分别为3×106和1×105，最大注入时间分别设置为100ms和50ms。全扫扫描范围为m/z 75-1050，选择每个全扫描循环中响应最强的前10个母离子进行二级质谱的采集。
2.3标准品分析
2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸的标准品配置于甲醇与水的混合溶液(1:4(v/v))，浓度分别为20ug/mL和10ug/mL。对两标准品溶液进行色谱质谱联用分析，检测条件同上血样检测条件。在正离子质谱模式下，根据2-氮己环酮提取的质荷比(100.0762±0.005)确认2-氮己环酮的保留时间。在负离子质谱模式下，根据12-羟基-花生四烯酸提取的质荷比(319.2273±0.005)确认12-羟基-花生四烯酸的保留时间。3.血清测试结果及辅助诊断方法
根据相应标准品的保留时间和提取质荷比分别定性出样本其中的2-氮己环酮(质谱正离子检测模式下保留时间0.75min，质荷比100.0762±0.005)和12-羟基-花生四烯酸(质谱负离子检测模式下保留时间5.98min，质荷比319.2273±0.005)，并提取其洗脱峰强度。提取D5-色氨酸(质谱正离子检测模式下保留时间0.93min，质荷比210.1291±0.005)和D3-硬脂酸(质谱负离子检测模式下保留时间7.56min，质荷比286.2826±0.005)的洗脱峰强度。将2-氮己环酮与内标D5-色氨酸的洗脱峰强度比较(相除)，即可获得2-氮己环酮的相对浓度。将12-羟基-花生四烯酸，与内标D3-硬脂酸的洗脱峰强度比较(相除)，即可获得12-羟基-花生四烯酸的相对浓度。2-氮己环酮在无视网膜病变的糖尿病患者和1,2,3及增生期有视网膜病变的糖尿患者相对4.25ug/mLD5-色氨酸的平均浓度为0.355、1.178、1.071、1.418和1.111(见图1A，纵坐标代表相对浓度，横坐标0，1，2，3，4，5分别代表无视网膜病变糖尿病组，1期视网膜病变糖尿病组，2期视网膜病变糖尿病组，3期视网膜病变糖尿病组以及增生期视网膜病变糖尿病组)。12-羟基-花生四烯酸在无视网膜病变的糖尿病患者和1,2,3及增生期有视网膜病变的糖尿患者相对2.5ug/mLD3-硬脂酸的平均浓度为0.005、0.029、0.032、0.035和0.036(见图1C，纵坐标代表相对浓度，横坐标0，1，2，3，4，5分别代表无视网膜病变糖尿病组，1期视网膜病变糖尿病组，2期视网膜病变糖尿病组，3期视网膜病变糖尿病组以及增生期视网膜病变糖尿病组)。对比无视网膜病变的糖尿病组，2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸在有视网膜病变的糖尿病组显著性上升(p<0.05)。同时将各样本的代谢物相对浓度带入以下回归方程中：
X＝2.962*A+156.350*B-2.700
Prob(糖尿病有视网膜病变)＝1/(1+e-x)；
其中A、B分别为2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸的内标校正后的相对浓度(内标浓度单位为ug/mL)。2-氮己环酮采用质谱正离子模式检测，并用内标D5-色氨酸校正(相除)，12-羟基-花生四烯酸采用质谱负离子模式检测，并用内标D3-硬脂酸校正(相除)。所得变量Prob在有视网膜病变的糖尿病人群中增高，该变量值可用于辅助判断糖尿病人群中的视网膜病变。截点值的确认依据为根据联合标志物变量Prob值作受试者工作曲线(ROC曲线)(见图2A)。ROC曲线的纵坐标为敏感度，横坐标为(1-特异性)，计算得到曲线上敏感度与特异性之和最大的点，该点对应的Prob值即为最佳截点值。。本发明确定的该联合标志物的对糖尿病人群中是否有视网膜病变的最佳截点值(cut-off值)为0.863。对于糖尿病人群，Prob值高于该截点值的则判断可能有视网膜病变，而低于该截点值则表明目前暂无视网膜病变。
计算各样本中根据代谢物和联合标志物变量的Prob值，作受试者工作曲线(ROC曲线)(见图2A)。计算得到曲线上敏感度与特异性之和最大的点，该点对应的敏感度和特异性即为组合标志物对疾病判别的敏感度和特异性。所建立模型中2-氮己环酮，12-羟基-花生四烯酸及其组合标志物对糖尿病视网膜病判别的敏感度和特异性均较高(见表1),且联合标志物比单一的标志物的敏感度和特异性明显提高(敏感度达到了0.920，特异性达到了0.918)。值的提出的是，组合标志物对糖尿病视网膜病判别的敏感度和特异性均同样很好(见表2，敏感度0.954，特异性0.918)。AUC表示ROC曲线下的面积，其值在0至1之间。曲线下面积越大，说明该项检验的诊断效能越大。图2A显示联合标志物的诊断能力达到了0.948的高值，表明联合标志物对区分无视网膜病变的糖尿病和有视网膜病变的糖尿病患者具有很好的判别能力。表1同时给出了AUC的95％的置信区间，也就是说AUC值落在该区间的可能性高达95％。
表1
Figure GDA0003089211150000071
将各样本中根据联合标志物变量计算的Prob值绘制于图4A(纵坐标代表Prob值，横坐标0，1，2，3，4，5分别代表无视网膜病变糖尿病组，1期视网膜病变糖尿病组，2期视网膜病变糖尿病组，3期视网膜病变糖尿病组以及增生期视网膜病变糖尿病组)。Prob值高于截点值0.863的则判断为有视网膜病变，而低于该截点值则表明目前暂无视网膜病变。Prob值对于有无视网膜病变的糖尿病人群的正确诊断率为0.852(见表2)。对于无视网膜病变的糖尿病和早期视网膜病变糖尿病患者也具有良好的判别能力(见图3A，AUC＝0.953)和准确率(见表2，准确率0.862)。
实施例2
1.血清样品收集，
所有纳入研究的志愿者在血样收集前签署知情同意书。
相同条件下采集血清样本：49例无视网膜病变的糖尿病人和205例有视网膜病变的糖尿患者(其中，1期早期视网膜病变52例，2期视网膜病变52例，3期视网膜病变55例及增生期视网膜病变46例)的血清样本，置于-80℃冰箱保存备检。
2.分析方法
同实施例1
3.血清测试结果及辅助诊断方法
实例2的测试集的结果与实例1训练集的结果基本吻合。根据相应标准品的保留时间和提取质荷比分别定性出样本其中的2-氮己环酮(质谱正离子检测模式下保留时间0.75min，质荷比100.0762±0.005)和12-羟基-花生四烯酸(质谱负离子检测模式下保留时间5.98min，质荷比319.2273±0.005)，并提取其洗脱峰强度。提取D5-色氨酸(质谱正离子检测模式下保留时间0.93min，质荷比210.1291±0.005)和D3-硬脂酸(质谱负离子检测模式下保留时间7.56min，质荷比286.2826±0.005)的洗脱峰强度。将2-氮己环酮与内标D5-色氨酸的洗脱峰强度比较(相除)，即可获得2-氮己环酮的相对浓度。将12-羟基-花生四烯酸，与内标D3-硬脂酸的洗脱峰强度比较(相除)，即可获得12-羟基-花生四烯酸的相对浓度。获得的2-氮己环酮在无视网膜病变的糖尿病患者和1,2,3及增生期有视网膜病变的糖尿患者的相对4.25ug/mLD5-色氨酸的平均浓度为0.292、1.268、1.210、1.383和1.187(见图1B，纵坐标代表相对浓度，横坐标0，1，2，3，4，5分别代表无视网膜病变糖尿病组，1期视网膜病变糖尿病组，2期视网膜病变糖尿病组，3期视网膜病变糖尿病组以及增生期视网膜病变糖尿病组)。12-羟基-花生四烯酸在无视网膜病变的糖尿病患者和1,2,3及增生期有视网膜病变的糖尿患者相对2.5ug/mLD3-硬脂酸的平均浓度为0.007、0.043、0.039、0.036和0.036(见图1D，纵坐标代表相对浓度，横坐标0，1，2，3，4，5分别代表无视网膜病变糖尿病组，1期视网膜病变糖尿病组，2期视网膜病变糖尿病组，3期视网膜病变糖尿病组以及增生期视网膜病变糖尿病组)。对比无视网膜病变的糖尿病组，2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸在有视网膜病变的糖尿病组显著性上升(p<0.05)。
将各样本的代谢物相对浓度带入以下回归方程中：
X＝2.962*A+156.350*B-2.700
Prob(糖尿病有视网膜病变)＝1/(1+e-x)；
其中A、B分别为2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸的内标校正后的相对浓度(内标浓度单位为ug/mL)。2-氮己环酮采用质谱正离子模式检测，并用内标D5-色氨酸校正(相除)，12-羟基-花生四烯酸采用质谱负离子模式检测，并用内标D3-硬脂酸校正(相除)。本发明确定的该联合标志物的对糖尿病人群中是否有视网膜病变的最佳截点值(cut-off值)为0.863。对于糖尿病人群，Prob值高于该截点值的则判断可能有视网膜病变，而低于该截点值则表明目前暂无视网膜病变。
计算各样本中根据代谢物和联合标志物变量的Prob值，作受试者工作曲线(ROC曲线)(见图2B)。计算得到曲线上敏感度与特异性之和最大的点，该点对应的敏感度和特异性即为组合标志物对疾病判别的敏感度和特异性。所建立模型中组合标志物对糖尿病视网膜病判别的敏感度和特异性均较高(见表2，敏感度0.863，特异性0.939)。值的提出的是，组合标志物对糖尿病视网膜病判别的敏感度和特异性均同样很好(见表2，敏感度0.942，特异性0.939)。AUC表示ROC曲线下的面积，其值在0至1之间。曲线下面积越大，说明该项检验的诊断效能越大。图2B显示联合标志物的诊断能力达到了0.948的高值，表明联合标志物对区分无视网膜病变的糖尿病和有视网膜病变的糖尿病患者具有很好的判别能力。表1同时给出了AUC的95％的置信区间，也就是说AUC值落在该区间的可能性高达95％。
将各样本中根据联合标志物变量计算的Prob值绘制于图4B(纵坐标代表Prob值，横坐标0，1，2，3，4，5分别代表无视网膜病变糖尿病组，1期视网膜病变糖尿病组，2期视网膜病变糖尿病组，3期视网膜病变糖尿病组以及增生期视网膜病变糖尿病组)。Prob值高于截点值0.863的则判断为有视网膜病变，而低于该截点值则表明目前暂无视网膜病变。Prob值对于有无视网膜病变的糖尿病人群的正确诊断率为0.827(见表2)。对于无视网膜病变的糖尿病和早期视网膜病变的糖尿病也具有良好的判别能力(见图3B,AUC＝0.967)和准确率(见表2,准确率0.901)。
表2
Figure GDA0003089211150000101
优异的ROC曲线结果和训练集、测试集中良好的正确诊断率使得组合标志物具有糖尿病中视网膜病变的诊断潜力。
本发明涉及试剂盒通过检测来自受试者的血清样品中2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸联合标志物的相对浓度，基于二元逻辑回归计算所述联合标志物变量Prob值，再基于确定的截点值，判断所述糖尿病受试者是否患有视网膜病变。也可以根据实验者的2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸结果通过二元逻辑回归得到新的方程，并定义该实验室的最佳截点值。本发明涉及的组合标志物对糖尿病人群中视网膜病变的诊断具有高敏感度、高特异性特征。同时该组合标志物对于早期的病变也能有良好的诊断，具有较好的应用前景。

Claims (8)

1.联合标志物的试剂在制备诊断糖尿病患者中的视网膜病变试剂盒中的应用，其中所述联合标志物包括2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸。
2.一种检测糖尿病受试者中的视网膜病变的试剂盒，所述试剂盒包括：
（1）标准品：2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸，所述标准品分别用于对应的血样中2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸的定性；和
（2）用于预处理受试者的血样的提取液：含内标D5-色氨酸和D3-硬脂酸的甲醇溶液；和
（3）用于洗脱色谱柱的洗脱液；
洗脱液为：
质谱正离子检测模式下流动相A: 甲酸体积浓度0.1%-0.5% 的水，和
质谱正离子检测模式下流动相B: 甲酸体积浓度0.1%-0.5% FA的乙腈；
质谱负离子检测模式下流动相A: 5-15mM的碳酸氢铵水溶液，和
质谱负离子检测模式下流动相B: 5-15mM的碳酸氢铵甲醇水溶液，其中甲醇占总体积百分比为90%-98%。
3.按照权利要求2所述的试剂盒，其中所述用于色谱柱的洗脱液在质谱正离子检测模式下是用于洗脱waters C8色谱柱的洗脱液；在质谱负离子检测模式下是用于洗脱watersT3色谱柱的洗脱液。
4.按照权利要求2所述的试剂盒，所述受试者均为糖尿病患者，其中包括有视网膜病变的糖尿病患，以及作为对照的无视网膜病变的糖尿病患者。
5.按照权利要求2所述的试剂盒，所述的2-氮己环酮、12-羟基-花生四烯酸标准品和受试者样本分别经超高相液相色谱质谱联用技术检测；根据标准品的保留时间辅助定性出样本中的2-氮己环酮和12-羟基-花生四烯酸，并提取其洗脱峰强度；将2-氮己环酮与内标D5-色氨酸的洗脱峰强度比较相除，即可获得2-氮己环酮的相对浓度；将12-羟基-花生四烯酸，与内标D3-硬脂酸的洗脱峰强度比较相除，即可获得12-羟基-花生四烯酸的相对浓度。
6.按照权利要求5所述的试剂盒，所述的2-氮己环酮和D5-色氨酸在正离子质谱模式下检测，提取的质荷比分别为：100.0762±0.005和210.1291±0.005；12-羟基-花生四烯酸和D3-硬脂酸在负离子质谱模式下检测，提取的质荷比分别为：319.2273±0.005和286.2826±0.005。
7.按照权利要求5所述的试剂盒，由两种代谢物经内标校正后的相对浓度值，基于二元逻辑回归方程计算Prob值；根据比较Prob值与最佳截点值cut-off值的大小来诊断糖尿病患者中的视网膜病变；对于糖尿病人群，Prob值高于该截点值的则判断为有视网膜病变，而低于该截点值则表明目前暂无视网膜病变。
8.按照权利要求2所述的试剂盒，所述内标D5-色氨酸和D3-硬脂酸于甲醇中浓度分别为1-10μg/mL和1-5μg/mL。
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