CN112055753A

CN112055753A - 玉米事件dp-023211-2及其检测方法

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Publication number: CN112055753A
Application number: CN201980028338.9A
Authority: CN
Inventors: H·M·克里斯滕森; B·聪; V·克雷恩; X·胡; A·L·卢; T·马布里; K·D·赖恩哈特克雷布斯; G·A·桑达尔
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 2018-04-27
Filing date: 2019-04-22
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2039-04-22
Also published as: CA3093007A1; US20240247279A1; EP3784787A1; WO2019209700A1; CN112055753B; MX2020011329A; CO2020013734A2; CL2020002754A1; WO2019209700A8; BR112020021986A2; PH12020551774A1; ZA202007166B; AU2019261281A1; UY38205A

Abstract

本文公开的实施例涉及植物分子生物学领域，具体地涉及用于赋予植物昆虫抗性的DNA构建体。本文公开的实施例涉及含有事件DP‑023211‑2的抗昆虫玉米植物以及用于检测样本及其组合物中事件DP‑023211‑2的存在的测定。

Description

玉米事件DP-023211-2及其检测方法

以电子方式递交的序列表的引用

该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为7493_SeqList.txt，创建于2018年4月16日，且具有157千字节大小，并且与本说明书同时提交。包含在所述ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年4月27日提交的美国临时申请号62/663,832、2018年5月31日提交的美国临时申请号62/678,579和2018年12月6日提交的美国临时申请号62/776,018的权益，以上各申请通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本文公开的实施例涉及植物分子生物学领域，包括用于赋予植物昆虫抗性的DNA构建体。本文公开的实施例还包括含有事件DP-023211-2的抗昆虫玉米植物以及用于检测样本及其组合物中事件DP-023211-2的存在的测定。

背景技术

玉米是重要的农作物，并且是世界许多地区的主要食物来源。尽管使用了诸如化学杀有害生物剂等保护性措施，但昆虫有害生物引起的损害仍是造成世界上玉米作物损失的主要因素。鉴于此，为了控制昆虫损害并减少对传统化学杀有害生物剂的需求，已经将昆虫抗性经过基因工程改造到诸如玉米的农作物中。已用于生产转基因抗昆虫作物的一组基因是来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的δ-内毒素组。δ-内毒素已在棉花、马铃薯、水稻、向日葵以及玉米等农作物中成功表达，并在某些情况下证明可很好地控制昆虫有害生物。(Perlak，F.J等人(1990)Bio/Technology[生物技术]8：939-943；Perlak，F.J.等人(1993)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]22：313-321；Fujimoto，H.等人(1993)Bio/Technology[生物技术]11：1151-1155；Tu等人，(2000)Nature Biotechnology[自然生物技术]18：1101-1104；PCT公开WO 01/13731；和Bing，J.W.等人.(2000)Efficacy ofCry1FTransgenic Maize[Cry1F转基因玉米的功效]，14^th Biennial International PlantResistance to Insects Workshop[第14届国际植物昆虫抗性两年一度研讨会]，科罗拉多州柯林斯堡)。

已知转基因在植物中的表达受许多不同因素的影响，包括驱动单个目的基因表达的表达盒的方向和组成，以及植物基因组中的位置，这可能是由于染色质的结构(例如异染色质)或转录调控元件(例如增强子)靠近所述整合位点的近距离(Weising等人(1988)Ann.Rev.Genet.[遗传学年度评论]22：421-477)。

能够检测特定事件的存在以便确定性杂交的后代是否包含目的转基因将是有利的。

通过核酸检测方法，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交，可以检测转基因的存在。这些检测方法通常集中于常用的遗传元件，如启动子、终止子、标记基因等，因为对于许多DNA构建体而言，所述编码区是可互换的。结果，除非与插入的异源DNA相邻的侧翼DNA的DNA序列是已知的，否则这些方法可能无法用于区分不同的事件，特别是使用相同DNA构建体或非常相似的构建体产生的事件。

发明内容

所述实施例涉及抗昆虫玉米(玉蜀黍(Zea mays))植物事件DP-023211-2，也称为“玉米系DP-023211-2”、“玉米事件DP-023211-2”和“DP-023211-2玉米”，涉及玉米植物事件DP-023211-2的DNA植物表达构建体，以及设计用于检测玉米植物事件DP-023211-2及其后代中的所述转基因构建体、侧翼和插入(靶基因座)区域的方法和组合物。

在一个方面，这些组合物和方法涉及产生和选择抗昆虫单子叶农作物植物的方法。组合物包括DNA构建体，所述DNA构建体在植物细胞和植物中表达时赋予对昆虫的抗性。在一个方面，提供了一种能够引入宿主细胞中并在宿主细胞中复制的DNA构建体，所述DNA构建体在植物细胞和植物中表达时赋予所述植物细胞和植物对昆虫的抗性。玉米事件DP-023211-2是通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的质粒PHP74643转化而产生的。如本文所述，这些事件包括DvSSJ1(SEQ ID NO：6)和IPD072(多核苷酸SEQ ID NO：4和氨基酸SEQ IDNO：5)盒，其赋予对某些鞘翅目植物有害生物的抗性。所述昆虫控制组分已证明对西方玉米根虫(WCR)、北方玉米根虫(NCR)和南方玉米根虫(SCR)具有功效。

第一盒表达为转录物，所述转录物包含来自玉米根萤叶甲(Diabroticavirgifera)(西方玉米根虫)的光滑间壁连接蛋白1(DvSSJ1)基因的两个RNA片段，衍生自玉蜀黍乙醇脱氢酶(zm-Adh1)基因的内含子1区的内含子接头序列将这些RNA片段隔开形成反向重复结构。所述DvSSJ1片段的表达受所述ubiZM1启动子、5′UTR和内含子的第三拷贝连同玉蜀黍W64系27-kDaγ玉米醇溶蛋白(Z27G)基因的终止子区域控制。存在两个另外的终止子来防止转录干扰：拟南芥(Arabidopsis thaliana)泛素14的终止子区域(UBQ14)基因(Callis等人，1995)和玉蜀黍In2-1基因的终止子区域(Hershev和Stoner，1991)。

第二盒含有来自绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)的杀虫蛋白基因ipd072Aa(SEQ ID NO：4)。所述IPD072Aa蛋白(SEQ ID NO：5)在植物中的表达可有效对抗某些鞘翅目有害生物，包括中肠上皮的破坏。所述IPD072Aa蛋白的长度为86个氨基酸，分子量为大约10kDa。所述ipd072Aa基因的表达受来自香蕉条斑病毒云南香蕉(acuminataYunnan)菌株(BSV[AY])的启动子区域(Zhuang等人，2011)和来自稻(Oryza sativa)(水稻(rice))假设蛋白(zm-HPLV9)的玉蜀黍(Zea mays)直系同源物的内含子区连同来自拟南芥at-T9基因的终止子区(GenBank登录号NM_001202984)控制。

第三基因盒(mo-pat基因盒)含有所述来自绿产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)的草丁膦乙酰转移酶基因(mo-pat)(Wohlleben等人，1988)。所述mo-pat基因表达赋予对草丁膦的耐受性的草丁膦乙酰转移酶(PAT)。所述PAT蛋白的长度为183个氨基酸，分子量为大约21kDa。所述mo-pat基因的表达受稻(水稻)肌动蛋白(os肌动蛋白)基因(GenBank登录号CP018159)的启动子和内含子区域连同所述CaMV35S终止子的第三拷贝控制。存在两个另外的终止子来防止转录干扰：分别来自双色高粱(Sorghum bicolor)(高粱)泛素(sb-ubi)基因(植物基因组(Phytozome)基因ID Sobic.004G049900.1)和γ-kafarin(sb-gkaf)基因的终止子区域(de Freitas等人，1994)。

第四基因盒(pmi基因盒)含有来自大肠杆菌(Escherichiacoli)的磷酸甘露糖异构酶(pmi)基因(Negrotto等人，2000)。所述PMI蛋白在植物中的表达充当选择性标记，它允许植物组织以甘露糖为碳源生长。所述PMI蛋白的长度为391个氨基酸，分子量为大约43kDa。如存在于PHP74643的T-DNA区域中的，所述pmi基因缺少启动子，但其位置靠近所述翻转酶重组靶位点FRT1，可以通过适当放置的启动子进行重组后表达。所述pmi基因的终止子是所述pinII终止子的第四拷贝。存在的另外的Z19终止子是为了防止盒之间的转录干扰。

根据一些实施例，提供了用于鉴定命名为DP-023211-2(ATCC保藏号PTA-124722)的新型玉米植物的组合物和方法。这些方法基于特异性识别DP-023211-2的5’和/或3’侧翼序列的引物或探针。提供了包含引物序列的DNA分子，所述引物序列在PCR反应中利用时将产生转基因事件DP-023211-2独特的扩增子。在一个实施例中，考虑了包含这些分子的玉米植物和种子。此外，提供了利用这些引物序列鉴定所述DP-023211-2事件的试剂盒。

一些实施例涉及如本文所述的DP-023211-2的特定侧翼序列，其可用于开发生物学样本中DP-023211-2的鉴定方法。更特别地，本公开涉及DP-023211-2的5’和/或3’侧翼区域，其可用于开发特异性引物和探针。进一步的实施例涉及基于此类特异性引物或探针的使用的生物学样本中DP-023211-2的存在的鉴定方法。

根据一些实施例，提供了检测样本中对应于所述玉米事件DP-023211-2的DNA的存在的方法。此类方法包括：(a)使包含DNA的所述样本与DNA引物组接触，所述DNA引物组用于与从包含事件DP-023211-2的玉米提取的基因组DNA进行核酸扩增反应时，分别产生诊断玉米事件DP-023211-2的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，从而产生所述扩增子；以及(c)检测所述扩增子。在一些方面，所述引物组包含SEQ ID NO：7和8，以及任选地包含SEQ ID NO：9的探针。

根据一些实施例，检测样本中与所述DP-023211-2事件相对应的DNA分子的存在的方法，包括：(a)使包含提取自玉米植物的DNA的样本与DNA探针分子接触，所述DNA探针分子在严格杂交条件下与提取自玉米事件DP-023211-2的DNA杂交，并且在所述严格杂交条件下不与对照玉米植物DNA杂交；(b)使所述样本和探针经受严格杂交条件；以及(c)检测所述探针与提取自玉米事件DP-023211-2的DNA的杂交。更具体地，一种用于检测样本中与DP-023211-2事件相对应的DNA分子的存在的方法，此类方法包括(a)使包含提取自玉米植物的DNA的样本与DNA探针分子接触，所述DNA探针分子由所述事件独特的序列组成，例如连接序列，其中所述DNA探针分子在严格杂交条件下与提取自玉米事件DP-023211-2的DNA杂交，并且在所述严格杂交条件下不与对照玉米植物DNA杂交；(b)使所述样本和探针经受严格杂交条件；以及(c)检测所述探针与DNA的杂交。

另外，提供了用于在检测DP-023211-2特定区域的生物学样本中鉴定事件DP-023211-2的试剂盒和方法。

提供了DNA分子以包含DP-023211-2的至少一个连接序列；其中连接序列跨越位于插入所述基因组中的异源DNA与来自位于所述插入位点侧翼的玉米细胞的DNA(即侧翼DNA)之间的连接，并且可诊断DP-023211-2事件。

根据一些实施例，生产抗昆虫玉米植物的方法包括以下步骤：(a)使包含赋予昆虫抗性的本文公开的表达盒的第一亲本玉米系与缺少此类表达盒的第二亲本玉米系进行有性杂交，从而产生多个后代植物；以及(b)选择抗昆虫的后代植物。此类方法可以任选地包括使后代植物回交到第二亲本玉米系以产生抗昆虫的真实遗传(true-breeding)玉米植物的进一步的步骤。

一些实施例提供了产生对昆虫具有抗性的玉米植物的方法，所述方法包括用DNA构建体PHP74643转化玉米细胞，使转化的玉米细胞生长成玉米植物，选择显示出昆虫抗性的玉米植物，并进一步使其生长成可育株的玉米植物。可以将可育株的玉米植物自花授粉或与相容的玉米品种杂交以产生抗昆虫后代。

一些实施例进一步涉及用于鉴定生物学样本中的玉米事件DP-023211-2的DNA检测试剂盒。所述试剂盒包括特异性识别DP-023211-2的5’或3’侧翼区域的第一引物，以及分别特异性识别DP-023211-2的所述非原生靶基因座DNA内或所述侧翼DNA内的序列的第二引物，用于PCR鉴定方案中。进一步的实施例涉及用于鉴定生物学样本中的事件DP-023211-2的试剂盒，所述试剂盒包含具有与事件DP-023211-2的特定区域具有约80％至100％序列同一性的序列对应或互补的序列的特异性探针。探针的序列对应于包含事件DP-023211-2的5’或3’侧翼区域的一部分的特定区域。在一些实施例中，所述第一或第二引物包含SEQ IDNO：7-8、10-11、13-14、16-17、19-20或22-23中的任何一个。

本文公开的实施例所涵盖的方法和试剂盒可用于不同目的，比如但不限于以下目的：鉴定植物、植物材料或产品中的事件DP-023211-2，比如但不限于包含或衍生自植物材料的食品或饲料产品(新鲜或加工的)；另外地或可替代地，所述方法和试剂盒可用于鉴定转基因植物材料，其目的是在转基因材料和非转基因材料之间进行分离；另外地或可替代地，所述方法和试剂盒可用于确定包含玉米事件DP-023211-2的植物材料的质量。所述试剂盒还可能含有执行所述检测方法所需的试剂和材料。

进一步的实施例涉及所述DP-023211-2玉米植物或其部分，包括但不限于所述玉米植物DP-023211-2及其衍生的后代的花粉，胚珠，果皮，营养细胞，花粉细胞核和卵细胞核。在另一个实施例中，所述靶向DP-023211-2的玉米植物和种子的DNA引物分子提供了特异性扩增子产物

附图说明

图1-显示了具有指示的遗传元件(SEQ ID NO：1)的质粒PHP74643的示意图。质粒大小为71，116bp。

图2.显示了质粒PHP74643的插入T-DNA区域的示意图(SEQ ID NO：2是T-DNA插入序列，SEQ ID NO：3是包括着陆垫(landing pad)的插入序列T-DNA)，指示了八个基因盒。所述T-DNA用于转化包含FRT1和FRT87位点的预先表征的系。含有pmi基因、mo-pat基因、DvSSJ1片段和ipd072Aa基因的T-DNA中FRT1和FRT87位点之间的区域以位点特异性方式整合到所述玉米系中。

图3.显示了基于所述的SbS测序(“Southern-by-Sequencing”)分析的DP-023211-2玉米的插入的示意图谱。中间框显示了FRT1和FRT87位点之间整合的PHP74643 T-DNA的单个拷贝。位点特异性的着陆垫序列由外部框显示，而所述5’和3’侧翼玉米基因组由水平黑色条表示。FRT1和FRT87连接的代表性个体测序读数显示为每个连接的堆叠线。所述FRT1和FRT87序列在每次读取时都以高亮显示。对于FRT1位点，在高亮显示的FRT1序列左侧的每个个体读数内的黑线表示相邻的位点特定的着陆垫序列，而在FRT1序列右侧的黑色表示整合的PHP74643序列。对于FRT87位点，高亮显示的FRT87序列左侧的黑线表示整合的PHP74643序列，FRT87序列右侧的黑线表示相邻的位点特异性的着陆垫序列。图谱下方的数字表示FRT元件相对于所述PHP74643 T-DNA序列的bp位置(图2)。

图4.显示了DP-023211-2的转化和开发示意图。

图5是显示与非产量农艺性状的基本项目相比，五个构建体设计的杂交表现的表。

图6是显示与非产量农艺性状的基本项目相比，事件DP-023211-2的杂交表现的表。

图7是显示与所有农艺性状的基本项目相比，构建体设计的近交表现的表。

图8是显示与所有农艺性状的基本项目相比，事件DP-023211-2的近交表现的表。

具体实施方式

如本文使用的，单数形式“一个/种(a/an)”以及“所述(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另有明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个此类细胞，并且提及“蛋白质”包括提及一种或多种蛋白及其等同物，等等。本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确说明。

本公开内容的组合物包括作为ATCC专利保藏号PTA-124722保藏的种子和植物、植物细胞以及由其衍生的种子。申请人已于2018年1月18日在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(美国弗吉尼亚州20110-2209马纳萨斯)保藏了玉米事件DP-023211-2(专利保藏号PTA-124722)的至少2500粒种子。这些保藏将根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约(Budapest Treaty)的条款维护。2018年1月18日在ATCC保藏的种子取自由爱荷华州50131-1000约翰斯顿岛第62大道7250NW先锋良种国际有限公司(Pioneer Hi-Bred International，Inc.，7250NW 62^nd Avenue，Johnston，Iowa 50131-1000)维护的保藏库。在向专利商标局委员以及由委员确定在要求下有资格的人员提出申请的期间，所述保藏是可获得的。在允许了本申请中的任何权利要求之后，根据37C.F.R.第1.808条，申请人将向公众公开美国典型培养物保藏中心(ATCC)，弗吉尼亚州20110-2209马纳萨斯10801大学大道的至少2500粒杂交玉米种子的样本。该玉米事件DP-023211-2的保藏种子将在ATCC保藏库(这是一个公共保藏库)中维护30年，也可以是在最近的要求之后5年，或专利的可执行期限内，以较长的时间为准，并且在此期间如果其变得无法存活，则应将其替换。此外，一位或多位申请人已经满足37C.F.R.§§1.801-1.809的所有要求，包括在保藏时提供样本的生活力的指示。一位或多位申请人无权不顾法律对转移生物材料或其商业运输的任何限制。申请人不会放弃根据本专利授予的权利或Plant Variety Protection Act[植物品种保护法](7 USC 2321以及下列等等)下适用于事件DP-023211-2的权利的任何侵犯。禁止未经授权的种子繁殖。可对所述种子进行调控。

如本文所用，术语“玉米(corn)”是指玉蜀黍(Zea mays)或玉米(maize)，并且包括可以与玉米一起育种的所有植物品种，包括野生玉米物种。

如本文使用的，术语“昆虫抗性”和“影响昆虫有害生物”是指在任何发育阶段影响昆虫摄食、生长和/或行为的变化，包括但不限于：杀死昆虫；延缓生长；降低生殖能力；抑制进食；等。

如本文使用的，术语“杀有害生物活性”和“杀昆虫活性”同义地用于指生物体或物质(例如，像蛋白质)的活性，所述活性可以通过很多参数来测量，包括但不限于有害生物死亡率、有害生物重量损失、有害生物吸引力、有害生物抵抗性、以及摄食和/或暴露于所述生物体或物质适当时长后有害生物的其他行为和物理变化。例如，“杀有害生物蛋白”是自身或与其他蛋白质组合显示杀有害生物活性的蛋白质。

如本文所用，“插入DNA”是指表达盒内用于转化植物材料的异源DNA，而“侧翼DNA”可以是天然存在于诸如植物等生物体中的基因组DNA，也可以是通过与原始插入DNA分子无关的转化过程引入的外来(异源)DNA，例如与转化事件相关的片段。如本文所用的“侧翼区域”或“侧翼序列”是指至少20bp(对于一些范围更窄的实施例，至少50bp，并且至多5000bp)的序列，其位于紧接原始非原生插入DNA分子上游并与其相邻和/或紧接其下游并与其相邻。所述外来DNA的转化程序可导致转化株包含每个转化株的特征性和独特的不同侧翼区域。当通过传统杂交将重组DNA引入植物中时，其侧翼区域通常不会改变。通过几代植物育种和传统杂交，在所述侧翼区域可能发生单核苷酸变化。转化株还将含有一片异源插入片段DNA和基因组DNA，或者两(2)片基因组DNA或两(2)片异源DNA之间的独特的连接。“连接”是两(2)个特异性DNA片段连接的点。例如，在插入DNA连接侧翼DNA的地方存在连接。连接点也存在于转化的生物体中，其中两个(2)DNA片段以由与天然生物体中发现的方式修饰的方式连接在一起。“连接DNA”是指包含连接点的DNA。在本公开中列出的连接序列包括位于所述玉米基因组DNA和插入序列的5’端之间的连接点，其从所述连接点的至少-5至+5个核苷酸(SEQ ID NO：31)起，从所述连接点的至少-10至+10个核苷酸(SEQ ID NO：32)起，从所述连接点的至少-15至+15个核苷酸(SEQ ID NO：33)起以及从所述连接点的至少-20至+20个核苷酸(SEQ ID NO：34)起；以及位于所述插入序列的3’端与玉米基因组DNA之间的连接点，其从所述连接点的至少-5至+5个核苷酸(SEQ ID NO：35)起，从所述连接点的至少-10至+10个核苷酸(SEQ ID NO：36)起，从所述连接点的至少-15至+15个核苷酸(SEQ ID NO：37)起以及从所述连接点的至少-20至+20个核苷酸(SEQ ID NO：38)起。在本公开中列出的连接序列还包括位于所述靶基因座和所述插入序列的5’端之间的连接点。在一些实施例中，用于DP-023211-2的SEQ ID NO：9或25代表位于所述靶基因座和所述插入序列的5’端之间的连接点。

如本文所用，关于核酸序列的“异源性”是指该核酸序列源于不同的非性相容物种，或者，如果源于相同物种的话，则是通过蓄意人为干预从其在组合物和/或基因组基因座中的天然形式进行实质性修饰得到的序列。例如，可操作地连接到异源核苷酸序列的启动子可以来自与衍生出所述核苷酸序列的物种不同的物种，或者，如果来自相同物种，则所述启动子不是天然地可操作地相连到所述核苷酸序列。异源蛋白可以源自外来物种，或者如果来自相同物种，则可以通过有意的人为介入对其原始形式进行实质性修饰。

术语“调控元件”是指具有基因调控活性的核酸分子，也就是能够影响可操作地连接的可转录多核苷酸的转录和/或翻译表达模式的核酸分子。因此，术语“基因调控活性”是指通过影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译，从而影响这种可操作地连接的可转录多核苷酸分子表达的能力。基因调控活性可为正向和/或负向，并且所述影响可通过其下列特性来表征：时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应，还可通过定量指示或定性指示来表征。

“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的核苷酸序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子序列包含近端元件和较远端上游元件，后一元件通常称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的核苷酸序列，并且可以是启动子的固有元件或插入的异源元件，用来增强启动子的水平或组织特异性。启动子可以全部衍生自天然基因，或者由衍生自在自然界发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的核苷酸区段。本领域技术人员应当理解，不同的调控元件可能引导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或者响应于不同环境条件的表达。在多数情况下引起核酸片段在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。进一步认识到，由于在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切边界，不同长度的核酸片段可具有相同的启动子活性。

所述“翻译前导序列”是指位于基因的启动子序列和编码序列之间的核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的经完全处理的mRNA上游。翻译前导序列可以影响多种参数，包括初级转录物到mRNA的加工、mRNA稳定性和/或翻译效率。

“3’非编码序列”是指位于编码序列下游的核苷酸序列，并且包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。聚腺苷酸化信号通常表征为影响聚腺苷酸片添加到mRNA前体的3’末端。

DNA构建体是连接在一起的DNA分子的组装，其可提供一个或多个表达盒。DNA构建体可以是能够在细菌细胞中自我复制的质粒，并且含有各种核酸内切酶限制性酶切位点，这些位点可用于引入提供功能性遗传元件的DNA分子，即启动子、内含子、前导序列、编码序列、3’终止区等；或者DNA构建体可以是DNA分子的线性组装，比如表达盒。DNA构建体中含有的表达盒包含提供信使RNA转录所必需的遗传元件。可以设计所述表达盒以在原核细胞或真核细胞中表达。设计所述实施例的表达盒以在植物细胞中表达。

在表达盒中提供本文公开的DNA分子以在目的生物体中表达。所述盒包括可操作地连接到编码序列的5’和3’调控序列。“可操作地连接”意指被连接的核酸序列为连续的，并且在有必要连接两个蛋白质编码区的情况下，是连续的并且在同一阅读框中。可操作地连接是指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动并介导相应于第二序列的DNA序列的转录。所述盒可以另外包含至少一个待共转化到生物体中的另外的基因。可替代地，所述一个或多个另外的基因可以在多个表达盒或多个DNA构建体上提供。

所述表达盒可能包括转录的5’至3’方向：在作为宿主的生物体中起作用的转录和翻译起始区、编码区和转录和翻译终止区。所述转录起始区(例如所述启动子)对于宿主生物体可以是天然的或类似的，或外来的或异源的。此外，所述启动子可以是天然序列，或可替代地，是合成序列。表达盒可另外在表达盒构建体中包含5’前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。

应当理解的是，如本文所用，术语“转基因的”通常包括其基因型已经通过异源核酸的存在而改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初如此改变的那些以及通过有性杂交或无性繁殖从初始转基因产生的那些并且保留此类异源核酸。

通过以下来产生转基因“事件”：用包含核酸表达盒的一种或多种异源DNA构建体转化植物细胞，该核酸表达盒包含目的转基因；再生由该转基因插入该植物的基因组中所产生的植物种群；并且选择表征为插入特定基因组位置的特定植物。事件在表型上表征为转基因的表达。在遗传水平上，事件是植物遗传组成的一部分。术语“事件”也指转化株和另一个品种之间有性异型杂交所产生的后代，其中所述后代包含异源DNA。在与轮回亲本回交后，所述插入的DNA和来自经转化的亲本的链接侧翼基因组DNA也存在于相同的染色体位置杂交的后代中。后代植物可能含有由于常规育种技术而导致的插入序列的变化。术语“事件”也指来自原始转化体的DNA，其包含插入的DNA和与插入的DNA直接相邻的侧翼序列，插入的DNA预期将被转移到接受包括目的转基因的插入的DNA的后代中，得到包括插入的DNA(例如，自交所产生的原始转化株和后代)的亲本系和不含有插入的DNA的亲本系发生有性杂交的结果。

抗昆虫的DP-023211-2玉米植物可以通过首先将第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交从而产生多个第一后代植物来育种，其中所述第一亲本玉米植物具有衍生自转化的转基因DP-023211-2事件植物及其后代，所述转化使用赋予昆虫抗性的所述实施例的表达盒进行，其中所述第二亲本玉米植物缺少此类表达盒；并且然后选择对昆虫具有抗性的第一后代植物；并且使第一后代植物自交，从而产生多个第二后代植物；并且然后从所述第二代后代植物中选择抗昆虫植物。这些步骤可以进一步包括使第一抗昆虫后代植物或第二抗昆虫后代植物与第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物回交，从而产生对昆虫具有抗性的玉米植物。术语“自交”是指自花授粉，包括来自同一生物体的配子和/或核的结合。

如本文所用，术语“植物”包括提及整株植物、植物的部分、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞及其后代。在一些实施例中，转基因植物的部分包含，例如植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及源自先前用本文所公开的DNA分子转化的转基因植物或其后代的花、茎、果实、叶和根，并且因此其至少部分由转基因细胞组成。

如本文所用，术语“植物细胞”包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、枝条、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可使用的植物种类通常与适于转化技术的高等植物类别一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物。

“转化”是指将核酸片段转移到宿主生物体的基因组中，导致遗传稳定的遗传。含有经转化的核酸片段的宿主植物称为“转基因”植物。

如本文所用，在事件DP-023211-2的背景中的术语“后代”表示包含玉米事件DP-023211-2的亲本植物的任何世代的后代。

可将本文公开的分离的多核苷酸掺入重组构建体，典型地是DNA构建体中，所述DNA构建体能够引入宿主细胞中并在宿主细胞中复制。此类构建体可以是载体，其包括复制系统和能够在给定宿主细胞中转录和翻译多肽编码序列的序列。在例如Pouwels等人，(1985；1987增刊)Cloning Vectors：A Laboratory Manual[克隆载体：实验室手册]，Weissbach和Weissbach(1989)Methods for Plant Molecular Biology[植物分子生物学方法]，(Academic Press[学术出版社]，纽约)；和Flevin等人，(1990)Plant MolecularBiology Manual[植物分子生物学手册]，(Kluwer Academic Publishers[克鲁维尔学术出版社])中描述了许多适合于稳定转染植物细胞或适合于建立转基因植物的载体。典型地，植物表达载体包括，例如，在5’和3’调控序列的转录控制下的一个或多个克隆的植物基因和显性选择性标记。此类植物表达载体还可包含启动子调控区(例如控制诱导型或组成型、环境或发育调控的、或细胞或组织特异性表达的调控区)、转录初始起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。

在将插入序列引入植物细胞基因组的过程中，所述插入序列和/或基因组侧翼序列发生一些缺失或其他改变并不罕见。因此，本文提供的质粒序列的相关区段可能包含一些微小的变异。对于本文提供的侧翼序列也是可能的。因此，包含与本主题公开内容的侧翼和/或插入序列具有一定范围同一性的多核苷酸的植物在本主题公开的范围内。与本公开的序列的同一性可以是与本文例示或描述的序列具有至少65％的序列同一性，至少70％的序列同一性，至少75％的序列同一性，至少80％的同一性，或至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的多核苷酸序列。如本文所提供的杂交和杂交条件也可以用于定义本主题公开内容的此类植物和多核苷酸序列。包含所述侧翼序列加上所述完整插入序列的序列可以参考保藏的种子来证实。

在一些实施例中，也可以使两种不同的转基因植物杂交以产生含有两个独立分离的添加的外源基因的后代。合适的子代的自交可产生对于两个添加的外源基因都是纯合的植物。还考虑了与亲本植物回交和与非转基因植物外交，即营养繁殖

“探针”是分离的核酸，其上附着有常规的合成可检测标记或报告分子，例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。这种探针与靶核酸链互补，例如与来自玉米事件DP-023211-2的分离的DNA链互补，无论其来自玉米植物还是来自包含所述事件DNA的样本。探针不仅可以包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还可以包括聚酰胺和与靶DNA序列特异性结合并可以用于检测该靶DNA序列的存在的其他经修饰的核苷酸。

“引物”是分离的核酸，其通过核酸杂交与互补的靶DNA链退火以在引物和靶DNA链之间形成杂交体，然后通过聚合酶(例如DNA聚合酶)沿着靶DNA链延伸。引物对是指其用于例如通过PCR或其他常规核酸扩增方法来扩增靶核酸序列。“PCR”或“聚合酶链式反应”是用于扩增特异性DNA区段的技术(参见美国专利号4,683,195和4,800,159；通过引用并入本文)。

探针和引物具有足够的核苷酸长度，可在由操作员确定的杂交条件或反应条件下特异性结合靶DNA序列。该长度可以是足以在选择的检测方法中有用的任何长度。通常，使用11个或更多个核苷酸、18个或更多个核苷酸和22个或更多个核苷酸的长度。此类探针和引物在高严格杂交条件下特异性地与靶序列杂交。尽管可通过常规方法设计与靶DNA序列不同并且保留与靶DNA序列杂交的能力的探针，但是根据实施例的探针和引物可具有与靶序列的连续核苷酸的完全DNA序列相似性。探针可用作引物，但通常设计为与靶DNA或RNA结合，且不用于扩增过程。

特异性引物可用于扩增整合片段，以产生可用作“特异性探针”的扩增子，以鉴定生物学样本中的事件DP-023211-2。当探针在允许所述探针与样本结合的条件下与生物学样本的核酸杂交时，可以检测到这种结合，从而可以指示生物学样本中事件DP-023211-2的存在。在本公开的一个实施例中，所述特异性探针是在适当条件下与所述事件的5’或3’侧翼区内的区域特异性杂交的序列，并且还包含与其邻接的外来DNA的一部分。所述特异性探针可包含与所述事件的特定区域至少80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、以及95％至100％相同(或互补)的序列。

制备和使用探针和引物的方法描述于，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第2版，第1-3卷，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约1989(下文，“Sambrook等人，1989”)；Ausubel等人编，Current Protocols inMolecular Biology[分子生物学实验指南]，，格林出版和韦利科学公司，纽约，1995(含定期更新)(下文，“Ausubel等人，1995”)；以及Innis等人，PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications[PCR方案：方法和应用指南]，学术出版社：圣地亚哥，1990。PCR引物对可源自已知序列，例如，通过使用用于该目的的计算机程序，例如Vector NTI第6版中的PCR引物分析工具(马里兰州贝塞斯达英孚麦斯公司(Informax Inc.))；PrimerSelect(威斯康辛州麦迪逊DNASTAR公司)；和引物(版本

1991，马萨诸塞州剑桥市怀特黑德生物医学研究所)。另外，可以使用本领域技术人员已知的指南目测扫描所述序列并手动鉴定引物。

如本文所使用的“试剂盒”是指用于执行本公开的方法实施例的目的，更特别地，用于生物学样本中事件DP-023211-2的鉴定的一组试剂以及任选地说明。可使用试剂盒，并且可以为了质量控制(例如，种子批次的纯度)，检测植物材料或包含或衍生自植物材料的材料(比如但不限于食品或饲料产品)中事件DP-023211-2的检测的目的对其组分进行专门调整。如本文所用，“植物材料”是指从植物获得或衍生自植物的材料。

可使用基于本文公开的侧翼DNA和插入序列的引物和探针通过常规方法，例如通过对此类序列进行重新克隆和测序，来证实(并且，如果需要，来校正)所公开的序列。所述核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。可使用任何常规的核酸杂交或扩增方法均从样本中的转基因事件中鉴定DNA的存在。

如果一个核酸分子与另一个核酸分子表现出完全互补性或最小互补性，则称它们为另一个核酸分子的“互补序列”。如本文所用，当分子中一个分子的每个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补时，则称这些分子表现出“完全互补性”。如果两个分子能够以足够的稳定性彼此杂交，以使它们在至少常规的“低严格性”条件下保持彼此退火，则称它们为“最小互补”。类似地，如果所述分子能够以足够的稳定性彼此杂交，以使它们在常规的“高严格性”条件下保持彼此退火，则称它们为“互补”。常规的严格性条件由Sambrook等人，1989以及由Haymes等人在Nucleic Acid Hybridization，a Practical Approach[核酸杂交，实用方法]，IRL出版社，华盛顿特区(1985)中描述，因此，可允许偏离完全互补性，只要此类偏离不完全排除分子形成双链结构的能力即可。为了使核酸分子用作引物或探针，其仅需要在序列上充分互补以能够在所用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。

在杂交反应中，特异性典型地取决于杂交后洗涤的功能，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度以及温度。热力学熔点(T_m)是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在所限定的离子强度和pH下)。对于DNA-DNA杂交物，T_m可以从Meinkoth和Wahl，(1984)Anal.Biochem.[分析生物化学]138：267-284的等式中进行估计：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中乌苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L为杂合体的碱基对长度。对于每1％的错配，T_m降低约1℃；因此，可调整T_m、杂交和/或洗涤条件以与所希望的同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有＞90％同一性的序列，则可将T_m降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在所限定的离子强度和pH下的T_m低约5℃。然而，在一些实施例中，可以应用其他的严格条件，包括极严格条件可以利用比T_m低1℃、2℃、3℃或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比T_m低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比T_m低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃的杂交和/或洗涤。

使用方程、杂交和洗涤组合物以及所需的T_m，普通技术人员将理解，本质上描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化。如果所希望的错配程度导致T_m小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则用户可选择增加SSC浓度以使得可使用较高温度。对核酸杂交的全面指导见于以下文献：Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes[生物化学与分子生物学技术-与核酸探针的杂交]，第I部分，第2章(Elsevier[爱思唯尔]，纽约)；以及Ausubel等人编(1995)和Sambrook等人(1989)。

在一些实施例中，互补序列具有与其杂交的核酸分子相同的长度。在一些实施例中，所述互补序列比与其杂交的核酸分子长或短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施例中，所述互补序列比与其杂交的核酸分子长或短1％、2％、3％、4％或5％。在一些实施例中，互补序列在核苷酸对核苷酸的基础上是互补的，这意味着不存在错配的核苷酸(每个A与T配对，每个G与C配对)。在一些实施例中，互补序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更少的错配。在一些实施例中，所述互补序列包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更少的错配。

相对于参考序列(主题序列)，“序列同一性百分比(％)”被确定为在比对序列并引入空位(如果需要)以实现最大百分比序列同一性后，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何氨基酸保守取代，候选序列(查询序列)中与参考序列中的相应氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。用于确定序列同一性百分比目的而进行的比对能以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公共可用的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2。本领域的技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在进行比较的序列的全长度上实现最大比对所需的任何算法。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数(例如，查询序列的同一性百分比＝查询序列和主题序列之间的相同位置的数目/查询序列的位置总数×100)。

关于使用特定扩增引物对的靶核酸序列的扩增(例如通过PCR)，严格条件允许所述引物对仅与靶核酸序列杂交，具有相应野生型序列(或其互补序列)的引物与所述靶核酸序列结合并任选地以在DNA热扩增反应中产生独特的扩增产物扩增子。

如本文所用，“扩增的DNA”或“扩增子”是指由于作为核酸模板的一部分的靶核酸序列的核酸扩增的产物。例如，为了确定由性杂交产生的玉米植物是否含有来自本文所公开的玉米植物的转基因事件基因组DNA，可以使用DNA引物对使从植物组织样本中提取的DNA接受核酸扩增方法，所述DNA引物对包括衍生自与插入的异源DNA的插入位点相邻的侧翼序列的第一引物和衍生自插入的异源DNA的第二引物，以产生诊断事件DNA的存在扩增子。可替代地，所述第二引物可衍生自手术侧翼序列。所述扩增子的长度和序列可诊断所述事件。所述扩增子的长度可以是从所述引物对的总长度加一个核苷酸碱基对的长度到可通过DNA扩增方案产生的扩增子的任何长度。可替代地，引物对可衍生自插入的DNA两侧的侧翼序列，以产生扩增子，所述扩增子包括PHP74643表达构建体的整个插入核苷酸序列以及在所述转基因插入序列侧翼的序列的一部分。衍生自所述侧翼序列的引物对的成员可位于距插入的DNA序列一定距离，该距离可以是从一个核苷酸碱基对直至扩增反应的极限。术语“扩增子”的使用特别地排除可能在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。

核酸扩增可以通过本领域已知的各种核酸扩增方法中的任何一种来完成，包括PCR。多种扩增方法是本领域已知的，尤其是在美国专利号4,683,195和4,683,202以及Innis等人，(1990)同上中描述。已经开发出PCR扩增方法以扩增高达22Kb的基因组DNA和高达42Kb的噬菌体DNA(Cheng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91：5695-5699，1994)。可将这些方法以及DNA扩增领域中已知的其他方法用于实施本公开内容的实施例。可以理解，特定PCR方案中的许多参数可能需要针对特定实验室条件进行调整，并且可能会稍加修改，而仍考虑到相似结果的收集。这些调整对于本领域技术人员将是显而易见的。

通过这些方法产生的扩增子可通过多种技术来检测，包括但不限于基因位分析(Nikiforov等人，Nucleic Acid Res.[核酸研究]22：4167-4175，1994)，其中设计了DNA寡核苷酸，其与相邻的侧翼DNA序列和插入的DNA序列都重叠。将所述寡核苷酸固定在微孔板的孔中。在对目的区域进行PCR之后(例如，使用插入序列中的一个引物和相邻侧翼序列中的一个引物)，可以将单链PCR产物与固定的寡核苷酸杂交，并用作使用DNA聚合酶和对预期的下一个碱基具有特异性的标记ddNTP进行单碱基延伸反应的模板。读数可以是荧光的或基于ELISA的。信号指示由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸而存在插入/侧翼序列。

另一种检测方法是Winge(2000)Innov.Pharma.Tech.[创新制药技术]00：18-24描述的焦磷酸测序技术。在该方法中，设计了一种寡核苷酸，所述寡核苷酸与相邻的DNA和插入的DNA连接重叠。所述寡核苷酸与来自目的区域的单链PCR产物(例如，插入序列中的一个引物和侧翼序列中的一个引物)杂交，并在DNA聚合酶、ATP、硫化酶、萤光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷5’磷酸硫酸和荧光素存在下孵育。单独添加dNTP，并且掺入产生可测量到的光信号。光信号指示由于成功的扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸而存在转基因插入/侧翼序列。

荧光偏振，如Chen等人，(1999)Genome Res[基因组研究].9：492-498所述，也是一种可用于检测扩增子的方法。使用该方法，设计了一种寡核苷酸，其与侧翼和插入的DNA连接重叠。所述寡核苷酸与来自目的区域的单链PCR产物(例如，插入DNA中的一个引物和侧翼DNA序列中的一个引物)杂交，并在DNA聚合酶和荧光标记ddNTP存在下孵育。单碱基延伸导致所述ddNTP的掺入。掺入可使用荧光计以极化变化测量。极化的变化指示由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸而存在转基因插入/侧翼序列。

定量PCR(qPCR)被描述为一种检测和定量DNA序列的存在的方法，并且在可商购的制造商提供的说明中已得到充分理解。简而言之，在一种此类qPCR方法中，设计了一种FRET寡核苷酸探针，该探针与侧翼和插入DNA连接重叠。FRET探针和PCR引物(插入DNA序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)在热稳定的聚合酶和dNTP存在下循环。FRET探针的杂交导致荧光部分的裂解和释放，使其远离FRET探针上的淬灭部分。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交，侧翼/转基因插入序列的存在。

Tyangi等人(1996)Nature Biotech[自然生物技术].14：303-308所述，分子信标已被描述用于序列检测。简而言之，设计了一种FRET寡核苷酸探针，该探针与侧翼和插入DNA连接重叠。FRET探针的独特结构导致它含有一个二级结构，该二级结构使荧光和猝灭部分保持紧密相邻。FRET探针和PCR引物(例如，插入DNA序列中的一个引物和侧翼序列中的一个引物)在热稳定的聚合酶和dNTP存在下循环。成功进行PCR扩增后，所述FRET探针与靶序列的杂交导致探针二级结构的去除以及荧光和淬灭部分的空间分离。产生荧光信号。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交，侧翼/转基因插入序列的存在。

使用对扩增子内发现的序列具有特异性的探针进行的杂交反应是用于检测由PCR反应产生的扩增子的又另一种方法。

昆虫有害生物包括选自以下目的昆虫：鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，尤其是鞘翅目和鳞翅目。

引人关注的是鞘翅目的幼虫和成虫，包括来自长角象虫科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻虫，包括但不限于：墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis Boheman)(棉铃象甲(boll weevil))；密点细枝象(Cylindrocopturus adspersus LeConte)(向日葵茎象鼻虫(sunflower stem weevil))；蔗根非耳象(Diaprepes abbreviatus Linnaeus)(根象非耳象)；三叶草叶象(Hyperapunctata Fabricius)(车轴草叶象虫(clover leaf weevil))；稻水象甲(Lissorhoptrusoryzophilus Kuschel)(稻水象虫(rice water weevil))；西印度蔗象(Metamasiushemipterus hemipterus Linnaeus)(西印度蔗象甲(West Indian cane weevil))；蔗丝光象甲(M.hemipterus sericeus Olivier或silky cane weevil)；谷象(Sitophilusgranarius Linnaeus)(谷象(granary weevil))；米象(S.oryzae Linnaeus)(米象(riceweevil))；黄褐小爪象(Smicronyx fulvus LeConte)(红葵花籽象甲(red sunflower seedweevil))；灰色小爪象(S.sordidus LeConte)(灰葵花籽象甲(gray sunflower seedweevil))；玉米隐啄象(Sphenophorus maidis Chittenden)(玉蜀黍象虫(maizebillbug)))；李维斯尖隐喙象(S.livis Vaurie)(甘蔗象鼻虫)；几内亚甘蔗象(Rhabdoscelus obscurus Boisduval)(新几内亚蔗象鼻虫(New Guinea sugarcaneweevil))；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫，包括但不限于：荒地玉米跳甲(Chaetocnema ectypa Horn)(沙漠玉米跳甲(desert cornflea beetle))；玉米铜色跳甲(C.pulicaria Melsheimer)(玉米跳甲(corn fleabeetle))；肖叶甲褐斑(Colaspis brunnea Fabricius)(葡萄肖叶甲(grape colaspis))；巴氏根萤叶甲(Diabrotica barberi Smith&Lawrence)(北方玉米根虫(northern cornrootworm))；黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctata howardi Barber)(南方玉米根虫(southern corn rootworm))；玉米根萤叶甲(D.virgifera virgifera LeConte)(西方玉米根虫(western corn rootworm))；马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata Say)(科罗拉多马铃薯甲虫)；橙足负泥虫(Oulema melanopus Linnaeus)(谷叶甲虫(cerealleaf beetle))；十字花科跳甲(Phyllotreta cruciferae Goeze)(玉米跳甲)；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis Fabricius)(向日葵叶甲(sunflower beetle)))；来自瓢虫科(Coccinellidae)的甲虫，包括但不限于：墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestisMulsant)(墨西哥豆瓢虫(Mexican bean beetle))；金龟子和来自金龟子科(Scarabaeidae)的其他甲虫，包括但不限于：Antitrogus parvulus Britton(Childers甘蔗蛴螬)；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis Arrow)(北方独角仙(northernmasked chafer)，白蛴螬(white grub))；南方圆头犀金龟(C.immaculata Olivier)(南方独角仙(southern masked chafer)，白蛴螬(white grub))；白毛革鳞鳃金龟(Dermolepidaalbohirtum Waterhouse)(灰背甘蔗甲虫)；Euetheola humilis rugiceps LeConte(甘蔗甲虫)；Lepidiota frenchi Blackburn(法国甘蔗蛴螬)；Tomarus gibbosus De Geer(胡萝卜金龟(carrot beetle))；T.subtropicus Blatchley(甘蔗蛴螬)；长毛食叶然金龟(Phyllophaga crinita Burmeister)(白蛴螬(white grub))；P.latifrons LeConte(六月鳃角金龟(June beetle))；日本丽金龟(Popillia japonica Newman)(日本甲虫)；欧洲切根鳃金龟(Rhizotrogus majalis Razoumowsky)(欧洲金龟子(European chafer))；来自皮蠹科(Dermestidae)的红缘皮蠹(carpet beetle)；来自叩头甲科(Elateridae)的铁线虫，伪金针虫属物种(Eleodes spp.)、叩头虫属物种(Melanotus spp.)(包括M.communisGyllenhal(铁线虫))；宽胸金针虫属物种(Conoderus spp.)；叩甲属物种(Limoniusspp.)；缺隆叩甲属物种(Agriotes spp.)；特尼塞拉属物种(Ctenicera spp.)；埃俄罗斯属物种(Aeolus spp.)；来自小蠹科(Scolytidae)的小蠹虫；来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫；来自天牛科(Cerambycidae)的甲虫，例如但不限于Migdolus fryanus Westwood(天牛)；以及来自吉丁虫科(Buprestidae)家族的甲虫，包括但不限于：Aphanisticuscochinchinae seminulum Obenberger(采叶吉丁甲虫(leaf-mining buprestidbeetle))。

在一些实施例中，所述DP-023211-2玉米事件可以还包括一堆另外的性状。包含多核苷酸序列堆叠的植物可以通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一种或两种获得。所述方法包括但不限于：育种各自包含目的多核苷酸的单个系，用随后的基因转化包含本文公开的基因的转基因植物，并将基因共转化为单个植物细胞。如本文所使用的，术语“堆叠”包括使多个性状存在于相同植物中(即，两个性状都并入核基因组中、一个性状并入核基因组中并且另一个性状并入质体的基因组中、或者两种性状都并入质体的基因组中)。

在一些实施例中，单独或与一种或多种另外的昆虫抗性性状堆叠的本文所公开的DP-023211-2玉米事件可以与一种或多种另外的输入性状(例如，除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育性、茎强度等)或输出性状(例如，增加的产量、改性淀粉、改善的油特性、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增加的消化性、改善的纤维品质、抗旱性等)堆叠。因此，所述实施例可用于提供具有灵活地且成本有效地控制任何数量的农艺有害生物的能力的经改善的作物品质的完整农艺学方案。

在另一个实施例中，可将所述DP-023211-2玉米事件与一种或多种另外的Bt杀虫毒素堆叠在一起，包括但不限于美国专利号8,101,826、6,551,962、6,586,365、6,593,273和PCT公开号WO 2000/011185中公开的Cry3B毒素；美国专利号8,269,069和8,513,492中公开的mCry3B毒素；在美国专利号8,269,069、7,276,583和8,759,620中公开的mCry3A毒素；或美国专利号7,309,785、7,524,810、7,985,893、7,939,651和6,548,291中公开的Cry34/35毒素。在进一步的实施例中，所述DP-023211-2玉米事件可以与包含这些Bt杀虫毒素和其他鞘翅目活性Bt杀虫性状的一个或多个另外的转基因事件堆叠，例如，美国专利号7,705,216中公开的MON863事件；美国专利号8,884,102中公开的事件MIR604；美国专利号9,133,474中公开的事件5307；美国专利号7,875,429中公开的事件DAS-59122；美国专利号8,575,434中公开的事件DP-4114；美国专利号9,441,240中公开的事件MON 87411；以及美国专利号8,686,230中公开的事件MON88017，所有这些文献均通过引用并入本文。在一些实施例中，所述DP-023211-2玉米事件可以与以下堆叠在一起：MON87427；MON-00603-6(NK603)；MON-87460-4；LY038；DAS-06275-8；BT176；BT11；MIR162；GA21；MZDT09Y；SYN-05307-1；和DAS-40278-9。

在一些实施例中，可以用种子处理剂处理包含DP-023211-2事件的玉米植物。在一些实施例中，所述种子处理剂可以是杀真菌剂、杀昆虫剂或除草剂。

以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。

实例

实例1.包含编码IPD072和靶向DvSSJ1的dsRNA的构建体的转基因植物的盒设计

根据在基因测试转化实验中的功效和表达，选择了用于分子堆叠中的IPD072和DvSSJ1表达盒设计以产生商业跟踪事件。在基因测试实验中评价了许多不同的调控因子(启动子、内含子)和其他元件(终止子、RNAi发夹设计)。使用大量不同的调控元件来评价表达模式的产量和性状功效。

进行了三个基因测试实验，以评价大约40个不同的IPD072单盒。这些实验涉及基因设计筛选和两个构建体矩阵，其中评价了多个启动子、终止子和亚细胞靶向策略。从这些实验中选择了四种IPD072盒设计，以包含在具有DvSSJ1的分子堆叠中。

采取了类似但更广泛的方法来选择DvSSJ1的三种盒设计。在多个T0实验中评价了约100个单DvSSJ1盒。这些包括旨在选择用于发夹茎设计的dvssj1片段、发夹环区域、发夹茎的方向性和驱动发夹表达的启动子的实验。

在所有情况下，所述DvSSJ1发夹都在IPD072基因的上游克隆。所述盒由三个终止子的堆叠分开。这些组合未在先前的转化中得到验证。表1中描述了所选事件构建体质粒PHP74643的T-DNA区域中包含的遗传元件。

表1：质粒PHP74643的T-DNA区域遗传元件的说明

实例2.通过农杆菌属转化对玉米的转化及含有IPD072、DvSSJ1、PAT和PMI基因的转基因植物的再生

农杆菌属介导的用质粒PHP74643的SSI转化产生了DP-023211-2玉米事件。农杆菌属介导的SSI基本上如美国专利申请公开号2017/0240911中所述进行，其通过引用并入本文(参见，例如实例3)。

用PHP74643感染2700多个未成熟胚。经过105天的选择和再生过程，总共再生了46株T0幼苗。从所有T0幼苗中取样以进行PCR分析，以验证插入的IPD072、PMI、mo-PAT和DvSSJ1基因的存在和拷贝数。除该分析之外，还通过PCR分析了所述T0幼苗中某些农杆菌属二元载体主链序列的存在以及美国专利7,579,529和7,256,322中公开的发育基因zm-odp2和zm-wus2，这些专利通过引用以其整体并入本文。选择经确定为含有插入的基因的单拷贝、没有农杆菌属主链序列和没有发育基因的植物用于进一步的温室繁殖。使用SbS测序收集来自那些PCR选择的T0质量事件的样本用于进一步分析，以证实所述插入的基因在正确的靶基因座(本文也称为“着陆垫”)中而没有任何基因破坏。证实玉米事件DP-023211-2含有单拷贝的T-DNA(参见实例3和4)。测定这些选择的T0植物的性状功效和蛋白质表达。将满足所有标准的T0植物进行改良，并与近交系杂交，以产生种子进行进一步测试。转化和事件开发的示意性概述在图4中给出。

实例3.玉米事件DP-023211-2的鉴定

分离代表多代玉米事件DP-023211-2的来自叶组织的基因组DNA、已知的拷贝数校准物对照、阴性对照源(来自非基因修饰玉米的DNA)和无模板对照(NTC)并使用事件特异性和构建体特异性的引物和探针进行定量实时PCR(qPCR)扩增。使用事件特异性和构建体特异性的测定对DP-023211-2玉米DNA进行实时PCR分析，证实了测试叶样本中质粒PHP74643的T-DNA单拷贝的稳定整合和分离，如DP-023211-2玉米中的事件DP-023211-2以及IPD072、PMI、DvSSJ1和mo-PAT转基因的定量检测所证明的。通过一式四份重复实验，评估每种事件特异性和构建体特异性PCR方法的可靠性。通过来自DP-023211-2的基因组DNA的各种稀释液来评价所述PCR扩增的灵敏度或检出限(LOD)。

在典型的温室生产条件下，使含有事件DP-023211-2的两代玉米在细胞分裂平板上生长。每代种植大约165粒种子。

当植物处于V5和V9生长期之间时，从每株健康植物中收集叶样本。样本取自从每株植物的轮生体长出的最年轻的叶。通过针对DP-023211-2事件以及来自在先锋良种国际有限公司(爱荷华州约翰斯顿)生长的种子中的IPD072、PMI、DvSSJ1和mo-PAT转基因的拷贝数PCR(qPCR)，分析了每株植物的三个叶打孔中的每个事件的基因组连接和PHP74643 T-DNA的拷贝数。使用高碱性提取方案从叶样本中提取基因组DNA。使用标准的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取方案从叶组织中制备经过验证的实验室对照(拷贝数校准物和阴性对照)。

使用Quant-iT

试剂(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)对支持实验室对照的基因组DNA进行了定量。使用NanoDrop2000c分光光度计，使用NanoDrop2000/2000c V1.6.198软件(赛默科技公司(ThermoScientific)，威尔明顿，特拉华州)，对基因组测试和对照样本的定量进行估计。

从DP-023211-2的叶组织分离的基因组DNA样本以及对照样本，使用事件特异性和构建体特异性的跨越PHP74643 T-DNA的特定区域的引物和探针以及跨越事件DP-023211-2的每个插入位点的基因组连接进行实时PCR扩增。使用内源参考基因高流动性A组(hmg-A)(Krech等人(1999).Gene[基因]234：(1)45-50)与每种测定双重使用，以对每种测定进行定性和定量评估；证明PCR反应中存在足够质量和数量的DNA。表3中显示了每个引物/探针组的PCR靶位点和预期PCR产物的大小。表4中显示了支持每个靶区域的引物和探针序列信息。表5中显示了PCR试剂和反应条件。在该研究中，将大约3-ng玉米基因组DNA用于所有PCR反应。

表3：PCR基因组DNA靶位点和PCR产物的预期大小

表4：PCR基因组DNA靶区域的引物和探针序列及扩增子

表5：PCR试剂和反应条件

^a如果使用Roche

480完成热循环，则对步骤2a和2b执行45个循环。

扩增大小为72-bp到113-bp的PCR产物，它们代表事件DP-023211-2的插入位点以及来自质粒PHP74643的T-DNA内的转基因，并在来自事件DP-023211-2的100个个体叶样本以及八个拷贝数校准物基因组对照中观察到，但在八个阴性基因组对照和八个NTC对照中均不存在。每个测定总共进行了四次，观察到的结果相同。计算每个样本和所有阳性对照的C_T值。

使用所述玉米内源参考基因hmg-A，扩增79-bp的PCR产物，并在来自事件DP-023211-2的100个个体叶样本以及八个拷贝数校准物和八个阴性基因组对照中观察到。在测试的八个无模板(NTC)对照中未观察到内源基因的扩增，未生成CT值。对于每个样本，每个测定均以双重方式进行，两个插入位点和所有转基因共进行四次，每次观察到的结果相同。计算每个样本以及所有阳性和阴性对照的CT值。

为了评估构建体特异性PCR测定的灵敏度，将DP-023211-2玉米DNA稀释于对照玉米基因组DNA中，得到的测试样本中包含各种量的事件DP-023211-2DNA(5-ng、1-ng、100-pg、50-pg、20-pg、10-pg、5-pg、1-pg、0.5-pg、0.1-pg)，总计5-ng的玉米DNA。这些不同量的DP-023211-2玉米DNA分别对应于总玉米基因组DNA中100％、20％、2％、1％、0.4％、0.2％、0.1％、0.01％和0.002％的DP-23211-2玉米DNA。对于所述转基因PMI，测试了总玉米基因组DNA中750-pg、500-pg和250-pg或15％、10％和5％的另外的浓度的DP-023211-2DNA。针对转基因IPD072、PMI、DvSSJ1和mo-PAT，对各种量的DP-023211-2DNA进行实时PCR扩增。根据这些分析，确定事件DP-023211-2的5-ng总DNA的检出限(LOD)为IPD072的大约20-pg，或0.4％，PMI的500-pg，或10％(DP-023211-2)。所描述的每种测定的确定灵敏度足以用于许多筛选应用。每个浓度总共测试了四次，每次观察到的结果相同。

利用事件DP-023211-2的事件特异性和构建体特异性的引物/探针组对事件DP-023211-2进行实时PCR分析，证实了测试叶样本中所述事件的质粒PHP74643的T-DNA单拷贝的稳定整合和分离，如DP-023211-2玉米中的IPD072、PMI、DvSSJ1和mo-PAT转基因的定量检测所证明的。在进行的所有重复qPCR分析中，这些结果都是可重现的。用于检测hmg-A的玉米内源参考基因测定在所有测试样本、阴性对照中均按预期扩增，在NTC样本中未检测到。在所述条件下，每种测定的灵敏度为5-pg至500-pg DNA，对于通过PCR进行许多筛选应用而言，这些灵敏度均足够。

实例4.DP-023211-2玉米的完整性和拷贝数的SbS测序(Southern-by-Sequencing)分析

SbS测序(Southern-by-Sequencing)利用基于探针的序列捕获、下一代测序(NGS)技术和生物信息学程序来分离、测序和鉴定玉米基因组中的插入DNA。通过汇编大量独特的测序读数并将其与转化质粒进行比较，在生物信息学分析中鉴定由于插入的DNA而产生的独特连接，并可用这些独特连接确定植物基因组内的插入数量。通过SbS分析了DP-023211-2玉米各自的一株T0植物，以确定插入拷贝数。另外，分析了所述对照玉米系的样本。

从DP-023211-2玉米和对照植物的T0代中提取基因组DNA。

通过Roche NimbleGen公司(麦迪逊，威斯康辛州)设计和合成了用于选择PHP74643质粒序列的捕获探针。使用包含所述质粒序列的一系列独特序列来设计重叠生物素化寡核苷酸作为捕获探针。设计所述探针组以在富集过程中靶向所述PHP74643转化质粒内的大多数序列。将所述探针与所述玉米基因组进行比较，以确定将与所述PHP74643质粒序列同时捕获并测序的玉米基因组序列的水平。

针对DP-023211-2玉米植物和所述对照玉米系构建了下一代测序文库。如Zastrow-Hayes等人Plant Genome[植物基因组](2015)所述进行SbS。通过两轮杂交将测序文库与捕获探针杂交，以富集靶序列。在HiSeq 2500(依诺米那公司(Illumina)，美国加利福尼亚州圣地亚哥)上进行NGS之后，测序读数进入生物信息学流程以进行修整和质量保证。将读数与玉米基因组和转化构建体进行比对，并将包含基因组和质粒序列的读数鉴定为连接读数。连接读数与转化构建体的比对显示了相对于预期插入的插入DNA的边缘。

为了鉴定包括内源玉米序列的连接，以与所述DP-023211-2玉米植物相同的方式捕获对照玉米基因组DNA文库并测序。这些文库测序的平均深度为DP-023211-2玉米植物样本深度的大约五倍。这增加了在对照样本中检测到PHP74643探针捕获的内源性连接的可能性，因此可以在DP-023211-2玉米样本中鉴定并移除它们。

在源自构建体PHP74643的DP-023211-2玉米中确定所述插入的整合和拷贝数。在图1和图2中提供了所述PHP74643质粒和用于转化的PHP74643的T-DNA的示意图谱。

在DP-023211-2玉米的T0植物上进行SbS，以确定所述基因组中的插入拷贝数。检测到所述基因组侧翼序列和所述着陆垫之间的独特连接。所述FRT1和FRT87位点是PHP74643 T-DNA的目标性状整合到位点特异性整合系中的两个连接点。在所述植物的FRT1和FRT87连接处的独特读数显示于图3。在所述植物中检测到的PHP74643序列与所述玉米基因组之间没有其他连接，表明DP-023211-2玉米中不存在其他质粒衍生的插入。此外，在已鉴定的PHP74643 T-DNA的非连续区域之间没有连接，这表明插入的DNA中没有可检测到的重排或截短。此外，在所分析的植物中，玉米基因组序列和PHP74643的主链序列之间没有连接，证明没有质粒主链序列掺入DP-023211-2玉米中。

对DP-023211-2玉米的T0植物的SbS分析证明，在DP-023211-2玉米中存在包含来自PHP74643 T-DNA的所需基因的单个插入，并且在相应的基因组中不存在另外的插入。

在DP-023211-2玉米的T0植物上进行了SbS测序(Southern-by-Sequencing)分析，以证实插入拷贝数。结果表明所述植物中存在单个PHP74643 T-DNA插入。在对照植物中未检测到所述PHP74643 T-DNA序列与所述玉米基因组之间的连接，这表明，正如预期的那样，这些植物不含任何衍生自PHP74643的插入序列。此外，在所分析的植物中未检测到质粒主链序列。对DP-023211-2玉米的T0植物的SbS分析证明，在每个DP-023211-2玉米中都有PHP74643T-DNA的单个插入，并且在相应的基因组中不存在其他插入。

实例5.玉米事件DP-023211-2的昆虫功效

生成了五个构建体设计的功效数据。每个构建体设计均由三个遗传背景组成，每个背景中均包含多个事件(表6)。在种植前对每个项目的42个籽粒样本进行表征，以通过事件特异性PCR证实所述事件的存在。四个项目需要在田间进行组织采样，并且从实验中剔除所有非典型的植物。功效测试包括：在八个位置的WCRW根部损害。在每个位置，单行地块均以不完全区组设计进行种植，每个位置两个重复。

对大约V2生长阶段的植株用大约375-750个施加到植株两侧的土壤中(共约750-1，500卵/植物)的WCRW卵人工侵染(随位置而异)。另外，在很高可能性含有WCRW自然侵染的田间种植了地块。在大约R2生长阶段评价植物的根。将每个地块的两株植物用唯一的标识符加标签，并从地块中移出并用加压水洗涤。使用0-3节点损伤量表(CRWNIS)对根部损害进行评分(Oleson等人(2005)J.Econ.Entomol.[经济昆虫学期刊]98(1)：1-8)。

对于构建体设计的单个位置分析(表7)，将线性混合模型分别应用于每个位置的节点损伤评分模型。将构建体设计视为固定效应。将重复、重复_不完全区组(replicationby incomplete block)、背景、构建体、背景_构建体、事件、田地范围、田地行、地块和残差的效应视为独立的正态分布随机变量，其均值为零。进行T检验以比较治疗效果。如果所述差异的P值小于0.05，则认为差异具有统计学显著性。所有数据分析和比较均在ASReml 3.0(VSN国际，赫默尔亨普斯特德，英国，2009年)中进行。

对于事件的跨位置分析(表8)，将构建体设计视为固定效应。将位置、位置_重复、位置_重复_不完全区组、背景、概念、背景_概念、事件、位置_背景、位置_概念、位置_背景_概念、位置_事件、每个位置内的田地范围、每个位置内的田地行、每个位置内的地块和每个位置内的残差的效应视为独立的正态分布随机变量，均值为零。进行T检验以比较治疗效果。如果所述差异的P值小于0.05，则认为差异具有统计学显著性。所有数据分析和比较均在ASReml 3.0(VSN国际，赫默尔亨普斯特德，英国，2009年)中进行。表6和表7列出了WCRW饲喂的估计根部损害等级，显示某些构建体的表现优于其他。

表6.针对每个构建体设计中的功效评价的遗传背景和事件的数量

构建体设计	背景数量	事件数量
			SSJ72_UBI；BSV(AY)<sup>a</sup>	3	22
SSJ72_UBI；A	3	24
			SSJ72_BSV(AY)；A	3	15
SSJ72_3XUBI；A	3	7
			SSJ72_UBI；B	3	25

^a事件DP-023211-2包括在此构建体设计中

*A和B各自是不同的启动子

表7.在田间测试中构建体设计对北方玉米根虫(NCR)和西方玉米根虫(WCR)幼虫混合种群的功效。

^a使用0-3节点损伤量表(Oleson等人，2005，同上)确定个体植物根质量的损害等级。

^b在一个位置内，具有相同字母的估计值无显著差异(T检验，P＞0.05)。

*A和B各自是不同的启动子

表8.事件对八个田间测试地点对NCR和WCR幼虫混合种群的功效。

^a使用0-3节点损伤重表(Oleson等人，2005，同上)确定个体植物根质量的损害等级。

在第3年，在北美商业玉米生长区的14个地点对DP-023211-2进行了进一步的田间测试：明尼苏达州本森(MK_BE)；南达科他州布鲁金斯(BR)；印第安纳州福勒(WN_FO)；印第安纳州古德兰(WN_GL)；威斯康星州简斯维尔(JV)；爱荷华州约翰斯顿(JH和JH_D3)；明尼苏达州曼卡托(MK)；伊利诺伊州曼斯菲尔德(CI_MF)；爱荷华州马里恩(MR)；爱荷华州雷德琳(MR)；伊利诺伊州西摩(CI_SE)；和内布拉斯加州约克(YK和YK_LI)。在CI_SE、JV、WN_FO、WN_GL和YK处未收集任何功效数据，原因是阴性对照根部的节点损伤评分(CRWNIS)低于0.75。

单行地块(长10英尺)以α实验设计进行种植，重复两次。种植前，对每个种子批次的42个籽粒进行表征，以通过PCR证实所述性状的存在。当植物达到生长阶段V2-V4时，使用装在拖拉机上的CRW卵侵染器以大约750卵/株或1500卵/株的目标侵染率对连续五株植物进行人工侵染。将卵侵染到每株植物两侧大约2-3英寸处约4英寸深的土壤中。种植后56至78天，评价幼虫取食对根部的损伤。对两个玉米根加标签，手动从地下挖出，用加压水冲洗干净土壤，并评价在大约R2生长阶段的幼虫取食量。使用爱荷华州0-3节点损伤量表，通过肉眼评级和记录每个根上所含幼虫取食的量来评价根损伤(Oleson等人，2005)。

表9提供了DP-023211-2玉米和对照玉米的来自CRW的平均结节损伤根评级结果。这些结果表明，针对CRW，含有昆虫活性蛋白IPD072Aa和RNAi性状DvSSJ1的玉米系有效。

表9.对玉米根虫的功效结果

^a具有统计学上显著差异；(P值＜0.05)

实例6.玉米事件DP-023211-2的农艺和产量田间评价

2016年夏季进行了农艺田间试验，所述试验包含实例5中使用的同时包含DvSSJ1和IPD072的五个分子堆叠物构建体设计，以生成产量数据并评价其他农艺特征。针对每种构建体设计测试了多个事件(表10)。测试一个事件的所有近交和杂交材料均从单个T0植物生成。

杂交试验

杂交试验种植在16个地点，每个地点都有单个重复的项目清单。从所述16个地点中的10个收获籽粒。具有共同背景的每个项目都与三个被测物进行杂交，以生成用于测试的杂交种子。实验是由被测物嵌套的，每个嵌套的项目都是随机的。在整个生长季节中，在每个种植地点均收集了各个观察结果和数据。分析了以下农艺特征，以与野生型项目(WT)或具有相同遗传学但没有DvSSJ1和IPD072分子堆叠的项目(也称为基本比较物)进行比较(表11-12和图5-6)：

1.)至吐丝生长度单位(GDUSLK)：当该地块中有50％的植物完全吐丝时，测量记录累积的总生长度单位。该数据集的单日等效值为大约2.5个生长度单位。

2.)至脱落生长度单位(GDUSHD)：当该地块中有50％的植物雄穗在脱落花粉时，测量记录累积的总生长度单位。该数据集的单日等效值为大约2.5个生长度单位。

3.)穗高(EARHT)：从地面到植物上发育最高的穗连接点的测量值。穗高以英寸测量。

4.)植株高度(PLTHT)：从地面到旗叶基部的测量值。植株高度以英寸测量。

5.)水分(MST)：收获时籽粒水分百分比的测量值。

6.)产量：记录从每个地块收获的籽粒重量。通过调整每个地块的测得水分，计算报告的蒲式耳/英亩产量。

近交试验

近交试验种植在八个地点，每个地点有两个重复的项目清单。通过构建体设计在每个位置嵌套一个重复；另一个重复种植为随机化的完全区组。收集了近交试验的农艺数据和观察结果，并进行了分析，以与野生型项目(WT)或相同基因型的无性状版本进行比较。所述近交试验产生的数据包括以下农艺性状(图7和8)：

5.)穗光度测定法产量(PHTYLD)：根据从每个地块中收获的穗的图像计算出的产量估算值。显示值的单位为蒲式耳/英亩。

试验结果

为了评价杂交数据，使用了一个混合模型框架来执行多位置分析。在多位置分析中，将主要效应构建体设计视为固定效应。将位置、背景、被测物、事件、背景_构建体设计、被测物_构建体设计、被测物_事件、位置_背景、位置_构建体设计、位置_被测物、位置_背景_构建体设计、位置_被测物_构建体设计、位置_事件、位置_被测物_事件等因素视为随机效应。将包括各位置内的范围和地块在内的空间效应视为消除外部空间噪声的随机效应。对于每个位置，假设异质残差(heterogeneous residual)有自回归相关，为AR1*AR1。生成了每个背景的构建体设计估计和事件预测。进行了T检验以比较WT的构建体设计/事件。如果所述差异的P值小于0.05，则认为差异具有统计学显著性。产量分析通过ASREML(VSN国际有限公司；最佳线性无偏预测；Cullis，B.R等人(1998)Biometrics[生物统计学]54：1-18，Gilmour，A.R.等人(2009)；ASReml User Guide[ASReml用户手册]3.0，Gilmour，A.R.，等人(1995)Biometrics[生物统计学]51：1440-50)进行。

为了评价近交数据，使用了一个混合模型框架来执行多位置分析。在多位置分析中，将主要效应构建体设计视为固定效应。将位置、背景、事件、背景_构建体设计、位置_背景、位置_构建体设计、位置_背景_构建体设计、位置_事件和位置内的重复等因素视为随机效应。将包括各位置内的范围和地块在内的空间效应视为消除外部空间噪声的随机效应。对于每个位置，假设异质残差(heterogeneous residual)有自回归相关，为AR1*AR1。生成了每个背景的构建体设计估计和事件预测。进行了T检验以比较WT的构建体设计/事件。如果所述差异的P值小于0.05，则认为差异具有统计学显著性。产量分析通过ASREML(VSN国际有限公司；最佳线性无偏预测；Cullis，B.R等人(1998)Biometrics[生物统计学]54：1-18，Gilmour，A.R.等人(2009)；ASReml User Guide[ASReml用户手册]3.0，Gilmour，A.R.，等人(1995)Biometrics[生物统计学]51：1440-50)进行。

在第2年进行了类似的实验，结果证实了来自第1年的表现数据；从以下中选择了两个事件：SSJ72_UBI；BSV(AY)_NONE构建体设计。

表10.每个构建体设计评价的事件数

^a事件DP-023211-2包括在此构建体设计中

*A和B各自是不同的启动子

表11.构建体设计与基本项目相比的杂交种表现——产量

^a事件DP-023211-2包括在此构建体设计中

*A和B各自是不同的启动子

表12.事件DP-023211-2与基本项目相比的杂交种表现——产量

实例7.蛋白质表达和浓度

蛋白质提取

将处理后的叶或根组织样本的等分试样称入1.2ml试管中，叶组织的目标重量为10mg，根组织的目标重量为20mg。在0.6ml冷却的PBST中提取分析PAT和PMI蛋白浓度的样本，在含25％的Stabilzyme Select的0.6ml冷却的PBST中提取用于IPD072Aa蛋白分析的样本。离心后，去除上清液，在PBST(PAT和PMI)或含有25％的Stabilzyme Select(IPD072Aa)的PBST中稀释，并进行分析。

IPD072Aa蛋白浓度的测定

IPD072Aa ELISA方法利用先锋良种国际有限公司开发生产的试剂盒来确定样本中IPD072Aa蛋白的浓度。将标准(典型地在一式三份的孔中分析)和稀释的样本(典型地在一式两份的孔中分析)在预先涂有IPD072Aa特异性抗体的板上孵育。孵育后，从板上洗去未结合的物质。将与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的另一种IPD072Aa特异性抗体添加到平板上并孵育。从板上洗去未结合的物质。通过加入底物完成结合的IPD072Aa-抗体复合物的检测，该底物在HRP存在下生成有色产物。用酸溶液终止反应，并使用读板仪测定每个孔的光密度(OD)。

PAT蛋白浓度的测定

PAT ELISA方法利用恩沃劳格(EnviroLogix^TM)公司生产的ELISA试剂盒来确定样本中PAT蛋白的浓度。将标准(典型地在一式三份的孔中分析)和稀释的样本(典型地在一式两份的孔中分析)同与酶HRP缀合的PAT特异性抗体在预先涂有另一种PAT特异性抗体的平板中共同孵育。孵育后，从板上洗去未结合的物质。通过加入底物完成结合的PAT-抗体复合物的检测，该底物在HRP存在下生成有色产物。用酸溶液终止反应，并使用读板仪测定每个孔的OD。

PMI蛋白浓度的测定

PMI ELISA方法利用先锋良种国际有限公司开发生产的试剂盒来确定样本中PMI蛋白的浓度。将标准(典型地在一式三份的孔中分析)和稀释的样本(典型地在一式两份的孔中分析)在预先涂有PMI特异性抗体的板上孵育。孵育后，从板上洗去未结合的物质。将与酶(HRP)缀合的另一种PMI特异性抗体添加到平板上并孵育。从板上洗去未结合的物质。通过加入底物完成结合的PMI-抗体复合物的检测，该底物在HRP存在下生成有色产物。用酸溶液终止反应，并使用读板仪测定每个孔的OD。

测定蛋白质浓度的计算

使用SoftMax Pro GxP(分子器械公司(Molecular Devices))微孔板数据软件执行将每组样本孔获得的OD值转换为蛋白质浓度值所需的计算。

每个ELISA板上包括标准曲线。标准曲线的方程式是通过软件导出的，该软件使用二次拟合将每组标准孔获得的OD值与相应的标准浓度(ng/ml)相关联。如下应用二次回归方程：

y＝Cx²+Bx+A

其中x＝已知标准浓度，并且y＝相应的吸光度值(OD)

通过使用针对标准曲线确定的A、B和C值求解上述方程中的x来进行样本浓度(ng/ml)的内插。

例如，给定曲线参数A＝0.0476，B＝0.4556，C＝-0.01910，且样本OD＝1.438

通过将插值浓度乘以N，根据表示为1∶N的稀释系数调整样本浓度值。

调整后的浓度＝内插样本浓度x稀释系数

例如，假定内插浓度为3.6ng/ml，稀释系数为1∶20

调整后的浓度＝3.6ng/ml x 20＝72ng/ml

将从SoftMax Pro GxP软件获得的调整后的样本浓度值从ng/ml转换为ng/mg样本重量，如下所示：

例如，样本浓度＝72ng/ml，提取缓冲液体积＝0.60ml，样本目标重量＝10mg

以ng/ml计的可报告的测定定量下限(LLOQ)如下计算：

可报告的测定LLOQ(ng/ml)＝(最低标准浓度-10％)x最小稀释度

例如，最低标准浓度＝0.50ng/ml，并且最小稀释度＝10

可报告的测定LLOQ(ng/ml)＝(0.50ng/ml-(0.50x 0.10))x 10＝4.5ng/ml

以ng/mg样本重量计的LLOQ如下计算：

例如，可报告的测定LLOQ＝4.5ng/ml，提取缓冲液体积＝0.60ml，样本目标重量＝10mg

结果

表13提供了两代DP-023211-2玉米V9根组织中IPD072Aa蛋白的均值、标准差和范围，并且表14提供了两代DP-023211-2玉米V9叶组织中PAT和PMI蛋白的均值、标准差和范围。

表13：在DP-023211-2玉米的V9根样本中表达的IPD072Aa蛋白浓度

表14.在DP-023211-2玉米的V9叶样本中表达的PAT和PMI蛋白浓度

实例8.DvSSJ1 dsRNA表达

在2017年，在美国爱荷华州约翰斯顿，使用典型的温室生产条件，将DP-023211-2玉米的不同代(BC1F1和BC2F1)种植在4英寸的盆中，并组织成包含15个盆的平地。

在大约V9的生长阶段(即，当第九片叶的叶颈变得可见时)从10株植物中收集了根样本，并使用终点实时PCR分析了DP-023211-2玉米事件以及ipd072Aa、mo-pat、pmi和DvSSJ1基因的存在与不存在。选择通过PCR分析测试为阳性的五株植物用于进一步分析。

通过从土壤中取出根并摇动以除去多余的土壤来获得每个根样本。然后用水彻底清洗根，然后从所述植物中取下。样本中不包括地上支撑根。将根组织切成长度为1英寸(2.5cm)或更短的切片，将一部分样本收集到预冷的小瓶中进行QuantiGene分析，并将其余样本收集到小瓶中进行水分分析。将所有样本保存在干冰上，直到转移至-80℃的冰箱中。

称重大约1.2g来自DP-023211-2玉米植物的冷冻的V9根组织样本，将其与裂解缓冲液混合，并研磨。根据制造商的说明，使用mirVana总RNA分离试剂盒(赛默飞世尔科技公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)，提取来自800μl的研磨组织和裂解缓冲液混合物中的总RNA，并在75μl分子级水中洗脱。使用NanoDrop-8000对提取的RNA进行定量，并保存在-80℃的冰箱中。

DvSSJ1发夹RNA(hpRNA)的参考标准是通过体外转录产生的。为了生成用于体外转录的包含DvSSJ1序列的构建体，从所述转基因植物中提取总RNA，并将其用于使用cDNA末端5’和3’快速扩增(RACE)通过逆转录合成全长DvSSJ1的cDNA。将得到的cDNA在T7启动子下克隆到pUC57载体中。从细菌培养物中分离出DvSSJ1全长构建体的质粒DNA，并将其用于通过SunScript RT RNA酶H-试剂盒(Sygnis，海德堡，德国)进行的DvSSJ1 hpRNA的体外转录。DvSSJ1 hpRNA的工作浓度为10ng/μl。九点浓度为每40μl 0.0105至16pg，将其用于生成标准曲线。生成标准曲线各点的测量值并取平均值。

使用经过验证的QuantiGene Plex 2.0测定(美国昂飞公司(Affymetrix Inc.)，加利福尼亚圣克拉拉)，通过九点浓度(每40μl反应体积0.0105到16pg)的DvSSJ1 hpRNA参考标准创建的标准曲线分析每孔250ng总RNA。所述测定中使用的探针组设计用于特异性检测DvSSJ1 RNA转录本。将来自非GM HC69玉米植物的总RNA用作阴性对照。

根据进行了修改的制造商说明进行QuantiGene测定。在96孔杂交板中一式三份的孔中以100μl的体积测定测试样本、阴性对照样本和DvSSJ1 hpRNA参考标准。在每个测试样本孔中，将250ng的总RNA与四分之一强度的探针组混合并在95℃下加热。加热3分钟后，将样本冷却并保持在54℃直至使用。将40μl RNA样本和5μl探针组的混合物转移至包含55μl珠混合物的杂交板上进行过夜杂交。信号扩增和洗涤后，根据制造商的说明通过MagPix分析仪(路明克斯公司(Luminex.Corp.)，奥斯汀，得克萨斯州)读取所述测定板的荧光强度。报告了每个测定孔的净中值荧光强度(MFI)。

收集每代五株植物的根组织样本，以获得鲜重与干重之比。记录每个样本的鲜重。然后将样本放在干冰上，冻干，并记录干重。

使用净MFI值为每组一式三份样本计算平均值、标准差和变异系数。在QuantiGene测定板上生成标准曲线，并将其用于根据净MFI值内插DvSSJ1 dsRNA浓度。来自每个测试样本的DvSSJ1 RNA的浓度进一步转换为pg/mg鲜重(fw)值。将所有鲜重值进一步换算为干重(dw)值的pg/mg。在2代中，对5株植物中的每株均以fw和dw为基础确定了DvSSJ1RNA水平的平均值、标准差和范围。

以pg/ml计的可报告的测定定量下限(LLOQ)如下计算：

可报告的测定LLOQ(pg/ml)＝最低标准浓度x 90％x最低稀释度

最低标准浓度为0.0105pg/rxn，并且使用的最小稀释度为0.574rxn/mg。

因此，LLOQ＝0.0105pg/rxn x 0.9x 0.574rxn/mg＝0.0054pg/mg

从每代分析的五株植物中平均得出DP-023211-2玉米根样本的DvSSJ1 dsRNA表达结果，并将平均值、标准差和范围汇总于表15中。

表15：DP-023211-2玉米V9根组织中DvSSJ1 RNA表达水平的汇总

实例9.LC₅₀和光谱分析

IPD072Aa和DvSSJ1都可以有效地控制玉米根萤叶甲(Diabrotica virgiferavirgifera，西方玉米根虫(WCR))，它是玉米的昆虫有害生物，以玉米植物根部组织为食并且会降低产量。基于以下几个标准选择用于IPD072Aa和DvSSJ1测试的物种：生物体与WCR的相关性、已建立的实验室生物测定方法、实验室饲养的昆虫的可获得性、适当饮食的可获得性以及每种生物体的实验室表现和响应变量的可重现性。方法的开发包括建立适当的饮食和环境条件，以实现强大的生物测定性能，并建立可接受的标准，通常为对于IPD072Aa在至少7天之内和对DvSSJ1在至少14天之内，死亡率低于20％。如果可能，还观察到其他亚致死终点，例如生长和发育时间。

在所有情况下，均尽可能频繁地向生物体提供含有适当浓度IPD072Aa和DvSSJ1的新鲜饲料，而不超过可接受的控制死亡率水平，或在生物测定条件下测试物稳定性下降。在大多数情况下，至少每3或4天或在某些情况下每天提供新鲜饲料。通常，可接受标准包括在生物测定对照中死亡率≤20％，与每次生物测定相关的各个阳性对照中观察到死亡率≥80％，然而考虑到该生物体在人工饲料实验室生物测定中的相对可变性能，WCR的≤30％对照死亡率被认为是可接受的。

IPD072Aa的LC50为15.9ppm(95％置信区间为12.6-20.6ppm)，使用7天持续时间的生物测定生成。DvSSJ1的14天LC50为0.036ppm(95％置信区间为0.0066-0.065ppm)。以DvSSJ1作为RNAi的作用方式进行了更长的研究时间，因为DvSSJ1比IPD072Aa需要更长的时间才能发挥作用并杀死目标有害生物。

通过与WCR相关的生物体或可用于实验室研究的物种的实验室研究，评估了IPD072Aa和DvSSJ1的活性。表16显示了在这些另外的生物测定中使用的物种阵列，其中一些代表各种谷物(玉米、小麦、大豆等)的有害生物，并且一些物种是在农业领域提供有益生态系统服务的非目标生物体。由于WCR属于鞘翅目，因此特别关注鞘翅目中的生物体。选择的另外的生物体代表鞘翅目中的另外的三个科。此外，对鳞翅目中的四个不同科进行了测试。

IPD072Aa存活的无观察效应浓度(NOEC)在100ppm至大于1000ppm之间(表16)。在所测试的浓度下，在鞘翅目以外没有观察到活性。除WCR的近亲属黄瓜十一星叶甲(Diabrotica undecimpunctata，南方玉米根虫(SCR))外，所有受测生物体的DvSSJ1存活NOEC均超过1ppm(表16)。没有观察到DvSSJ1对除西方(WCR)和南方玉米根虫(SCR)以外的任何生物体的活性。

对本公开的各种所说明的实施例的上述描述并不旨在是详尽的或者限制范围于所公开的精确形式。虽然为了说明目的而在本文描述了具体实施例和实例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开范围内的各种等效修饰是可能的。本文提供的教导可以应用于除了上述实例之外的其他目的。根据上述教导，许多修改和变化是可能的，并且因此在所附权利要求书的范围内。

可以根据上述详细描述进行这些改变和其他改变。通常，在以下权利要求书中，所用的术语不应被解释为将范围限制于说明书和权利要求书中公开的具体实施例。

背景技术、具体实施方式和实例中引用的每个文献(包括专利、专利申请、杂志文章、摘要、手册、书籍或其他公开内容)的全部公开内容通过引用以其整体并入本文。

就使用的数字(例如量、温度、浓度等)而言，已努力确保其准确性，但仍应允许有一些实验误差和偏差。除非另有说明，份为重量份，分子量为平均分子量；温度单位为摄氏度；并且压力为大气压或接近大气压。

Claims

1.一种包含玉米事件DP-023211-2的基因型的玉米植物，其中所述基因型包含SEQ IDNO：31和SEQ ID NO：35中所列出的核苷酸序列。

2.如权利要求5所述的玉米植物，其中所述基因型包含SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：36中所列出的核苷酸序列。

3.如权利要求5所述的玉米植物，其中所述基因型包含SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：37中所列出的核苷酸序列。

4.一种包含可操作地连接的第一和第二表达盒的DNA构建体，其中所述第一表达盒包含：

a)ubiZM1启动子；

b)ubiZM1 5′UTR；

c)ubiZM1内含子；

d)DvSSJ1片段；

e)zm-Adh1内含子接头；

f)DvSSJ1片段；

g)Z27G终止子

h)UBQ14终止子；以及

i)玉米In2-1终止子；

其中所述第二表达盒包含：

1)BSV(AY)启动子；

2)zm-HPLV9内含子；

3)ipd072Aa；以及

4)at-T9终止子。

5.一种植物，所述植物包含如权利要求4所述的DNA构建体。

6.如权利要求5所述的植物，其中所述植物是玉米植物。

7.一种植物，所述植物包含SEQ ID NO：25中所列出的序列。

8.一种玉米事件DP-023211-2，其中所述玉米事件的种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124722。

9.如权利要求8所述的玉米事件的植物部分。

10.包含玉米事件DP-023211-2的种子，其中所述种子包含选自SEQ ID NO：31和SEQ IDNO：35的DNA分子，其中所述玉米事件DP-023211-2种子的代表性样品已经保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124722。

11.一种玉米植物或其部分，所述玉米植物或其部分从如权利要求10所述的种子生长。

12.一种转基因种子，所述转基因种子由如权利要求8所述的玉米植物产生。

13.一种转基因玉米植物或其部分，所述转基因玉米植物或其部分从如权利要求12所述的种子生长。

14.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含选自SEQ ID NO：25和31-38的核苷酸序列及其全长互补序列。

15.一种扩增子，所述扩增子包含选自SEQ ID NO：25-30的核酸序列及其全长互补序列。

16.一种衍生自玉米事件DP-023211-2植物、组织或种子的生物学样品，其中所述样品包含作为选自SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：35的序列或与其互补的核苷酸序列，其中可使用核酸扩增或核酸杂交方法在所述样品中检测所述核苷酸序列，其中所述玉米事件DP-023211-2种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124722。

17.如权利要求16所述的生物学样品，其中所述生物学样品包括转基因玉米事件DP-023211-2的植物、植物组织或种子。

18.如权利要求17所述的生物学样品，其中所述生物学样品是从转基因玉米植物事件DP-023211-2中提取的DNA样品，且其中所述DNA样品包含选自SEQ ID NO：25-38的一个或多个核苷酸序列及其互补序列。

19.如权利要求16所述的生物学样品，其中所述生物学样品选自玉米细粉、玉米粗粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉和以整体或部分制造而包含玉米副产物的谷物。

20.一种提取物，所述提取物衍生自玉米事件DP-023211-2植物、组织或种子，并且包含作为选自SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：35的序列或与其互补的核苷酸序列，其中所述玉米事件DP-023211-2种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124722。

21.如权利要求20所述的提取物，其中可使用核酸扩增或核酸杂交方法在所述提取物中检测所述核苷酸序列。

22.如权利要求21所述的提取物，其中所述提取物包括转基因玉米植物事件DP-023211-2的植物、植物组织或种子。

23.如权利要求22所述的提取物，其中所述提取物是选自玉米细粉、玉米粗粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉和以整体或部分制造而包含玉米副产物的谷物的组合物，其中所述组合物包含可检测量的所述核苷酸序列。

24.一种生产杂交玉米种子的方法，所述方法包括：

a)使包含选自SEQ ID NO：25-38的核苷酸的第一玉米近交系与具有不同基因型的第二近交系有性杂交；

b)使来自所述杂交的后代生长；以及

c)收获由此产生的杂交种子。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述第一玉米近交系是母本。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述第一玉米近交系是父本。

27.一种用于生产对鞘翅目有害生物具有抗性的玉米植物的方法，所述方法包括：

a)使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，其中所述第一或第二亲本玉米植物包含事件DP-023211-2，由此产生多个第一代后代植物；

b)使所述第一代后代植物自交，由此产生多个第二代后代植物；以及

c)从包含所述事件DP-023211-2并且对鞘翅目有害生物具有抗性的第二代后代植物中选择。

28.一种生产杂交玉米种子的方法，所述方法包括：

a)使包含如权利要求1所述的DNA构建体的第一玉米近交系与不包含如权利要求1所述的DNA构建体的第二近交系有性杂交；以及

b)收获由此产生的杂交种子。

29.如权利要求28所述的方法，所述方法还包括如下步骤：将包含玉米事件DP-023211-2的第二代后代植物与缺少所述玉米事件DP-023211-2DNA的亲本植物回交，由此产生对鞘翅目有害生物具有抗性的回交后代植物。

30.一种用于生产对玉米根虫具有抗性的玉米植物的方法，所述方法包括：

a)使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物杂交，其中所述第一或第二亲本玉米植物包含事件DP-023211-2，由此产生多个第一代后代植物；

b)选择包含所述事件DP-023211-2的第一代后代植物；

c)使步骤(b)的所述第一代后代植物与缺少所述玉米事件DP-023211-2DNA的亲本植物回交，由此产生多个回交后代植物；以及

d)从所述回交后代植物中选择包含事件DP-023211-2的植物；

其中步骤(d)的所选回交后代植物包含SEQ ID NO：25、31或35。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述第一亲本玉米系的植物是母本或父本。

32.一种杂交种子，所述杂交种子通过如权利要求30所述的方法产生。

33.一种确定生物学样品中包含事件DP-023211-2的玉米植物的接合性的方法，所述方法包括：

a)使所述样品与第一对DNA分子和不同的第二对DNA分子接触，使得：

1)当用于包含玉米事件DP-023211-2DNA的核酸扩增反应中时，产生诊断事件DP-023211-2的第一扩增子，以及

2)当用于包含除DP-023211-2DNA以外的玉米基因组DNA的核酸扩增反应中时，产生诊断除DP-023211-2DNA以外的玉米基因组DNA的第二扩增子；

b)进行核酸扩增反应；以及

c)检测如此产生的扩增子，其中检测到两种扩增子的存在表明所述样品对于玉米事件DP-023211-2DNA是杂合的，其中仅检测到所述第一扩增子表明所述样品对于玉米事件DP-023211-2DNA是纯合的。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述第一对DNA分子包含引物对SEQ ID NO：7和8。

35.如权利要求33所述的方法，其中所述第一和第二对DNA分子包含可检测标记。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述可检测标记是荧光标记。

37.如权利要求35所述的方法，其中所述可检测标记与所述引物分子中的一个或多个共价缔合。

38.一种检测包含玉米核酸的样品中事件DP-023211-2独特的核酸分子的存在的方法，所述方法包括：

a)使所述样品与一对引物接触，所述引物在用于与来自事件DP-023211-2的基因组DNA的核酸扩增反应中时，产生诊断事件DP-023211-2的扩增子；

b)进行核酸扩增反应，由此产生诊断事件DP-023211-2的扩增子；以及

c)检测诊断事件DP-023211-2的扩增子。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述诊断事件DP-023211-2的核酸分子是通过核酸扩增链式反应产生的扩增子。

40.如权利要求38所述的方法，其中所述探针包含可检测标记。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述可检测标记是荧光标记。

42.如权利要求40所述的方法，其中所述可检测标记与所述探针共价缔合。

43.多个包含一个或多个多核苷酸的多核苷酸引物，所述一个或多个多核苷酸靶向样品中的事件DP-023211-2DNA模板，以由于聚合酶链式反应方法产生诊断事件DP-023211-2的扩增子。

44.如权利要求43所述的多核苷酸引物对，其中

a)所述第一多核苷酸引物包含选自SEQ ID NO：3的核苷酸1-503、SEQ ID NO：3的核苷酸16687-17568及其互补序列的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸；并且

b)所述第二多核苷酸引物包含选自SEQ ID NO：3的核苷酸1-503、SEQ ID NO：3的核苷酸16687-17568及其互补序列的至少10个连续核苷酸。

45.如权利要求43所述的多核苷酸引物对，其中

a)所述第一多核苷酸引物包含SEQ ID NO：7中所列出的核苷酸序列及其互补序列；并且

b)所述第二多核苷酸引物包含SEQ ID NO：8中所列出的核苷酸序列及其互补序列。

46.如权利要求43所述的引物对，其中所述第一引物和所述第二引物是至少18个核苷酸。

47.一种检测样品中与DP-023211-2事件相对应的DNA的存在的方法，所述方法包括：

a)使包含玉米DNA的样品与多核苷酸探针接触，所述多核苷酸探针在严格杂交条件下与来自玉米事件DP-023211-2的DNA杂交，并且在所述严格杂交条件下不与非DP-023211-2玉米植物DNA杂交；

b)使所述样品和探针经受严格杂交条件；以及

c)检测所述探针与所述DNA的杂交；

其中检测到杂交表明所述DP-023211-2事件的存在。

48.一种用于检测事件DP-023211-2独特的核酸的试剂盒，所述试剂盒包括至少一个具有足够长度的连续多核苷酸的核酸分子，以在核酸检测方法中充当引物或探针，并且在样品中的靶核酸序列扩增或与样品中的靶核酸序列杂交、随后检测所述扩增子或与所述靶序列的杂交后，所述连续多核苷酸诊断所述样品中事件DP-023211-2独特的核酸序列的存在。

49.如权利要求48所述的试剂盒，其中所述核酸分子包含来自SEQ ID NO：7-38的核苷酸序列。

50.如权利要求48所述的试剂盒，其中所述核酸分子是选自SEQ ID NO：7-38及其互补序列的引物。

51.一种包含玉米事件DP-023211-2的基因型的玉米植物，其中所述基因型包含与SEQID NO：31和SEQ ID NO：35具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

52.如权利要求5所述的玉米植物，其中所述基因型包含与SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：36具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。

53.如权利要求5所述的玉米植物，其中所述基因型包含与SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：37具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。