CN112055598A - 用于抑制gys2表达的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及可用于降低GYS2表达(尤其是在肝细胞中)的寡核苷酸、组合物和方法。公开的用于降低GYS2表达的寡核苷酸可以是双链或单链的，并且可以被修饰以改善特性，诸如更强的对核酸酶的抗性和更低的免疫原性。公开的用于降低GYS2表达的寡核苷酸也可以包括靶向配体以靶向特定细胞或器官，诸如肝脏的肝细胞，并且可用于治疗糖原贮积病(例如，GSDIa、GSDIII、GSDIV、GSDVI和GSDIX)和相关病况。
Description
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求在2018年3月2日提交且题为“COMPOSITIONSAND METHODS FOR INHIBITING GYS2 EXPRESSION”的美国临时申请号62/637574的益处，所述申请的完整内容通过引用并入本文。
发明领域
本申请涉及寡核苷酸及其用途，尤其是涉及糖原贮积病和相关病况的治疗的用途。
序列表的引用
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表作为在2019年2月15日创建的题为D0800.70014WO00-SEQ.txt的文件(其大小为132千字节)提供。序列表的电子格式的信息通过引用以其整体并入本文。
发明背景
糖原是身体用于贮存葡萄糖的复合糖。当身体需要更多葡萄糖以行使功能时，它通常分解贮存的糖原以在细胞过程中使用。数种酶参与用于将葡萄糖贮存为糖原(糖原合成)和将糖原分解为葡萄糖(糖原分解)的过程。当这些酶中的一种或多种受到抑制时，可能导致糖原贮积病，其中可能观察到糖原贮存的缺乏、糖原在受累细胞(例如，肝脏和/或肌肉细胞)中的积累或异常结构的糖原的形成。当糖原贮存或分解的病症发生时，受影响的那些可能患有许多症状，包括但不限于：肝肿大、肝毒性增加(例如，较高水平的AST、ALT和/或ALP)、肝纤维化、肝中脂肪酸沉积、肝增生、肝细胞腺瘤和/或肝细胞癌。一组非限制性的示例性糖原贮积病可包括：GSDI(例如GSDIa)、GSDIII、GSDIV、GSDVI和GSDIX。
发明简述
本公开的各方面涉及用于在受试者中治疗糖原贮积病(例如，影响糖原分解或贮存的疾病或病症，例如GSDIa、GSDIII、GSDIV、GSDVI或GSDIX)的寡核苷酸和相关方法。在一些实施方案中，已开发了有效的RNAi寡核苷酸用于选择性抑制受试者中的GYS2表达。在一些实施方案中，RNAi寡核苷酸可用于降低肝细胞中的总体GYS2活性，从而降低或预防肝肿大、肝毒性(例如AST、ALT和/或ALP的水平)、肝纤维化、肝中脂肪酸沉积、肝增生、肝细胞腺瘤和/或肝细胞癌。在一些实施方案中，本文中已鉴定了GYS2 mRNA的关键区域(称为热点)，其特别可适合于使用这样的基于寡核苷酸的方法的靶向(参见例如实施例1)。
本公开的一个方面提供了用于降低GYS2的表达的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含含有如SEQ ID NO:193-384、417-466、518-568、575-580、586-598或620-627中任一者所示的序列的反义链。在一些实施方案中，反义链由如SEQ ID NO:193-384、417-466、518-568、575-580、586-598或620-627中任一者所示的序列组成。在一些实施方案中，反义链包含如SEQ ID NO:417-466、575-580、586-598、620-627中任一者所示的序列或由其组成。在一些实施方案中，寡核苷酸进一步包含含有如SEQ ID NO:1-192、385-416、467-517、569-574、581-585或612-619中任一者所示的序列的有义链。在一些实施方案中，有义链由如SEQ ID NO:1-192、385-416、467-517、569-574、581-585或612-619中任一者所示的序列组成。在一些实施方案中，有义链包含如SEQ ID NO:385-416、569-574、581-585、612-619中任一者所示的序列或由其组成。
本公开的一个方面提供了用于降低GYS2的表达的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含长度为15至30个核苷酸的反义链。在一些实施方案中，所述反义链具有与如SEQ ID NO:599-608中任一者中所示的GYS2的靶标序列互补的区域。在一些实施方案中，互补的区域长度为至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个或至少22个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述互补的区域与GYS2的靶标序列完全互补。在一些实施方案中，所述与GYS2互补的区域长度为至少19个连续核苷酸。
在一些实施方案中，所述反义链长度为19至27个核苷酸。在一些实施方案中，所述反义链长度为21至27个核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸进一步包含长度为15至40个核苷酸的有义链，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区域。在一些实施方案中，所述有义链长度为19至40个核苷酸。在一些实施方案中，反义链长度为27个核苷酸，并且有义链长度为25个核苷酸。在一些实施方案中，所述双链体区域长度为至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21个核苷酸。在一些实施方案中，所述反义链和所述有义链形成长度为25个核苷酸的双链体区域。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度各自在21至23个核苷酸的范围内的反义链和有义链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为19至21个核苷酸的范围内的双链体结构。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为一个或多个核苷酸的3'-突出端序列，其中3'-突出端序列存在于反义链、有义链或反义链和有义链上。在一些实施方案中，寡核苷酸进一步包含在反义链上长度为两个核苷酸的3'-突出端序列。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为两个核苷酸的3'-突出端序列，其中所述3'-突出端序列存在于所述反义链上，且其中所述有义链长度为21个核苷酸且所述反义链长度为23个核苷酸，使得所述有义链和反义链形成长度为21个核苷酸的双链体。
在一些实施方案中，有义链包含如SEQ ID NO:1-192、385-416、467-517、569-574、581-585或612-619中任一者所示的序列。在一些实施方案中，有义链由如SEQ ID NO:1-192、385-416、467-517、569-574、581-585或612-619中任一者所示的序列组成。在一些实施方案中，反义链包含如SEQ ID NO:193-384、417-466、518-568、575-580、586-598或620-627中任一者所示的序列。在一些实施方案中，反义链由如SEQ ID NO:193-384、417-466、518-568、575-580、586-598或620-627中任一者所示的序列组成。
在一些实施方案中，有义链在其3'末端包含如下所示的茎-环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，且其中L在S1和S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环。
本公开的另一方面提供了用于降低GYS2的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含反义链和有义链，其中所述反义链长度为21至27个核苷酸且具有与GYS2互补的区域，其中所述有义链在其3'-末端包含如下所示的茎-环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，且其中L在S1和S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，且其中所述反义链和所述有义链形成长度为至少19个核苷酸的双链体结构，但不共价连接(参见例如图3)。在一些实施方案中，所述互补的区域与GYS2 mRNA的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21个连续核苷酸完全互补。在一些实施方案中，L是四环。在一些实施方案中，L长度为4个核苷酸。在一些实施方案中，L包含示为GAAA的序列。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述修饰的核苷酸包含2'-修饰。在一些实施方案中，所述2'-修饰是选自以下的修饰：2'-氨基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸都是修饰的。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸间键。在一些实施方案中，所述至少一个修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。在一些实施方案中，所述磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。
在一些实施方案中，寡核苷酸的至少一个核苷酸缀合至一个或多个靶向配体。在一些实施方案中，各靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质。在一些实施方案中，各靶向配体包含N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分。在一些实施方案中，所述GalNac部分是单价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分或四价GalNAc部分。在一些实施方案中，所述茎-环的L的最多达4个核苷酸各自缀合至单价GalNAc部分。在一些实施方案中，所述靶向配体包含适体。
本公开的另一个方面提供了包含本公开的寡核苷酸和赋形剂的组合物。本公开的另一个方面提供了包括将本公开的组合物施用于受试者的方法。在一些实施方案中，所述方法导致肝肿大、肝结节形成、肝毒性(例如AST、ALT和/或ALP的水平)、肝纤维化、肝细胞增殖、肝中脂肪酸沉积、肝增生、肝细胞腺瘤和/或肝细胞癌的水平降低或预防。本公开的另一方面提供了用于治疗糖原贮积病或糖原贮积病的一种或多种症状的方法。一组非限制性的示例性糖原贮积病可包括：GSDI(例如GSDIa)、GSDIII、GSDIV、GSDVI和GSDIX。
本公开的另一个方面提供了用于降低GYS2的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含长度为15至40个核苷酸的有义链和长度为15至30个核苷酸的反义链，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区域，其中所述有义链包含如SEQ ID NO:1-192、385-416、467-517、569-574、581-585或612-619中任一者中所示的序列，且导致所述反义链包含选自SEQ IDNO:193-384、417-466、518-568、575-580、586-598或620-627的互补序列。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含选自表4中所示的表的行的一对有义和反义链。
附图简述
并入本说明书并构成本说明书的一部分的附图举例说明某些实施方案，并且与书面描述一起用于提供本文公开的组合物和方法的某些方面的非限制性实例。
图1A和1B是显示在HEK-293细胞中筛选264种GYS2缀合物后剩余的GYS2 mRNA的百分比的图。在NM_021957.3中对应于各siRNA的有义链的3'末端的核苷酸位置在x轴上指出。
图2A和2B是一组图，显示在HEK-293细胞中以两个或三个不同浓度(0.1nM和1.0nM，或0.03nM、0.1nM和1.0nM)的71种GYS2寡核苷酸的GYS2寡核苷酸筛选后剩余的mRNA的百分比。
图3是显示已缀合至四个GalNAc部分(菱形)的具有带切口的四环结构的双链寡核苷酸的非限制性实例的示意图。
图4是显示以一种或两种不同的修饰模式在HEK-293细胞中使用不同碱基序列的GYS2寡核苷酸的筛选结果的图。X轴列出了由评价的寡核苷酸靶向的有义链的3'末端。阴性对照序列(NC1)、未转染的细胞和模拟物转染的细胞在左边作为对照显示。
图5是显示在猴肝细胞中使用以带切口的四环结构的不同碱基序列的GYS2寡核苷酸的筛选结果的图。使用相同的修饰模式，和以三个不同的浓度(0.1μM、0.3μM和1.0μM)测试寡核苷酸。未转染的细胞在左边作为对照显示。
图6A和6B是显示在HEK-293细胞中对于选自剂量应答曲线筛选的GYS2寡核苷酸的IC50结果的一系列图。
图7是显示GalNAc缀合的以带切口的四环结构的GYS2寡核苷酸的体内活性评价的图。测试了八个不同的寡核苷酸序列。寡核苷酸以0.5mg/kg皮下施用至表达人GYS2的小鼠。数据显示在施用后第4天剩余的GYS2 mRNA的量，其归一化至PBS对照。
发明详述
根据一些方面，本公开提供了靶向GYS2 mRNA的寡核苷酸，其在细胞，特别是肝脏细胞(例如肝细胞)中有效降低GYS2表达，以治疗糖原贮积病(例如，GSDIa、GSDIII、GSDIV、GSDVI和GSDIX)或糖原贮积病的一种或多种症状。因此，在相关的方面，本公开提供了治疗糖原贮积病(例如，GSDIa、GSDIII、GSDIV、GSDVI和GSDIX)或糖原贮积病的一种或多种症状的方法，其包括选择性降低肝脏中的GYS2基因表达。在某些实施方案中，本文提供的GYS2靶向寡核苷酸经设计以递送至靶组织的经选择的细胞(例如，肝脏的肝细胞)以在受试者中治疗糖原贮积病(例如GSDIa、GSDIII、GSDIV、GSDVI和GSDIX)或糖原贮积病的一种或多种症状。
本公开的进一步的方面，包括定义的术语的描述，在下文提供。
I.定义
施用：如本文所用，术语“施用(administering)”或“施用(administration)”意指以药理学有用的方式将物质(例如，寡核苷酸)提供给受试者(例如，以治疗受试者中的病况)。
近似：如本文所用，如应用于一种或多种目标值的术语“近似”或“约”是指与所述参考值类似的值。在某些实施方案中，除非另有说明或另外从上下文显而易见，否则术语“近似”或“约”是指落入所述参考值在任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的值的范围(除非这种数字将超过可能值的100％)。
脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)：如本文所用，术语“脱唾液酸糖蛋白受体”或“ASGPR”是指由主要的48kDa(ASGPR-1)和次要的40kDa亚基(ASGPR-2)形成的二分C-型凝集素。ASGPR主要表达在肝细胞的血窦表面上，并且在含有末端半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺残基的循环糖蛋白(脱唾液酸糖蛋白)的结合、内化和随后的清除中具有主要作用。
互补：如本文所用，术语“互补”是指核苷酸(例如，在相对的核酸上或在单一核酸链的相对区域上的两个核苷酸)之间允许核苷酸彼此形成碱基对的结构关系。例如，一个核酸的与相对核酸的嘧啶核苷酸互补的嘌呤核苷酸可以通过彼此形成氢键而碱基配对在一起。在一些实施方案中，互补的核苷酸可以以沃森-克里克(Watson-Crick)方式或以允许形成稳定双链体的任何其他方式碱基配对。在一些实施方案中，两个核酸可以具有与彼此互补以便形成互补区域的核苷酸序列，如本文所述。
脱氧核糖核苷酸：如本文所用，术语“脱氧核糖核苷酸”是指与核糖核苷酸相比在其戊糖的2’位置处具有氢的核苷酸。修饰的脱氧核糖核苷酸是除了在2’位置以外具有一个或多个原子的修饰或取代(包括糖、磷酸酯基团或碱基中的修饰或取代或糖、磷酸酯基团或碱基的修饰或取代)的脱氧核糖核苷酸。
双链寡核苷酸：如本文所用，术语“双链寡核苷酸”是指基本上呈双链体形式的寡核苷酸。在一些实施方案中，在共价分离的核酸链的核苷酸的反向平行序列之间形成双链寡核苷酸的一个或多个双链体区域的互补碱基配对。在一些实施方案中，在共价连接的核酸链的核苷酸的反向平行序列之间形成双链寡核苷酸的一个或多个双链体区域的互补碱基配对。在一些实施方案中，从单一核酸链形成双链寡核苷酸的一个或多个双链体区域的互补碱基配对，所述单一核酸链被折叠(例如，经由发夹)，以提供在一起碱基配对的核苷酸的互补的反向平行序列。在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含彼此完全双链体化的两条共价分离的核酸链。然而，在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含部分双链体化、例如在一个或两个末端具有突出端的两条共价分离的核酸链。在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含核苷酸的反向平行序列，其部分互补，且因此，可以具有一个或多个错配，所述错配可以包括内部错配或末端错配。
双链体：如本文所用，关于核酸(例如寡核苷酸)的术语“双链体”是指通过核苷酸的两个反向平行序列的互补碱基配对形成的结构。
赋形剂：如本文所用，术语“赋形剂”是指可以被包括在组合物中例如以提供或促成期望的稠度或稳定作用的非治疗剂。
糖原贮积病：如本文所用，术语“糖原贮积病(glycogen storage disease)”、“GSD”或“糖原贮积病(glycogen storage diseases)”是指由影响糖原合成、糖原分解和/或葡萄糖分解(糖酵解)的酶缺乏引起的代谢病症。已经表征了各种类型的糖原贮积病，包括GSD 0、GSD I(亦称为GSD 1或冯·吉尔克病；例如GSDIa)、GSD II(亦称为蓬佩病或酸性麦芽糖酶缺乏症)、GSD III(亦称为GSD3、柯里氏病或福贝斯氏病)、GSD IV(GSD 4或安德森病)、GSD V(亦称为麦卡德尔病)、GSD VI(亦称为GSD 6或赫斯氏病)、GSD VII(亦称为GSD 7或塔里氏病)、GSD VIII和GSD IX(亦称为GSD9)。在一些实施方案中，具有糖原贮积病的个体显示许多症状中的一种或多种，所述症状包括但限于：肝肿大、肝毒性增加(例如，较高水平的AST、ALT和/或ALP)、肝纤维化、肝中脂肪酸沉积、肝增生、肝细胞腺瘤和/或肝细胞癌。
GYS2：如本文所用，术语“GYS2”或“糖原合酶2”是指肝脏糖原合酶基因。该基因编码蛋白质肝脏糖原合酶，其催化糖原合成中的限速途径(即，葡萄糖分子从UDP-葡萄糖转移到糖原分子的末端分支)。GYS2在肝脏细胞例如肝细胞中表达。GYS2的同系物在一定范围的物种中是保守的，包括人、小鼠、大鼠、非人灵长类物种等等(参见例如，NCBI HomoloGene:56580)。在人中，GYS2编码多重转录物，即如在GenBank登记号NM_021957.3(SEQ ID NO:609)、XM_006719063.3和XM_017019245.1中所示，各自分别编码不同的同工型，GenBank登记号NP_068776.2、XP_006719126.1(同工型X1)和XP_016874734.1(同工型X2)。示例性的猴(猕猴)转录物序列在GenBank登记号XM_001098578.2(SEQ ID NO:610)中显示。示例性的小鼠转录物在GenBank登记号NM_145572.2(SEQ ID NO:611)中显示。
肝细胞：如本文所用，术语“肝细胞(hepatocyte或hepatocytes)”是指肝脏的实质组织的细胞。这些细胞占肝脏质量的近似70-85％，并且制造血清白蛋白、纤维蛋白原和凝血因子的凝血酶原组(除了因子3和4)。肝细胞谱系细胞的标志物可以包括，但不限于：运甲状腺素蛋白(Ttr)、谷氨酰胺合成酶(Glul)、肝细胞核因子1a(Hnf1a)和肝细胞核因子4a(Hnf4a)。成熟肝细胞的标志物可以包括，但不限于：细胞色素P450(Cyp3a11)、延胡索酰基乙酰乙酸水解酶(Fah)、葡萄糖6-磷酸(G6p)、白蛋白(Alb)和OC2-2F8。参见，例如，Huch等人,(2013),Nature,494(7436):247-250，其涉及肝细胞标志物的内容通过引用并入本文。
环：如本文所用，术语“环”是指核酸(例如，寡核苷酸)的未配对区域，其侧接核酸的两个反向平行区域，所述核酸的两个反向平行区域彼此充分互补，使得在适当的杂交条件下(例如，在磷酸盐缓冲液中，在细胞中)，侧接未配对区域的两个反向平行区域杂交以形成双链体(称为“茎”)。
修饰的核苷酸间键：如本文所用，术语“修饰的核苷酸间键”是指与包含磷酸二酯键的参考核苷酸间键相比具有一个或多个化学修饰的核苷酸间键。在一些实施方案中，修饰的核苷酸是非天然存在的键。通常，修饰的核苷酸间键为其中存在修饰的核苷酸间键的核酸赋予一种或多种期望的特性。例如，修饰的核苷酸可以提高热稳定性、对降解的抗性、核酸酶抗性、溶解度、生物利用度、生物活性、降低免疫原性等。
修饰的核苷酸：如本文所用，术语“修饰的核苷酸”是指与选自以下的对应参考核苷酸相比具有一个或多个化学修饰的核苷酸：腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和胸苷脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，修饰的核苷酸是非天然存在的核苷酸。在一些实施方案中，修饰的核苷酸在其糖、核碱基和/或磷酸酯基团中具有一个或多个化学修饰。在一些实施方案中，修饰的核苷酸具有与对应参考核苷酸缀合的一个或多个化学部分。通常，修饰的核苷酸为其中存在修饰的核苷酸的核酸赋予一种或多种期望的特性。例如，修饰的核苷酸可以提高热稳定性、对降解的抗性、核酸酶抗性、溶解度、生物利用度、生物活性、降低免疫原性等。在某些实施方案中，修饰的核苷酸在核糖环的2’位置处包含2’-O-甲基或2’-F取代。
带切口的四环结构：“带切口的四环结构”是RNAi寡核苷酸的结构，其特征在于存在分开的有义(过客)和反义(引导)链，其中所述有义链具有与所述反义链互补的区域，使得两条链形成双链体，且其中所述链中的至少一条，通常是有义链，从双链体延伸，其中延伸段含有四环和形成与该四环相邻的茎区域的两个自互补序列，其中该四环被配置为稳定由至少一条链的自互补序列形成的相邻茎区域。
寡核苷酸：如本文所用，术语“寡核苷酸”是指短核酸，例如长度小于100个核苷酸的短核酸。寡核苷酸可以包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸，包括例如修饰的核糖核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链的。寡核苷酸可以具有或可以不具有双链体区域。作为一组非限制性实例，寡核苷酸可以是，但不限于，小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、切丁酶底物干扰RNA(dsiRNA)、反义寡核苷酸、短siRNA或单链siRNA。在一些实施方案中，双链寡核苷酸是RNAi寡核苷酸。
突出端：如本文所用，术语“突出端”是指由延伸超过互补链的末端的一个链或区域产生的末端非碱基配对核苷酸，所述一个链或区域与所述互补链形成双链体。在一些实施方案中，突出端包含从双链寡核苷酸的5'末端或3'末端的双链体区域延伸的一个或多个未配对的核苷酸。在某些实施方案中，所述突出端是双链寡核苷酸的反义链或有义链上的3'或5'突出端。
磷酸酯类似物：如本文所用，术语“磷酸酯类似物”是指模拟磷酸酯基团的静电和/或空间特性的化学部分。在一些实施方案中，磷酸酯类似物代替经常易于酶促除去的5'-磷酸酯位于寡核苷酸的5'末端核苷酸处。在一些实施方案中，5'-磷酸酯类似物含有磷酸酶抗性键。磷酸酯类似物的实例包括5'-膦酸酯，诸如5'-亚甲基膦酸酯(5'-MP)和5'-(E)-乙烯基膦酸酯(5'-VP)。在一些实施方案中，寡核苷酸在5’-末端核苷酸处的糖的4’-碳位置处具有磷酸酯类似物(被称为“4’-磷酸酯类似物”)。4'-磷酸酯类似物的一个实例是其中氧基甲基的氧原子与糖部分(例如在其4'-碳处)结合的氧基甲基膦酸酯或其类似物。参见，例如，在2017年9月1日提交的国际专利申请PCT/US2017/049909，在2016年9月2日提交的美国临时申请号62/383,207和2016年9月12日提交的美国临时申请号62/393,401，其各自涉及磷酸酯类似物的内容通过引用并入本文。已经对于寡核苷酸的5’末端开发其他修饰(参见，例如，WO 2011/133871；美国专利号8,927,513；和Prakash等人(2015),Nucleic Acids Res.,43(6):2993-3011，其各自涉及磷酸酯类似物的内容通过引用并入本文)。
降低的表达：如本文所用，术语基因的“降低的表达”是指与适当的参考细胞或受试者相比，由所述基因编码的RNA转录物或蛋白的量减少和/或所述基因在细胞或受试者中的活性量减少。例如，用双链寡核苷酸(例如，具有与GYS2 mRNA序列互补的反义链的双链寡核苷酸)处理细胞的行为可导致RNA转录物、蛋白和/或酶促活性(例如，由GYS2基因编码)的量与未用所述双链寡核苷酸处理的细胞相比减少。类似地，如本文所用的“降低表达”是指导致基因(例如，GYS2)的表达降低的行为。
互补区域：如本文所用，术语“互补区域”是指核酸(例如，双链寡核苷酸)的核苷酸的序列，其与核苷酸的反向平行序列(例如，mRNA内的靶标核苷酸序列)充分互补以允许在适当的杂交条件下(例如在磷酸盐缓冲液中，在细胞中等)在核苷酸的两个序列之间的杂交。互补区域可以与核苷酸序列(例如，mRNA或其部分内存在的靶标核苷酸序列)完全互补。例如，与mRNA中存在的核苷酸序列完全互补的互补区域具有与mRNA中的相应序列互补而没有任何错配或缺口的连续核苷酸序列。或者，互补区域可以与核苷酸序列(例如，mRNA或其部分中存在的核苷酸序列)部分互补。例如，与mRNA中存在的核苷酸序列部分互补的互补区域具有与mRNA中的相应序列互补、但与mRNA中的相应序列相比含有一个或多个错配或缺口(例如1、2、3个或更多个错配或缺口)的连续核苷酸序列，条件是所述互补区域保持能够在适当的杂交条件下与mRNA杂交。
核糖核苷酸：如本文所用，术语“核糖核苷酸”是指具有核糖作为其戊糖的核苷酸，其在其2’位置处含有羟基基团。修饰的核糖核苷酸是除了在2’位置以外具有一个或多个原子的修饰或取代(包括核糖、磷酸酯基团或碱基中的修饰或取代或核糖、磷酸酯基团或碱基的修饰或取代)的核糖核苷酸。
RNAi寡核苷酸：如本文所用，术语“RNAi寡核苷酸”是指(a)双链寡核苷酸，其具有有义链(过客)和反义链(引导)，其中所述反义链或所述反义链的一部分由Argonaute 2(Ago2)核酸内切酶用于切割靶标mRNA；或(b)单链寡核苷酸，其具有单一反义链，其中该反义链(或该反义链的一部分)由Ago2核酸内切酶用于切割靶标mRNA。
链：如本文所用，术语“链”是指通过核苷酸间键(例如，磷酸二酯键、硫代磷酸酯键)连接在一起的核苷酸的单一连续序列。在一些实施方案中，链具有两个游离末端，例如5’-末端和3’-末端。
受试者：如本文所用，术语“受试者”意指任何哺乳动物，包括小鼠、兔和人。在一个实施方案中，所述受试者是人或非人灵长类动物。术语“个体”或“患者”可以与“受试者”可互换使用。
合成的：如本文所用，术语“合成的”是指这样的核酸或其他分子，其为人工合成的(例如，使用机器(例如，固态核酸合成仪))或并且不是以其他方式衍生自通常产生该分子的天然来源(例如，细胞或生物)。
靶向配体：如本文所用，术语“靶向配体”是指选择性结合目标组织或细胞的同源分子(例如，受体)且为了将其他物质靶向至目标组织或细胞的目的而可与另一物质缀合的分子(例如，碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质)。例如，在一些实施方案中，为了将寡核苷酸靶向至特定目标组织或细胞的目的，可以将靶向配体与寡核苷酸缀合。在一些实施方案中，靶向配体选择性结合细胞表面受体。因此，在一些实施方案中，当与寡核苷酸缀合时，靶向配体通过选择性结合细胞的表面上表达的受体和细胞对包含所述寡核苷酸、靶向配体和受体的复合物的内体内化而促进所述寡核苷酸递送至特定细胞中。在一些实施方案中，靶向配体经由接头与寡核苷酸缀合，所述接头在细胞内化之后或期间切割，使得所述寡核苷酸在细胞中从靶向配体释放。
四环：如本文所用，术语“四环”是指增加通过核苷酸的侧接序列的杂交形成的相邻双链体的稳定性的环。随着高于从一组由随机选择的核苷酸的序列组成的相当长度的环平均预期的相邻茎双链体的Tm的相邻茎双链体的解链温度(Tm)的增加，稳定性的增加是可检测的。例如，四环可以为包含长度为至少2个碱基对的双链体的发夹赋予在10mM NaHPO4中至少50℃、至少55℃、至少56℃、至少58℃、至少60℃、至少65℃或至少75℃的解链温度。在一些实施方案中，四环可以通过堆叠相互作用使相邻的茎双链体中的碱基对稳定。此外，四环中核苷酸间的相互作用包括但不限于非沃森-克里克碱基配对、堆叠相互作用、氢键键合和接触相互作用(Cheong等人,Nature 1990Aug.16；346(6285):680-2；Heus和Pardi,Science 1991 Jul.12；253(5016):191-4)。在一些实施方案中，四环包含3至6个核苷酸或由其组成，且通常为4至5个核苷酸。在某些实施方案中，四环包含可以被修饰或可以不被修饰(例如，可以与靶向部分缀合或可以不与靶向部分缀合)的3、4、5或6个核苷酸或由其组成。在一个实施方案中，四环由四个核苷酸组成。可以在四环中使用任何核苷酸，并且可以使用用于此类核苷酸的标准IUPAC-IUB符号，如Cornish-Bowden(1985)Nucl.AcidsRes.13:3021-3030中所述。例如，字母“N”可以用于意味着任何碱基都可以在该位置，字母“R”可以用于显示A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)可以在该位置，且“B”可用于显示C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)或T(胸腺嘧啶)可以在该位置。四环的实例包括四环的UNCG家族(例如UUCG)、四环的GNRA家族(例如GAAA)和CUUG四环。(Woese等人,Proc Natl Acad Sci USA.1990November；87(21):8467-71；Antao等人,Nucleic Acids Res.1991Nov.11；19(21):5901-5)。DNA四环的实例包括四环的d(GNNA)家族(例如d(GTTA))、四环的d(GNRA)家族、四环的d(GNAB)家族、四环的d(CNNG)家族和四环的d(TNCG)家族(例如d(TTCG))。参见，例如:Nakano等人.Biochemistry,41(48),14281-14292,2002.SHINJI等人Nippon Kagakkai Koen YokoshuVOL.78th；NO.2；PAGE.731(2000)，其对于其相关公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，所述四环包含在带切口的四环结构内。
治疗：如本文所用，术语“治疗”是指为了就现有病况(例如，疾病、病症)而言改善受试者的健康和/或幸福的目的或为了预防或降低病况的发生的可能性，例如通过将治疗剂(例如，寡核苷酸)施用于受试者来向有此需要的受试者提供护理的行为。在一些实施方案中，治疗涉及降低受试者经历的病况(例如，疾病、病症)的至少一种体征、症状或促成因素的频率或严重程度。
II.基于寡核苷酸的抑制剂
i.GYS2靶向寡核苷酸
本文通过检查GYS2 mRNA，包括不同物种的mRNA(人和猕猴(参见例如实施例1))以及体外和体内测试，已鉴定了有效的寡核苷酸。这样的寡核苷酸可通过降低GYS2活性，并因此通过降低或预防肝肿大、肝毒性(经证实，例如AST、ALT和/或ALP的水平)、肝纤维化、肝中脂肪酸沉积、肝增生、肝细胞腺瘤和/或肝细胞癌，用于实现对于具有糖原贮积病(例如GSDIa、GSDIII、GSDIV、GSDVI和GSDIX)或糖原贮积病的一种或多种症状的受试者的治疗益处。例如，本文提供了有效的RNAi寡核苷酸，其具有包含如SEQ ID NO:1-192、385-416、467-517、569-574、581-585或612-619中任一者所示的序列或由其组成的有义链和包含选自SEQID NO:193-384、417-466、518-568、575-580、586-598或620-627的互补序列或由其组成的反义链，如也在表4中提供的表中排列的(例如，包含如SEQ ID NO:1所示的序列的有义链和包含如SEQ ID NO:193所示的序列的反义链)。
所述序列可放置到如本文所述的多种不同的寡核苷酸结构(或格式)中。
在一些实施方案中，已发现GYS2 mRNA的某些区域是用于靶向的热点，因为它们比其他区域更适合于基于寡核苷酸的抑制。在一些实施方案中，GYS2的热点区域由如SEQ IDNO:599-608中任一者中所示的序列组成。为了抑制GYS2 mRNA表达的目的，可以使用如本文所讨论的寡核苷酸靶向GYS2 mRNA的这些区域。
因此，在一些实施方案中，为了靶向细胞中的mRNA和抑制其表达的目的，设计本文提供的寡核苷酸以便具有与GYS2 mRNA(例如，在GYS2 mRNA的热点内)互补的区域。为了抑制其表达的目的，所述互补区域通常具有合适的长度和碱基含量，以使得所述寡核苷酸(或其链)能够与GYS2 mRNA退火。
在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸包含互补区域(例如，在双链寡核苷酸的反义链上)，其与如SEQ ID NO:1-192、385-416、467-517、569-574、581-585或612-619(其包括定位至GYS2 mRNA的热点区域内的序列)中任一者中所示的序列至少部分互补。在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸包含互补区域(例如，在双链寡核苷酸的反义链上)，其与如SEQ ID NO:1-192、385-416、467-517、569-574、581-585或612-619中任一者中所示的序列完全互补。在一些实施方案中，与如SEQ ID NO:1-192、385-416、467-517、569-574、581-585或612-619中所示的序列的连续核苷酸互补的寡核苷酸的互补区域跨越反义链的整个长度。在一些实施方案中，与如SEQ ID NO:1-192、385-416、467-517、569-574、581-585或612-619中任一者中所示的序列的连续核苷酸互补的寡核苷酸的互补区域跨越反义链的整个长度的一部分(在反义链的3’末端的除了两个以外的所有核苷酸)。在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸包含互补区域(例如，在双链寡核苷酸的反义链上)，其与跨越如SEQ IDNO:1-192、385-416、467-517、569-574、581-585或612-619中所示的序列的核苷酸1-19的核苷酸的连续延伸段至少部分(例如，完全)互补。
在一些实施方案中，互补区域长度为至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个核苷酸。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸具有与GYS2 mRNA互补的区域，其长度在12至30(例如，12至30、12至22、15至25、17至21、18至27、19至27或15至30)个核苷酸的范围内。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸具有与GYS2 mRNA互补的区域，其长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
在一些实施方案中，与GYS2 mRNA互补的区域与GYS2 mRNA的相应序列相比可以具有一个或多个错配。寡核苷酸上的互补区域可以具有最多达1个、最多达2个、最多达3个、最多达4个等的错配，条件是其维持在适当的杂交条件下与GYS2 mRNA形成互补碱基对的能力。或者，寡核苷酸上的互补区域可以具有不超过1个、不超过2个、不超过3个或不超过4个错配，条件是其维持在适当的杂交条件下与GYS2 mRNA形成互补碱基对的能力。在一些实施方案中，如果在互补区域中存在多于一个错配，则它们可以连续地定位(例如，连续2、3、4或更多个)，或散布在整个互补区域中，条件是所述寡核苷酸维持在适当的杂交条件下与GYS2mRNA形成互补碱基对的能力。
仍然，在一些实施方案中，本文提供的双链寡核苷酸包含以下或由其组成：具有如SEQ ID NO:1-192、385-416、467-517、569-574、581-585或612-619中任一者中所示的序列的有义链和具有选自SEQ ID NO:193-384、417-466、518-568、575-580、586-598或620-627的互补序列的反义链，如表4中提供的表中所排列(例如，包含如SEQ ID NO:1中所示的序列的有义链和包含如SEQ ID NO:193中所示的序列的反义链)。
ii.寡核苷酸结构
存在可用于本公开的方法中靶向GYS2 mRNA的各种寡核苷酸结构，包括RNAi、miRNA等。本文或别处描述的任何结构都可用作框架以并入或靶向本文所述的序列(例如，GYS2的热点序列，诸如SEQ ID NO:599-608中举例说明的那些，或包含分别如SEQ ID NO:1-192、385-416、467-517、569-574、581-585或612-619所示或如SEQ ID NO:193-384、417-466、518-568、575-580、586-598或620-627所示的序列或由其组成的有义或反义链)。用于靶向GYS2表达(例如，经由RNAi途径)的双链寡核苷酸通常具有彼此形成双链体的有义链和反义链。在一些实施方案中，所述有义和反义链不是共价连接的。然而，在一些实施方案中，所述有义和反义链是共价连接的。
在一些实施方案中，本文所述的序列可并入包含长度均在17-40个核苷酸的范围内的有义和反义链的寡核苷酸中，或使用包含长度均在17-40个核苷酸的范围内的有义和反义链的寡核苷酸靶向。在一些实施方案中，提供了并入此类序列的寡核苷酸，其具有在其有义链的3’延伸段内的四环结构，和在其反义链的3’末端的两个末端突出端核苷酸。在一些实施方案中，两个末端突出端核苷酸是GG。通常，所述反义链的两个末端GG核苷酸中的一个或两个与靶标不互补。
在一些实施方案中，提供了并入此类序列的寡核苷酸，其具有长度均在21至23个核苷酸的范围内的有义和反义链。在一些实施方案中，在长度为1或2个核苷酸的有义链、反义链或有义链和反义链上提供3’突出端。在一些实施方案中，寡核苷酸具有23个核苷酸的引导链和21个核苷酸的过客链，其中过客链的3'-末端和引导链的5'-末端形成平末端，且其中引导链具有两个核苷酸的3'突出端。
在一些实施方案中，用于降低GYS2表达的表达的双链寡核苷酸参与RNA干扰(RNAi)。例如，已经开发RNAi寡核苷酸，其中每条链具有19-25个核苷酸的大小，且具有至少一个1至5个核苷酸的3’突出端(参见，例如，美国专利号8,372,968)。还已经开发更长的寡核苷酸，其被切丁酶加工以生成活性RNAi产物(参见，例如，美国专利号8,883,996)。进一步的工作产生延伸的双链寡核苷酸，其中至少一条链的至少一个末端延伸超过双链体靶向区域，包括其中所述链之一包括热力学稳定的四环结构的结构(参见，例如，美国专利号8,513,207和8,927,705，以及WO2010033225，其关于其对这些寡核苷酸的公开内容通过引用并入本文)。此类结构可以包括单链延伸(在所述分子的一侧或两侧)以及双链延伸。
在一些实施方案中，寡核苷酸可以长度在21至23个核苷酸的范围内。在一些实施方案中，寡核苷酸在有义链和/或反义链的3’末端可以具有突出端(例如，长度为1、2或3个核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸(例如，siRNA)可以包含与靶标RNA反义的21核苷酸引导链和互补的过客链，其中两条链退火以形成19-bp双链体和在任一或两个3’末端的2核苷酸突出端。参见，例如，US9012138、US9012621和US9193753，其各自的内容对于其相关公开内容并入本文。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸具有36个核苷酸的有义链，其包含延伸超出反义双链体的区域，其中所述延伸区域具有茎-四环结构，其中所述茎是六碱基对双链体且其中所述四环具有四个核苷酸。在一些实施方案中，茎-四环如以下所示：S1-L-S2，其中S1与S2互补以形成双链体，且其中L在S1和S2之间形成四环。
在那些实施方案中的某些中，所述四环核苷酸中的三个或四个各自缀合至单价GalNac配体。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含25个核苷酸的有义链和27个核苷酸的反义链，当由切丁酶作用时，其产生并入成熟RISC中的反义链。
用于与本文公开的组合物和方法一起使用的其他寡核苷酸设计包括：16-聚体siRNAs(参见，例如，Nucleic Acids in Chemistry and Biology.Blackburn(编),RoyalSociety of Chemistry,2006)，shRNAs(例如，具有19bp或更短的茎；参见，例如，Moore等人Methods Mol.Biol.2010；629:141-158)，平端siRNAs(例如，长度为19bp；参见：例如，Kraynack和Baker,RNA Vol.12,p163-176(2006))，不对称siRNAs(aiRNA；参见，例如，Sun等人,Nat.Biotechnol.26,1379–1382(2008))，不对称的较短双链体siRNA(参见，例如，Chang等人,Mol Ther.2009Apr；17(4):725-32)，分叉siRNAs(参见，例如，Hohjoh,FEBS Letters,Vol 557,issues 1-3；Jan 2004,p 193-198)，单链siRNAs(Elsner；Nature Biotechnology30,1063(2012))，哑铃形环状siRNAs(参见，例如，Abe等人J Am Chem Soc 129:15108-15109(2007))和小的内部分段干扰RNA(sisiRNA；参见，例如，Bramsen等人,Nucleic AcidsRes.2007Sep；35(17):5886–5897)。前述参考文献各自对于其中的相关公开内容以其整体通过引用并入。在一些实施方案中可用于降低或抑制GYS2的表达的寡核苷酸结构的另外的非限制性实例是微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和短siRNA(参见，例如，Hamilton等人,Embo J.,2002,21(17):4671-4679；还参见美国申请号20090099115)。
a.反义链
在一些实施方案中，本文公开的用于靶向GYS2的寡核苷酸包含反义链，所述反义链包含如SEQ ID NO:193-384、417-466、518-568、575-580、586-598或620-627中任一者中所示的序列或由其组成。在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链包含如SEQID NO:193-384、417-466、518-568、575-580、586-598或620-627中任一者中所示的序列的至少12个(例如，至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸或由其组成。
在一些实施方案中，双链寡核苷酸可以具有长度为最多达40个核苷酸(例如，长度为最多达40个、最多达35个、最多达30个、最多达27个、最多达25个、最多达21个、最多达19个、最多达17个或最多达12个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸可以具有长度为至少12个核苷酸(例如，长度为至少12个、至少15个、至少19个、至少21个、至少22个、至少25个、至少27个、至少30个、至少35个或至少38个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸可以具有长度为12至40(例如，12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至22、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40或32至40)个核苷酸的范围内的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸可以具有长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的反义链。
在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链可被称为“引导链”。例如，如果反义链可以与RNA-诱导的沉默复合物(RISC)接合并结合Argonaut蛋白，或与一种或多种相似因子接合或结合一种或多种相似因子，并引导靶标基因的沉默，则其可以被称为引导链。在一些实施方案中，与引导链互补的有义链可以被称为“过客链”。
b.有义链
在一些实施方案中，本文公开的用于靶向GYS2的寡核苷酸包含如SEQ ID NO:1-192、385-416、467-517、569-574、581-585或612-619中任一者中所示的有义链序列或由其组成。在一些实施方案中，寡核苷酸具有有义链，所述有义链包含如SEQ ID NO:1-192、385-416、467-517、569-574、581-585或612-619中任一者中所示的序列的至少12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸或由其组成。
在一些实施方案中，寡核苷酸可以具有长度为最多达40个核苷酸(例如，长度为最多达40个、最多达36个、最多达30个、最多达27个、最多达25个、最多达21个、最多达19个、最多达17个或最多达12个核苷酸)的有义链(或过客链)。在一些实施方案中，寡核苷酸可以具有长度为至少12个核苷酸(例如，长度为至少12个、至少15个、至少19个、至少21个、至少25个、至少27个、至少30个、至少36个或至少38个核苷酸)的有义链。在一些实施方案中，寡核苷酸可以具有长度在12至40(例如，12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至21、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40或32至40)个核苷酸的范围内的有义链。在一些实施方案中，寡核苷酸可以具有长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的有义链。
在一些实施方案中，有义链在其3’-末端包含茎-环结构。在一些实施方案中，有义链在其5’-末端包含茎-环结构。在一些实施方案中，茎是长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个碱基对的双链体。在一些实施方案中，茎-环为分子提供更好的针对降解(例如，酶促降解)的保护，并促进靶向特征用于递送至靶标细胞。例如，在一些实施方案中，环提供添加的核苷酸，可以对其进行修饰而基本上不影响寡核苷酸的基因表达抑制活性。在某些实施方案中，本文提供了寡核苷酸，其中有义链包含(例如，在其3'-末端)如下所示的茎-环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，且其中L在S1和S2之间形成长度为最多达10个核苷酸(例如，长度为3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的环。
在一些实施方案中，茎-环的环(L)是四环(例如，在带切口的四环结构内)。四环可以含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、修饰的核苷酸及其组合。通常，四环具有4至5个核苷酸。
c.双链体长度
在一些实施方案中，在有义和反义链之间形成的双链体长度为至少12个(例如，至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21个)核苷酸。在一些实施方案中，在有义和反义链之间形成的双链体在长度为12-30个核苷酸(例如长度为12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30个核苷酸)的范围内。在一些实施方案中，在有义和反义链之间形成的双链体长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，在有义和反义链之间形成的双链体不跨越所述有义链和/或反义链的整个长度。在一些实施方案中，在有义和反义链之间的双链体跨越有义或反义链的整个长度。在某些实施方案中，在有义和反义链之间的双链体跨越有义链和反义链两者的整个长度。
d.寡核苷酸末端
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含有义链和反义链，使得在有义链或反义链或有义链和反义链两者上存在3’-突出端。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸具有一个5’末端，所述5'末端与另一5’末端相比热力学较不稳定。在一些实施方案中，提供了不对称寡核苷酸，其包括在有义链的3’末端的平末端和在反义链的3’末端的突出端。在一些实施方案中，在反义链上的3’突出端长度为1-8个核苷酸(例如，长度为1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸)。
通常，RNAi的寡核苷酸在反义(引导)链的3’末端具有两个核苷酸的突出端。然而，其他突出端是可能的。在一些实施方案中，突出端是3'突出端，其包含1和6个核苷酸之间的长度，任选地1至5个、1至4个、1至3个、1至2个、2至6个、2至5个、2至4个、2至3个、3至6个、3至5个、3至4个、4至6个、4至5个、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸。然而，在一些实施方案中，突出端是5'突出端，其包含1和6个核苷酸之间的长度，任选地1至5个、1至4个、1至3个、1至2个、2至6个、2至5个、2至4个、2至3个、3至6个、3至5个、3至4个、4至6个、4至5个、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸。
在一些实施方案中，有义和/或反义链的3’末端或5’末端的一个或多个(例如，2、3、4个)末端核苷酸是修饰的。例如，在一些实施方案中，反义链的3’末端的一个或两个末端核苷酸是修饰的。在一些实施方案中，反义链的3'末端的最后一个核苷酸是修饰的，例如包含2’-修饰，例如，2’-O-甲氧基乙基。在一些实施方案中，在反义链的3’末端的最后一个或两个末端核苷酸与靶标互补。在一些实施方案中，在反义链的3’末端的最后一个或两个核苷酸不与靶标互补。在一些实施方案中，有义或反义链的5’末端和/或3’末端具有反向帽核苷酸。
e.错配
在一些实施方案中，在有义和反义链之间存在一个或多个(例如1、2、3或4个)错配。如果在有义和反义链之间存在多于一个错配，则它们可以被连续地定位(例如，连续2、3或更多个)，或者散布在整个互补区域中。在一些实施方案中，所述有义链的3’末端含有一个或多个错配。在一个实施方案中，在所述有义链的3’末端并入两个错配。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的有义链的3’-末端的区段的碱基错配或去稳定化提高RNAi中的合成双链体的功效，可能是通过促进切丁酶的加工。
iii.单链寡核苷酸
在一些实施方案中，如本文所述的用于降低GYS2表达的寡核苷酸是单链的。此类结构可以包括但不限于单链RNAi寡核苷酸。近来的努力已经表明单链RNAi寡核苷酸的活性(参见，例如，Matsui等人(May2016),Molecular Therapy,Vol.24(5),946-955)。然而，在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸是反义寡核苷酸(ASO)。反义寡核苷酸是具有核碱基序列的单链寡核苷酸，当以5'至3'方向书写时，所述核碱基序列包含特定核酸的靶向区段的反向互补物且被合适地修饰(例如，作为间隙体(gapmer))以便诱导RNaseH介导的其靶标RNA在细胞中的切割或(例如，作为混合体(mixmer))以便抑制靶标mRNA在细胞中的翻译。用于本公开中的反义寡核苷酸可以以本领域中已知的任何合适方式进行修饰，包括，例如，如美国专利号9,567,587中所示，其对于其关于反义寡核苷酸的修饰(包括，例如，长度，核碱基(嘧啶、嘌呤)的糖部分，和核碱基的杂环部分的改变)的公开内容通过引用并入本文。进一步，已经持续数十年使用反义分子以降低特定靶标基因的表达(参见，例如，Bennett等人；Pharmacology of Antisense Drugs,Annual Review of Pharmacology andToxicology,Vol.57:81-105)。
iv.寡核苷酸修饰
寡核苷酸可以以各种方式修饰以改进或控制特异性、稳定性、递送、生物利用度、免于核酸酶降解的抗性、免疫原性、碱基-配对特性、RNA分布和细胞摄取以及与治疗或研究用途相关的其他特征。参见，例如，Bramsen等人,Nucleic Acids Res.,2009,37,2867-2881；Bramsen和Kjems(Frontiers in Genetics,3(2012):1-22)。因此，在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸可以包括一种或多种合适的修饰。在一些实施方案中，修饰的核苷酸在其碱基(或核碱基)、糖(例如，核糖、脱氧核糖)或磷酸酯基团中具有修饰。
寡核苷酸上的修饰的数目和那些核苷酸修饰的位置可以影响寡核苷酸的特性。例如，寡核苷酸可以通过将它们缀合至脂质纳米颗粒(LNP)或类似载体或将它们包封在脂质纳米颗粒(LNP)或类似载体中而在体内递送。然而，当寡核苷酸不被LNP或类似载体保护(例如，“裸露的递送”)时，其核苷酸中的至少一些被修饰可以是有利的。因此，在本文提供的任何寡核苷酸的某些实施方案中，寡核苷酸的所有或基本上所有核苷酸都被修饰。在某些实施方案中，所述核苷酸的多于一半被修饰。在某些实施方案中，所述核苷酸的少于一半被修饰。通常，在裸露的递送的情况下，每个核苷酸都在该核苷酸的糖基团的2'-位置被修饰。这些修饰可以是可逆的或不可逆的。通常，2'-位置修饰是2’-氟、2’-O-甲基等。在一些实施方案中，如本文公开的寡核苷酸具有一定数量和类型的修饰核苷酸，其足以引起期望的特征(例如，免于酶促降解的保护，在体内施用后靶向期望细胞的能力和/或热力学稳定性)。
a.糖修饰
在一些实施方案中，修饰的糖(本文也称为糖类似物)包括修饰的脱氧核糖或核糖部分，例如，其中一个或多个修饰发生在所述糖的2'、3'、4'和/或5'碳位置处。在一些实施方案中，修饰的糖还可以包括非天然替代碳结构，诸如存在于以下中的那些：锁定核酸(“LNA”)(参见，例如，Koshkin等人(1998),Tetrahedron 54,3607-3630)、未锁定核酸(“UNA”)(参见，例如，Snead等人(2013),Molecular Therapy–Nucleic Acids,2,e103)和桥连的核酸(“BNA”)(参见，例如，Imanishi和Obika(2002),The Royal Society ofChemistry,Chem.Commun.,1653-1659)。Koshkin等人，Snead等人以及Imanishi和Obika对于其涉及糖修饰的公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，糖中的核苷酸修饰包含2’-修饰。在某些实施方案中，2’-修饰可以是2’-氨基乙基、2’-氟、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基或2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸。通常，所述修饰是2’-氟、2’-O-甲基或2’-O-甲氧基乙基。然而，已经开发用于寡核苷酸中的多种2'位置修饰可用于本文公开的寡核苷酸中。参见，例如，Bramsen等人,NucleicAcids Res.,2009,37,2867-2881。在一些实施方案中，糖中的修饰包含糖环的修饰，其可以包含糖环的一个或多个碳的修饰。例如，核苷酸的糖的修饰可以包含糖的2’-碳和1'-碳或4'-碳之间的键。例如，所述键可以包含亚乙基或亚甲基桥。在一些实施方案中，修饰的核苷酸具有无环糖，所述无环糖缺乏2’-碳至3’-碳键。在一些实施方案中，修饰的核苷酸具有巯基，例如，在所述糖的4’位置。
在一些实施方案中，末端3’-末端基团(例如，3’-羟基)是磷酸酯基团或其他基团，其可用于例如连接接头、衔接子或标记物，或用于将寡核苷酸直接连接至另一核酸。
b.5’末端磷酸酯
在一些情况下，寡核苷酸的5’-末端磷酸酯基团可以增强与Argonaut 2的相互作用。然而，包含5’-磷酸酯基团的寡核苷酸可易于经由磷酸酶或其他酶降解，其可以限制它们在体内的生物利用度。在一些实施方案中，寡核苷酸包括对这种降解有抗性的5’磷酸酯的类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物可以是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸链的5’末端连接至模拟天然5’-磷酸酯基团的静电和空间特性的化学部分(“磷酸酯模拟物”)(参见，例如，Prakash等人(2015),NucleicAcids Res.,Nucleic Acids Res.2015Mar 31；43(6):2993–3011，其涉及磷酸酯类似物的内容通过引用并入本文)。已经开发可以连接至5’末端的许多磷酸酯模拟物(参见，例如，美国专利号8,927,513，其涉及磷酸酯类似物的内容通过引用并入本文)。已经对于寡核苷酸的5’末端开发其他修饰(参见，例如，WO 2011/133871，其涉及磷酸酯类似物的内容通过引用并入本文)。在某些实施方案中，羟基基团连接至寡核苷酸的5’末端。
在一些实施方案中，寡核苷酸在所述糖的4’-碳位置处具有磷酸酯类似物(被称为“4’-磷酸酯类似物”)。参见，例如，在2017年9月1日提交的国际专利申请PCT/US2017/049909，在2016年9月2日提交的题为4’-Phosphate Analogs and OligonucleotidesComprising the Same的美国临时申请号62/383,207，和在2016年9月12日提交的题为4’-Phosphate Analogs and Oligonucleotides Comprising the Same的美国临时申请号62/393,401，其各自涉及磷酸酯类似物的内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸在5'-末端核苷酸处包含4'-磷酸酯类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物是其中氧基甲基基团的氧原子与糖部分(例如，在其4'-碳处)结合的氧基甲基膦酸酯或其类似物。在其他实施方案中，4'-磷酸酯类似物是其中硫代甲基基团的硫原子或氨基甲基基团的氮原子与糖部分的4'-碳结合的硫代甲基膦酸酯或氨基甲基膦酸酯或其类似物。在某些实施方案中，4'-磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯。在一些实施方案中，氧基甲基膦酸酯由式-O-CH2-PO(OH)2或-O-CH2-PO(OR)2代表，其中R独立地选自H、CH3、烷基基团、CH2CH2CN、CH2OCOC(CH3)3、CH2OCH2CH2Si(CH3)3或保护基团。在某些实施方案中，所述烷基基团是CH2CH3。更通常，R独立地选自H、CH3或CH2CH3。
c.修饰的核苷间键
在一些实施方案中，所述寡核苷酸可以包含修饰的核苷间键。在一些实施方案中，磷酸酯修饰或取代可以产生寡核苷酸，其包含至少一个(例如，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个)修饰的核苷酸间键。在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸中的任一种包含1至10个(例如，1至10个、2至8个、4至6个、3至10个、5至10个、1至5个、1至3个或1至2个)修饰的核苷酸间键。在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸中的任一种包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰的核苷酸间键。
修饰的核苷酸间键可以是二硫代磷酸酯键、硫代磷酸酯键、磷酸三酯键、硫羰烷基膦酸酯键、硫羰烷基磷酸三酯键、亚磷酰胺键、膦酸酯键或硼酸磷酸酯键。在一些实施方案中，如本文所公开的寡核苷酸中的任一种的至少一个修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
d.碱基修饰
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸具有一个或多个修饰的核碱基。在一些实施方案中，修饰的核碱基(在本文中也称为碱基类似物)在核苷酸糖部分的1'位置处连接。在某些实施方案中，修饰的核碱基是含氮碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基不含氮原子。参见例如，美国公开专利申请号20080274462。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包含通用碱基。然而，在某些实施方案中，修饰的核苷酸不含核碱基(无碱基)。
在一些实施方案中，通用碱基是位于修饰的核苷酸中的核苷酸糖部分的1'位置或核苷酸糖部分取代中的等效位置处的杂环部分，当存在于双链体中时，其可以相对多于一种类型的碱基定位，而基本上不改变双链体的结构。在一些实施方案中，相比于与靶标核酸完全互补的参考单链核酸(例如，寡核苷酸)，含有通用碱基的单链核酸与靶标核酸形成双链体，其具有比与互补核酸形成的双链体更低的Tm。然而，在一些实施方案中，与其中通用碱基已被碱基替换以生成单个错配的参考单链核酸相比，含有通用碱基的单链核酸与靶标核酸形成双链体，其具有比与包含错配碱基的核酸形成的双链体更高的Tm。
通用结合核苷酸的非限制性实例包括肌苷、1-β-D-核糖呋喃糖基-5-硝基吲哚和/或1-β-D-核糖呋喃糖基-3-硝基吡咯(Quay等人的美国专利申请公开号20070254362；VanAerschot等人,An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguousnucleoside.Nucleic Acids Res.1995Nov 11；23(21):4363-70；Loakes等人,3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNAsequencing and PCR.Nucleic Acids Res.1995Jul 11；23(13):2361-6；Loakes和Brown,5-Nitroindole as an universal base analogue.Nucleic Acids Res.1994Oct 11；22(20):4039-43。前述各自对于其涉及碱基修饰的公开内容通过引用并入本文)。
e.可逆修饰
尽管可以进行某些修饰以保护寡核苷酸在到达靶标细胞之前不受体内环境的影响，但一旦寡核苷酸到达靶标细胞的胞质溶胶，靶标细胞就可以降低寡核苷酸的功效或活性。可以进行可逆修饰，使得所述分子在细胞外部保留期望的特性，其然后在进入细胞的胞质溶胶环境后被除去。可逆修饰可以例如通过细胞内酶的作用或通过细胞内的化学条件(例如通过由细胞内谷胱甘肽还原)除去。
在一些实施方案中，可逆修饰的核苷酸包含谷胱甘肽敏感性部分。通常，核酸分子已经用环状二硫醚(disulfide)部分化学修饰以掩蔽由核苷酸间二磷酸酯键产生的负电荷，并改善细胞摄取和核酸酶抗性。参见最初转让给Traversa Therapeutics,Inc.(“Traversa”)的美国公开申请号2011/0294869，转让给Solstice Biologics,Ltd.(“Solstice”)的PCT公开号WO 2015/188197，Meade等人,Nature Biotechnology,2014,32:1256-1263(“Meade”)，转让给Merck Sharp&Dohme Corp的PCT公开号WO 2014/088920，其各自对于其对于此类修饰的公开内容而通过引用并入。这种核苷酸间二磷酸酯键的可逆修饰被设计成通过胞质溶胶的还原环境(例如谷胱甘肽)而在细胞内裂解。较早的实例包括中和磷酸三酯修饰，据报道其可在细胞内切割(Dellinger等人J.Am.Chem.Soc.2003,125:940-950)。
在一些实施方案中，这种可逆修饰允许在体内施用期间保护(例如，通过血液和/或细胞的溶酶体/内体隔室转运)，其中所述寡核苷酸将暴露于核酸酶和其他严酷的环境条件(例如，pH)。当释放至细胞的胞质溶胶(其中谷胱甘肽的水平与细胞外空间相比更高)中时，修饰被逆转，且结果是切割的寡核苷酸。使用可逆的谷胱甘肽敏感性部分，与使用不可逆化学修饰可得的选项相比，可以将空间上更大的化学基团引入目标寡核苷酸中。这是因为这些较大的化学基团将在胞质溶胶中被除去，且因此不应干扰细胞的胞质溶胶内寡核苷酸的生物活性。作为结果，可以将这些较大的化学基团工程改造以为核苷酸或寡核苷酸赋予各种优点，诸如核酸酶抗性、亲脂性、电荷、热稳定性、特异性和降低的免疫原性。在一些实施方案中，可以将谷胱甘肽敏感性部分的结构工程改造以修改其释放的动力学。
在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分连接至核苷酸的糖。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分连接至修饰的核苷酸的糖的2’-碳。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分位于糖的5'-碳，尤其是当修饰的核苷酸是所述寡核苷酸的5'-末端核苷酸时。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分位于糖的3'-碳，尤其是当修饰的核苷酸是所述寡核苷酸的3'-末端核苷酸时。在一些实施方案中，所述谷胱甘肽敏感性部分包含磺酰基基团。参见，例如，国际专利申请PCT/US2017/048239，其在2018年3月1日作为国际专利公开WO2018/039364公布，题为Compositions Comprising Reversibly Modified Oligonucleotidesand Uses Thereof，其在2016年8月23日提交，其内容对于其相关公开内容通过引用并入本文。
v.靶向配体
在一些实施方案中，可期望将本公开的寡核苷酸靶向至一个或多个细胞或一个或多个器官。这种策略可以帮助避免在其他器官中的不期望的作用，或者可以避免寡核苷酸过度地损失给对于寡核苷酸不受益的细胞、组织或器官。因此，在一些实施方案中，可以修饰本文公开的寡核苷酸以促进靶向特定组织、细胞或器官，例如，促进寡核苷酸递送至肝脏。在某些实施方案中，可以修饰本文公开的寡核苷酸以促进寡核苷酸递送至肝脏的肝细胞。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与一个或多个靶向配体缀合的核苷酸。
靶向配体可以包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、肽、多肽、蛋白或蛋白的部分(例如，抗体或抗体片段)或脂质。在一些实施方案中，靶向配体是适体。例如，靶向配体可以是用于靶向肿瘤脉管系统或神经胶质瘤细胞的RGD肽，用于靶向肿瘤脉管系统或气门(stoma)的CREKA肽，靶向CNS脉管系统上表达的转铁蛋白受体的转铁蛋白、乳铁蛋白或适体，或靶向神经胶质瘤细胞上的EGFR的抗EGFR抗体。在某些实施方案中，所述靶向配体是一个或多个GalNAc部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸的1个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自缀合至分开的靶向配体。在一些实施方案中，寡核苷酸的2至4个核苷酸各自缀合至分开的靶向配体。在一些实施方案中，靶向配体缀合至有义或反义链的任一末端的2至4个核苷酸(例如，配体缀合至有义或反义链的5’或3’末端的2至4个核苷酸的突出端或延伸段)，使得所述靶向配体类似于牙刷的刷毛，且所述寡核苷酸类似于牙刷。例如，寡核苷酸可以包含有义链的5’或3’末端的茎-环，并且所述茎的环的1、2、3或4个核苷酸可以单独地缀合至靶向配体，如例如在2016年6月23日公开的国际专利申请公开WO 2016/100401(其相关内容通过引用并入本文)中所述。
在一些实施方案中，期望将降低GYS2的表达的寡核苷酸靶向至受试者的肝脏的肝细胞。任何合适的肝细胞靶向部分都可用于该目的。
GalNAc是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的高亲和力配体，所述脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)主要表达在肝细胞的血窦表面上并且在含有末端半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺残基的循环糖蛋白(脱唾液酸糖蛋白)的结合、内化和随后的清除中具有主要作用。GalNAc部分与本公开的寡核苷酸的缀合(间接或直接)可用于将这些寡核苷酸靶向至在这些肝细胞上表达的ASGPR。
在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸直接或间接缀合至单价GalNAc。在一些实施方案中，所述寡核苷酸直接或间接缀合至多于一个单价GalNAc(即，缀合至2、3或4个单价GalNAc部分，并且通常缀合至3或4个单价GalNAc部分)。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸缀合至一个或多个二价GalNAc、三价GalNAc或四价GalNAc部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸的1个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自缀合至GalNAc部分。在一些实施方案中，所述茎-环的环(L)的2至4个核苷酸各自缀合至分开的GalNAc。在一些实施方案中，靶向配体缀合至有义或反义链的任一末端的2至4个核苷酸(例如，配体缀合至有义或反义链的5’或3’末端的2至4个核苷酸的突出端或延伸段)，使得所述GalNAc部分类似于牙刷的刷毛，且所述寡核苷酸类似于牙刷。例如，寡核苷酸可以包含有义链的5’或3’末端的茎-环，并且所述茎的环的1、2、3或4个核苷酸可以单独地缀合至GalNAc部分。在一些实施方案中，GalNAc部分缀合至有义链的核苷酸。例如，四个GalNAc部分可以缀合至有义链的四环中的核苷酸，其中每个GalNAc部分缀合至一个核苷酸。
可以使用适当的方法或化学法(例如，点击化学法)来将靶向配体连接至核苷酸。在一些实施方案中，使用点击接头将靶向配体缀合至核苷酸。在一些实施方案中，基于缩醛的接头用于将靶向配体缀合至本文所述的寡核苷酸中的任一种的核苷酸。基于缩醛的接头例如公开于2016年6月23日公开的国际专利申请公开号WO2016100401 A1，并且其涉及此类接头的内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，所述接头是不稳定的接头。然而，在其他实施方案中，所述接头是相当稳定的。在一些实施方案中，在靶向配体(例如，GalNAc部分)和双链寡核苷酸之间提供双链体延伸段(长度为最多达3、4、5或6个碱基对)。
III.制剂
已经开发了各种制剂以促进寡核苷酸使用。例如，可以使用使降解最小化、促进递送和/或摄取或为制剂中的寡核苷酸提供另一种有益特性的制剂将寡核苷酸递送至受试者或细胞环境。在一些实施方案中，本文提供了包含寡核苷酸(例如，单链或双链寡核苷酸)以降低GYS2的表达的组合物。可以合适地配制此类组合物，使得当施用于受试者(至靶标细胞的直接环境中或全身性地)时，足够部分的寡核苷酸进入细胞以降低GYS2表达。各种合适的寡核苷酸制剂中的任一种可用于递送寡核苷酸用于减少GYS2，如本文所公开。在一些实施方案中，将寡核苷酸配制于缓冲溶液、诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、脂质体、胶束结构和壳体(capsids)中。在一些实施方案中，将裸露的寡核苷酸或其缀合物配制于水中或水溶液(例如，pH调节的水)中。在一些实施方案中，将裸露的寡核苷酸或其缀合物配制于碱性缓冲水溶液(例如，PBS)中。
具有阳离子脂质的寡核苷酸的制剂可用于促进寡核苷酸转染至细胞中。例如，可以使用阳离子脂质，诸如脂转染试剂(lipofectin)，阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(例如，聚赖氨酸)。合适的脂质包括Oligofectamine、Lipofectamine(Life Technologies)、NC388(Ribozyme Pharmaceuticals,Inc.,Boulder,Colo.)或FuGene 6(Roche)，其全部可以根据制造商的说明使用。
因此，在一些实施方案中，制剂包含脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，赋形剂包含脂质体、脂质、脂质复合物、微球、微粒、纳米球或纳米颗粒，或者可以以其他方式配制用于向有此需要的受试者的细胞、组织、器官或身体施用(参见，例如，Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第22版,Pharmaceutical Press,2013)。
在一些实施方案中，如本文所公开的制剂包含赋形剂。在一些实施方案中，赋形剂向组合物赋予活性成分的提高的稳定性、提高的吸收、提高的溶解度和/或治疗性增强。在一些实施方案中，赋形剂是缓冲剂(例如，柠檬酸钠、磷酸钠、tris碱或氢氧化钠)或媒介物(例如，缓冲溶液、矿脂、二甲基亚砜或矿物油)。在一些实施方案中，将寡核苷酸冻干用于延长其保质期，且然后在使用(例如，施用于受试者)之前制成溶液。因此，包含本文所述的寡核苷酸中的任一种的组合物中的赋形剂可以是冻干保护剂(例如，甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮)或塌陷温度改变剂(例如，葡聚糖、ficoll或明胶)。
在一些实施方案中，将药物组合物配制为与其意欲的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、经皮(局部)、经粘膜和直肠施用。通常，施用的途径是静脉内或皮下的。
适用于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内或皮下施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorEL.TM.(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇诸如甘露醇、山梨醇和氯化钠。无菌可注射溶液可以通过如下来制备：将所需量的寡核苷酸与所需的以上列举的成分中的一种或组合并入选择的溶剂中，随后进行过滤灭菌。
在一些实施方案中，组合物可以含有至少约0.1％或更多的治疗剂(例如，用于降低GYS2表达的寡核苷酸)，尽管一种或多种活性成分的百分比可以在总组合物的重量或体积的约1％和约80％或更多之间。制备此类药物制剂的领域中的技术人员将考虑因素诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用的途径、产品保质期以及其他药理学考量，并且因此各种剂量和治疗方案可以是期望的。
即使许多实施方案涉及本文公开的任何寡核苷酸的肝脏靶向递送，也考虑靶向其他组织。
IV.使用方法
i.降低细胞中的GYS2表达
在一些实施方案中，提供了用于出于降低细胞中的GYS2的表达而向细胞递送有效量的本文公开的寡核苷酸中的任一种的方法。本文提供的方法可用于任何适当的细胞类型中。在一些实施方案中，细胞是表达GYS2的任何细胞(例如，肝脏细胞，例如肝细胞或脂肪细胞)。在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞，其已经从受试者获得，且可能已经经历有限数目的世代，使得所述细胞基本上维持其天然表型特性。在一些实施方案中，向其递送所述寡核苷酸的细胞是离体的或体外的(即，可以递送至培养物中的细胞或所述细胞驻留的生物)。在具体实施方案中，提供了用于出于仅仅或主要降低肝细胞中的GYS2的表达的目的而向细胞递送有效量的本文公开的寡核苷酸中的任一种的方法。
在一些实施方案中，可以使用适当的核酸递送方法引入本文公开的寡核苷酸，所述核酸递送方法包括注射含有所述寡核苷酸的溶液，通过由所述寡核苷酸覆盖的颗粒轰击，将细胞或生物暴露于含有所述寡核苷酸的溶液或在所述寡核苷酸存在的情况下细胞膜的电穿孔。可以使用用于将寡核苷酸递送至细胞的其他适当的方法，诸如脂质介导的载体转运，化学品介导的转运和阳离子脂质体转染诸如磷酸钙和其他。
可以通过评估细胞或受试者的一种或多种特性的适当测定法或通过评估指示GYS2表达的分子(例如，RNA、蛋白)的生物化学技术来证实抑制的后果。在一些实施方案中，通过比较GYS2的表达水平(例如，mRNA或蛋白水平)与适当对照(例如，未向其递送寡核苷酸或已向其递送阴性对照的细胞或细胞群体中的GYS2表达的水平)来评估本文提供的寡核苷酸降低GYS2的表达的水平的程度。在一些实施方案中，GYS2表达的适当对照水平可以是预定水平或值，使得不需要每次测量对照水平。预定水平或值可以采用各种形式。在一些实施方案中，预定水平或值可以是单一截止值，诸如中值或平均值。
在一些实施方案中，如本文所述的寡核苷酸的施用导致细胞中的GYS2表达的水平的降低。在一些实施方案中，GYS2表达的水平的降低可以是与GYS2的适当对照水平相比降低至1％或更低、5％或更低、10％或更低、15％或更低、20％或更低、25％或更低、30％或更低、35％或更低、40％或更低、45％或更低、50％或更低、55％或更低、60％或更低、70％或更低、80％或更低或90％或更低。适当的对照水平可以是未与如本文所述的寡核苷酸接触的细胞或细胞群体中的GYS2表达的水平。在一些实施方案中，在有限的时间段之后评价根据本文公开的方法将寡核苷酸递送至细胞的效果。例如，可以在将所述寡核苷酸引入细胞后至少8小时、12小时、18小时、24小时；或至少一、二、三、四、五、六、七或十四天分析细胞中的GYS2的水平。
在一些实施方案中，寡核苷酸以转基因的形式递送，所述转基因被工程改造为在细胞中表达所述寡核苷酸(例如，其有义和反义链)。在一些实施方案中，使用经工程改造以表达本文公开的任何寡核苷酸的转基因递送寡核苷酸。可以使用病毒载体(例如，腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、痘病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒)或非病毒载体(例如，质粒或合成的mRNA)递送转基因。在一些实施方案中，转基因可以直接注射给受试者。
ii.治疗方法
本公开的方面涉及用于降低GYS2表达用于治疗受试者中的糖原贮积病的方法。在一些实施方案中，所述方法可以包括向有此需要的受试者施用有效量的本文公开的寡核苷酸中的任一种。此类治疗可用于例如降低或预防肝肿大、肝毒性(例如，降低或减少AST、ALT和/或ALP的水平)、肝纤维化、肝中脂肪酸沉积、肝增生、肝细胞腺瘤和/或肝细胞癌。这样的治疗也可用于例如治疗或预防与选自GSDIa、GSDIII、GSDIV、GSDVI和GSDIX的糖原贮积病有关的一种或多种症状，或治疗或预防这样的糖原贮积病的一种或多种症状。本公开提供了治疗处于糖原贮积病(例如GSDIa、GSDIII、GSDIV、GSDVI和GSDIX)和/或与糖原贮积病(例如GSDIa、GSDIII、GSDIV、GSDVI和GSDIX)有关的症状或病况的风险中(或易患糖原贮积病(例如GSDIa、GSDIII、GSDIV、GSDVI和GSDIX)和/或与糖原贮积病(例如GSDIa、GSDIII、GSDIV、GSDVI和GSDIX)有关的症状或病况)的受试者的预防和治疗方法。
在某些方面，本公开提供了用于通过向受试者施用治疗剂(例如，寡核苷酸或编码其的载体或转基因)来预防受试者中的如本文所述的疾病、病症、症状或病况的方法。在一些实施方案中，待治疗的受试者是将从例如肝脏中的GYS2蛋白的量的减少在治疗上受益的受试者。
本文所述的方法通常涉及向受试者施用有效量(即能够产生期望的治疗结果的量)的寡核苷酸。治疗上可接受的量可以是能够治疗疾病或病症的量。任一受试者的适当剂量将取决于某些因素，包括受试者的体型、体表面积、年龄、待施用的特定组合物、组合物中的一种或多种活性成分、施用的时间和途径、总体健康和同时施用的其他药物。
在一些实施方案中，经肠(例如，经口，通过胃喂食管，通过十二指肠喂食管，经由胃造口术或经直肠)，肠胃外(例如，皮下注射，静脉内注射或输注，动脉内注射或输注，肌内注射)，局部(例如，表皮，吸入，经由滴眼或通过粘膜)，或通过直接注射入靶标器官(例如，受试者的肝脏)，向受试者施用本文公开的组合物中的任一种。通常，本文公开的寡核苷酸静脉内或皮下施用。
在一些实施方案中，寡核苷酸以0.1mg/kg至25mg/kg(例如，1mg/kg至5mg/kg)的范围内的剂量施用。在一些实施方案中，寡核苷酸以0.1mg/kg至5mg/kg的范围内或0.5mg/kg至5mg/kg的范围内剂量施用。
作为一组非限制性实例，将通常每年一次、每年两次、每季度(每三个月一次)、每两个月(每两个月一次)、每个月或每周施用本公开的寡核苷酸。
在一些实施方案中，待治疗的受试者是人(例如，人患者)或非人灵长类动物或其他哺乳动物受试者。其他示例性受试者包括家养动物诸如狗和猫；牲畜诸如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；和动物诸如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。
实施例
实施例1：使用基于人和小鼠细胞的测定法开发GYS2寡核苷酸抑制剂
使用基于人和小鼠的测定法来开发用于抑制GYS2表达的候选寡核苷酸。首先，使用基于计算机的算法来生成用于GYS2抑制的候选寡核苷酸序列(25-27-聚体)。然后，基于细胞的测定法和PCR测定法用于评估候选寡核苷酸的降低GYS2表达的能力。
基于计算机的算法提供了与人GYS2 mRNA(SEQ ID NO:609，表1)互补的寡核苷酸，其中某些序列也与猕猴GYS2 mRNA(SEQ ID NO:610，表1)互补。
表1.人和猕猴GYS2 mRNA的序列
| 物种 | GenBank RefSeq# | SEQ ID NO. |
| 人 | NM_021957.3 | 609 |
| 猕猴 | XM_001098578.2 | 610 |
在该算法提供的寡核苷酸中，选择264种寡核苷酸作为候选物，用于在基于HEK-293细胞的测定法中进行实验评估。在该测定法中，用所述寡核苷酸转染稳定表达GYS2的HEK-293人胚肾细胞(称为HEK-GYS2细胞)。转染后将细胞维持一段时间，且然后使用基于
的qPCR测定法询问剩余GYS2 mRNA的水平。使用两种qPCR测定法，3’测定法和5’测定法，来测定如分别通过HEX和FAM探针所测量的mRNA水平。用264种寡核苷酸的基于HEK-293细胞的测定法的结果显示于图1A和1B中。对于3'测定法(圆形)和5'测定法(菱形)各自显示剩余的mRNA的百分比。导致与阴性对照相比剩下最低百分比的mRNA的寡核苷酸被视为命中物。与人基因组具有低互补性的寡核苷酸被用作阴性对照。
基于这些寡核苷酸的活性和位置，定义人GYS2 mRNA上的热点。热点被鉴定为与至少两种寡核苷酸相关的人GYS2 mRNA序列上的延伸段，其导致在任一测定法中，mRNA水平与对照相比小于或等于35％。因此，鉴定人GYS2 mRNA序列内的以下热点：579-618、691-738、1089-1125、1175-1211、1431-1486、2341-2383、2497-2543、2660-2698、2808-2851和3014-3050。
热点的序列概述于表2中。
表2.热点的序列
剂量应答分析
在初始的基于HEK-293细胞的测定法中评估的264种寡核苷酸中，基于其敲低GYS2水平的能力来选择71种尤其有活性的寡核苷酸作为命中物，并进行次级筛选。
在该次级筛选中，使用与初级筛选中相同的测定法测试候选寡核苷酸，但以两种或三种不同浓度(1nM、0.1nM和0.03nM)(图2A和2B)。将靶标mRNA水平一般基于富含精氨酸/丝氨酸的剪接因子9(SFRS9)(在样品间提供稳定表达参考的管家基因)归一化，以生成图2A和2B中显示的百分比mRNA。与阴性对照序列(NC1)和模拟物转染相比显示图2A和2B的每一个中的测试的寡核苷酸。所有71种寡核苷酸都具有相同的修饰模式(被称为M1)，所述修饰模式含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和2’-O-甲基修饰的核苷酸的组合。测试的71种寡核苷酸的序列提供于表3中。
表3.基于HEK-293细胞的测定法的候选寡核苷酸序列
Hs：人，和Rm：猕猴；有义和反义SEQ ID NO.列以相对顺序提供杂交以制成每种寡核苷酸的有义链和相应的反义链。例如，SEQ ID NO:1的有义链与SEQ ID NO:193的反义链杂交。
在该阶段，从测试选择36种最有效的序列用于进一步分析。将选择的序列转化为带切口的四环结构形式(36-聚体过客链与22-聚体引导链)。对于通用的四环结构，参见图3。然后如前测试这些寡核苷酸，以三种浓度评估每种寡核苷酸的减少HepG2细胞中的GYS2mRNA表达的能力。
图4显示由具有带切口的四环结构的不同碱基序列(其各自适应于一种或两种不同的修饰模式)制成的寡核苷酸的数据。X轴列出了由评价的寡核苷酸靶向的有义链的3'末端。如上所述将靶标mRNA水平归一化以生成图4中显示的百分比mRNA，并且与阴性对照序列(NC1)和模拟物转染相比显示测试的寡核苷酸。
在猴肝细胞中以0.1μM、0.3μM和1.0μM对于各化合物(图5)使用相同的修饰模式进一步测试某些四环-修饰的寡核苷酸。图5中测试的寡核苷酸与未转染的细胞比较显示。某些寡核苷酸在HEK-293细胞中使用全剂量应答曲线进一步测试，以测定各化合物的半最大抑制浓度(IC50)(参见图6A和6B)。
体内鼠筛选
评价来自上述体外实验的数据，以鉴定将改进递送特性、同时维持用于降低小鼠肝细胞中的GYS2表达的活性的四环和修饰模式。基于该分析，然后将选择的寡核苷酸缀合至GalNAc部分。将四个GalNAc部分缀合至四环中有义链的核苷酸。使用点击接头进行缀合。使用的GalNAc如下所示：
N-乙酰基-b-D-半乳糖胺(CAS#:14131-60-3)
测试了来自18个不同的碱基序列和具有不同的修饰模式和带切口的四环结构的总共65种有效的GalNAc-缀合的GYS2寡核苷酸。选择的GYS2寡核苷酸序列针对人和猴mRNA序列有活性，但对小鼠Gys2没有活性。GYS2寡核苷酸通过以0.5-5mg/kg流体动力注射人GYS2表达质粒，经皮下施用至瞬时表达人GYS2 mRNA的CD-1小鼠。在施用后第4天将小鼠安乐死。获得肝脏样品和提取RNA以通过RT-qPCR评价GYS2 mRNA水平。与PBS对照mRNA比较，基于这些测量确定GYS2 mRNA百分比。
从测试的65种缀合物，鉴定了8种最有效的碱基序列，并且通过皮下注射0.5mg/kg至瞬时表达人GYS2mRNA的CD-1小鼠，各自用相同的修饰模式测试。在施用后第4天将小鼠安乐死。获得肝脏样品和提取RNA以通过RT-qPCR评价GYS2mRNA水平。与PBS对照mRNA比较，基于这些测量确定GYS2mRNA百分比，并显示在图7中。
材料和方法
转染
对于第一次筛选，使用Lipofectamine RNAiMAXTM来复合寡核苷酸用于有效转染。将寡核苷酸、RNAiMAX和Opti-MEM在室温下一起孵育20分钟，且然后向板中每孔添加50μL的该混合物，然后转染。从正在活跃传代细胞的烧瓶吸出培养基，并将细胞在37℃下在胰蛋白酶存在的情况下孵育3-5分钟。细胞不再粘附至烧瓶之后，添加细胞生长培养基(缺乏青霉素和链霉素)以中和胰蛋白酶并悬浮细胞。取出10μL等分试样，并用血细胞计数器计数，以基于每毫升定量细胞。对于细胞，每孔将10,000至25,000个细胞/孔接种于培养基(例如100μL培养基)中。将稀释的细胞悬浮液添加至96孔转染板中，所述96孔转染板已经在Opti-MEM中含有所述寡核苷酸。然后将转染板在37℃下孵育24小时。孵育24小时之后，从每个孔吸出培养基。使用来自Promega RNA分离试剂盒的裂解缓冲液裂解细胞。将裂解缓冲液添加至每个孔中。然后将裂解的细胞转移至Corbett XtractorGENE(QIAxtractor)用于RNA分离或储存在-80℃。
对于随后的筛选和实验，例如二级筛选，使用Lipofectamine RNAiMAx以复合所述寡核苷酸用于反向转染。通过在OptiMEM培养基中混合RNAiMAX和siRNA 15分钟来制备复合物。将转染混合物转移至多孔板，并将细胞悬浮液添加至孔中。在孵育24小时之后，将细胞用PBS洗涤一次，且然后使用来自Promega SV96试剂盒的裂解缓冲液进行裂解。在真空歧管中使用SV96板纯化RNA。然后将四微升纯化的RNA在65℃下加热5分钟并冷却至4℃。然后将RNA用于在10微升反应中使用高容量逆转录试剂盒(Life Technologies)进行逆转录。然后用无核酸酶的水将cDNA稀释至50μL，并用于用多重化5’-核酸内切酶测定法和SSoFastqPCR主要混合物(Bio-Rad laboratories)进行定量PCR。
cDNA合成
使用Corbett X-tractor GeneTM(QIAxtractor)从组织培养物中的哺乳动物细胞分离RNA。修改的SuperScript II方案用于从分离的RNA合成cDNA。将分离的RNA(近似5ng/μL)加热至65℃，持续5分钟，并且与dNP、随机六聚体、寡聚dT和水孵育。将混合物冷却15秒。将由水、5X第一链缓冲液、DTT、SUPERase·InTM(RNA抑制剂)和SuperScript II RTase组成的“酶混合物”添加至混合物中。使用热循环仪，将内容物加热至42℃，持续1小时，然后加热至70℃，持续15分钟，且然后冷却至4℃。然后将所得cDNA进行基于
的qPCR。qPCR反应是多重化的，每个反应含有两次5’核酸内切酶测定。
qPCR测定
最初使用基于
的qPCR筛选引物组。通过评价解链曲线以及“减去RT”对照来验证测定特异性。分别使用来自HeLa和Hepa1-6细胞的cDNA模板的稀释液(每个反应从20ng且至0.02ng的10-倍连续稀释液)来测试人(Hs)和小鼠(Mm)测定。将qPCR测定设置在384-孔板中，用MicroAmp膜覆盖，并在来自Applied Biosystems的7900HT上运行。试剂浓度和循环条件包括以下：2x SYBR混合物、10μM正向引物、10μM反向引物、DD H2O和cDNA模板，直至10μL的总体积。
克隆
根据制造商的说明将展现单一解链曲线的PCR扩增子连接至来自Promega的
载体试剂盒中。遵循制造商的方案，用新连接的载体转化JM109高效细胞。然后将细胞铺板在含有氨苄青霉素的LB板上，并在37℃下孵育过夜用于菌落生长。
PCR筛选和质粒小量制备
将PCR用于鉴定已经用含有连接的目标扩增子的载体转化的大肠杆菌的菌落。在PCR反应中使用侧接插入物的载体特异性引物。然后将所有PCR产物在1％琼脂糖凝胶上运行，并在染色后通过透照仪成像。对凝胶进行定性评价，以确定哪些质粒看起来含有预期大小的连接的扩增子(近似300bp，包括对于所用引物特异性的扩增子和侧接载体序列)。
然后将通过PCR筛选证实为转化体的菌落在由2mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基组成的培养物中在37℃下在振荡下孵育过夜。然后裂解大肠杆菌细胞，并使用Promega的小量制备试剂盒分离目标质粒。通过260nm处的UV吸光度测定质粒浓度。
质粒测序和定量
使用
终止剂测序试剂盒对纯化的质粒进行测序。使用载体特异性引物T7来得到跨越插入物的阅读长度。在测序反应中使用以下试剂：水、5X测序缓冲液、BigDye终止剂混合物、T7引物和质粒(100ng/μL)，至10μL的体积。将混合物在96℃下保持1分钟，然后进行15个循环的96℃持续10秒、50℃持续5秒、60℃持续1分钟15秒；5个循环的96℃持续10秒、50℃持续5秒、60℃持续1分钟30秒；和5个循环的96℃持续10秒、50℃持续5秒和60℃持续2分钟。然后使用Applied Biosystems的毛细管电泳测序仪对染料终止反应进行测序。
然后定量序列验证的质粒。将它们使用单一切割限制性核酸内切酶线性化。使用琼脂糖凝胶电泳证实线性。在TE缓冲液(pH7.5)中用100μg tRNA/mL缓冲液制成所有质粒稀释液，以减少质粒与聚丙烯小瓶的非特异性结合。
然后将线性化的质粒从1,000,000拷贝/μL连续稀释至01拷贝/μL，并进行qPCR。计算测定效率，并且如果效率在90-110％的范围内，则该测定被视为可接受。
多重化测定
对于每种靶标，通过两种5’核酸酶测定法定量mRNA水平。通常，针对每种靶标筛选几种测定法。选择的两种测定法展现良好的效率、低检测限值以及目标基因(GOI)的宽5’→3’覆盖范围的组合。当在相应探针上使用不同的荧光团时，两种针对一种GOI的测定法可以组合在一个反应中。因此，测定验证中的最后步骤是确定选择的测定法当它们在相同qPCR中组合或“多重化”时的效率。
将10倍稀释液中的两种测定法的线性化质粒组合，并进行qPCR。如上所述测定每种测定法的效率。接受的效率为90-110％。当使用线性化的质粒标准品验证多重化反应时，还使用cDNA作为模板评价目标靶标的Cq值。对于人或小鼠靶标，分别使用HeLa和Hepa1-6cDNA。在这种情况下，cDNA衍生自在Corbett上从未转染细胞分离的RNA(在水中～5ng/μl)。以该方式，从该样品cDNA观察到的Cq值代表来自96-孔板转染的预期Cq值。在其中Cq值大于30的情况下，寻求表现出目标基因的更高表达水平的其他细胞系。生成在Corbett上经由高通量方法从每种人和小鼠系分离的总RNA的文库，并用于针对靶标表达的可接受水平进行筛选。
寡核苷酸命名法的描述
本文所述的所有寡核苷酸都被命名为任一SN1-ASN2-MN3。以下名称适用：
·N1:有义链序列的序列标识符编号
·N2:反义链序列的序列标识符编号
·N3:修饰模式的参考编号，其中每个编号代表寡核苷酸中的修饰核苷酸的模式。
例如，S27-AS219-M1代表具有由SEQ ID NO:27所示的有义序列、由SEQ ID NO:219所示的反义序列且适合于标识为M1的修饰模式的寡核苷酸。
表4.GYS2 RNAi寡核苷酸
本文说明性描述的公开内容可以在本文未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制不存在的情况下合适地实施。因此，例如，在本文每种情况下，术语“包含”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任一者可以用其他两个术语中的任一个替换。已经采用的术语和表述用作描述、而非限制的术语，并且此类术语和表述的使用并不意欲排除显示和描述的特征或其部分的任何等效方案，但应认识到，在请求保护的本发明的范围内可能存在各种修改。因此，应当理解，尽管优选实施方案已经具体公开了本发明，但本领域技术人员可以付诸本文公开的概念的任选的特征、修改和变异，并且此类修改和变异被认为在说明书和所附权利要求所限定的本发明的范围内。
另外，在马库什组或替代方案的其他分组的方面来描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，还由此在马库什组或其他组的任何个别成员或成员的亚组的方面来描述本发明。
应当理解，在一些实施方案中，在描述寡核苷酸或其他核酸的结构中可以参考序列表中呈现的序列。在此类实施方案中，实际的寡核苷酸或其他核酸与指定序列相比可以具有一个或多个替代核苷酸(例如，DNA核苷酸的RNA对应物或RNA核苷酸的DNA对应物)和/或一个或多个修饰的核苷酸和/或一个或多个修饰的核苷酸间键和/或一个或多个其他修饰，同时保留与指定序列基本上相同或相似的互补特性。
在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)使用术语“一(a)”和“一(an)”和“该(the)”和类似参考物应被解释为涵盖单数和复数，除非本文以其他方式指明或与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释为开放式术语(即，意指“包括，但不限于”)，除非另有说明。除非本文另有说明，本文的值的范围的记载仅仅意欲充当单独引用落入该范围内的每个单独值的简写方法，且每个单独值如同其在本文中单独记载地并入本说明书。本文所述的所有方法都可以以任何合适的顺序进行，除非本文另有指明或另外与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅仅意欲更好地举例说明本发明，并且不构成对本发明的范围的限制，除非另有要求。本说明书中的任何语言都不应解释为指示对实施本发明必不可少的任何未请求保护的要素。
本文描述了本发明的实施方案。阅读上述描述后，这些实施方案的变异对于本领域普通技术人员可变得显而易见。
本发明人期望技术人员适当时采用此类变异，且本发明人意欲本发明以本文中具体描述不同的其他方式实施。因此，如适用法律所允许，本发明包括其随附权利要求中所述的主题的所有修改和等效方案。此外，本发明涵盖其所有可能的变异中的上述要素的任何组合，除非本文另有指明或另外与上下文明显矛盾。仅仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或者能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等效方案。此类等效方案意欲由以下权利要求涵盖。
Claims (54)
1.用于降低GYS2的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含含有如SEQ ID NO:417-466、575-580、586-598和620-627中任一者中所示的序列的反义链。
2.权利要求1的寡核苷酸，其进一步包含含有如SEQ ID NO:385-416、569-574、581-585和612-619中任一者中所示的序列的有义链。
3.权利要求1或2的寡核苷酸，其中所述反义链由如SEQ ID NO:417-466、575-580、586-598和620-627中任一者中所示的序列组成。
4.权利要求2或3的寡核苷酸，其中所述有义链由如SEQ ID NO:385-416、569-574、581-585和612-619中任一者中所示的序列组成。
5.用于降低GYS2的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含长度为15至30个核苷酸的反义链，其中所述反义链具有与如SEQ ID NO:599-608中任一者中所示的GYS2的靶标序列互补的区域，其中所述互补的区域长度为至少15个连续核苷酸。
6.权利要求5的寡核苷酸，其中所述互补的区域与GYS2的靶标序列完全互补。
7.权利要求1至6中任一项的寡核苷酸，其中所述反义链长度为19至27个核苷酸。
8.权利要求1至7中任一项的寡核苷酸，其中所述反义链长度为21至27个核苷酸。
9.权利要求2至8中任一项的寡核苷酸，其中所述有义链长度为15至40个核苷酸，并且其中所述有义链与所述反义链形成双链体区域。
10.权利要求9的寡核苷酸，其中所述有义链长度为19至40个核苷酸。
11.权利要求9或10的寡核苷酸，其中所述双链体区域长度为至少19个核苷酸。
12.权利要求9至11中任一项的寡核苷酸，其中所述双链体区域长度为至少21个核苷酸。
13.权利要求5至12中任一项的寡核苷酸，其中与GYS2互补的区域长度为至少19个连续核苷酸。
14.权利要求5至13中任一项的寡核苷酸，其中与GYS2互补的区域长度为至少21个连续核苷酸。
15.权利要求9至14中任一项的寡核苷酸，其中所述有义链包含如SEQ ID NO:385-416、569-574、581-585和612-619中任一者中所示的序列。
16.权利要求5至15中任一项的寡核苷酸，其中所述反义链包含如SEQ ID NO:417-466、575-580、586-598和620-627中任一者中所示的序列。
17.权利要求9至16中任一项的寡核苷酸，其中所述有义链由如SEQ ID NO:385-416、569-574、581-585和612-619中任一者中所示的序列组成。
18.权利要求5至17中任一项的寡核苷酸，其中所述反义链由如SEQ ID NO:417-466、575-580、586-598和620-627中任一者中所示的序列组成。
19.权利要求9至18中任一项的寡核苷酸，其中所述有义链在其3'-末端包含如下所示的茎-环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，且其中L在S1和S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环。
20.用于降低GYS2的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含反义链和有义链，
其中所述反义链长度为21至27个核苷酸且具有与GYS2互补的区域，
其中所述有义链在其3′-末端包含如下所示的茎-环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，且其中L在S1和S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，
且其中所述反义链和所述有义链形成长度为至少19个核苷酸的双链体结构，但不共价连接。
21.权利要求20的寡核苷酸，其中所述互补的区域与GYS2 mRNA的至少19个连续核苷酸完全互补。
22.权利要求19至21中任一项的寡核苷酸，其中L是四环。
23.权利要求19至22中任一项的寡核苷酸，其中L长度为4个核苷酸。
24.权利要求19至23中任一项的寡核苷酸，其中L包含示为GAAA的序列。
25.权利要求9至18中任一项的寡核苷酸，其中所述反义链长度为27个核苷酸，且所述有义链长度为25个核苷酸。
26.权利要求25的寡核苷酸，其中所述反义链和有义链形成长度为25个核苷酸的双链体区域。
27.权利要求20至24中任一项的寡核苷酸，其在所述反义链上进一步包含长度为两个核苷酸的3′-突出端序列。
28.权利要求9至18中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含长度各自在21至23个核苷酸的范围内的反义链和有义链。
29.权利要求28的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含长度在19至21个核苷酸的范围内的双链体结构。
30.权利要求28或29的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含长度为一个或多个核苷酸的3'-突出端序列，其中所述3'-突出端序列存在于反义链、有义链或反义链和有义链上。
31.权利要求28或29的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含长度为两个核苷酸的3'-突出端序列，其中所述3'-突出端序列存在于所述反义链上，且其中所述有义链长度为21个核苷酸且所述反义链长度为23个核苷酸，使得所述有义链和反义链形成长度为21个核苷酸的双链体。
32.前述权利要求中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸。
33.权利要求32的寡核苷酸，其中所述修饰的核苷酸包含2’-修饰。
34.权利要求33的寡核苷酸，其中所述2'-修饰是选自以下的修饰：2'-氨基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸。
35.权利要求32至34中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸都是修饰的。
36.前述权利要求中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸间键。
37.权利要求36的寡核苷酸，其中所述至少一个修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
38.前述权利要求中任一项的寡核苷酸，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。
39.权利要求38的寡核苷酸，其中所述磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。
40.前述权利要求中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一个核苷酸缀合至一个或多个靶向配体。
41.权利要求40的寡核苷酸，其中各靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质。
42.权利要求41的寡核苷酸，其中各靶向配体包含N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分。
43.权利要求42的寡核苷酸，其中所述GalNac部分是单价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分或四价GalNAc部分。
44.权利要求19至24中任一项的寡核苷酸，其中所述茎-环的L的最多达4个核苷酸各自缀合至单价GalNAc部分。
45.权利要求40的寡核苷酸，其中所述靶向配体包含适体。
46.组合物，其包含前述权利要求中任一项的寡核苷酸和赋形剂。
47.将寡核苷酸递送至受试者的方法，所述方法包括将权利要求46的组合物施用于所述受试者。
48.降低受试者中的糖原贮积病的一种或多种症状的方法，所述方法包括将权利要求46的组合物施用于所述受试者。
49.降低或预防肝肿大、肝结节形成、肝毒性、肝纤维化、肝细胞增殖、肝中脂肪酸沉积、肝增生、肝细胞腺瘤和/或肝细胞癌的方法，所述方法包括将权利要求46的组合物施用于所述受试者。
50.权利要求49的方法，其中选自AST、ALT和ALP的一种或多种酶的水平降低。
51.权利要求49或50的方法，其中所述受试者患有糖原贮积病。
52.权利要求48-51中任一项的方法，其中所述糖原贮积病选自：GSDIa、GSDIII、GSDIV、GSDVI和GSDIX。
53.用于降低GYS2的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含长度为15至50个核苷酸的有义链和长度为15至30个核苷酸的反义链，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区域，其中所述有义链包含如SEQ ID NO:385-416、569-574、581-585和612-619中任一者中所示的序列，且其中所述反义链包含选自SEQ ID NO:417-466、575-580、586-598和620-627的互补序列。
54.用于降低GYS2的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含选自表4中所示的表的行的一对有义和反义链。
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