CN112020506B - 新生霉素类似物与脯氨酸的共晶体形式 - Google Patents
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Abstract
公开了N‑(2‑(5‑(((2R，3R，4S，5R)‑3，4‑二羟基‑5‑甲氧基‑6，6‑二甲基四‑氢‑2H‑吡喃‑2‑基)氧基)‑3’‑氟‑[1，1’‑联苯基]‑2‑基)乙基)‑乙酰胺和L‑脯氨酸或D‑脯氨酸的共晶体形式、其药物组合物、制造方法和用于治疗神经退行性病症例如糖尿病性周围神经病的使用方法。
Description
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2018年2月7日提交的美国申请序列No.62/627,570的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
约2600万美国人患有1型或2型糖尿病。尽管使用胰岛素和经口抗糖尿病药物来帮助维持血糖正常，但这些个体中的约60％至70％会发生糖尿病性周围神经病(diabeticperipheral neuropathy，DPN)。参见Veves，A.；Backonja，M.；Malik，R.A.，Pain Med.9(2008)660-674。据报道，许多基于新生霉素支架的小分子均抑制热激蛋白90(heat shockprotein 90，Hsp90)，并具有重要的神经保护特性，可用于逆转动物模型中的DPN症状。参见B.R.Kusuma gt al.，J.Med.Chem.55(2012)5797-5812；美国专利No.9,422,320。
这种类型的一种新生霉素类似物(“novologue”)是N-(2-(5-(((3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺(4)，据报道其展示了很高的神经元保护活性。Kusuma(2012)。还报道了novologue 4的一些作用取决于另一种热激蛋白Hsp70的存在，而其他作用则独立于Hsp70。Hsp70在novologue 4和相关化合物的作用机制中的确切作用尚未得到充分表征。J.Ma gtal.，ACS Chem.Neurosci.6(9)(2015)1637-1648。
据报道，novologue 4的合成遵循导致无定形固体的程序，并且其物理化学特征省略了在2位的立体化学的确定分配(Kusuma(2012)；美国专利No.9,422,320)，从而原则上允许存在两种可能的异头物4a和4b，如下所示：
已公开的4(也称为KU-596)的合成虽然表明HPLC纯度为95.6％，但并不表明无定形固体的异头物纯度，如通过只有诺维糖(noviose)的2位缺乏确定的立体化学分配的事实所证明的。(Kusuma(2012)。
发明内容
本公开内容以出乎意料的发现为前提，即以高产率、纯度和异头物纯度实现了novologue 4a和L-脯氨酸或D-脯氨酸的共晶体形式。此外，相对于已知的无定形形式4，本发明形式表现出生物利用度的显著改善。
因此，本公开的一个实施方案是N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺和L-脯氨酸(1∶2)的共晶体。该共晶体通过包含以下峰的X射线粉末衍射图来表征：14.76、16.86、19.00和21.05°2θ±0.20°2θ，如使用波长为的Cu-Kα辐射在衍射仪上确定的。该共晶体在本文中称为“B型”。
另一个实施方案是N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺和L-脯氨酸(1∶2)的共晶体。该共晶体通过包含以下峰的X射线粉末衍射图来表征：9.20、16.19、18.45和24.51°2θ±0.2°2θ，如使用波长为 的Cu-Kα辐射在衍射仪上确定的。该共晶体在本文中称为“D型”。
另外，一个实施方案是以丙酮溶剂化物形式存在的N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺和L-脯氨酸(1∶1∶1)的共晶体。该共晶体通过包含以下峰的X射线粉末衍射图来表征：14.64、17.53、18.91和21.33°2θ±0.20°2θ，如使用波长为的Cu-Kα辐射在衍射仪上确定的。该共晶体在本文中称为“C型”。
在另一个实施方案中，本公开内容涉及摩尔比分别为约1∶1.2∶0.6∶0.1的N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺和L-脯氨酸作为甲基乙基甲酮和吡嗪的溶剂化物的共晶体。该共晶体通过包含以下峰的X射线粉末衍射图来表征：10.42、14.62、19.28和21.14°2θ±0.20°2θ，如使用波长为的Cu-Kα辐射在衍射仪上确定的。该共晶体在本文中称为“G型”。
本公开内容还提供了N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺和D-脯氨酸(1∶1)的共晶体，其通过包含以下峰的X射线粉末衍射图来表征：11.77、14.52、19.54和21.23°2θ±0.20°2θ，如使用波长为的Cu-Kα1辐射在衍射仪上确定的。
本公开内容还提供了N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺和L-脯氨酸(1∶1)的共晶体，其通过包含以下峰的X射线粉末衍射图来表征：8.52、16.33、19.50和21.22°2θ±0.20°2θ，如使用波长为的Cu-Kα1辐射在衍射仪上确定的。
根据另一个实施方案，本公开内容涉及包含本文中所述的任何一种共晶体形式的药物组合物。该组合物还包含可药用固体载体。在一些实施方案中，组合物还包含一种或更多种另外的共晶体形式。
本公开内容的另一个实施方案是用于抑制对象中的热激蛋白90(Hsp90)的方法。该方法包括向对象施用治疗有效量的本文中所述的共晶体。
本公开内容还体现在用于在患有神经退行性病症的对象中治疗或预防神经退行性病症的方法中。该方法包括向对象施用治疗有效量的本文中所述的共晶体。在一些实施方案中，神经退行性病症是糖尿病性周围神经病(DPN)。
或者，根据其他实施方案，本公开内容提供了用于在患有1型或2型糖尿病的对象中预防糖尿病性周围神经病的发生或者降低发生糖尿病性周围神经病的可能性的方法。该方法包括向对象施用治疗有效量的本文中所述的共晶体。
根据另一个实施方案，本公开内容提供了用于制造B型共晶体的方法。该方法包括以下步骤：将C1-6-烷基醇中的摩尔比为约1∶1至约1∶2的N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺(4a)和L-脯氨酸的组合加热至第一温度以得到溶液。然后将溶液冷却至不高于约30℃的第二温度，从而得到共晶体的浆状物，然后将浆状物在第二温度下搅拌约72小时或更短的时间。
另一个实施方案是制备D型共晶体的方法。该方法包括将EtOH或乙腈中的摩尔比为约1∶1的N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺(4a)和L-脯氨酸的组合加热至第一温度，然后将溶液冷却至不高于约30℃的第二温度，从而得到共晶体的悬浮液。然后将悬浮液在第二温度下搅拌约72小时或更短的时间。
本公开内容体现在用于制备C型共晶体的另一种方法中。该方法包括(a)任选地将等摩尔量的N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺(4a)和L-脯氨酸在EtOH中回流以得到溶液，并将溶液冷却至不高于约30℃的温度，从而得到固体产物。然后将步骤(a)的产物，或在其他情况下摩尔比为约1∶1的N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺(4a)和L-脯氨酸的组合在不高于约30℃的温度下在丙酮中搅拌约72小时或更短的时间，从而得到共晶体。
根据另一个实施方案，本公开内容提供了用于制备G型共晶体的方法。该方法包括将摩尔比分别为约1∶1∶20的N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺(4a)、L-脯氨酸和吡嗪在甲基乙基甲酮(MEK)和MeOH的混合溶剂中组合以得到溶液，然后搅拌溶液，从而得到共晶体。
本公开内容另外提供了用于制备如本文中所述的4a/D-脯氨酸的共晶体的方法，该方法包括将C1-6-烷基醇中的摩尔比为约1∶1的N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺(4a)和D-脯氨酸的组合加热至第一温度以得到溶液；将溶液冷却至不高于约30℃的第二温度，从而得到共晶体的悬浮液。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了提高N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺(4a)相对于N-(2-(5-(((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺(4b)在包含4a和4b的组合物中的浓度的方法。该方法包括包括使组合物与脯氨酸在溶剂中接触，并使组合物、脯氨酸和溶剂处于结晶条件下，由此产生4a与脯氨酸的共晶体。主体共晶体(bulk co-crystal)显示出比包含4a和4b的组合物中更高的4a浓度。
附图说明
图1示出了B型的X射线粉末衍射(X-ray powder diffraction，XRPD)图。
图2是B型的差示扫描量热法(differential scanning calorimetry，DSC)曲线。
图3是B型的热重分析(thermal gravimetric analysis，TGA)曲线。
图4是B型的动态蒸汽吸附(dynamic vapor sorption，DVS)曲线。
图5是B型的红外(infrared，IR)光谱。
图6是B型的拉曼光谱。
图7是通过单晶X射线晶体学确定的B型的原子位移椭圆体图。
图8是基于单晶结构确定的B型的计算XRPD图。
图9示出了B型的计算XRPD图(底部迹线)与B型的实验XRPD图(顶部迹线)的比较。
图10示出了C型的X射线粉末衍射(XRPD)图。
图11是C型的热重分析(TGA)曲线。
图12是通过单晶X射线晶体学确定的C型的原子位移椭圆体图。
图13是基于单晶结构确定的C型的计算XRPD图。
图14示出了D型的X射线粉末衍射(XRPD)图。
图15示出了D型的DSC(底部迹线)和TGA(顶部迹线)曲线。
图16是D型的动态蒸汽吸附(DVS)曲线。
图17示出了G型的X射线粉末衍射(XRPD)图。
图18示出了4a/D-脯氨酸共晶体的X射线粉末衍射(XRPD)图。
图19示出了4a/D-脯氨酸共晶体的DSC(底部迹线)和TGA(顶部迹线)曲线。
图20是4a/D-脯氨酸共晶体的动态蒸汽吸附(DVS)曲线。
图21示出了在施用单次经口剂量的材料A(·)和无定形4a(○)后小鼠中4a的平均血浆浓度。
图22示出了在通过经口管饲法施用单次经口剂量的材料A(·)和无定形4a(○)后以及在施用松散填充的胶囊中的材料A和无定形4a(△)后猴中4a的平均血浆浓度。
图23示出了4a/L-脯氨酸共晶体材料A的X射线粉末衍射(XRPD)图。
图24示出了4a/L-脯氨酸共晶体材料A的DSC(底部迹线)和TGA(顶部迹线)曲线。
图25是4a/L-脯氨酸共晶体材料A的动态蒸汽吸附(DVS)曲线。
具体实施方式
定义
在本公开内容全文中使用的缩写、首字母缩写词和术语具有以下含义。
介绍
如上所述，对novologue 4的研究突出了该化合物在不依赖Hsp70的对Hsp90的抑制中的优异效力(Kusuma(2012)和Ma(2015))。研究揭示了该化合物合成的潜在缺点，包括其趋于导致α-异头物4a和β-异头物4b的混合物的趋势以及较低的总产率。此外，虽然所报道的4的柱色谱法纯化方法适用于小规模研究，即使该化合物的纯度为约95％(HPLC)，但该方法对于产生大量药学纯的α-异头物4a用于药物开发还是不切实际的。
因此，本发明人采取了多种结晶策略来分离4a。然而，发明人发现没有条件可以通过结晶将4a与4b分离。
本发明人对无定形4a进行了包含28种共形成物(co-former)的共晶体筛选，并出乎意料地发现L-脯氨酸和D-脯氨酸与α-异头物4a选择性地共结晶。此外，发明人发现，L-脯氨酸和D-脯氨酸是仅有的经测试产生适于确定表征的任何晶体材料的共形成物(参见实施例3)。
共晶体形式
使化合物4与共形成物L-脯氨酸或D-脯氨酸接触出乎意料地导致4a与任一共形成物选择性地共结晶(参见实施例2和10)。以这种方式，共晶体实现了4的量相对于4b高度富集在4a中，例如如通过HPLC测定的。因此，在一个实施方案中，4a与L-脯氨酸的选择性共结晶降低了β-异头物的浓度，并促进了微量杂质的去除。因此，形成4a/L-脯氨酸共晶体将4a的纯度(HPLC)从约90％提高到至少95％、96％、97％或98％。随后的4a/L-脯氨酸共晶体的重结晶进一步将4a的纯度提高到至少97％、98％或99％。
类似地，在其他实施方案中，将4a与4b的起始组合物与D-脯氨酸共结晶，例如以约等摩尔量的4a/4b和D-脯氨酸，得到4a/D-脯氨酸共晶体，其中如通过HPLC测定的，4a的纯度(即浓度)相对于起始组合物中4a的浓度，提高了至少15％、10％、5％或3％。因此，例如，起始组合物4a/4b包含浓度为约93％的4a，并且在与D-脯氨酸共结晶后，所得的共晶体包含浓度为约98％的4a。在一些实施方案中，4a/D-脯氨酸共晶体包含最终纯度为至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的4a。
在其他实施方案中，通过将一定量的α-异头物4a与D-脯氨酸(例如以等摩尔量)接触来纯化，由此产生4a/D-脯氨酸共晶体。主体共晶体中所得的4a浓度比起始量4a中的4a浓度高例如至少1％、2％、3％、4％或5％(HPLC)。这些实施方案中的每一个都预期一次或更多次重结晶的任选步骤，以更进一步提高给定共晶体中4a的纯度。
共结晶还产生了如上文所概述的多种共晶体形式。通过一种或更多种分析技术(包括X射线粉末衍射(XRPD)、差示扫描量热法(DSC)和热重分析(TGA))来识别和区分多种形式。
B型
因此，表示为B型的一个实施方案是摩尔比分别为1∶2的N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺(4a)和L-脯氨酸的共晶体。X射线粉末衍射图包含在14.76、16.86、19.00和21.05°2θ±0.2°2θ处的特征峰，如使用波长为的Cu-Kα辐射在衍射仪上确定的。在一个实施方案中，X射线粉末衍射图还包含在12.14、17.51、18.89和19.41°2θ±0.2°2θ处的峰。根据又一个实施方案，B型还基本上通过其整个X射线粉末衍射图(参见图1)来表征。
B型的DSC曲线是该共晶体的特征，其特征在于它在约211℃下显示出放热。根据一个实施方案，B型通过基本上如图2所示的整个DSC热分析图来表征。
本公开内容还体现在用于制备B型的方法中(参见实施例4)。该方法包括将C1-6-烷基醇中的摩尔比为约1∶1至约1∶2的N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺(4a)和D-脯氨酸的组合加热以得到溶液。在一些实施方案中，4a以纯4a存在，而在其他实施方案中，4a以与β-异头物4b的组合存在，例如由公开的4的合成产生的组合(Kusuma 2012，见上文)。例如，4a以95％、96％、97％、98％或99％(w/w)存在。将该组合物加热至约50℃至约80℃的第一温度。示例性的C1-6-烷基醇包括甲醇、乙醇以及正丙醇和异丙醇。在一个实施方案中，醇是乙醇。根据一个实施方案，方便的第一温度是在标准压力下醇的沸点。因此，例如，当乙醇是所述醇时，第一温度是沸点，即约78℃。
该方法还包括将4a和L-脯氨酸的溶液冷却至不高于约30℃的第二温度，从而得到共晶体的浆状物的步骤。将浆状物在第二温度下搅拌约72小时或更短的时间。在一个实施方案中，将浆状物过滤以分离B型。
D型
本公开内容还体现为分别以1∶2摩尔比存在的4a和L-脯氨酸的共晶体，并表示为D型。D型通过包含以下峰的X射线粉末衍射图来表征：9.20、16.19、18.45和24.51°2θ±0.2°2θ峰，如使用波长为的Cu-Kα辐射在衍射仪上确定的。另一个实施方案涉及在11.83、17.16、20.15和25.34°2θ±0.2°2θ处出现的附加特征峰。D型还由基本上如图14所示的其X射线粉末衍射图来表征。
D型的DSC曲线也是该共晶体的特征，其特征在于它在约212.2℃时表现出吸热，起始温度为约211.2℃。根据一个实施方案，D型通过基本上如图15所示的整个DSC热分析图来表征。
本公开内容的实施方案还涉及用于制备D型的方法。该方法包括将EtOH或乙腈中的摩尔比为约1∶1的N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺(4a)和L-脯氨酸的组合加热至第一温度。在一些实施方案中，4a以纯4a存在，而在其他实施方案中，4a以与β-异头物4b的组合存在，例如由公开的4的合成产生的组合(Kusuma 2012，见上文)。例如，4a以95％、96％、97％、98％或99％(w/w)存在。第一温度是在约70℃至约85℃的范围内选择的温度。例如，通过使组合物回流，即在约82℃的乙腈沸点下，可达到适宜的温度。
该方法还包括以下步骤：将溶液冷却至不高于约30℃的第二温度，从而得到共晶体的悬浮液，然后将该悬浮液在第二温度下搅拌约72小时或更短的时间。根据一个实施方案，例如将悬浮液过滤以分离D型。
C型
本公开内容还体现为分别以1∶1∶1摩尔比存在的4a和L-脯氨酸的共晶体的丙酮溶剂化物，并将其表示为C型(参见实施例6)。该共晶体通过包含以下峰的X射线粉末衍射图来表征：14.64、17.53、18.91和21.33°2θ±0.2°2θ，如使用波长为的Cu-Kα辐射在衍射仪上确定的。更具体地，根据另一个实施方案，X射线粉末衍射图包含在12.10、15.14、18.26和19.56°2θ±0.2°2θ处的附加峰。作为C型的特征的这些峰和附加峰在基本上如图10所示的其X射线粉末衍射图中展示。
C型还通过参考其TGA热分析图来表征，所述TGA热分析图包括在约150℃至约220℃下完成的重量损失步骤。一个实施方案描绘了C型的TGA热分析图，基本上如图11所示。
通过根据本公开内容的多种实施方案的方法制备C型。因此，在一个实施方案中，该方法包括将EtOH中的等摩尔量的N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺(4a)和L-脯氨酸回流以得到溶液，然后将溶液冷却至不高于约30℃的温度，从而得到固体产物。然后将固体产物在不高于约30℃的温度下在丙酮中搅拌约72小时或更短的时间，从而得到C型。
或者，将摩尔比为约1∶1的4a和L-脯氨酸的组合在丙酮中于不高于约30℃的温度下搅拌约72小时或更短的时间，从而得到C型。在这些实施方案中的任何一个中，4a以纯4a或以与β-异头物4b的组合存在，例如由公开的4的合成所产生的。在另一个实施方案中，分离C型，例如通过过滤。
G型
本公开内容还涉及作为甲基乙基甲酮和吡嗪的溶剂化物存在的4a和L-脯氨酸的共晶体，并且被表示为G型(参见实施例9)。如实施例中所述，G型的XRPD索引与摩尔比为1∶1的4a：L-脯氨酸一致，但该索引无法区分大小相当的MEK和吡嗪分子，使得确定的溶剂量难以通过这种分析技术建立。然而，G型的质子NMR分析确定了4a、L-脯氨酸、MEK和吡嗪的摩尔比分别为约1∶1.2∶0.6∶0.1。因此，G型通过其XRPD衍射图来表征，该图的特征峰在10.42、14.62、19.28和21.14°2θ±0.2°2θ处，如使用波长为的Cu-Kα辐射在衍射仪上确定的。另一个实施方案在11.85、14.93、17.40和19.28°2θ±0.2°2θ处提供附加峰。G型也可以通过基本上如图17所示的其完整的XRPD衍射图来表征。
根据另一个实施方案，G型的XRPD分析还建立了表征共晶体的晶胞参数。因此，参数为α＝90°、β＝108.56°、并且γ＝90°。
本公开内容还涉及用于制备G型的方法。该方法包括将甲基乙基甲酮(MEK)和MeOH的混合溶剂中的摩尔比分别为约1∶1∶20的N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺(4a)、L-脯氨酸和吡嗪组合以得到溶液。在一些实施方案中，4a以纯4a存在，而在其他实施方案中，4a以与β-异头物4b的组合存在，例如由公开的4的合成产生的组合(Kusuma 2012，见上文)。例如，4a以95％、96％、97％、98％或99％(w/w)存在。通常，混合溶剂体现在MEK相对于MeOH过量。因此，MEK与MeOH的示例性比为约9∶1(v/v)。然后搅拌溶液，从而得到G型。
材料A
本公开内容的另一个实施方案是摩尔比分别为1∶1的4a和L-脯氨酸的共晶体，并表示为材料A。材料A通过包含以下峰的X射线粉末衍射图来表征：8.52、16.33、19.50和21.22°2θ±0.20°2θ，如使用波长为的Cu-Kα1辐射在衍射仪上确定的。另一个实施方案涉及在9.19、13.22、14.75和17.57°2θ±0.2°2θ处出现的附加特征峰。材料A还通过基本上如图23所示的其X射线粉末衍射图来表征。
根据另一个实施方案，材料A的XRPD分析还建立了表征共晶体的晶胞参数。因此，参数为：α＝90°、β＝90°、并且γ＝90°。
材料A的DSC曲线也是该共晶体的特征，其特征在于其在约145℃下表现出吸热。根据一个实施方案，材料A通过基本上如图24所示的整个DSC热分析图来表征。
另外，材料A通过参考其TGA热分析图来表征，所述TGA热分析图包括在约160℃至约230℃下完成的重量损失步骤。一个实施方案描绘了材料A的TGA热分析图，基本上如图24所示。
4a/D-脯氨酸共晶体
在另一个实施方案中，本公开内容还提供了以1∶1摩尔比存在的4a和D-脯氨酸的共晶体(参见实施例11)。共晶体通过其XRPD衍射图来表征，该图的特征峰在11.77、14.52、19.54和21.23°2θ±0.20°2θ处，如使用波长为的Cu-Kα1辐射在衍射仪上确定的。其他特征峰出现在8.45、13.18、16.95和19.12°2θ±0.2°2θ处。作为共晶体的特征的这些峰和附加峰在基本上如图18所示的其X射线粉末衍射图中展示。
4a/D-脯氨酸晶体的DSC曲线也是该共晶体的特征，其特征在于其在约130℃下表现出吸热。根据一个实施方案，该共晶体通过基本上如图19所示的整个DSC热分析图来表征。
所述共晶体另外通过参考其TGA热分析图来表征，所述TGA热分析图包括两个重量损失步骤，分别在约150至160℃和约230℃结束。一个实施方案描绘了共晶体的TGA热分析图，基本上如图19所示。
本公开内容还提供了用于制备4a/D-脯氨酸晶体的方法。该方法包括以下步骤：(a)将C1-6-烷基醇中的摩尔比为约1∶1的N-(2-(5-(((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-甲氧基-6，6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1，1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺(4a)和D-脯氨酸的组合加热至第一温度以得到溶液；以及(b)将溶液冷却至不高于约30℃的第二温度，从而得到共晶体的悬浮液。在一些实施方案中，4a以纯4a存在，而在其他实施方案中，4a以与β-异头物4b的组合存在，例如由公开的4的合成产生的组合(Kusuma 2012，见上文)。例如，4a以95％、96％、97％、98％或99％(w/w)存在。
纯化方法
根据一个实施方案，4a与L-脯氨酸和D-脯氨酸选择性共结晶这一出乎意料的发现产生了用于从大量4中纯化4a的方法。也就是说，4a与脯氨酸的共结晶富集了4a/·脯氨酸共晶体的主体样品中4a相对于4b的浓度。提高4a浓度的方法首先考虑了4a和4b的起始组合物。该起始组合物可以是由公开的4的合成产生的或通过有机合成领域的技术人员已知或合理考虑的可导致4的许多替选合成途径之一产生的主体固体。或者，起始组合物可以是由其他纯化方法(例如柱色谱法)产生的主要为4a的主体固体。发明人在这方面出乎意料地发现4a违反了所有的结晶尝试；实际上，在任何条件下都没有观察到4a以结晶形式存在。在任何这些实例中，起始组合物至少包含一些量的4b，例如0.5％至约10％(w/w)。
将摩尔过量的脯氨酸，例如一至约两个当量，与起始组合物在溶剂中组合。在一些实施方案中，脯氨酸是L-脯氨酸，在其他实施方案中，脯氨酸是D-脯氨酸。可以使用L-脯氨酸和D-脯氨酸的混合物。能够基本上溶解脯氨酸和起始组合物的任何溶剂都适用于该目的。示例性溶剂，例如本文中所述的任何溶剂，包括C1-C6-烷基醇，例如甲醇和乙醇。在该方法的一些实施方案中，有利的是通过对起始组合物、脯氨酸和溶剂混合物进行加热来促进溶解。为此目的合适的温度是溶剂的回流温度。
然后使起始组合物、脯氨酸和溶剂的组合经受结晶条件以实现4a与脯氨酸的共结晶。在本文中，多种结晶技术是可用的，例如本文中所述的任何技术。在示例性的实施方案中，使起始组合物和脯氨酸的温热溶液冷却至室温。可以采用外部冷却措施将溶液冷却到室温以下，以促进共结晶。作为替代或组合，使溶剂缓慢蒸发。这些手段中的任何一种，单独或相互结合，都会破坏溶液的平衡，从而导致结晶。
所得的4a与脯氨酸的主体共晶体由此相对于起始组合物中4a的浓度而富含4a。相应的4b浓度降低。另外，该方法纯化4a与其他杂质分离。用于量化4a浓度的方便方法是通过HPLC，尽管任何能够分解和量化混合物中存在的组分的分析技术都适用于此目的，包括在手性固定相上进行气相色谱法(gas chromatography，GC)。因此，例如，主体共晶体中4a的浓度比起始组合物中高约3％至约20％，或约5％至约15％(w/w)。或者，相对于主体起始组合物中4a的浓度，主体共晶体中4a的提高为至少约5％、约10％或约15％(w/w)。因此，例如，如通过HPLC测定的，起始组合物4包含约93％的4a和约6％的4b(参见实施例10(A))。按照如本发明方法所描述的与L-脯氨酸共结晶后，所得主体共晶体中4b的量降低至约2.5％。在这些实施方案中的任何一个中，随后的4a/脯氨酸共晶体的重结晶可以进一步降低主体材料中4b的量。
就其特征峰而言，本公开内容涉及例如XRPD图的图。对于给定的共晶体形式，这些峰的组合是唯一的，这在单个仪器和实验条件引起的不确定性内。因此，例如，每个XRPD峰都是以2θ角公开的，该角度具有可接受的±0.2°2θ不确定度，因此可以理解，该不确定度内的特征峰方差决不会削弱具有其特征峰的相应组合的共晶体形式的同一性。
药物组合物
本公开内容还考虑了包含如本文中所述的共晶体的药物组合物作为另一个实施方案。如在实施例中所解释的，本发明的共晶体出乎意料地显示出比单独的4a，即作为无定形固体大得多的生物利用度。因此，相对于包含无定形4a的制剂，可以将药物组合物配制成包含更低浓度的共晶体以实现治疗上相同的效果。通过本发明的共晶体的这一益处，药物组合物中治疗有效量的共晶体提供约0.1mg至约1000mg的剂量，根据对象的体重根据需要进行调节。典型的剂量可以从每天约0.01mg/kg至约100mg/kg变化。
根据药物配混的公认实践，药物组合物还包含一种或更多种可药用赋形剂、稀释剂、辅料、稳定剂、乳化剂、防腐剂、着色剂、缓冲剂或风味赋予剂，它们合计构成可药用载体。通常，药物组合物用常规材料和技术例如混合、共混等制备。原则上，可药用载体可以是液体，只要该共晶体保持组成稳定性和结构稳定性即可，例如通过不溶解在该载体中。然而，通常，可药用载体以及因此整个组合物是固体。
根据一些实施方案，药物组合物还包含如本文中公开的一种或更多种另外的共晶体。例如，组合物包括两种形式、三种形式或四种形式。一种示例性的组合物包括B型和D型。二元组合物，即仅包含两种形式的那些，以约0.05∶1至约1∶0.05的多种重量比提供形式。也可以考虑中间的比和范围，例如0.2∶1至约1∶0.2，以及0.5∶1至约1∶0.5。
对于片剂组合物，将本发明的共晶体与无毒的可药用赋形剂混合用于制造片剂。这样的赋形剂的实例包括但不限于：惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒和崩解剂，例如玉米淀粉或藻酸；黏合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，也可以通过已知的包衣技术进行包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在所需的时间内提供持续的治疗作用。例如，可以使用延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
经口使用的制剂也可以以硬明胶胶囊剂存在，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者以软明胶胶囊剂存在，其中活性成分与水或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。这些制剂以及本文中所述的所有其他液体制剂均受到以上所述的限制，以保持固体共晶体的组成和结构完整性。
根据下述实施方案，药物组合物以悬浮剂存在。所述实施方案涉及“稳定悬浮剂”，意味着即使与悬浮剂的其他组分接触，即通过不溶解在悬浮剂的液体赋形剂中，不会转化为另一种共晶体或无定形形式，或者二者，给定的共晶体或共晶体的组合也保持其特征，例如XRPD峰。
对于水性悬浮剂，将本发明的共晶体与适合于保持稳定悬浮剂的赋形剂混合。这样的赋形剂的实例包括但不限于羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、氢丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶。
经口悬浮剂也可以包含分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如十七碳乙烯氧基十六烷醇，或环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇一油酸酯，或环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯。水性悬浮剂还可包含一种或更多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)、-种或更多种着色剂、一种或更多种矫味剂，和一种或更多种甜味剂(例如蔗糖或糖精)。
油性悬浮剂可以通过将活性成分混悬在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或矿物油(例如液体石蜡)中来配制。油性悬浮剂可包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。
可以添加例如上述那些的甜味剂以及矫味剂以提供可口的经口制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸来保存。
适用于通过添加水来制备水性悬浮剂的可分散粉末剂和颗粒剂可以提供与分散剂或润湿剂、助悬剂和一种或更多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散剂或润湿剂和助悬剂由上面已经提到的那些例示。也可以存在其他赋形剂，例如甜味剂、矫味剂和着色剂。
本发明的药物组合物也可以是水包油(oil-in-water)乳剂的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡，或者这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯胶或黄蓍胶；天然存在的磷脂，例如大豆，卵磷脂；以及来源于脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨糖醇一油酸酯和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯。乳剂还可以包含甜味剂和矫味剂。
糖浆剂和酏剂可以与甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖一起配制。这样的制剂还可以包含缓和剂、防腐剂以及矫味剂和着色剂。药物组合物可以是无菌注射剂、水性悬浮剂或油性悬浮剂的形式。该悬浮剂可以根据已知技术使用上面已经提到的那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂也可以是在无毒、亲代可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂或悬浮剂，例如在1，3-丁二醇中的溶液剂。可以使用的可接受的载剂和溶剂是水、林格液和等张氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，发现脂肪酸例如油酸可用于注射剂的制备中。
本发明的共晶体还可以以栓剂的形式施用，用于直肠施用该共晶体。这些组合物可通过将共晶体与合适的无刺激性赋形剂混合而制备，该赋形剂在常温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中融化以释放共晶体。这种材料的实例是可可脂和聚乙二醇。
用于肠胃外施用的组合物在无菌介质中施用。取决于所用的载剂和制剂中共晶体的浓度，肠胃外制剂可以是共晶体的悬浮剂，条件是共晶体的粒度分布适合于这种施用方式。辅料，例如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以添加至肠胃外组合物。
使用方法
如所附实施例所证明的，由本发明的共晶体赋予的一个出乎意料的优点是能够以非常高的非对映体纯度和化学纯度制造大量的4a。这对于开发符合例如美国食品药品管理局颁布的《良好生产规范》(Good Manufacturing Practice，GMP)法规的4a尤为重要。相比之下，无定形4a的合成需要后续且费力的分离技术，例如色谱法-如上所述，所有结晶尝试均未成功-其仍无法有效地分离出用于GMP目的的高化学纯度和非对映体纯度的4a。由于这些原因，本发明的共晶体及其制备方法提供了大量的4a，其可用于临床试验和商业化努力。
本发明的共晶体的另一个优点在于与无定形4a相比，来自该共晶体的4a具有出乎意料的高生物利用度。更具体地，与相同剂量的无定形4a相比，在体内施用共晶体可将4a的生物利用度提高约1.5至2倍(参见实施例12和13)。本发明的共晶体的这一特征是更加出乎意料的，这是鉴于一般观察到的无定形形式的药物比其晶体对应体显著更易溶并因此具有更高的生物利用度，并且本发明实际上与之相反。参见，B.C.Hancock et al.，Pharm.Res.17(4)(2000)397-404；B.C.Hancock et al.，J.Pharm.Sci.86(1)(1997)1-12。
鉴于这些优点，本发明还涉及任何共晶体形式，包括其药物组合物，用于在患有神经退行性病症的对象中治疗或预防神经退行性病症中的用途。这种神经退行性病症的非限制性实例包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateralsclerosis，ALS)、亨廷顿病、脊髓性肌萎缩、脊髓小脑共济失调和共济失调形式、以及包括运动神经元疾病在内的脱髓鞘神经病症。另外，共晶体形式及其药物组合物可用于治疗糖尿病性神经病(包括其疼痛和敏感形式二者)和其他形式的神经病，包括非糖尿病引起的神经性疼痛。
根据报道的化合物4a在神经元中改善受损的线粒体功能和降低糖尿病神经元中炎性标志物的表达的用途(Ma(2015))，该共晶体形式及其药物组合物还可用于治疗涉及线粒体功能障碍、氧化应激或炎症的神经系统病症。因为糖尿病组织经受明显的氧化应激，所以这些结果表明，本发明的共晶体形式及其药物组合物可用于治疗其他涉及氧化应激和慢性炎症的神经系统病症，包括癫痫、多发性硬化、脊髓损伤和精神障碍，包括精神分裂症、抑郁症、双相障碍(bipolar disorder)、自闭症和相关障碍，以及创伤后应激障碍。所述组合物和共晶体形式可以与其他治疗组合使用，特别是通过其他机制减轻氧化应激、炎症和线粒体功能障碍的治疗。
如本文中所用，术语“神经退行性病症”是指在周围神经系统中或中枢神经系统中发生神经元的进行性丧失的病症。因此，在一个实施方案中，本公开内容提供了通过抑制导致细胞死亡的神经元进行性退化用于抑制对象中Hsp90的方法，例如在神经退行性病症的治疗期间或根据其进行。
本文中所述的方法包括向对象施用治疗有效量的本发明的共晶体。在上述剂量准则内，“治疗有效量”是共晶体的量，其全部或部分抑制病症的进展或者至少部分缓解病症的一种或更多种症状。治疗有效量也可以是预防有效量。治疗有效量将取决于患者的大小和性别、待治疗的病症、病症的严重程度以及所寻求的结果。对于给定的患者和病症，可以通过本领域技术人员已知的方法确定治疗有效量。
在多个实施方案中，方法需要预防神经系统病症。如本文中所用的术语“预防”意指当将本发明的共晶体施用于对象时是有用的，所述对象在施用时尚未被诊断为可能患有该病症但通常预期会发生该病症或处于患该病症之提高的风险中。本发明的共晶体减缓了病症症状的发生，延迟了病症的发作，或完全阻止了对象发生该病症。预防还考虑将共晶体施用于因年龄、家族史、遗传或染色体异常和/或由于存在一种或更多种该病症的生物标志物而易患该病症的对象。
在其他实施方案中，本发明的方法需要“治疗”，这意指在具有病症的至少初步诊断的对象中使用共晶体。因此，本发明的共晶体延迟或减慢了病症的进展。另外，术语“治疗”至少包括与病症有关的症状的改善，其中改善在广义上是指至少减小与所治疗的疾病相关的参数(例如症状)的量级。这样，“治疗”还包括其中病症或至少与之相关的症状被完全抑制的情况，例如，阻止其发生或使其停止，例如终止，从而对象不再患有该病症或者至少不再表征该病症的症状。
在一个实施方案中，神经退行性病症是由例如与糖尿病病症相关的高血糖症引起的感觉神经元糖毒性。例如，对象患有1型或2型糖尿病。更具体地，根据一个实施方案，该神经退行性病症是糖尿病性周围神经病。因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括在患有1型或2型糖尿病的对象中预防糖尿病性周围神经病的发生或者降低发生糖尿病性周围神经病的可能性。
在本发明的方法和用途的上下文中，待用本发明的共晶体治疗的“对象”是动物，并且优选是哺乳动物，例如狗、猫、小鼠、猴、大鼠、兔、马、牛、豚鼠、绵羊。在一个实施方案中，对象是人。
实施例
提供以下非限制性实施例以举例说明本公开的其他实施方案。
例如，根据公开的程序(Kusuma(2012)和美国专利No.9,422,320)获得约95％纯度(HPLC)的无定形4a。
I.一般结晶实验方法
碰撞沉淀(CP)：在给定的摩尔比和搅拌下，在多种溶剂或具有多种共形成物的溶剂体系中制备4a溶液。在搅拌下分配多种抗溶剂的等分试样，直到发生沉淀。将混合物搅拌指定的时间。在规定的情况下，采用了另外的结晶技术。
快速蒸发(FE)：在给定的摩尔比和搅拌下，在具有多种共形成物的多种溶剂中制备4a的溶液。除非另有说明，否则允许每种溶液在环境条件下从敞开的小瓶中蒸发。允许溶液蒸发至干，除非指定为部分蒸发(固体存在，同时残留少量溶剂)，在这种情况下，通过所规定的方法分离固体或如所规定的使用另外的结晶技术。
手动研磨：将称量的4a和多种共形成物转移到玛瑙研钵中。将少量给定的溶剂添加到固体中，并用玛瑙杵将混合物手动研磨给定的时间。
研磨：将称量的4a和给定的共形成物转移到玛瑙研磨容器中。将少量给定的溶剂和玛瑙研磨球添加到容器中，然后将该容器与Retsch磨机连接。将混合物以30s-1研磨持续规定时间。在循环之间将固体从罐壁上刮下。
反应结晶(RC)：通过将一种组分的固体添加到第二组分的溶液中，在给定的溶剂中制备4a与多种共形成物的混合物。当添加足够的固体以使溶液包含不同浓度的每种组分(一种组分相对于另一种组分的摩尔浓度通常相差10至20倍)时，可将溶液搅拌延长的时间。如果规定的话，如果没有沉淀发生，则添加另外的更浓缩组分的固体，并且将混合物再次搅拌延长的时间。分离并分析任何沉淀的固体。
缓冷(SC)：在升高的温度和搅拌下，在给定的摩尔比下，在具有多种共形成物的多种溶剂体系中制备4a的浓缩溶液。将每个小瓶加盖并留在热板上，然后关闭热板以使样品缓慢冷却至环境温度。如果冷却至环境温度后不存在固体，则将样品放入冰箱(约2至8℃)和/或冷冻器(约-10至-25℃)中进行进一步冷却。如果不存在固体，则如指定的使用其他结晶技术。
缓慢蒸发(SE)：以给定的摩尔比，在具有多种共形成物的多种溶剂体系中制备4a的溶液。使每种溶液在环境条件下在覆盖有穿有小孔的铝箔的小瓶中蒸发。除非指定为部分缓慢蒸发(其中部分溶剂蒸发)，否则将溶液蒸发至干。通过所规定的技术分离所得的固体，或在规定的情况下使用另外的结晶技术。
浆状物实验：通过在环境条件下将足够的固体添加到给定的溶剂体系中使得存在不溶的固体，来制备具有所述摩尔比的具有多种共形成物的4a悬浮液。然后将混合物在所述条件下在密封小瓶中搅拌(通常通过搅拌)延长的时间。通过所述技术收集固体，或在规定的情况下采用另外的结晶技术。
蒸汽扩散(VD)：在多种溶剂中制备给定原料(给定形式的4a/L-脯氨酸或规定的4a和L-脯氨酸的化学计量混合物)的浓缩溶液。在某些情况下，溶液通过0.2-μm的尼龙滤器进行过滤。将每种溶液分配到一个小瓶中，然后将其放入包含给定抗溶剂的大瓶中。在规定的情况下，将给定4a/L脯氨酸形式的晶种(seed)添加到溶液中。将小瓶保持未加盖，将大瓶盖上盖子，以使蒸汽发生扩散。在规定的情况下，尝试了另外的结晶技术。
真空过滤：通过真空过滤将固体收集在纸或尼龙滤器上，并在减压下短暂地在滤器上空气干燥，然后转移到小瓶中。
相互转化的浆状物：通过在规定的温度下将固体添加至给定的溶剂体系中，来制备给定的原料(给定的4a/L-脯氨酸形式或规定的4a和L-脯氨酸的化学计量混合物)的溶液。如果指定了饱和溶液，则将悬浮液在环境温度下搅拌延长的时间，以确保液相饱和。将目的每种给定的4a/L脯氨酸形式的晶种添加到制备的溶液中(或添加到从饱和溶液中滤出的液相中)，使得存在未溶解的固体。然后将每种混合物在密封的小瓶中在规定的温度下搅拌(通常通过搅拌)给定的时间。通过真空过滤分离固体并进行分析。
II.X射线粉末衍射(XRPD)峰鉴定
在整个本公开内容中的是X射线衍射图和具有峰列表的表。选择了最高约30°2θ范围内的峰。使用舍入算法将每个峰舍入到最接近的0.01°2θ。使用专有软件(TRIADSTM v2.0)确定图和列表二者中沿x轴(°2θ)的峰的位置，并舍入到小数点后的两位有效数字。根据USP讨论的X射线粉末衍射变异性中概述的建议(美国药典，USP 38-NF 33至S2，<941>12/1/2015)，将峰位置变异性限制在±0.2°2θ以内。与本文中公开的任何特定测量相关的准确性和精确度尚未确定。此外，在不同仪器上对独立制备的样品进行第三方测量可能会导致变异性大于±0.2°2θ。用于计算d间距的波长为即Cu-Kα1波长(Holzer，G.；Fritsch，M.；Deutsch，M.；Hartwig，J.；Forster，E.Phys.Rev.1997，A56(6)，4554-4568)。根据USP建议在每个d间距处计算与d间距估计值相关的变异性，并在相应的数据表中提供。
根据USP准则，可变的水合物和溶剂合物的峰方差可能大于0.2°2θ，因此0.2°2θ的峰方差不适用于这些材料。
对于仅具有一个XRPD图而没有其他方法来评价该样品是否提供粉末平均值的良好近似的样品，峰表包含仅被标识为“突出峰(Prominent Peak)”的数据。这些峰是整个观察到的峰列表的子集。通过识别优选地具有强强度的不重叠的低角度峰，从观察到的峰中选择突出峰。
在可获得多个衍射图的情况下，则可以评估粒子统计(particle statistics，PS)和/或择优取向(preferred orientation，PO)。在单个衍射仪上分析的多个样品的XRPD图之间的可再现性表明，粒子统计数据是足够的。来自多个衍射仪的XRPD图之间的相对强度的一致性表明良好的取向统计。或者，可以将观察到的XRPD图与基于单晶结构的计算出的XRPD图进行比较(如果可用)。使用面探测器的二维散射图也可以用于评价PS/PO。如果确定PS和PO二者的影响均可以忽略不计，则XRPD图代表样品的粉末平均强度，突出峰可以识别为“代表性峰(Representative Peak)”。通常来说，收集以确定代表性峰的数据越多，则对这些峰的分类越有信心。
“特征峰”在它们存在的程度上是代表性峰的子集，并且用于区分一个结晶多晶型物与另一个结晶多晶型物(多晶型物是具有相同化学组成的结晶形式)。通过评价化合物的一种结晶多晶型物中相对于该化合物的所有其他已知结晶多晶型物存在的代表性峰(如果有的话)在±0.2°2θ以内来确定特征峰。并非化合物的所有结晶多晶型物都必须具有至少一个特征峰。
装置技术
差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry，DSC)：使用TAInstruments Q2000差示扫描量热仪进行DSC。使用NIST可追踪的铟金属进行温度校准。将样品放入铝制Tzero卷曲DSC盘中，盖上盖，并精确记录重量。将配置为样品盘的经称重铝盘放置在晶胞的参考侧。
动态蒸气吸附(Dynamic Vapor Sorption，DVS)：在VTI SGA-100蒸气吸附分析仪上收集动态蒸气吸附数据。NaCl和聚乙烯吡咯烷酮(polyvinypyrrolidone，PVP)用作校准标准。样品在分析之前未干燥。在氮气吹扫下，以10％RH增量在5％至95％RH的范围内收集吸附和解吸数据。用于分析的平衡标准在5分钟内重量变化小于0.0100％，最大平衡时间为3小时。没有针对样品的初始水分含量校正数据。
EasyMaxTM反应器：使用具有Julabo F26冷却器/循环器的Mettler ToledoEasyMaxTM 102进行结晶实验。在磁力搅拌下在20mL玻璃管(加盖)中进行结晶。使用夹套温度(Tj)设置来控制温度。
元素分析：元素分析由Galbraith Laboratories，Knoxville，TN进行。
红外光谱(Infrared Spectroscopy，IR)：在配备有Ever-Glo中/IR外光源、溴化钾(KBr)分束器和氘代硫酸三甘肽(DTGS)检测器的Nicolet 6700傅立叶变换红外(FT-IR)分光光度计(Thermo Nicolet)上获取IR光谱。使用NIST SRM 1921b(聚苯乙烯)进行波长验证。衰减全反射(attenuated total reflectance，ATR)附件(ThunderdomeTM，ThermoSpectra-Tech)与锗(germanium，Ge)晶体用于数据获取。每个光谱代表以4cm-1光谱分辨率收集的256个共加扫描。用干净的Ge晶体获取背景数据集。通过取这两个数据集彼此之比获得Log 1/R(R＝反射率)光谱。
拉曼光谱：在FT-Raman模块上获取拉曼光谱，所述模块与配备有砷化铟镓(ndiumgallium arsenide，InGaAs)检测器的Nexus 670FT-IR分光光度计(Thermo Nicolet)连接。使用硫和环己烷进行波长验证。通过将样品放入颗粒支架中来制备每个样品用于分析。约0.514W的Nd：YVO4激光功率(1064nm激发波长)用于辐照样品。每个光谱代表以4cm-1光谱分辨率收集的256个共加扫描。
单晶X射线衍射(Single Crystal X-Ray Diffraction，SCXRD)：4a/L-脯氨酸形式B和形式C的单晶体结构是在普渡大学(Purdue University)的晶体学实验室测定的。
热重分析法(Thermogravimetry，TGA)：使用TA Instruments 2050或Discovery热重分析仪进行TG分析。使用镍和AlumelTM进行温度校准。将每个样品放在铝或铂盘中，并插入到TG炉中。在氮气吹扫下，以10℃/分钟的加热速率将炉从环境温度加热至350℃。
光学显微镜：在具有以2×或4×物镜的交叉偏振器的Wolfe光学显微镜下，或在具有以0.8×至10×物镜的交叉偏振器的一阶红色补偿器的Leica立体显微镜下观察样品。
溶液1H NMR光谱：溶液1H NMR光谱是由Spectral Data Services of Champaign，IL在25℃下用VarianUNITYINOVA-400光谱仪获得的。将样品溶解在DMSO-d6中。来自未完全氘化的DMSO的残留峰在约2.5ppm处，并且在约3.3ppm处的相对较宽的峰是由于水。
X射线粉末衍射(X-Ray Powder Diffraction，XRPD)
PANalytical X’PERT Pro MPD衍射仪-透射几何(大多数样品)：用PANalyticalX′Pert PRO MPD衍射仪使用Cu辐射的入射光束收集XRPD图，所述Cu辐射的入射光束使用长而精细的聚焦光源产生。使用椭圆渐变的多层反射镜使Cu KαX射线聚焦穿过样本并到达检测器。在分析之前，对硅样本(NIST SRM 640e)进行分析，以验证观察到的Si111峰的位置与NIST认证的位置一致。将样品的样本夹在3μm厚的膜之间，并以透射几何进行分析。使用光束阻挡器、短的防散射延伸和防散射刃口以最小化由空气产生的背景。入射光束和衍射光束的索勒狭缝(Soller slit)用于最小化轴向发散的展宽。使用定位距样本240mm的扫描位置敏感检测器(X’Celerator)和数据收集器软件v.2.2b(Data Collector softwarev.2.2b)收集衍射图。
PANalytical X’PERT Pro MPD衍射仪-反射几何(限量样品)：用PANalytical X’Pert PRO MPD衍射仪使用Cu Kα辐射的入射光束收集XRPD图，所述Cu Kα辐射的入射光束使用长而精细的聚焦源和镍过滤器产生。衍射仪使用对称的Bragg-Brentano几何进行配置。在分析之前，对硅样本(NIST SRM 640e)进行分析，以验证观察到的Si 111峰的位置与NIST认证的位置一致。将样品的样本制备成以硅零-背景基底为中心的薄圆层。防散射狭缝(Antiscatter slit，SS)用于最小化由空气产生的背景。入射光束和衍射光束的索勒狭缝用于最小化轴向发散的展宽。使用定位距样品240mm的扫描位置敏感检测器(X’Celerator)和数据收集器软件v.2.2b收集衍射图。
HPLC程序
下表示出了本文中所述的HPLC测量的参数和条件。报道的4a和4b的HPLC纯度未考虑针对脯氨酸的峰。
实施例1：4a/L-脯氨酸共晶体(材料A)的合成
通过色谱分离(HPLC：4a，96.4％和4b，1.2％，500mg)获得化合物4a，并将其与EtOH(4mL)中的L-脯氨酸(128mg，1当量)混合。将混合物加热回流15分钟。热溶液过滤通过棉塞。将所得透明滤液缓慢冷却并在室温下保持16小时。通过过滤收集沉淀固体，并在室温下在空气中干燥以得到4a/L-脯氨酸共晶体，其被指定为材料A(456mg，73％产率)，为白色固体。M.P.203-205℃。1H NMR表明4a与L-脯氨酸的比为1∶1.1。
材料A是1∶1 4a/L脯氨酸共晶体，并且其可能是同构溶剂化物。材料A包含较少的基于XRPD图的L-脯氨酸组分(图23)，所述组分已被成功索引(表A1)。对于主要或仅由单结晶相组成的样品，XRPD索引通常是成功的。然而，在了解XRPD图中8.7°、15.0°和18.0°2θ处的次要峰/肩峰与索引溶液不一致，并且可能归因于L-脯氨酸时，针对该混合物获得索引溶液。表A2中示出了从索引溶液中获得的选定晶胞参数。
表A1：针对4a/L-脯氨酸材料A观察到的峰
表A2：4a/L脯氨酸材料A的晶胞参数
晶胞体积足够大以容纳溶剂化的1∶1 4a/L-脯氨酸共晶体。自由体积(或共晶体占据之后剩余的晶胞体积)可能够适合水和/或从中产生材料A的任何溶剂，包括EtOH、IPA和THF。
如上所述的材料A另外由DSC、TGA和DVS表征。该材料的DSC和TGA热分析图的叠加如图24中所示。TGA热分析图显示出两个不同的重量损失步骤，第一个发生在约100℃至160℃(按重量计7％)并且第二个发生在160℃至230℃(按重量计21％)。宽的吸热峰通过DSC观察到，在145℃下具有峰最大，这对应于第一TGA重量损失步骤。这些事件发生的相对较高温度以及重量损失的逐步性质可能表明结合溶剂/水的损失。通过DSC在约170℃至约240℃的叠加吸热事件对应于TGA热分析图中的第二重量损失步骤，可能对应于共晶体的同时熔融和L-脯氨酸组分的挥发。TGA热分析图中在约250℃以上的急剧下降可能对应于分解。
图25中示出了如上所述的材料A的DVS等温线。因为该材料被表征为是具有未反应的L-脯氨酸的混合物，所以尚不清楚过量的L-脯氨酸可能对蒸气吸附行为有什么影响(如果有的话)。该材料在或高于85％RH下表现出明显的吸湿性，在85％至95RH之间吸收了按重量计约6％的蒸气。蒸气吸附动力学平衡在85％至95％RH下超时，表明如果允许更长的平衡时间，则共晶体可潜在地吸收比所测量的更多的水分。相对稳定的重量损失在解吸之后在95％至5％RH之间注意到。解吸之后的重量损失(按重量计约8％)显著高于吸附期间获得的重量损失，表明该材料在分析开始时可能被溶剂化/水合。通过XRPD对后DVS材料的分析显示结晶度降低，尽管固体形式保持完整。由于XRPD图中的紊乱，不能确认后DVS样品中过量L-脯氨酸的存在与否。
实施例2：通过与L-脯氨酸共结晶来纯化4a
将500mg由化合物4a和4b(HPLC：4a 92.0％和4b 7.1％)以及乙醇(4mL)中的L-脯氨酸(128mg，1当量)组成的混合物4回流15分钟。用实施例1中获得的共晶体接种混合物，并且允许混合物冷却并随后在室温下保持18小时。滤出白色固体，同时将剩余固体与母液一起移出反应烧瓶。收集的4a/L-脯氨酸共晶体的量(通过1H-NMR确定的1∶1比，497mg，79％产率)由98.0％4a和1.49％4b组成(通过HPLC分析)。
实施例3：共晶体筛选
无定形4a在约50个共晶体筛选实验中与除L-脯氨酸和D-脯氨酸之外的26种共形成物一起使用，如下表1中所示。使用了多种适合于共晶体形成的结晶技术，包括溶剂辅助研磨和手动研磨、冷却、蒸发、淤浆、崩解沉淀和反应结晶，其中将包含高摩尔过量的一种组分的溶液与另一种组分进行组合以促进反应平衡从而有利于共晶体形成。使用了具有能够形成氢键的官能团的多种共形成物，包括羧酸、氨基酸、糖、酰胺、胺和许多功能性芳族化合物。然而，在该筛选中研究的多种条件和共形成物下，4a并没有与这些常见的共形成物形成任何确认的共晶体。
表1
a，b包含4a和焦谷氨酸的不同批次的非特征结晶材料的种子。
实施例4：4a/L-脯氨酸形式B的制备和表征
将等摩尔量的无定形4a和L-脯氨酸(1∶1)在甲醇中混组合加热至约68℃。允许所得溶液缓慢冷却至室温，此时形成白色混悬液。然后将混悬液在室温下搅拌三天，然后通过过滤收集作为白色固体的形式B并干燥。
或者，将摩尔比为1∶2的无定形4a和L-脯氨酸在乙醇中组合，并加热至约82℃以产生白色混悬液。将混悬液在82℃下保持约5分钟，允许其缓慢冷却至室温，并随后在室温下搅拌三天。通过过滤收集作为白色固体的形式B并干燥。
形式B为无水1∶2的4a/L-脯氨酸共晶体。形式B通过XRPD(具有索引)、DSC、TGA、DVS、拉曼光谱、IR光谱、质子NMR、HPLC和元素分析来表征。
成功地索引了形式B的XRPD图(表2)并且其表明形式B主要或仅由单结晶相组成(图1)。从索引溶液获得的晶胞体积与无水1∶2 4a/L-脯氨酸共晶体一致。下表3示出了晶胞参数。
表2：针对4a/L-脯氨酸形式B观察到的峰
表3：4a/L-脯氨酸形式B的晶胞参数
从MeOH浆料分离的形式B样品通过质子NMR和HPLC表征。质子NMR数据表明没有检测到残留溶剂的1∶2 4a/L-脯氨酸化学计量。如通过HPLC测定的样品中4a的纯度为99.7％。
分别在图2和图3中示出了形式B的DSC和TGA热分析图。由于每种技术分析不同的样品，因此数据分别绘制。通过TGA分析的样品从MeOH浆料中分离，而DSC样品是从MeOH中进行的共晶体形成实验得到的。通过TGA在环境温度和190℃之间几乎没有观察到重量损失，这与无水/非溶剂化材料一致。DSC也与此一致，直到在208℃下开始吸热事件以及叠加强放热事件才显示出明显的热事件。值得注意的是，在进行该分析之后，观察到样品从盘中冒出，可能是放热幅度的原因。这些事件可能对应于共晶体的熔化/解离。类似地，TGA热分析图中在190℃以上的急剧下降可能归因于共晶体中一部分L-脯氨酸组分的挥发，然后可能分解。
为了进一步确认共晶体化学计量，通过C、H、N、F和O元素分析法分析了形式B(表4)。针对1∶1和1∶2共晶体的实验百分比组成值与理论值的比较表明，样品与1∶2的共晶体更紧密地一致。该结果与其他表征数据一致。
表4：4a/L-脯氨酸形式B的元素分析
图4中示出了形式B的动态蒸气吸附(dynamic vapor sorption，DVS)等温线。在5％至95％RH之间注意到了按重量计2.3％的重量增加，其中大部分吸附发生在50％RH以上。所有这些重量在解吸时均损失并注意到较小的滞后。蒸气吸附动力学平衡在85％至95％RH之间的吸附步骤中超时，表明如果允许更长的平衡时间，则共晶体可能潜在地比所测量的吸收更多的水分。通过XRPD对后DVS材料的分析示出形式没有明显变化。
获得了形式B的IR和拉曼光谱并分别在图5和图6中示出。
实施例5：4a/L-脯氨酸形式B的单晶X射线结构测定
数据收集
将尺寸为约0.70×0.45×0.30mm的4a/L-脯氨酸形式B(C34H48FN3O10[C24H30FNO6，2(C5H9NO2)])的无色板以随机定向安装在尼龙环上。在配备有共焦光学元件的Rigaku RapidII衍射仪上，用Cu Kα辐射 进行了初步检查和数据收集。使用SHELX2013(Sheldrick，G.M.Acta Cryst.，2008，A64，112)进行细化。
使用在4°＜θ＜68°范围内的21646反射的设置角度，从最小二乘法细化获得用于数据收集的细胞常数和定向矩阵。来自DENZO/SCALEPACK的细化镶嵌度为0.44°，表明晶体质量良好(Otwinowski，Z.；Minor，W.Methods Enzymol.1997，276，307)。空间组通过程序XPREP(Bruker，XPREPin SHELXTL v.6.12.，Bruker AXS Inc.，Madison，WI，USA，2002)确定。根据以下条件的系统性存在：0k0k＝2n，以及根据随后的最小二乘法细化确定空间组为P21(no.4)。
在室温下收集数据至最大衍射角(2θ)为135.73°。
数据降低
帧(frame)用HKL3000(Otwinowski(1997))集成。总共收集了21646个反射，其中5936个是唯一的。将Lorentz和极化校正应用于数据。Cu Kα辐射的线性吸收系数为0.833mm-1。应用了使用SCALEPACK(Otwinowski(1997))的经验吸收校正。透射系数为0.128至0.779。应用二次消光校正(Sheldrick(2008))。以最小二乘法细化的最终系数为0.0157(11)(以绝对单位)。对等效反射强度进行平均。基于强度平均的一致因子为4.1％。
结构解析和细化
通过使用SHELXT(Sheldrick(2008))的直接方法解析结构。剩余原子位于后续的差分傅立叶合成中。氢原子被包含在细化中，但被限制跨置在其所键合的原子之上。通过使函数最小化，以全矩阵最小二乘法改进结构：
∑w(|Fo|2-|Fc|2)2
权重w定义为1/[σ2(Fo 2)+(0.0640P)2+(0.5095P)]，其中P＝(Fo 2+2Fc 2)/3。
散射因子取自“国际晶体学表”(International Tables for Crystallography，Vol.C，Kluwer Academic Publishers：Dordrecht，The Netherlands，1992，表4.2.6.8和6.1.1.4)。在细化中使用的5936个反射中，仅Fo 2＞2σ(Fo 2)的反射被用于计算拟合残差(fitresidual)R。在计算中总共使用了5601个反射。细化的最终循环包含490个可变参数，并且用以下未加权和加权的一致因子进行收敛(最大参数移位＜0.01倍的其估计标准偏差)：
R＝∑|Fo-Fc|/∑Fo＝0.0422
单位重量观察到的标准偏差(拟合优度)为1.062。最终差分傅立叶中的最高峰的高度为最小负峰的高度为
经计算X射线粉末衍射(XRPD)图
使用Mercury(Macrae，C.F.Edgington，P.R.McCabe，P.Pidcock，E.Shields，G.P.Taylor，R.Towler M.and van de Streek，J.；J.Appl.Cryst.，2006，39，453-457)以及来自单晶体结构的原子坐标、空间组和晶胞参数，生成了针对Cu辐射的经计算XRPD图。
原子位移椭圆体和堆积图
使用Mercury(Macrae(2006))制备原子位移椭圆体图。原子由50％概率的各向异性热椭圆体表示。用Mercury(Macrae(2006))生成包装图和另外的图。氢键表示为虚线。用PLATON(Spek，A.L.PLATON.Molecular Graphics Program.Utrecht University，Utrecht，The Netherlands，2008；Spek，A.L，J.Appl.Cryst.2003，36，7)进行手性中心的评估。使用分子手性规则的规范(Cahn，R.S.；Ingold，C；Prelog，V.Angew.Chem.Intern.Ed.Eng.，1966，5，385；Prelog，V，Helmchen，G.Angew.Chem.Intern.Ed.Eng.，1982，21，567)评价绝对构型。
结果
单斜晶胞参数和计算体积为： β＝109.309(2)°(α＝γ＝90°)，形式B晶体结构中不对称单元的式量(formula weight)为677.75g mol-1，Z＝2，所得计算密度为1.313gcm-3。确定的空间组为P21(no.4)。表5中提供了晶体数据和晶体学数据收集参数的总结。
表5 4a/L-脯氨酸形式B的晶体数据和数据收集参数
aOtwinowski，Z.；Minor，W.Methods Enzymol.1997，276，307.
bFlack，H.D.Acta Cryst.，1983A39，876.
cHooft，R.W.W.，Straver，L.H.，and Spek，A.L.J.Appl.Cryst.，2008，41，96-103.
空间组和晶胞参数与从形式B的XRPD分析获得的那些一致(参见上表3)。
所获得结构的质量高，如由拟合残差R为0.0422(4.22％)所指示。引用R值为0.02至0.06用于最可靠确定的结构(Glusker，Jenny Pickworth；Trueblood，KennethN.Crystal Structure Analysis：A Primer，2nd ed.；Oxford University press：NewYork，1985；p.87)。
图7中示出了形式B的原子位移椭圆体图。在单晶体结构的不对称单元中观察到的分子与所建议的4a分子结构一致。图7中所示的不对称单元包含一个4a分子和两个L-脯氨酸分子，与1∶2 4a：L-脯氨酸化学计量一致。两个质子独立地在两个脯氨酸氮原子上定位并细化，表明是两性离子。两个L-脯氨酸分子在两个位置上无序排列，细化至82/18％和71/29％占据。
可通过分析晶体对异常X射线的散射来确定绝对结构。细化参数x，称为Flack参数(Flack，H.D.；Bernardinelli，G.，Acta Cryst.1999，A55，908；Flack，H.D.；Bernardinelli，G.，J.Appl.Cryst.2000，33，1143；Flack，H.D.Acta Cryst.1983，A39，876；Parsons，S.，Flack，H.D.，Wagner，T.，Acta Cryst.2013，B69，249-259)编码倒位孪晶中这两种组分的相对丰度。该结构包含细化中模型的分数1-x及其倒位x。假设获得了低的标准不确定性，如果解析的结构正确，则Flack参数应接近0，并且如果逆模型正确，则Flack参数应接近1。图7中所示的形式B结构的测量Flack参数为-0.02，标准不确定度为0.11，这表明反分辨力弱，并且因此不能对Flack参数进行解释。标准不确定度中的误差阻止仅基于Flack因子的分配。
Flack参数(x)的细化没有导致关于绝对结构分配的定量陈述。然而，将贝叶斯统计应用于Bijvoet差异的方法可为绝对结构的不同假设提供一系列概率(Hooft，R.W.W.，Straver，L.H.，and Spek，A.L.J.Appl.Cryst.，2008，41，96-103；Bijvoet，J.M.；Peerdeman，A.F.；van Bommel A.J.Nature 1951，168，271)。除绝对结构正确、不正确或为外消旋孪晶的概率之外，该分析还提供了Flack等效(Hooft)参数。对于目前的数据集，Flack等效(Hooft)参数确定为-0.02(5)，结构正确的概率为1.000，结构不正确的概率为0.9×10-91，并且材料是外消旋孪晶的概率为0.2×10-24。因此，图7中模型的绝对配置是正确的。该结构包含在4a上位于C7、C9、C11和C12的四个手性中心(图7)，其分别以R、R、S和R构型键合，并且在C26和C31二者的每个脯氨酸分子上的一个手性中心均以S构型键合。
图8示出了从单晶体结构生成的形式B的经计算XRPD图。形式B的先前索引的实验XRPD图(实施例4)在上文示出，并且与经计算XRPD图一致(图9)。
实施例6：4a/L-脯氨酸形式C的制备和表征
将等摩尔量的无定形4a和L-脯氨酸(1∶1)浆化，并随后在室温下于丙酮中搅拌3天。过滤浆料以收集作为白色固体的形式C。
还通过将等摩尔量的无定形4a和L-脯氨酸溶解在EtOH中来制备形式C。然后通过蒸汽扩散(vapor diffusion，VD)将丙酮引入溶液中以沉淀形式C。
数据表明尽管丙酮不参与氢键，但是形式C由1∶1的共晶体和1摩尔存在于晶格中的丙酮组成。单晶体数据提供了化学和固相组成的确认。
成功索引了形式C的XRPD图(图10)并且观察到的峰示于表6。
表6：针对4a/L-脯氨酸形式C观察到的峰
来自XRPD索引的晶胞参数在下表7中示出：
表7：4a/L-脯氨酸形式C的晶胞参数
形式C的TGA热分析图显示逐步重量损失，这与该材料由丙酮溶剂化物组成的发现一致(图11)。丙酮似乎在两个单独的步骤中挥发。在第一步骤中，在约60℃至150℃之间观察到2.6％的重量损失。假设挥发物为丙酮，则按重量计2.6％对应于0.26摩尔(或约1/4的每个单晶体结构的总丙酮)。在150℃至220℃之间的第二重量损失步骤对应于6.7％重量损失，或者如果假设丙酮是唯一的挥发物，则对应于0.70mol。
实施例7：4a/L-脯氨酸形式C的单晶体X射线结构测定
将尺寸约为0.19×0.18×0.10mm的C32H45FN2O9[C24H30FNO6，C5H9NO2，C3H6O]无色板以随机定向安装在纤维上。在配备有共焦光学元件的Rigaku Rapid II衍射仪上，用Cu Kα辐射进行初步检查和数据收集。使用SHELX2013(Sheldrick(2008))进行细化。
使用在4°＜θ＜59°范围内的12615个反射的设置角度，从最小二乘法细化获得用于数据收集的细胞常数和定向矩阵。来自DENZO/SCALEPACK的细化镶嵌度为0.25°，表明晶体质量良好(Otwinowski(1997))。通过程序XPREP(Bruker(2002年))确定空间组。根据以下条件的系统性存在：0k0k＝2n，以及随后的最小二乘法细化，确定该空间组为P21(no.4)。
在室温下收集数据至最大衍射角(2θ)为117.84°。
帧用HKL3000(Bruker(2002))集成。总共收集了12615个反射，其中4368个是唯一的。将Lorentz和极化校正应用于数据。Cu Kα辐射的线性吸收系数为0.788mm-1。应用了使用SCALEPACK(Bruker(2002))的经验吸收校正。透射系数为0.060至0.924。应用了二次消光校正(Sheldrick(2008))。以最小二乘法细化的最终系数为0.0049(7)(以绝对单位)。对等效反射强度进行平均。基于强度平均的一致因子为4.8％。
以类似于以上实施例5的方式进行结构解析和细化。在细化中使用的4368个反射中，仅Fo 2＞2σ(Fo 2)的反射被用于计算拟合残差R。计算中总共使用了3518个反射。细化的最终循环包含417个可变参数，并且用以下未加权和加权的一致因子收敛(最大参数移位＜0.01倍的其估计的标准偏差)：
R＝∑|Fo-Fc|/∑Fo＝0.0535
单位重量观察到的标准偏差(拟合优度)为1.078。最终差分傅立叶中的最高峰的高度为最小负峰的高度为
根据实施例5中的程序生成了经计算XRPD图和原子位移椭圆体图。
单斜晶胞参数和计算体积为： β＝107.937(4)°(α＝γ＝90°)，形式C晶体结构中不对称单元的式量为620.70g mol-1，Z＝2，所得计算密度为1.252g cm-3。确定该空间组为P21(no.4)。表8中提供了晶体数据和晶体学数据收集参数的总结。空间组和晶胞参数与先前通过XRPD索引获得的那些(实施例6)一致。
表8 4a/L-脯氨酸形式C的晶体数据和数据收集参数
aOtwinowski(1997).
bFlack(1983).
cHooft(2008).
图12中示出了形式C的原子位移椭圆体图。在单晶体结构的不对称单元中观察到的分子与所提出的4a/L-脯氨酸的分子结构一致。图12中所示的不对称单元包含一个4a分子、一个L-脯氨酸分子和一个丙酮分子。两个质子独立地在脯氨酸氮原子上定位和细化，表明是两性离子。
图13示出了由单晶体结构生成的形式C的经计算XRPD图。如上所述，图10中示出了从中获得晶体的散装材料的实验XRPD图。实验图中的所有峰均以经计算XRPD图表示，表明散装材料可能是单一相。计算的与实验粉末衍射图之间的强度差异通常归因于优选的定向。优选的定向是晶体以某种程度的顺序排列其自身的趋势。样品的这种优选定向可显著影响实验粉末衍射图中的峰强度，但不影响峰位置。
对于目前的数据集，以实施例5中所述的方式确定Flack等效(Hooft)参数，并将其确定为0.09(9)，结构正确的概率为1.000，结构不正确的概率为0.4×10-21以及材料是外消旋孪晶的概率是0.4×10-4。
因此，图12中模型的绝对构型可能是正确的。该结构包含在4a上位于C7、C9、C11和C12的四个手性中心(图12)，其分别以R、R、S、R构型键合；并且在脯氨酸上位于C26的一个手性中心以S构型键合。
实施例8：4a/L-脯氨酸形式D的制备和表征
将等摩尔量的无定形4a和L-脯氨酸在乙腈中混合以得到薄的混悬液，然后将其加热至约85℃。将混悬液冷却至约71℃，用少量实施例1中制备的材料接种，并在约71℃下保持约15分钟。然后允许混悬液缓慢冷却至室温，并随后搅拌三天。过滤所得白色混悬液以产生形式D，然后将其干燥。
还通过以下来制备形式D：将等摩尔量的无定形4a和L-脯氨酸在EtOH中组合，加热至约82℃，并在该温度下保持约15分钟，冷却至约76℃，用少量实施例1中制备的材料接种，缓慢冷却至温度，并搅拌三天。过滤所得灰白色浆料，并在真空下在约48℃下干燥收集的形式D的量。
形式D由无水/非溶剂化的1∶2 4a/L-脯氨酸共晶体组成。形式D的XRPD图已成功索引，表明该材料主要或仅由单结晶相组成(图14，表9)。从索引溶液获得的晶胞体积(表10)与无水1∶2 4a/L-脯氨酸共晶体一致。
表9：针对4a/L-脯氨酸形式D观察到的峰
表10：4a/L-脯氨酸形式D的晶胞参数
通过热技术、质子NMR、HPLC和DVS表征形式D。图15中示出了干燥的形式D的DSC和TGA热分析图的叠加。通过TGA不明显的重量损失高达185℃和通过DSC缺乏广泛的去溶剂化吸热，这与无水/非溶剂化材料一致。在132℃(峰最大)下观察到小的广泛吸热。开始在211℃下的急剧吸热对应于TGA热分析图中按重量计26％的急剧逐步重量损失，这可能对应于共晶体的同时熔融和L-脯氨酸的挥发。
质子NMR数据表明1∶2的4a/L-脯氨酸化学计量检测到按重量计0.2％的残留EtOH。通过HPLC，样品中4a的纯度为99.6％。
图16中示出了针对形式D的DVS等温线。该材料表现出显著的吸湿性，特别是在RH55％以上时，在5％至95％RH之间注意到按重量计4.7％的重量增加。在解吸时所有这些重量均损失，观察到具有较小的滞后。值得注意的是，在85％至95％RH之间的吸附步骤中，蒸气吸附动力学平衡超时，这表明如果允许更长的平衡时间，则共晶体可能潜在地吸收比所测量的更多的水分。
实施例9：4a/L-脯氨酸形式G的制备和表征
通过首先将吡嗪溶解在甲基乙基酮和MeOH(90∶10，v/v)中，分别以1∶20∶1的摩尔比组合无定形4a、吡嗪和L-脯氨酸。将吡嗪溶液添加至4a和L-脯氨酸混合物中，并在室温下搅拌两天以得到不透明的白色混悬液。通过真空过滤混悬液分离形式G。
形式G由MEK溶剂化的4a/L-脯氨酸共晶体组成。形式G展示了由XRPD索引(表11)的独特的结晶图(图17)。
表11：针对4a/L-脯氨酸形式G观察到的峰
从索引XRPD图获得的晶胞体积(表12)与其中存在至多1摩尔MEK或吡嗪的1∶1 4a/L-脯氨酸共晶体一致(MEK和吡嗪分子的体积相当并且不能通过XRPD索引来区分)。晶胞参数(表12)还表明形式G与形式B和C同构。通过质子NMR确认形式G包含以约1∶1.2∶0.6∶0.1摩尔比的4a、L-脯氨酸、MEK和较少残留吡嗪。
表12：4a/L-脯氨酸形式G的晶胞参数
形式B和形式C的单晶体分析表明这些形式是同构的，其中4a和L-脯氨酸形成容纳另外的针对形式B的L-脯氨酸和针对形式C的丙酮的通道。各个通道中的L-脯氨酸和丙酮分子二者均不与构成通道的分子形成氢键。如上所述，针对形式G所获得的空间组和其他晶胞参数表明，其与形式B和C同构。尽管可能是其他解释，但考虑到已知的有关这些形式的分子堆积和通过质子NMR测定的形式G的L-脯氨酸和MEK的非化学计量的等同物，由于通道内缺乏氢键而容易产生交换，形式G中的通道可能以非化学计量(并且可能是可变的)比容纳L-脯氨酸和MEK二者。
实施例10：通过共晶体形成来纯化4a
A.用L-脯氨酸纯化
共结晶4根据上述程序导致形式B和形式D，并从而非常有效地降低了β-端基异构体4b的量。如通过HPLC测定的无定形4的典型批次由93.2％/6.3％的4a/4b组成。在典型实验中的共晶体形成步骤之后，4b的水平从6.3％降低至2.4％(HPLC)。通过将所得4a/L-脯氨酸共晶体与MeOH(2倍体积)混合将其重结晶，并将混合物加热回流3小时。将混合物在2.5小时内冷却至0±3℃，并随后过夜搅拌。通过过滤收集所得固体。重结晶之后，4b的量进一步降低至1.2％，并且4a的纯度提高至98.7％(HPLC)。
B.用D-脯氨酸纯化
如通过HPLC测定的无定形化合物4的单独量包含89.3％的4a和10.1％的4b。在90℃的油浴中加热在EtOH(2.4mL)中的化合物4(300mg，0.670mmol)和D-脯氨酸(77.3mg，0.671mmol)。回流15分钟之后，将所得溶液在小瓶中冷却至室温，并在移去小瓶盖的情况下保持24小时，以使EtOH在室温下缓慢蒸发。通过过滤收集沉淀固体，并在空气中干燥以得到4a/D-脯氨酸共晶体。如通过HPLC测定的共晶体包含97.6％的4a和2.1％的4b(150mg，为白色固体，40％产率)。共晶体的1H NMR分析表明4a与D-脯氨酸的摩尔比为1∶1。
实施例11：4a/D-脯氨酸共晶体的制备和表征
将化合物4a(100mg，0.223mmol)和D-脯氨酸(25.8mg，0.224mmol)在EtOH(0.8mL)中的混合物在90℃的油浴中加热。回流15分钟之后，将溶液冷却至室温，并在室温下在加盖的小瓶中保持24小时。然后移去小瓶盖以使EtOH在室温下缓慢蒸发。24小时之后，通过过滤收集沉淀固体并随后在空气中干燥，以得到为白色固体的以99±％纯度(HPLC)的4a/D-脯氨酸共晶体(74mg，59％产率)。1H NMR分析表明该共晶体包含1/1比的化合物4a和D-脯氨酸。
通过XRPD、DSC、TGA和DVS表征4a/D-脯氨酸共晶体。4a/D-脯氨酸共晶体的XRPD图已成功索引，表明该材料主要或仅由单结晶相组成(图18，表13)。
表13：针对4a/D-脯氨酸观察到的峰
图19中示出了该材料的DSC/TGA叠加。4a/D-脯氨酸共晶体的TGA热分析图显示出两个不同的重量损失步骤，第一个发生在约100℃和150至160℃之间(7.0％重量损失)，并且第二个在150℃至230℃之间(20.0％重量损失)。通过DSC观察到广泛的吸热，在130℃下具有峰最大，这与第一TGA重量损失步骤相协调，这可能归因于结合的溶剂/水的损失。在约170℃以上观察到重叠的吸热事件，可能是由于共结晶的D-脯氨酸成分同时熔融/挥发。TGA热分析图中在约250℃以上的急剧下降可能对应于分解。
图20中示出了D-脯氨酸共晶体的DVS等温线。吸附之后，该共晶体在5％至95％RH之间增加了按重量计26％，其中绝大部分的重量增加发生在85％至95％RH之间。在该步骤期间动力学平衡超时，表明如果允许更长的平衡时间，则共晶体可潜在地吸收比所测量的更多的水分。解吸之后，在95％至5％RH之间共晶体显示出相对稳定的重量损失，并且比在吸附期间增加的(按重量计29％)损失更多重量，表明该材料在分析开始时可能包含溶剂/水。值得注意的是，观察到D-脯氨酸共晶体的DVS后样品黏在盘上并且不能被回收，表明在实验期间部分潮解。
实施例12：向小鼠比较施用4a/L-脯氨酸材料A和无定形4a
该实施例评价了在雄性C57BL/6小鼠中与无定形4a的混悬液制剂相比，经口施用如实施例1中所制备的材料A的混悬液制剂之后对4a的全身性暴露。
在具有5％DMSO的0.5％CMC中配制无定形4a或材料A(考虑到以重量为基础的脯氨酸的存在)，并使用15mL/kg的给药体积以1000mg/kg通过经口管饲施用于35只雄性C57BL/6小鼠。如下表14中所总结的，在给药之后0.25、0.5、1、2、4、8和24小时收集用于血浆分离的血液样品，每个时间点使用单独的小鼠组(n＝5/组/时间点)。对于4a的浓度如下所述通过LC/MS/MS方法分析血浆样品。
表14：小鼠研究的总结
试剂和供应品：所有的试剂和供应品均是高质量的并且在适当时是LC/MS级的，并从标准商业供应商获得。
血浆样品制备：使用蛋白质沉淀方法从K3EDTA强化的血浆样品中提取4a。在聚丙烯微板(96孔)的孔中，添加20μL在乙腈/H2O(1∶1)中制备的2.5-ng/mL D3-4a(内标，IS)溶液，随后添加20μL血浆样品。用密封带(Phenomenex，AH0-7362)将板密封，并用涡旋混合器轻轻混合1分钟。将该溶液吸移到包含500μL甲醇的聚丙烯板(96孔，2mL，Phenomenex，AH0-7194)的孔中。将板密封并涡旋混合5分钟，随后在室温下以3000×g离心3分钟。将300μL的上清液等分试样转移到包含300μL去离子水的新孔中。轻轻混合之后，将板密封并放置在保持在12℃的LC自动进样器中，并将10μL等分试样注入LC/MS/MS系统中用于4a的定量分析。
色谱法和质谱条件：4a的液相色谱分离通过反相分析柱实现，其中流动相溶液包含H2O、乙腈和甲酸。通过以多反应监测(multiple-reaction-monitoring，MRM)模式操作的Waters Xevo TQ-S三重四极杆质谱仪检测色谱分析物。使用MassLynx软件V4.1(WatersCorp.)对质量控制样品、校准标准品和研究样品的色谱峰面积进行整合。
药代动力学分析：使用WinNonlinTM软件版本6.3(Pharsight Corp.，Cary，NC)从每个剂量组的平均4a血浆浓度-时间数据的非房室分析中获得药代动力学参数估计值。使用线性对数梯形法则确定从时间零至4a的最后可测量浓度的时间(t)的血浆浓度-时间曲线下面积(AUC(0至t))。最后可测量浓度的时间定义为每个剂量组中大多数动物中4a浓度低于定量限(below the limit of quantitation，BLQ)的时间。
结果：单次经口管饲施用材料A和无定形4a之后的平均(±SD)4a血浆浓度-时间数据示于下表15中，并在图21中展示。表16中示出了4a的药代动力学参数估计值。
表15：施用单次经口剂量的材料A和无定形4a之后小鼠中4a的平均(±SD)血浆浓度
a组中的所有样品均为BLQ。
表16：向小鼠单次经口施用之后的血浆药代动力学参数估计值
实施例13：向猴比较施用4a/L-脯氨酸材料A和无定形4a
该实施例分别评价了在使用无菌水中的0.5％羧甲基纤维素(CMC)作为载剂(5mL/kg)以30mg/kg单次经口管饲施用或以松散填充胶囊中以50mg(不论体重)单次经口管饲施用之后，如实施例1中制备的材料A和无定形4a制剂在雄性食蟹猴(cynomolgus monkey)中的全身性暴露，如下表17中所总结的。
表17：猴研究的总结
a施用的剂量不考虑体重
bNA，不适用
材料A的给药考虑了以重量为基础的脯氨酸的存在。在给药之后0.25、0.5、1、2、4、8、12和24小时从每只猴收集血液样品用于血浆分离。如上实施例12中所述，通过LC/MS/MS方法分析血浆样品的4a浓度，并进行药代动力学分析。
结果：下表18中示出了单次经口管饲(30mg/kg，5mL/kg)之后或胶囊给药(50mg)之后的平均(±SD)血浆浓度，并在图22中展示。表19中示出了药代动力学参数估计值。
表18：在经口施用作为混悬剂或胶囊剂的材料A或无定形4a之后，猴中的平均(±SD)4a血浆浓度
a中间时间点的3个值中的2个(即在两个时间点之间具有可量化的值)低于定量限(BLQ)，并且包含在作为1/2的最低定量下限(lower limit of quantitation，LLOQ)(即0.200ng/mL)的平均值内。
b中间时间点(即在两个时间点之间具有可量化的值)的所有值均为BLQ，并且报道为1/2的LLOQ(即0.200ng/mL)
c3个值中的1个是BLQ，并分配了1/2的LLOQ的值(即0.200ng/mL)以计算平均值和标准偏差
d平均值报道为BLQ，因为3个样品中的2个为BLQ
e所有值均为BLQ
表19：通过经口管饲施用4a混悬剂或胶囊剂之后，猴中的平均(±SD)药代动力学数据
a数据表示为中位数
两种胶囊制剂(但不是经口混悬液制剂)在给药之后4和8小时产生的4a血浆浓度低于或接近最低定量下限(即0.400ng/mL)，但在24小时时显示二次暴露峰，其中材料A和无定形4a制剂的平均(±SD)4a浓度分别为12.5±11.0和6.11±9.23ng/mL。
Claims (18)
1.摩尔比为1:1的N-(2-(5-(((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-甲氧基-6,6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1,1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺和L-脯氨酸的共晶体，其通过包含以下峰的X射线粉末衍射图来表征：8.52、9.19、13.22、14.75、16.33、17.57、19.50和21.22°2θ±0.20°2θ，如使用波长为的Cu-Kα1辐射在衍射仪上确定的。
2.根据权利要求1所述的共晶体，其中所述X射线粉末衍射图基本上如图23所示。
3.根据权利要求1或2所述的共晶体，其通过如下晶胞尺寸来表征：
α＝90°、β＝90°、并且γ＝90°。
4.根据权利要求1所述的共晶体，其通过包含在约145℃下的吸热的差示扫描量热法(DSC)热分析图来表征。
5.根据权利要求4所述的共晶体，其中所述DSC热分析图基本上如图24所示。
6.药物组合物，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的共晶体以及可药用固体载体。
7.提高N-(2-(5-(((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-甲氧基-6,6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1,1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺(4a)相对于N-(2-(5-(((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-甲氧基-6,6-二甲基四-氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3’-氟-[1,1’-联苯基]-2-基)乙基)-乙酰胺(4b)在包含4a和4b的起始组合物中的浓度的方法，其包括使所述起始组合物与脯氨酸在溶剂中接触，并使所述起始组合物、脯氨酸和溶剂处于结晶条件下，由此产生4a与脯氨酸的共晶体，其中主体共晶体显示出比包含4a和4b的起始组合物中更高的4a浓度。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述脯氨酸是L-脯氨酸。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述脯氨酸是D-脯氨酸。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述方法还包括对所述起始组合物、脯氨酸和溶剂进行加热。
11.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中4a的浓度通过HPLC确定。
12.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中在所述4a与脯氨酸的主体共晶体中的4a浓度比所述起始组合物中高3至20重量百分比。
13.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中在所述4a与脯氨酸的主体共晶体中的4a浓度比所述起始组合物中高5至15重量百分比。
14.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中在所述4a与脯氨酸的主体共晶体中的4a浓度提高约5重量百分比、约10重量百分比或约15重量百分比。
15.根据权利要求1至5中任一项所述的共晶体在制备用于在对象中抑制热激蛋白90(Hsp90)的药物中的用途。
16.根据权利要求1至5中任一项所述的共晶体在制备用于在患有神经退行性病症的对象中治疗或预防神经退行性病症的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述神经退行性病症是糖尿病性周围神经病。
18.根据权利要求1至5中任一项所述的共晶体在制备用于在患有1型或2型糖尿病的对象中预防糖尿病性周围神经病的发生或者降低发生糖尿病性周围神经病的可能性的药物中的用途。
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