CN111983043B - 注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆残留量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆残留量的检测方法，所述方法，包括以下步骤：1)样品溶液配制方法：原料样品加入已过夜冷冻的乙腈，原始样品体积与乙腈体积的比值在1～3范围内，震荡，超声2～4min，再震荡20～40s，8000～9800rpm离心1～3min，取上清液；2)标准品溶液配制方法：取泊洛沙姆标准品，称量并配制标准品溶液，浓度依次为2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml；3)检测：分别取标准品溶液和样品溶液，注入高效液相色谱仪，记录CAD检测到的色谱图，以标准品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，用外标法计算样品溶液中泊洛沙姆的含量，经换算得到注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆的含量。

Description

注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆残留量的检测方法

技术领域

本发明属于检测分析技术，具体涉及一种注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆残留量的测定方法。

背景技术

注射用重组人尿激酶原(商品名，普佑克)用于急性ST段抬高性心肌梗死的溶栓治疗。

注射用重组人尿激酶原的原料为重组人尿激酶原(pro-UK)，即注射用重组人尿激酶原的原液，其制备方法见200410058006.0(公开号为CN1730098A)。

注射用重组人尿激酶原(Pro-UK)原料的原生产工艺是20L发酵规模，为了满足蓬勃发展的市场需求，现将工艺放大到300L发酵规模。该300L新工艺在发酵过程中会产生大量的气泡，因此在反应器的细胞培养基中新添加了普兰尼克F68(Pluronic F68)，又称泊洛沙姆188(Poloxamer188)，简称F68，它可以作为消泡剂和抗击细胞培养中剪切力的细胞膜稳定剂，该化合物经过后期的纯化工艺可以被去除。根据国家法规的要求，需要对工艺过程中引入的杂质进行研究、检测和控制，因此，为了确定泊洛沙姆188对产品质量的影响，必须对产品原料中的残留水平进行研究。

高效液相色谱(HPLC)方法是药品杂质残留量分析常用的检测方法，泊洛沙姆188与目的蛋白均是大分子物质，需要选择合适的色谱条件将其分离。另外，泊洛沙姆188不具有光吸收性质，也不具有荧光性质，需要选择合适的通用型检测器对其进行测定。

中国专利CN101262918A(申请号为200680033079.1)公开了一种液体蛋白质样品中泊洛沙姆类的分析检测方法，具体是将分子筛析色谱柱TSK G3000PW(粒径10μm或者17μm，孔径

)和示差折光检测器(RI)应用在泊洛沙姆188的检测上，蛋白质的分子量是20-70kDa之间，优选为FSH、LH、hCG、TSH的促性腺激素。该色谱柱分离效率较低，RI检测器的灵敏度不高，容易受到检测环境中温度的影响，且不能使用梯度洗脱的色谱条件。另外，该方法采用了较低pH值的流动相(pH为1.7～1.9)，对整个液相系统(包括液相管路、色谱柱、检测器)来说，长期使用会造成损伤，考虑到液相系统的pH耐受情况，一般选择的色谱条件在2～9的pH范围内。

李响等在《蒸发光散射检测法测定重组人IL-12注射液中泊洛沙姆188》中报道，采用反相色谱柱Poly RP-100(粒径5μm，孔径

)和蒸发光散射检测器(ELSD)检测泊洛沙姆188，IL-12是白介素，属于重组蛋白。ELSD检测器灵敏度不高，可以检测到ug级，不能检测到低于10％的物质，比较适合蛋白制品中药用辅料含量的检测，对于蛋白制品中残留物含量的检测来说，电喷雾检测器(CAD)更为适合，可以检测到ng级，可以检测到低于0.05％的杂质，另外相对于CAD检测器而言，ELSD检测器线性范围很窄(1-2个数量级)，响应一致性差，重现性不高。本发明用高效液相色谱(HPLC)将泊洛沙姆188与其他物质进行分离，然后用电喷雾检测器(CAD)对泊洛沙姆188进行检测。本发明检测原料中泊洛沙姆188的残留量，其含量很少，即便使用CAD检测器也增加了检测难度。另外，重组人尿激酶原和泊洛沙姆188均是大分子物质，难以分离，这也为HPLC色谱条件的优化增加了难度。

发明内容

本发明提供了一种注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆残留量的检测方法。

本发明提供检测原料中泊洛沙姆188的残留量方法，包括以下步骤：

1)样品溶液配制方法：原料样品加入已过夜冷冻的乙腈，原始样品体积与乙腈体积的比值在1～3范围内，震荡，超声2～4min，再震荡20～40s，8000～9800rpm离心1～3min，取上清液；

2)标准品溶液配制方法：

取泊洛沙姆标准品，称量并配制标准品溶液，浓度依次为2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml；

3)检测：分别取标准品溶液和样品溶液，注入高效液相色谱仪，记录CAD检测到的色谱图，以标准品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，用外标法计算样品溶液中泊洛沙姆的含量，经换算得到注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆的含量。

其中，所述高效液相色谱的色谱条件如下：

色谱柱Acclaim^TM Surfactant Plus column,3μm,30mm×150mm；进样体积10μL；柱温40℃；流速0.7mL/min；梯度洗脱；UV检测器280nm；CAD检测器：采样频率5赫兹，峰过滤时间参数3.6秒，雾化温度50℃；

梯度洗脱条件见表1：

表1：梯度洗脱表

时间(分钟)	流动相A：100mM甲酸铵	流动相B：100％乙腈	梯度曲线*
				0.00	72	28	5
4.00	72	28	5
				12.00	30	70	5
14.00	10	90	5
				18.00	10	90	5
18.10	72	28	5
				24.00	72	28	5

备注：*梯度曲线(curve)见图11。

其中，所述原料样品为任意一种其中含有微量泊洛沙姆的原料药，优选多肽类药物，更优选为通过基因重组技术生产的多肽类药物，包括已知的多种药物如，白介素类，EPO类，集落细胞刺激因子类，抗肿瘤多肽，尿激酶多肽等，最优选为重组人尿激酶原多肽原料药，该原料药为尿激酶的前体，由411个氨基酸残基组成，主要被纤溶酶和肽激酶水解，它是从人体细胞所克隆的尿激酶原，通过基因重组技术制备得到，主要用于急性ST段抬高性心肌梗死。

以下为本发明名称术语的解释和说明：

所述原始样品为注射用重组人尿激酶原原液，蛋白浓度低于50mg/mL。

标准品为泊洛沙姆，简称F68，Sigma生产，批号为SLBP3447V。

高效液相色谱仪采用Thermo Ultimate 3000，也可以选择其他品牌的具有同等功能的仪器。

优选的，本发明提供检测原料中泊洛沙姆188的残留量方法，包括以下步骤：

1)样品溶液配制方法：200μl原始样品加入300μl已过夜冷冻的乙腈，震荡30s，超声3min，再震荡30s，9500rpm转速离心1min，取上清液。

2)标准品溶液配制方法：

取泊洛沙姆标准品，称量并配制标准品溶液，浓度依次为2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml。

3)高效液相色谱的色谱条件如下：

色谱柱Acclaim^TM Surfactant Plus column,3μm,30mm×150mm；进样体积10μL；柱温40℃；流速0.7mL/min；梯度洗脱；UV检测器280nm；CAD检测器：采样频率5赫兹，峰过滤时间参数3.6秒，雾化温度50℃，流动相及梯度洗脱表如下；

时间(分钟)	流动相A：100mM甲酸铵	流动相B：100％乙腈	梯度曲线*
				0.00	72	28	5
4.00	72	28	5
				12.00	30	70	5
14.00	10	90	5
				18.00	10	90	5
18.10	72	28	5
				24.0	72	28	5。

4)检测：分别取标准品溶液和样品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，用外标法计算样品溶液中泊洛沙姆的含量。

本发明的各项参数都是经过筛选得到的，筛选过程如下：

1、通用型检测器的确定。

在通用型检测器中，示差折光检测器(RI)灵敏度较低，对温度变化敏感，且不适用于梯度洗脱的色谱条件；蒸发光散射检测器(ELSD)克服了RI检测器不适用于梯度洗脱的不足，但是灵敏度和重现性不高依然使其应用受到影响；电喷雾检测器(CAD)具有灵敏度高(检测限低至ng级)，重现性好(RSD通常小于2％)，应用范围广(可应用于任何非挥发和半挥发性化合物)等优点，适用于泊洛沙姆188的测定，尤其适用于痕量泊洛沙姆188的测定。

2、色谱柱的确定。

Thermo Scientific的Acclaim^TM Surfactant Plus色谱柱适用于各种表面活性剂的分离。泊洛沙姆188是乙氧基丙氧基共聚物，分子式为(C₃H₆O.C₂H₄O)x，CAS编号9003-11-6，是一种具有双官能团的表面活性剂，该色谱柱适用于泊洛沙姆188的分离。3、色谱条件的优化。

重组人尿激酶原和泊洛沙姆188均是大分子物质，难以分离，通过筛选流动相、优化流动相起始梯度和优化流动相梯度曲线等方法，使得大部分目的蛋白进入流穿组分，泊洛沙姆188在色谱柱中保留并分离。

3.1标准品和样品：

标准品：F68(STD)，Sigma，批号SLBP3447V；

样品1：注射用重组人尿激酶原原液(SPL1)，上海天士力，批号T20161219B；

样品2：注射用重组人尿激酶原原液(SPL2)，上海天士力，批号V20170526B；

空白样品：不含有F68和重组人尿激酶原的样品，为60％乙腈(Blank)。

3.2流动相的筛选：色谱柱Acclaim^TM Surfactant Plus column,3μm,30mm×150mm；进样体积10μL；柱温40℃；流速0.7mL/min；UV检测器280nm；CAD检测器：采样频率5赫兹，峰过滤时间参数3.6秒，雾化温度50℃；流动相及梯度洗脱见表2：

需要说明的是：流动相是根据色谱柱和检测器来选。该色谱柱推荐这样的流动相，而且这样的流动相也适用于CAD检测器。

表2：梯度洗脱表

	色谱条件1	色谱条件2
			流动相A	100mM甲酸铵	100mM甲酸铵
流动相B	100％乙腈	100％甲醇
			时间(分钟)	流动相A	流动相B
0.00	80	20
			2.00	80	20
10.00	30	70
			12.00	10	90
16.00	10	90
			16.10	80	20
20.00	80	20

结果见图1-2。

结论：色谱条件1和色谱条件2使用了不同的流动相B，两者均不能使F68(STD)与重组人尿激酶原(SPL)完全分离开；

色谱条件1中目标峰STD更尖锐，比色谱条件2中STD与SPL的分离度好，因此暂定色谱条件1，即采用乙腈作为流动相B。

3.3流动相起始梯度的优化：色谱柱Acclaim^TM Surfactant Plus column,3μm,30mm×150mm；进样体积10μL；柱温40℃；流速0.7mL/min；UV检测器280nm；CAD检测器：采样频率5赫兹，峰过滤时间参数3.6秒，雾化温度50℃。流动相及梯度洗脱见表3：

表3：流动相及梯度洗脱

时间(分钟)	流动相A：100mM甲酸铵	流动相B：100％乙腈
			0.00	100-x	x
4.00	100-x	x
			12.00	30	70
14.00	10	90
			18.00	10	90
18.10	100-x	x
			24.00	100-x	x

备注：x代表流动相B的起始梯度浓度，本试验中x的值分别为26、28、32。

结果见图3-5。

结论：

1)改变流动相B的起始梯度浓度对重组人尿激酶原(SPL)保留时间的影响较大；

2)起始梯度浓度26％会使SPL和STD均在色谱柱上保留，并无法分离，起始梯度浓度32％会使SPL不在色谱柱上保留，但是一部分STD也无法保留，起始梯度浓度28％会使大部分SPL不在色谱柱上保留的时候，同时STD有较好的保留，小部分保留的SPL可以尝试通过样品前处理的方法去除，因此选择28％的流动相B作为起始梯度浓度。

3.4流动相梯度曲线的优化：色谱柱Acclaim^TM Surfactant Plus column,3μm,30mm×150mm；进样体积10μL；柱温40℃；流速0.7mL/min；UV检测器280nm；CAD检测器：采样频率5赫兹，峰过滤时间参数3.6秒，雾化温度50℃。流动相及梯度洗脱见表4：

表4：流动相及梯度洗脱表

时间(分钟)	流动相A：100mM甲酸铵	流动相B：100％ACN	梯度曲线
				0.00	72	28	5
4.00	72	28	5
				12.00	30	70	x
14.00	10	90	x
				18.00	10	90	x
18.10	72	28	x
				24.00	72	28	5

备注：x代表梯度曲线(curve)，本试验中x的值分别为2、3、4、5、6。

结果见图6、7、11。

结论：改变流动相梯度曲线对重组人尿激酶原(SPL)无影响，但对F68(STD)的峰形和响应会有很大改善；梯度曲线x的值越小，STD的响应越高，但空白样品(Blank)的干扰峰越大，为了得到较高的目的峰响应和较弱的背景干扰，因此选择梯度曲线x的值为5。

2.5样品前处理方法的结合。

由于蛋白在冰乙腈中易团聚沉淀，泊洛沙姆188则易溶于乙腈，因此用冰乙腈来提取泊洛沙姆188。样品溶液(SPL2)的制备为200μl注射用重组人尿激酶原原液，加入300μl过夜冷冻的乙腈，震荡30s，超声3min，离心1min，取上清液。加标回收溶液(STD+SPL2)的制备为200μl注射用重组人尿激酶原原液，加入300μl过夜冷冻的乙腈，再加入10μl浓度为5mg/ml的F68溶液，震荡30s，超声3min，离心1min，取上清液，并计算回收率。

色谱条件：色谱柱Acclaim^TM Surfactant Plus column,3μm,30mm×150mm；进样体积10μL；柱温40℃；流速0.7mL/min；UV检测器280nm；CAD检测器：采样频率5赫兹，峰过滤时间参数3.6秒，雾化温度50℃。流动相及梯度洗脱见表1。

结果见图8。

结论：用优化后的色谱条件结合冰乙腈沉淀蛋白的前处理方法，回收率为81.42％(该样品前处理方法为预实验，回收率数值仅供参考)。

本发明提供的方法具有以下优点：

1、本发明注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆188的含量很少，且泊洛沙姆与F68均属于大分子物质，检测难度加大，本发明特点：

1)选用冰乙腈对原液进行前处理，蛋白在冰乙腈中易团聚沉淀，泊洛沙姆188则易溶于乙腈，因此，用冰乙腈来提取泊洛沙姆188。

2)色谱条件方面：

选用灵敏度高(检测限低至ng级)的电喷雾检测器(CAD)；

通过筛选流动相、优化流动相起始梯度和优化流动相梯度曲线等方法，使得大部分目的蛋白进入流穿组分，泊洛沙姆188在色谱柱中保留并分离。

2、本发明提供的方法实现了对注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆188残留量进行绝对定量检测，操作简单、快速、灵敏度高，重现性好，大大提高检验效率。

附图说明

图1：色谱条件1下的标准品(STD)和样品(SPL1和SPL2)的叠加图；

图2：色谱条件2下的标准品(STD)和样品(SPL1和SPL2)的叠加图；

图3：流动相起始梯度26％条件下的标准品(STD)和样品(SPL)的叠加图；

图4：流动相起始梯度28％条件下的标准品(STD)和样品(SPL)的叠加图；

图5：流动相起始梯度32％条件下的标准品(STD)和样品(SPL1和SPL2)的叠加图；

图6：梯度曲线(curve)2、5、6条件下的标准品(STD)和样品(SPL)的叠加图；

图7：梯度曲线(curve)3、4、5、6条件下的空白样品(Blank)的叠加图；

图8：空白样品(Blank)、标准品(STD)、样品(SPL2)和加标样品(STD+SPL2)的叠加图；

图9：一次线性公式；

图10：二次线性公式；

图11为梯度曲线(curve)图，其中图11-1到图11-5分别为Curve2、3、4、5、6。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：一种注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆残留量的检测方法

样品前处理方法：200μl原始样品加入300μl已过夜冷冻的乙腈，震荡30s，超声3min，再震荡30s，9500rpm转速离心1min，取上清液。

标准品溶液配制方法：取泊洛沙姆标准品，称量并配制标准品溶液，浓度依次为2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml。

色谱条件(HPLC-CAD)：色谱柱Acclaim^TM Surfactant Plus column,3μm,30mm×150mm；进样体积10μL；柱温40℃；流速0.7mL/min；CAD检测器：采样频率5赫兹，峰过滤时间参数3.6秒，雾化温度50℃；流动相及梯度洗脱见表1。

检测：分别取标准品溶液和样品溶液，注入高效液相色谱仪，记录CAD检测到的色谱图，以标准品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，用外标法计算样品溶液中泊洛沙姆的含量，经换算得到注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆的含量。

实施例2：方法的验证

1、样品及溶液的配制：

1.1标准品和样品

标准品：F68(STD)，Sigma，批号SLBP3447V；

样品1：注射用重组人尿激酶原原液(SPL1)，上海天士力，批号T20161219B；

样品2：注射用重组人尿激酶原原液(SPL2)，上海天士力，批号V20170526B。

空白样品：不含有F68和重组人尿激酶原的样品，为60％乙腈(Blank)。

1.2样品溶液的配制

Stock#1溶液(2mg/mL)：准确称取10.84mg F68于5mL容量瓶中，加入3mL稀释剂，用稀释剂定容至刻度线，混匀即得；

Stock#2溶液(2mg/mL)：准确称取10.38mg F68于5mL容量瓶中，加入3mL稀释剂，用稀释剂定容至刻度线，混匀即得；

L8溶液(2mg/mL)：即取stock#2溶液；

L7溶液(1mg/mL)：取2.5ml stock#2溶液于5mL容量瓶中，用稀释剂定容至刻度线，混匀即得；

L6溶液(0.5mg/mL)：取1.25ml stock#2溶液于5mL容量瓶中，用稀释剂定容至刻度线，混匀即得；

L5溶液(0.25mg/mL)：取0.625ml stock#2溶液于5mL容量瓶中，用稀释剂定容至刻度线，混匀即得；

L4溶液(0.1mg/mL)：取2.0ml L5溶液于5mL容量瓶中，用稀释剂定容至刻度线，混匀即得；

L3溶液(0.04mg/mL)：取0.8ml L5溶液于5mL容量瓶中，用稀释剂定容至刻度线，混匀即得；

L2溶液(0.02mg/mL)：取0.4ml L5溶液于5mL容量瓶中，用稀释剂定容至刻度线，混匀即得；

L1溶液(0.01mg/mL)：取0.5ml L2溶液与0.5ml稀释剂混匀即得；

L0溶液(0.005mg/mL)：取0.5ml L1溶液与0.5ml稀释剂混匀即得；

STD#1溶液(0.25mg/mL)：取0.625ml stock#1溶液于5mL容量瓶中，用稀释剂定容至刻度线，混匀即得；

STD#2溶液(0.25mg/mL)：取L5溶液；

样品溶液(SPL)：准确移取200μl注射用重组人尿激酶原原液(SPL1)至1.5ml离心管中，加入300μl过夜冷冻的乙腈，震荡30s，超声3min，再震荡30s，9500rpm离心1min，轻缓的吸取上部100μl清液，标记为SPL1_1。重复上述操作，制备其平行样SPL1_2。准确移取200μl注射用重组人尿激酶原原液(SPL2)至1.5ml离心管中，重复上述操作，分别制备SPL2_1及其平行样SPL2_2。

加标回收溶液(STD+SPL)：准确移取200μl注射用重组人尿激酶原原液(SPL1)至1.5ml离心管中，加入10μl stock#2溶液，加入300μl过夜冷冻的乙腈，震荡30s，超声3min，再震荡30s，9500rpm离心1min，轻缓的吸取上部100μl清液，标记为STD+SPL1_1。重复上述操作，制备其平行样STD+SPL1_2。准确移取200μl注射用重组人尿激酶原原液(SPL2)至1.5ml离心管中，重复上述操作，分别制备STD+SPL2_1及其平行样STD+SPL2_2。

2、系统适应性结果分析：

2.1专属性

结果见图8的图谱，空白样品的色谱图中主峰出峰时间处无显著性干扰。

2.2线性范围、检测限和定量限

用实施例1中所述的色谱条件进行分析，L8～L0溶液各进样1针，其HPLC-CAD测定结果见表5：

表5：测定结果

溶液名称	浓度(理论mg/mL)	浓度(实际mg/mL)	F68峰面积	S/N
					L0	0.005	0.00519	23534187.07	5.11
L1	0.01	0.01038	74157071.52	10.2
					L2	0.02	0.02076	137726285.48	N/A
L3	0.04	0.04152	254733094.74	N/A
					L4	0.1	0.1038	583045970.73	N/A
L5	0.25	0.2595	1169400085.76	N/A
					L6	0.5	0.519	2011662734.14	N/A
L7	1	1.038	3203033440.13	N/A
					L8	2	2.076	5670711620.20	N/A

通过分析，共得到两种标准曲线拟合公式，描述见图9和图10：

图9所示的一次线性公式(y＝3,787,041,577.16347000x+102,375,336.30632900)的线性范围为0.01038～0.519mg/ml(R²＝0.991)，图10所示的二次线性公式(y＝-446,466,526.45674800x²+3,576,394,504.59511000x+139,202,996.73747000)的线性范围为0.01038～2.076mg/ml(R²＝0.996)，因为该方法是建立注射用重组人尿激酶原原液中F68残留量的检测，样品中的F68含量很低，因此选择线性范围为0.01038～0.519mg/ml的一次线性公式进行拟合。

L0溶液浓度为0.00519mg/ml，HPLC-CAD分析的S/N＝5.11，为检测限，样品中可检出F68的最低含量为13μg/ml。

L1溶液浓度为0.01038mg/ml，HPLC-CAD分析的S/N＝10.2，为定量限，样品中可定量F68的最低含量为26μg/ml。

2.3精密度

用实施例1的色谱条件分析STD#2溶液，共进样5针，其HPLC-CAD测定结果见表6：

表6：测定结果

上述精密度考察试验中，对保留时间来说，重复进样5针的RSD＝0.33％；对于峰面积来说，重复进样5针的RSD＝0.56％。

2.4对照标准品的准确度

上述STD#2溶液的F68峰面积平均值和溶液浓度见表7：

表7：峰面积平均值和浓度

溶液名称	F68峰面积	浓度(mg/mL)
			STD#2	1137688461.53	0.2595

用实施例1的色谱条件分析STD#1溶液，进样1针，其HPLC-CAD测定结果见表8：

表8：测定结果

溶液名称	F68峰面积	浓度(mg/mL)
			STD#1	1234567718	0.271

对照标准品STD#1的回收率为103.91％。

回收率计算公式为(1137688461.53÷0.2595)÷(1234567718÷0.271)×100％

2.5括号式标准品的准确度

在液相系统运行过程中，每隔一段时间进样1针STD#2溶液，其HPLC-CAD测定结果见表9：

表9：测定结果

括号式标准品STD#2的回收率计算公式为各时间点进样的F68峰面积除以零时进样的F68峰面积，再乘以100％。

2.6 F68加标回收率

用实施例1中所述的色谱条件进行分析，STD+SPL1_1、STD+SPL1_2、STD+SPL2_1、STD+SPL2_2各进样1针，其HPLC-CAD测定结果见表10：

表10：测定结果

溶液名称	F68峰面积	F68加标回收率(％)
			L3	254733094.74	N/A
STD+SPL1_1	236376283.74	92.79％
			STD+SPL1_2	267331485.87	104.95％
STD+SPL2_1	272398279.54	106.93％
			STD+SPL2_2	274189337.73	107.64％

STD+SPL1_1、STD+SPL1_2、STD+SPL2_1、STD+SPL2_2是将10μl stock#2溶液(2mg/ml)加入500μl体系中，加标F68理论浓度为0.04mg/ml，加标F68理论面积为L3溶液(0.04mg/ml)的峰面积254733094.74，F68加标回收率计算公式为STD+SPL1_1、STD+SPL1_2、STD+SPL2_1、STD+SPL2_2的峰面积除以L3溶液的峰面积，再乘以100％

3、该方法的验证结论如下：

3.1系统适应性结果：见表11

表11：系统适应性

3.2 F68加标回收率结果：见表12

表12：F68加标回收率

通过HPLC-CAD法检测注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆残留量的方法学验证，包括专属性、线性范围、检测限、定量限、精密度、准确度以及F68加标回收率，证明样品中最低可以检出F68的最低含量为13μg/ml，最低可以定量出F68的最低含量为26μg/ml，方法学线性范围为0.01038～0.5190mg/mL，线性关系满足R²≥0.99，同时方法学精密度和准确度均满足要求，因此确定该方法适用于注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆残留量的检测。

Claims (2)

1.一种注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆188残留量的检测方法，所述方法，包括以下步骤：

1)样品溶液配制方法：原始样品加入已过夜冷冻的乙腈，原始样品体积与乙腈体积的比值在1～3范围内，震荡，超声2～4min，再震荡20～40s，8000～9800rpm离心1～3min，取上清液；

2)标准品溶液配制方法：

取泊洛沙姆标准品，称量并配制标准品溶液，浓度依次为2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml；

3)高效液相色谱的色谱条件如下：

色谱柱Acclaim^TMSurfactant Plus column,3μm,30mm×150mm；进样体积10μL；柱温40℃；流速0.7mL/min；梯度洗脱；UV检测器280nm；CAD检测器：采样频率5赫兹，峰过滤时间参数3.6秒，雾化温度50℃，流动相为100nm甲酸铵和乙腈，梯度洗脱；梯度洗脱条件见下表：

时间(分钟) 流动相A：100mM甲酸铵 流动相B：100％乙腈 梯度曲线^* 0.00 72 28 5 4.00 72 28 5 12.00 30 70 5 14.00 10 90 5 18.00 10 90 5 18.10 72 28 5 24.0 72 28 5

4)检测：分别取标准品溶液和样品溶液，注入高效液相色谱仪，记录CAD检测到的色谱图，以标准品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，用外标法计算样品溶液中泊洛沙姆的含量，经换算得到注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆的含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，包括以下步骤：

1)样品溶液配制方法：200μl原始样品加入300μl已过夜冷冻的乙腈，震荡30s，超声3min，再震荡30s，9500rpm转速离心1min，取上清液，

2)标准品溶液配制方法：

取泊洛沙姆标准品，称量并配制标准品溶液，浓度依次为2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml，

3)高效液相色谱的色谱条件如下：

色谱柱Acclaim^TMSurfactant Plus column,3μm,30mm×150mm；进样体积10μL；柱温40℃；流速0.7mL/min；梯度洗脱；UV检测器280nm；CAD检测器：采样频率5赫兹，峰过滤时间参数3.6秒，雾化温度50℃，流动相为甲酸铵和乙腈，梯度洗脱见下表：

时间(分钟) 流动相A：100mM甲酸铵 流动相B：100％乙腈 梯度曲线^* 0.00 72 28 5 4.00 72 28 5 12.00 30 70 5 14.00 10 90 5 18.00 10 90 5 18.10 72 28 5 24.0 72 28 5

4)检测：分别取标准品溶液和样品溶液，注入高效液相色谱仪，记录CAD检测到的色谱图，以标准品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，用外标法计算样品溶液中泊洛沙姆的含量，经换算得到注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆的含量。

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