CN112028916B

CN112028916B - 程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针和制备

Info

Publication number: CN112028916B
Application number: CN202010988668.7A
Authority: CN
Inventors: 吕高超; 林建国; 邱玲; 谢敏浩; 缪银杏; 陈银飞
Original assignee: Jiangsu Institute of Nuclear Medicine
Current assignee: Jiangsu Institute of Nuclear Medicine
Priority date: 2020-09-18
Filing date: 2020-09-18
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2040-09-18
Also published as: CN112028916A

Abstract

本发明涉及放射性药物化学技术领域，具体涉及一种程序性细胞死亡蛋白受体‑1靶向的分子探针及其制备方和用途，本发明提供的一种程序性细胞死亡蛋白受体‑1靶向的分子探针，该小分子探针对靶标PD‑L1具有中等亲和力，可以选择性在PD‑L1阳性肿瘤部位摄取，能够较好区分阴阳性肿瘤，对PD‑L1高表达的肿瘤部位有响应，可以用于开发PD‑L1小分子PET显像剂。

Description

程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针和制备

技术领域

本发明涉及放射性药物化学技术领域，具体涉及一种程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针及其制备方和用途。

背景技术

癌症，又称为恶性肿瘤，是人体正常细胞在外源性或内源性致癌因子作用下，细胞生长与增殖发生严重紊乱，转化成非正常细胞即癌细胞。临床常见的癌症治疗方法包括手术治疗、化学治疗、放射性治疗和生物治疗等。通过调动自身免疫系统来杀死肿瘤细胞的免疫疗法，被认为是当前治疗癌症最具潜力的方法之一，其中以免疫检查点阻滞疗法尤为有效。程序性细胞死亡蛋白(Programmed cell death protein 1,PD-1)是一个重要的免疫抑制检查点，具有两个配体PD-L1或PD-L2。其中配体PD-L1是一种40kDa的1型跨膜蛋白，主要存在于大多数肿瘤细胞表面。研究表明，PD-1与PD-L1的结合抑制了抗原特异性CD8⁺T细胞或CD4⁺辅助细胞对肿瘤细胞的杀伤，从而介导肿瘤免疫逃逸。目前，PD-1/PD-L1的抗体治疗已成功应用于肺癌、黑色素瘤、乳腺癌等，并获得中华人民共和国国家食品药品监督管理总局(CFDA)、美国食品药品管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)的临床用药批准。但在临床应用中，患者对于该疗法的总体响应效率低于30％。为优化疗效，筛选目标人群，提高患者响应率，通常在治疗前采用免疫组织化学(IHC)定量患者体内PD-L1的表达水平。然而，PD-L1的表达水平在肿瘤增殖发展中是一个动态的过程，且具有异质性，这给IHC方法准确定量患者PD-L1表达水平带来很大困难。

正电子发射断层扫描技术(PET)因其高灵敏度、高分辨率和实时、无侵袭性等优点在核医学诊疗领域中占据重要地位。近年来针对PD-L1靶点的特异性PET示踪剂的开发持续被报道，探针的前体结构已经从单克隆抗体、工程蛋白深入到纳米抗体或核酸适配体。研究发现，全长链抗体探针的血液循环和清除时间较长，不能在相对较短的时间内给出准确的显像评估；另外，此类型示踪剂常使用半衰期较长的放射性核素(⁶⁴Cu、⁸⁹Zr、¹³¹I、^99mTc)进行标记，这可能给患者带来较高的健康风险。虽然纳米抗体可以克服上述缺点，对PD-L1也表现出较高的亲和力，但设计合成需要精确的基因组或蛋白质组技术，制备过程繁琐。相对而言，化学小分子示踪剂有很多优势，如明确的化学结构，灵活的标记基团，良好的肿瘤渗透，快速的显像，可控的药物动力学和不会引起免疫原性反应。例如，探针WL12是由14个氨基酸组成的多肽链，可特异性地与PD-L1结合。研究表明，WL12的结构可以灵活地标记上不同的放射性核素，用于体内动态监测PD-L1表达水平。WL12是设计PD-L1示踪剂的成功先例，但目前利用小分子探针对PD-L1成像的研究报道较少，主要原因在于，对小分子化合物来说，微小的差异，就可能会导致其作用完全不同，比如选择在靶向PD-L1的化合物修饰上放射性基团后，其化合物结构发生了变化，难以预测其是否仍然具有PD-L1靶向性作用。因此，目前对PD-L1成像的小分子探针的相关研究和报道非常少。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提出一种程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针及其制备方和用途。

本发明提供了一种程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针，具有如下式所示的结构：

本发明提供了一种程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体，其特征在于，具有如下式所示的结构：

本发明提供了一种程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体的制备方法，包括如下步骤：

将化合物L3和N-boc-乙二胺进行缩合反应，得到化合物L4；

将化合物L4进行脱保护反应，得到化合物L5；

将化合物L5和Boc-D-炔丙基甘氨酸进行缩合反应，得到化合物LN1；

将化合物LN1进行脱保护反应，得到化合物LN2；

将化合物LN2和AMBF₃进行click反应，得到化合物LN；合成路线如下：

在所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体的制备方法中，在制备化合物LN的步骤中，先溶解化合物LN2，依次加入AMBF₃,三(2-苯并咪唑基甲基)胺，迅速加入催化剂，在氮气保护下进行反应；

可选的，采用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、乙腈(MeCN)或甲醇(MeOH)中的至少一种溶解化合物LN2；

可选的，所述催化剂为硫酸铜(CuSO₄)和抗坏血酸钠的混合物、六氟磷酸四(乙腈)铜(Ⅰ)、碘化亚铜(CuI)或氯化亚铜(CuCl)中的至少一种；

可选的，在氮气保护下反应条件为45℃加热反应2小时。

可选的，化合物LN2、AMBF₃和六氟磷酸四(乙腈)铜(Ⅰ)的比例为0.04×10³(mmol):0.17(mmol):10(mg)。

在所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体的制备方法中，在制备化合物LN1的步骤中，将化合物L5与Boc-D-炔丙基甘氨酸溶解，加入缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺，使得溶液pH在8至9，反应室温搅拌过夜；

可选的，采用无水N,N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃溶解化合物L5与Boc-D-炔丙基甘氨酸。

可选的，化合物L5与Boc-D-炔丙基甘氨酸的摩尔比为1:1；

可选的，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为0.83:1.09。

在所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体的制备方法中，在制备化合物L4的步骤中，将化合物L3与N-boc-乙二胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，滴加冰醋酸催化，先反应2-5小时后再加入三乙酰氧基硼氢化钠反应过夜。

可选的，化合物L3与N-boc-乙二胺的摩尔比为0.95:1。

在所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体的制备方法中，还包括化合物L3的合成，包括：

将苯并-1，4-二氧六环-6-硼酸和3-溴-2-甲基苯甲醇进行suziki偶联反应，得到化合物L1；

将化合物L1和5-氯-2,4-二羟基苯甲醛进行缩合反应，得到化合物L2；

将化合物L2和3-溴甲基苯甲腈进行缩合反应，得到化合物L3；合成路线如下：

本发明提供了一种程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针的制备方法，将所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体或所述的制备方法制备得到的分子探针前体进行放射性性核素标记；优选的，放射性核素为¹⁸F。

所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针或所述的制备方法制备的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针在制备程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的PET显像剂的用途。

所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针或所述的制备方法制备的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针在制备肿瘤靶向的PET显像剂的用途。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针是一种小分子PET显像探针，该小分子探针对靶标PD-L1具有中等亲和力，可以选择性在PD-L1阳性肿瘤部位摄取，能够较好区分PD-L1阴阳性肿瘤，可以用于开发PD-L1小分子PET显像剂。同现有技术相比，本发明中的小分子PET探针具有合成方便、成本低、快速显像、稳定性好等优势。

2.本发明提供的一种程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体的制备方法，步骤简单，容易合成。

3.本发明提供的一种程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针制备方法，通过“¹⁸F-¹⁹F”同位素交换进行标记并获得高放射化学纯度和良好的放射性比活度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中化合物5-氯-2,4-二羟基苯甲醛的质谱分析图；

图2是本发明实施例1中化合物L2的质谱分析图；

图3是本发明实施例1中化合物L3的质谱分析图；

图4是本发明实施例1中化合物L5的质谱分析图；

图5是本发明实施例1中化合物LN2的质谱分析图；

图6是本发明实施例1中系列化合物L1、5-氯-2,4-二羟基苯甲醛、L2、L3的高效液相色谱分析图；图a、b、c、d分别对应化合物L1、5-氯-2,4-二羟基苯甲醛、L2、L3；

图7是本发明实施例1中系列化合物L 4、L5、LN1、LN2和LN的高效液相色谱分析图；图e、f、g、h、i分别对应化合物L 4、L5、LN1、LN2和LN；

图8是本发明实施例1中化合物LN的核磁共振氢谱；

图9是本发明实施例1中化合物LN的核磁共振碳谱；

图10是本发明实施例1中化合物LN的核磁共振氟谱；

图11是本发明实施例2中[¹⁸F]LN经标记后反应液的放射性HPLC图；

图12是本发明实施例2中经C18柱纯化后的[¹⁸F]LN的放射性HPLC图；

图13是本发明实验例1中探针[¹⁸F]LN在小鼠血清和PBS(pH＝7.4)孵育1、2、4小时的稳定性HPLC分析；图Serum对应在小鼠血清孵育，图PBS对应在PBS(pH＝7.4)孵育；

图14是本发明实验例3中探针前体LN与PD-L1的结合作用；图a为PD-L1在A375和A375-hPD-L1细胞中表达的流式分析图；图b经不同浓度LN孵育后PD-L1在A375-hPD-L1细胞中表达变化的流式分析图；图c为A375-hPD-L1细胞与LN(0、1.5625、6.25、12.5、25、50μM)孵育后各样品的PD-L1表达，半定量以平均荧光强度(MFI)表示；

图15是本发明实验例4中细胞活力分析及细胞摄取研究结果；图a、b分别为在1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50和100μM/孔浓度下的探针前体LN分别作用A375和A375-hPD-L1细胞24和48小时的细胞毒性分析；图c为A375、A375-hPD-L1和blocked组在设定时间点的细胞摄取分析，其中blocked组使用50μM的LN预处理30分钟(*P<0.05)；

图16是本发明实验例5中探针[¹⁸F]LN在A375-hPD-L1和A375荷瘤鼠体内的PET成像；图中a、b分别为探针[¹⁸F]LN在A375-hPD-L1和A375荷瘤鼠1小时内动态成像的代表性横断面和冠状面PET图像；图c为探针[¹⁸F]LN在经过LN(5mg/kg)预处理30分钟后A375-hPD-L1荷瘤鼠的动态PET图像；(d)根据PET图像半定量分析[¹⁸F]LN的肿瘤区域摄取值；

图17是本发明实验例6中小鼠体内生物分布的结果(n＝3，***P<0.01)；图中插图为生物分布中A375-hPD-L1和A375荷瘤鼠肿瘤与肌肉的摄取比值(T/M)；

图18是本发明实验例6中小鼠药代动力学分析结果；

图19是本发明实验例7中免疫组化分析结果；图中a、b分别为A375-hPD-L1和A375荷瘤小鼠的肿瘤组织免疫组化分析图(n＝3,标尺为50μm)；图中c为A375-hPD-L1和A375荷瘤小鼠的PD-L1半定量分析结果图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

下述实施例中涉及的室温温度范围为20-30℃。

下述实施例中涉及的溶剂均为分析纯。

下述实验例中涉及的细胞系和细胞培养：人源黑素瘤细胞株A375和转染人PD-L1基因的细胞株A375(A375-hPD-L1)均使用DMEM培养基，该培养基中添加10％胎牛血清、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素，细胞均在含5％二氧化碳的37℃培养箱中孵育生长。

下述实验例中涉及的动物模型：雌性BALB/c裸鼠模型和雌性BALB/c小白鼠均购自常州Cavens实验动物公司。待小鼠约4-5周龄时，将A375细胞(5×10⁶)和A375-hPD-L1细胞(5×10⁶)分别皮下注射于小鼠右前肢腋下，每隔一天监测肿瘤直径。待肿瘤体积达到100-120mm³(计算公式:1/2×长径×短径²)时，将小鼠用于体内研究实验。所有程序和动物方案均经江苏省原子医学研究所实验动物福利伦理委员会批准。

上述的细胞A375-hPD-L1由江苏省原子医学研究所提供。

实施例1程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的PET探针前体LN的合成

所述PET探针前体LN具有如下式所示的结构：

所述PET探针前体LN的合成路线图如下：

制备方法如下：

(1)化合物L1的合成

先将溶剂(1，4-二氧六环：纯水＝4：1，v/v)共200毫升，通氮气排去混合溶剂中氧。取苯并-1，4-二氧六环-6-硼酸(1.8g，0.01mol)，3-溴-2-甲基苯甲醇(2.0g，0.01mol)，无水碳酸钾(13.0g，0.09mol)放入反应瓶中，放入磁力搅拌子，再加入四(三苯基膦)钯(1.0g，0.80mmol)。反应瓶口插上干燥冷凝管，注入溶剂，氮气保护下100℃加热，冷凝水回流，反应24小时。反应结束后冷却反应液，使用旋转蒸发仪去除溶剂1，4-二氧六环。在反应瓶中加入适量水，溶解碳酸钾。再加二氯甲烷萃取5次，每次加入体积约50毫升。无水硫酸钠干燥后旋干，柱层析法分离纯化(正己烷：乙酸乙酯＝1：3，v/v)，真空干燥，得黄色油状物1.7g(产率：66.4％)，即化合物L1。

(2)化合物5-氯-2,4-二羟基苯甲醛的合成

称取N-氯代琥珀酰亚胺(5.1g，0.04mol)加入无水乙醚(50mL)中，注入哌啶(3.6mL，0.04mol)，在氮气保护下室温搅拌反应4小时。处理反应液时，加适量水洗不溶于乙醚的物质，水洗5次，收集乙醚相并旋干，产物为无色油状物，称重得3.6g(0.03mol)。配置混合溶剂(浓硫酸/水＝1/1，v/v)共200毫升，在冰上取浓硫酸慢滴入水中，再将混合溶剂冷却至室温。将上述所得产物(3.6g，0.03mol)注入含2，4-二羟基苯甲醇(4.17g，0.03mol)的浓硫酸水溶液中，在氮气保护下，室温搅拌反应24小时。反应结束处理反应液时，反复用纯水洗涤抽滤，直至pH近中性，最后烘干产物，得粉色固体产物3.5g(产率：68.6％)，即得化合物5-氯-2,4-二羟基苯甲醛，其质谱分析图如图1所示。

(3)化合物L2的合成

化合物L1称取1.28g(5.0mmol)，化合物5-氯-2,4-二羟基苯甲醛称取0.86g(5.0mmol)，三苯基膦称取1.5g(5.7mmol)，将这三者加入反应瓶中，放入磁力搅拌子，加入四氢呋喃(20mL)溶解。通风橱内将反应瓶置于冰上，慢慢滴加偶氮二甲酸二异丙酯(1mL，5.0mmol)，滴加完后取出反应瓶，恢复到室温，在氮气保护下，搅拌反应过夜。反应结束时有不溶物，反应液呈棕黄色。用旋转蒸发仪去除四氢呋喃，用乙酸乙酯多次洗涤，收集乙酸乙酯相并旋干。柱层析法分离纯化(正己烷：乙酸乙酯＝1：3，v/v)。将产物真空干燥，得淡黄色固体1.2g(产率：58.5％)，即得化合物L2，其质谱分析图如图2所示。

(4)化合物L3的合成

化合物L2称取2.60g(6.3mmol)，3-溴甲基苯甲腈称取4.95g(12.1mmol)，碳酸铯称取8.24g(25.4mmol)，三者溶于N,N-二甲基甲酰胺(17mL)，室温搅拌过夜。反应结束后加水溶解碳酸铯，用乙酸乙酯萃取，加入无水硫酸钠，旋干乙酸乙酯相。经过柱层析法分离纯化(正己烷：乙酸乙酯＝1：1，v/v)得黄色固体2.8g(产率：84.1％)，即得化合物L3，其质谱分析图如图3所示。

(5)化合物L5的合成

将化合物L3(500mg，0.95mmol)与N-boc-乙二胺(160μl,1mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(15mL)，滴加冰醋酸使反应液偏酸性。先反应5小时后再加入三乙酰氧基硼氢化钠(807mg，3.8mmol)反应过夜。反应原液通过乙酸乙酯萃取后旋干，柱层析法分离纯化(乙酸乙酯/甲醇＝10/1，v/v)得1.5g产物L4。将所得的化合物L4(1.5g)溶于二氯甲烷中，滴加三氟乙酸1.5ml，室温反应2小时，将反应液多次加入二氯甲烷旋干，得到化合物L5，经质谱验证，其质谱分析图如图4所示。

(6)化合物LN2的合成

将化合物L5(313mg，0.55mmol)与Boc-D-炔丙基甘氨酸(117mg，0.55mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(15mL)中，加入缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(315mg，0.83mmol)和N,N-二异丙基乙胺200μL(141mg，1.09mmol)，使得溶液pH在8至9，反应室温搅拌过夜。向反应原液加50mL去离子水通过乙酸乙酯萃取后旋干，柱层析法分离纯化(乙酸乙酯：甲醇＝2：1，v/v)得产物LN1。将所得的化合物溶于5mL二氯甲烷中，滴加三氟乙酸0.5mL，室温反应2小时，将反应液多次加入二氯甲烷旋干，得化合物LN2共275mg，经质谱验证，其质谱分析图如图5所示。

(7)化合物LN的合成

先加入N,N-二甲基甲酰胺2mL溶解化合物LN2(58mg,0.08mol),依次加入AMBF₃(68.4mg，0.34mmol),三(2-苯并咪唑基甲基)胺(纯)888μL，迅速加入六氟磷酸四(乙腈)铜(Ⅰ)20mg，再加入去离子水1mL，在氮气保护下45℃加热反应2小时，得到化合物LN，经过HPLC制备纯化，经验证，所得10mg。

上述合成的系列化合物L1、5-氯-2,4-二羟基苯甲醛、L2、L3、L 4、L5、LN1、LN2经高效液相色谱分析，化合物LN经过半制备型高效液相色谱纯化，流动相A为H₂O(0.1％(v/v)TFA)％(v/v)，流动相B为MeCN(0.1％TFA(v/v))％(v/v)，具体纯化条件如下表1：

表1系列化合物高效液相色谱分析及半制备型高效液相色谱柱纯化条件

时间	H<sub>2</sub>O(0.1％TFA)％	MeCN(0.1％TFA)％
			0min	80	20
3min	80	20
			5min	60	40
30min	45	55
			35min	10	90
40min	80	20

上述系列化合物的高效液相色谱分析图见图6-图7。

化合物LN的碳氢谱分析如下：

氢谱解析：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.82(d,J＝63.0Hz,2H),8.26(s,1H),8.00(d,J＝9.8Hz,2H),7.84(dd,J＝15.3,7.8Hz,2H),7.70–7.51(m,2H),7.41(d,J＝7.3Hz,1H),7.30–7.11(m,3H),6.92(d,J＝8.1Hz,1H),6.82–6.67(m,2H),5.35(s,2H),5.27(s,2H),4.86(t,J＝7.0Hz,2H),4.28(s,4H),4.20(s,2H),4.05(s,1H),3.74(t,J＝7.0Hz,4H),3.45(dd,J＝15.5,6.2Hz,2H),3.18(dd,J＝6.5,3.7Hz,2H),3.02(s,7H),2.41(q,J＝4.7Hz,2H),2.24(s,3H).其核磁共振氢谱如图8所示。

碳谱解析：¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ168.81,156.74,155.65,143.45,143.02,142.20,141.10,138.61,135.16,134.77,134.57,132.85,132.68,132.34,131.49,130.37,130.27,128.09,125.96,125.16,122.57,119.14,118.16,117.29,113.67,113.50,112.04,100.80,70.21,69.60,64.59,63.56,53.74,52.58,46.02,44.61,44.12,35.64,27.41,16.34.其核磁共振碳谱如图9所示。

氟谱分析：¹⁹F NMR(376MHz,CDCl₃)δ-75.49.其核磁共振氟谱如图10所示。

实施例2程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的PET探针[¹⁸F]LN的合成

所述PET探针[¹⁸F]LN具有如下式所示的结构：

所述PET探针[¹⁸F]LN的标记路线如下：

具体标记方法如下：

(1)标记前:

a.Sep-Pak light QMA柱活化：先用注射器吸取10mL 0.5M的碳酸氢钠(NaHCO₃)溶液，慢慢注入柱内清洗，再吸取10mL无菌注射用水清洗，最后将注射器吸入空气吹干QMA柱。QMA柱活化后挂好，待传靶。

b.Sep-Pak light C18柱活化：先取10mL乙醇慢慢注入C18柱，然后用10mL无菌注射用水清洗。

c.标记前体配制：将10mg化合物LN溶于465μL DMF中，配制成25mM的澄清溶液，置于-20℃冰箱冷藏。

d.哒嗪-盐酸缓冲溶液配制：取哒嗪1000μL加入1050μL的浓盐酸(12mol/L)，加水稀释4100μL，而后加入6150μL DMF，超声，溶液呈无色透明，此时测得溶液pH值在2.0～2.5间，放-20℃冰箱储存。

(2)标记过程：

以¹⁸O-H₂O为靶材料，通过¹⁸O(p，n)¹⁸F反应生产¹⁸F-F^-，经阴离子交换柱(QMA)固定吸附(测放射剂量)，用500μL哒嗪-盐酸缓冲溶液将¹⁸F-F^-从QMA柱上洗脱下来(测放射剂量)，置于含30μL标记前体(浓度为25mM)的反应管中。将反应管油浴80℃加热反应30分钟。反应结束后测整管剂量，取少量反应液用乙腈稀释，用放射性HPLC观测标记情况，结果如图11所示，可以看出，转化率高达65％。确认标记成功后，测纯化前剂量得到[¹⁸F]LN(0.41GBq)。将标记反应原液倒入40mL去离子水中稀释，用注射器吸取混合溶液挂C18柱，测挂柱后的剂量，再用去离子水10mL洗涤挂C18柱的标记产物三次，每一次洗涤测剂量(终剂量待变化幅度稳定)。用500μL的DMSO将标记产物淋洗置于10mL的西林瓶中，取少量纯化后的产物稀释，经放射性HPLC检测其放射性化学纯度，结果如图12所示，可以看出通过C18柱纯化得放射化学纯度高于98％的产物。在上述放射高效液相色谱中[¹⁸F]LN的保留时间为19.3分钟，与前体LN(19.1分钟)的出峰时间相近，经衰减校正后，[¹⁸F]LN的最终放射化学产率(RCY)为22.3％，比活度为36.34±5.73GBq/μmol。

实验例1体外稳定性研究

经纯化后探针[¹⁸F]LN与PBS缓冲液(pH＝7.4)或小鼠血清孵育不同时间来进行评估，具体为：将50μL探针[¹⁸F]LN(37MBq)分别与450μL PBS或小鼠血清溶液中，然后放置在37℃下分别孵育不同时间(1，2，4小时)。其中，血清稳定性是在每个检测时间点，取约20μL的混合溶液加入等体积的乙腈沉淀离心，去除蛋白杂质，取上清液进行放射性HPLC分析。

结果如图13所示，[¹⁸F]LN在37℃与小鼠血清或PBS中孵育1～4小时在HPLC图谱显示单峰，也获得良好的稳定性。

实验例2脂水分布系数测定

将等体积1mL的正辛醇与纯水于室温下振荡，将[¹⁸F]LN(18.5MBq)放入总体积为2mL的正辛醇和水中，充分振荡使其混合均匀，然后在4000g的转速下离心5min使脂水相分层，从两相中分别取出100μL的溶液(每组设置三个平行实验)，通过γ计数仪分别测量放射性剂量在水相和油相中的分布，然后通过下列公式来判断探针的溶解特性Log P。其中，Co表示探针在有机相中的浓度，Cw表示探针在水相的浓度。

测定得到，探针[¹⁸F]LN在正辛醇辛和水相中测得脂水分布系数Log P为0.93±0.01,表示该探针显示脂溶性。

实验例3细胞流式分析

采用细胞流式分析前体LN与PD-L1的相互作用。具体为：将A375细胞和A375-hPD-L1细胞铺于6孔板中，每孔细胞数量为3×10⁵个。分别以不加药的A375细胞和A375-hPD-L1细胞作为对照组以测定这两种细胞系的PD-L1表达。对于PD-L1阳性细胞，每孔加入不同梯度浓度(0-50μM)的LN孵育4小时，然后用不含EDTA胰酶消化细胞以收集细胞悬液。再向每管细胞悬液中加入含20μL anti-PD-L1-PE的1ml无血清培养基，避光4℃孵育30分钟。然后采用Calibur流式细胞仪检测。用荧光素PE的平均荧光强度(MFI)定义PD-L1的表达。

结果如图14所示，图14的a图中，A375和A375-hPD-L1细胞的PD-L1表达量检测为3.62±0.25和48.38±2.37(n＝3)。然后用不同浓度的LN孵育A375-hPD-L1细胞，见图14的b图和c图中,平均荧光强度(MFI)值从48.38±2.37减少至15.22±0.75，这表明前体LN能够与PD-L1荧光抗体直接竞争，间接说明LN能够靶向PD-L1。

实验例4细胞毒性分析及细胞摄取研究

1、细胞毒性分析

将A375细胞和A375-hPD-L1细胞铺于6孔板中，每孔细胞数量为3×10⁵个，分别使用1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50和100μM/孔的浓度下的探针前体LN分别作用A375细胞和A375-hPD-L1细胞24和48小时，进行细胞毒性分析。

探针前体LN对A375-hPD-L1和A375细胞毒性分析结果如图15中的a图和b图显示，其对A375-hPD-L1和A375细胞的毒性较低，在50μM/孔的探针前体LN中孵育48h，细胞存活率均大于90％。在高浓度经100μM/孔的LN处理后，细胞存活率仍大于85％。结果表明，探针前体LN具有较低的细胞毒性和良好的生物相容性。

2、细胞摄取研究

本实验旨在探索[¹⁸F]LN在活细胞中检测PD-L1表达的潜力，在A375-hPD-L1或A375细胞中分析[¹⁸F]LN的细胞摄取情况。将A375细胞和A375-hPD-L1细胞铺于6孔板中，每孔细胞数量为3×10⁵个。分别将[¹⁸F]LN(3.7×10^-2MBq/孔)加入三个实验组：A375，A375-hPD-L1和blocked组(阻断组，即在加入探针前，提前加入冷化合物(LN)阻断)。其中blocked组提前使用探针前体LN(50μM/孔)处理30分钟，三个实验组分别孵育0.5、1、2、4小时，孵育结束后用磷酸缓冲溶液(PBS，pH值为7.4)清洗两次，然后用氢氧化钠(0.1M)裂解细胞，收集后由γ计数器检测样品的CPM值，细胞摄取AD％结果以细胞内的CPM与总剂量的CPM比值表示。

结果如图15的c图中可看出，30分钟时，A375-hPD-L1的细胞摄取比为1.88±0.07％，A375细胞摄取比为1.73±0.14％，两组间无显著差异。但随着孵育时间延长，到达4小时，A375-hPD-L1的细胞摄取比为增加到4.02±0.15％，高于A375细胞摄取比(3.18±0.09％)，同时也高于blocked组(2.79±0.04％)，显示了在体外[¹⁸F]LN与PD-L1亲和力适中。

实验例5小鼠体内PET成像分析

为实现对荷瘤小鼠肿瘤内PD-L1表达的监测，分别建立A375和A375-hPD-L1的肿瘤模型鼠，通过Inveon Dedicated micro-PET动物扫描仪进行PET成像。荷瘤小鼠分为三个实验组：A375，A375-hPD-L1和blocked组，其中blocked是提前30分钟注射5mg/kg的剂量的前体化合物LN的A375-hPD-L1荷瘤鼠。PET显像时，将荷瘤小鼠用异氟烷(与氧气含1.5％)以2L/min的流速进行全程麻醉。当扫描仪开始编程时，每只小鼠通过通道针进行尾静脉静注射[¹⁸F]LN(3.7MBq)，动态成像1小时后，利用软件(ASIPro，Siemens)计算摄取值(％ID/g)。

探针[¹⁸F]LN在A375-hPD-L1和A375荷瘤鼠体内成像如图16所示，研究该探针在肿瘤部位与PD-L1的结合响应能力。对于A375-hPD-L1肿瘤，[¹⁸F]LN在肿瘤部位有明显的摄取(图16中a图)。从肿瘤摄取的时间—活度曲线可看出，在探针[¹⁸F]LN注射后15分钟，肿瘤摄取迅速达1.96±0.27％ID/g(图16中d图)，在20分钟时可观察到最高的肿瘤/肌肉摄取比(T/M)为1.943。虽然在阳性荷瘤鼠实验组的肿瘤/肌肉摄取比值相对较低，由于[¹⁸F]LN和PD-L1的适度亲和力，在整个成像过程中可见肿瘤轮廓。而在PD-L1阴性肿瘤(A375荷瘤鼠)中，由于PD-L1表达较低，肿瘤在整个扫描过程中不可见，最大摄取量为0.89±0.31％ID/g，(图16中b图，图16中d图)。PET结果表明，[¹⁸F]LN可在PD-L1高表达的A375-hPD-L1肿瘤选择性摄取。为了进一步验证这一结果，用LN(5mg/kg)对A375-hPD-L1荷瘤鼠进行预处理30分钟再注射探针。从图16中c图可以看出，LN对A375-hPD-L1肿瘤进行预处理后，探针在肿瘤部位放射性明显下降，最大摄取值出现在15分钟为1.07±0.26％ID/g，大大低于阳性实验组，这进一步说明PD-L1的高表达促进了[¹⁸F]LN在A375-hPD-L1肿瘤中的摄取。从PET图还可以看出小鼠四肢有放射性，表明[¹⁸F]LN在体内循环后可能存在部分脱氟现象。

实验例6小鼠药代动力学分析及体内生物分布

小鼠体内药动学分析是将探针[¹⁸F]LN(2.2MBq)通过尾静脉注射入雌性BALB/c小白鼠(n＝4)体内，在不同时间点(1、2、5、7、10、15、20、30、45、60、90、120分钟)通过小鼠尾静脉部取血，取等体积溶液作为参考，使用γ计数仪测量CPM值，所得结果在DAS 2.1软件中进行数据拟合分析。

荷瘤小鼠分为PD-L1阳性(A375-hPD-L1荷瘤鼠)、阴性(A375荷瘤鼠)的两个实验组，通过尾静脉注射[¹⁸F]LN(2.5MBq,100μL)。在探针注射1h后，小鼠被异氟醚麻醉进行安乐死，取心、肝、脾、肺、肾等主要器官和肿瘤，并进行称重，用γ计数仪对样品进行检测，以％ID/g为单位计算放射性。

小鼠体内生物分布的结果如图17所示，在探针作用1小时后将小鼠进行安乐死，对主要器官和组织进行解剖，观察到在荷瘤鼠的肾脏(16.55±2.38％ID/g)、肝脏(5.54±0.82％ID/g)和心脏(2.00±0.11％ID/g)等非靶组织中有较高的放射性，这与荷瘤鼠PET显像图扫描结果一致。但在其他器官，如肺、胃和肌肉中，探针摄取量低于1％ID/g。在A375-hPD-L1荷瘤鼠中，肿瘤摄取量1.17±0.07％ID/g，此时的肿瘤与肌肉比值大于2.5，但在A375荷瘤小鼠中肿瘤摄取量仅为0.62±0.05％ID/g，说明该探针能够明显地区分PD-L1阴阳性肿瘤。

小鼠药代动力学分析结果如图18所示，分析小鼠给药后的药代动力学参数下表2。在血药浓度分析中，以时间(min)为横坐标，剂量吸收比(ID％/g)为纵坐标绘制出线性相关(r2>0.95)的清除率曲线图，并计算生物半衰期(t1/2＝62.3min)等药代动力学参数。

表2血药动力学参数

参数	单位	均值
			AUC(0-t)	ID％/g*min	402.603
AUC(0-∞)	ID％/g*min	482.125
			MRT(0-∞)	min	55.298
T<sub>1/2</sub>	min	62.335
			T<sub>max</sub>	min	2
CL	L/min/kg	0.041
			V<sub>ss</sub>	L/kg	3.731

实验例7免疫组化分析

免疫组化分析用于再次验证PD-L1在A375-hPD-L1和A375肿瘤细胞异种移植小鼠体内的表达情况。在荷瘤小鼠进行PET显像后，分别从小鼠体内切除肿瘤组织，用4％多聚甲醛(pH＝7.4)浸泡过夜。脱水后，用石蜡包埋切片，采用梯度浓度的二甲苯和乙醇脱蜡。然后使用柠檬酸抗原修复法，加热后冷却至室温。用免疫染色阻断液封闭15分钟，与一抗PD-L1抗体(ab205921,Abcam)在4℃孵育过夜。在PBS洗涤后，用二抗37℃孵育1小时。依次加入DAB显色，使用苏木精复染核，自来水返蓝，梯度浓度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。图像采集采用显微成像系统(Olympus CX41,Olympus DP72)。

分析结果如图19中(a图、b图和c图)所示，免疫组化验证荷瘤小鼠肿瘤组织内部PD-L1表达情况，如图19中a图和b图所示，肿瘤组织经过石蜡切片染色后，细胞核呈蓝色(黑白图中呈深灰色)，PD-L1阳性表达部位呈棕黄色(黑白图中呈现浅灰色)，主要在细胞膜表达。免疫组化结果再次验证了[¹⁸F]LN在A375-hPD-L1荷瘤鼠肿瘤部位的PET成像，是因为该探针对PD-L1靶向并响应，并且PD-L1的表达量在A375-hPD-L1和A375荷瘤鼠肿瘤组织内有较大区别。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针，其特征在于，具有如下式所示的结构：

2.一种程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体，其特征在于，具有如下式所示的结构：

3.一种如权利要求2所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将化合物L3和N-boc-乙二胺进行缩合反应，得到化合物L4；

将化合物L4进行脱保护反应，得到化合物L5；

将化合物LN1进行脱保护反应，得到化合物LN2；

4.根据权利要求3所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体的制备方法，其特征在于，在制备化合物LN的步骤中，先溶解化合物LN2，依次加入AMBF₃,三(2-苯并咪唑基甲基)胺，迅速加入催化剂，在氮气保护下进行反应。

5.根据权利要求4所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体的制备方法，其特征在于，采用N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、乙腈或甲醇中的至少一种溶解化合物LN2。

6.根据权利要求4所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体的制备方法，其特征在于，所述催化剂为硫酸铜和抗坏血酸钠的混合物、六氟磷酸四(乙腈)铜(Ⅰ)、碘化亚铜或氯化亚铜中的至少一种。

7.根据权利要求4所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体的制备方法，其特征在于，在氮气保护下反应条件为45℃加热反应2小时。

8.根据权利要求3或4所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体的制备方法，其特征在于，在制备化合物LN1的步骤中，将化合物L5与Boc-D-炔丙基甘氨酸溶解，加入缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺，使得溶液pH在8至9，反应室温搅拌过夜。

9.根据权利要求8所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体的制备方法，其特征在于，采用无水N,N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃溶解化合物L5与Boc-D-炔丙基甘氨酸。

10.根据权利要求3-7任一项所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体的制备方法，其特征在于，在制备化合物L4的步骤中，将化合物L3与N-boc-乙二胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，滴加冰醋酸催化，先反应2-5小时后再加入三乙酰氧基硼氢化钠反应过夜。

11.根据权利要求3-7任一项所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体的制备方法，其特征在于，还包括化合物L3的合成，包括：

12.一种程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针的制备方法，其特征在于，将权利要求2所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针前体或权利要求3-11任一项所述的制备方法制备得到的分子探针前体进行放射性核素标记。

13.根据权利要求12所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针的制备方法，其特征在于，放射性核素为¹⁸F。

14.权利要求1所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针或权利要求12或13的制备方法制备的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针在制备程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的PET显像剂的用途。

15.权利要求1所述的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针或权利要求12或13的制备方法制备的程序性细胞死亡蛋白受体-1靶向的分子探针在制备肿瘤靶向的PET显像剂的用途。