CN111961680B - 一种甜橙抗寒基因CsLAC18及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种从甜橙中分离、克隆得到的抗寒功能基因CsLac18，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将本发明的基因CsLac18导入到烟草及枳壳中进行功能验证，发现获得的转基因超表达植物抗寒能力明显提高，而转基因沉默表达植物抗寒能力明显降低。本发明为植物抗寒基因工程提供重要的基因资源，能够提高植物的抗寒性能。
Description
技术领域
本发明涉及一种从甜橙（Citrus sinensis）中分离、克隆得到的一个低温诱导漆酶基因CsLAC18，该基因具有抗寒功能，还涉及一种甜橙抗寒转运蛋白基因CsLAC18在植物抗寒改良中的应用，即将上述基因转化到烟草及枳，获得的转基因超表达植物抗寒能力明显提高，而转基因沉默表达植物抗寒能力明显降低，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
柑橘作为我国乃至全球范围内第一大类水果，也是在我国南部地区栽培面积最广、产品产量最大、经济地位最高的果树类园艺作物。我国柑橘产业迅速发展，栽培面积从1978年的17.8万hm2发展到2017年的268.88万hm2，增长了约15倍，总产量从1978年的38.3万吨发展到2017年的3853.32万吨，增长了近100倍。柑橘产业的蓬勃发展不仅丰富了果品市场，还在农业经济振兴和供给侧改革方面发挥着不可忽视的作用。柑橘类果树的地域主要分布在北纬35°以南的区域，特点是喜温暖和湿润气候条件，而我国的经济商用的栽培柑橘主要分布在北纬20～33°之间的亚热带地区，种植区主要在于长江沿线以南和秦岭以南，受分布地域影响，越冬冻害时有发生；有学者提出柑橘越冬期冻害不仅与冬季降温强度有关，还与冬季干旱、降温过程伴随雨雪等有关，因此，自然条件在很大程度上制约了柑橘产业的发展，它轻则影响植株生长，损伤树体，导致结果树减产，影响果实品质，重则造成树体死亡，果园毁灭。因此，研究柑橘抗寒性对于其抗寒育种和北移栽培都具有重要意义。由于绝大多数的柑橘类果树为多胚类型，其无性胚发育优于有性胚，造成后者发育不良，加之柑橘童期长、遗传高度杂合等限制因素，采用有性杂交或者常规育种方法很难有效的获得柑橘抗寒品种。然而，迅猛发展的生物技术为植物育种提供了新的途径，通过基因工程可以对作物进行定向的遗传改良，已经在培育作物抗逆新品种（材料）中展现出重要的利用价值。而，发掘和鉴定抗逆基因是利用基因工程创制抗逆转基因植株的前提和关键。
低温对植物的伤害分为两种，一种是零上低温（0～12℃）造成的，称之为寒害（chilling stress），另一种是零下低温造成的，称之为冻害（freezing stress）。冻害容易导致干旱胁迫综合症，使植物细胞结冰形成冰晶，并且使细胞严重脱水，机械性伤害并最终导致植物死亡，对植物造成直接的物理伤害；而寒害则是一个间接缓慢的过程，会抑制生长速度和叶片膨胀，破坏细胞结构，影响其关键的生理功能。低温胁迫引起渗透胁迫，这会导致膨压丧失，破坏膜的稳定性、使蛋白质失活或变性、积累活性氧（Reactive OxygenSpecies, ROS）产生氧化损伤，进而导致光合作用被抑制、代谢功能紊乱和细胞结构遭到破坏。最终影响植物的生长发育，严重时会导致植株完全死亡。
低温胁迫可能对植物产生诸多不利影响，包括抑制种子发芽，减少植物生长和繁殖以及降低作物产量和品质。首先，低温会改变细胞膜的流动性，这可能会影响膜定位蛋白的功能以触发下游反应；第二，极端温度会严重影响酶的活性。例如活性氧（ROS）清除酶可能会受到影响，从而导致氧化应激；第三，低温会对细胞生理产生相当大的影响，例如蛋白质复合物和RNA二级结构的失稳，最终导致光抑制和代谢失衡。此外低温是影响作物产量以及限制植物地理分布的重要因子之一。
通过传统育种方法得到柑橘抗性增强的品种是一个耗时耗力且十分困难的工程。随着现代基因工程的迅速发展，依托新型生物技术方法已成为培育柑橘抗性种质资源的重要途径。
漆酶（EC1.10.3.2）最初是由吉田在Rhusvernicifera中发现的，属于铜蓝蛋白氧化酶家族。漆酶具有三个催化位点，可与四个铜离子结合在一起，在氧气存在下能够催化氧化各种芳香族和非芳香族化合物。一些化合物，例如铜螯合剂，叠氮化物和脂肪酸以及十六烷基三甲基铵溴化物（CTAB）通过改变酶的空间结构或结合来抑制漆酶活性底物的位置。漆酶广泛存在于植物和真菌中，但也存在于细菌和昆虫中。而在高等植物中，漆酶的研究相对有限，漆酶已在拟南芥，水稻，烟草，黑麦草，棉花，黄杨，杨木和无花果中鉴定出。对漆酶的最详细的研究是在Rhusvernicifera漆酶上。植物漆酶是含有比真菌漆酶（10～25％）更高的碳水化合物含量（20～45％）的糖蛋白，据报道它是造成铜保留，酶稳定性和活性的原因。这些分子通常由500-600个氨基酸组成，重约60-130kDa，而其等电点（pI）值范围为7.0到9.6。大多数植物漆酶都是分泌蛋白，预计会有一些例外位于线粒体中。植物和真菌来源的漆酶最适pH不同，植物漆酶的最适pH约为7.0～10.0的生理范围，而真菌则为较低的酸性pH值。此外，预测这两种漆酶活性位点有所不同。这些特征可能部分地解释了植物和真菌漆酶的差异性功能，一种催化木质素生物合成，另一种负责降解。
漆酶属于铜蓝蛋白家族，含有500个左右的氨基酸，以氧气为电子受体，具有丰富的催化底物。随着研究的深入，漆酶已被证明对植物次生细胞壁的形成起到关键作用，是木质素单体最终聚合的关键酶。模式植物拟南芥的一项研究表明，17个拟南芥漆酶基因中有8个在花序茎中高表达，表明漆酶可能参与木质素聚合。近年来，相继在棉花、高粱、水稻中验证了漆酶基因在木质素合成过程中起到关键作用。在柑橘上研究发现，枳受到过量硼胁迫处理时，miR397可通过调节LAC7的活力促进木质素的合成，从而提高植株对硼毒害的耐受性，公开号为CN109468333A的中国专利申请就公开了一种柑橘漆酶家族基因CsiLAC4在提高植物耐硼毒能力方面的应用。在植物中漆酶涉及到多种不同的生物学过程，如给发育期的果实着色，有助于发病植物的木质化病理修复等。植物漆酶一般由多基因家族编码，主要通过参与细胞壁木质素合成、色素合成途径、促进伤口愈合及抗病、抗逆等方面影响植物生长发育。目前高等植物漆酶的报道在木质素合成、抗逆、抗病及色素合成等方面已取得了一定的成果。参与木质素合成途径的关键酶和基因可以在应对非生物胁迫时发挥多种作用，在有限的实验数据中已收集有关植物漆酶的亚细胞定位。据报道在拟南芥中，LAC4和LAC17位于原始管腔元素分化的次生细胞壁中。值得注意的是，据报道AtLAC15在液泡腔内而不是细胞壁内观察到，这可能与其功能有关。木质素在细胞壁中的沉积提供了机械强度并支持组织，使水能够运输，并且还被证明对防御病原体和许多寄生虫很重要。木质素是木质纤维素生物质中最大的非碳水化合物成分（15～40％）。据报道，它是一种复杂的芳香族生物聚合物，是影响植物抗逆性的最重要因子之一。
综上可知，漆酶在植物逆境响应中具有重要调控作用，但是在低温胁迫的作用尚不清楚。因此，克隆和鉴定新的抗寒基因可为柑橘抗寒育种提供理论基础和重要的基因资源。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足而提供一种甜橙抗寒基因CsLAC18，同时给出了其在植物抗寒中的应用。
本发明提供了一种甜橙抗寒基因CsLAC18，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述的甜橙抗寒基因CsLAC18编码的蛋白质的氨基酸序列，该序列如SEQID NO.2所示。
上述技术方案中，所述甜橙抗寒基因CsLAC18为包含1743 bp的开放阅读框，其编码580个氨基酸。
上述技术方案中，所述甜橙抗寒基因CsLAC18编码的氨基酸序列，其等电点为9.10，分子量为6.401 KDa。
另外，克隆上述甜橙抗寒基因CsLAC18的cDNA序列的引物对，其核苷酸序列如下所示：
正向引物 5’- ATGGGAGCTTCTCTTCTTCGATC -3’；
反向引物 5’- TCAGCACTGAGGAAGATCTG -3’。
本发明的另一个目的是提供了甜橙抗寒基因CsLAC18在植物抗寒中的应用，通过农杆菌介导遗传转化法将上述基因转化到烟草和枳，获得的转基因植株经过生物学功能验证，表明本发明克隆的CsLAC18基因具有调控植株抗寒的功能。
本发明利用农杆菌介导的遗传转化法转化烟草及枳，获得的转基因超表达植株和沉默系表达株系，经生物学功能验证，转基因超表达植物抗寒能力明显提高，而转基因沉默表达植物抗寒能力明显降低，进而表明本发明克隆的CsLAC18基因具有调控抗寒功能。在本发明的实施例部分，详细阐述了甜橙漆酶基因CsLAC18的分离、功能验证和应用。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
1.本发明基因的发现，为柑橘抗寒基因工程提供了理论基础和重要的基因资源；
2.通过农杆菌介导遗传转化法将CsLAC18导入到烟草及枳壳中，获得的转基因超表达植株和沉默系株系，经生物学功能验证，表明本发明克隆的CsLAC18基因具有正向调控抗寒功能。
总之，本发明利用基因克隆技术从甜橙中分离、克隆获得了具有抗寒功能的低温诱导基因，为植物抗寒等品种的转基因培育奠定了基础，并为植物抗寒基因工程提供重要的基因组员，能够提高植物的抗寒性能。
附图说明
图1为本发明中甜橙漆酶基因CsLAC18的克隆﹑分离和功能验证的流程示意图。
图2为本发明实施例2中甜橙漆酶基因CsLAC18的亚细胞定位图。
图3为本发明实施例3中超表达烟草阳性鉴定及表达量分析图。图中M是marker，P是plasmid，Wt是wild type，W是water；A是指35s启动阳性鉴定，B是指NTP2片段阳性鉴定，C是指q-PCR表达量分析。
图4为本发明实施例3中基因CsLAC18转化烟草低温处理前、后的表型图。图中A是指低温处理前、后转基因烟草的表型；B是指低温处理后转基因烟草的相关生理指标测定，包括成活率、相对电导率、MDA含量；C是指低温处理前后转基因烟草的叶绿素荧光测定；D是指低温处理前转基因烟草的Fv/Fm；E是指低温处理处理后转基因烟草的Fv/Fm。
图5为本发明实施例3中转CsLAC18基因烟草株系及野生型（WT）生理指标测定图。图中A是低温处理后DAB和NBT组织化学染色；B是指H2O2含量测定；C是指CAT含量测定；D是指SOD含量测定；E是指O2-含量测定；F是指POD含量测定；G是指漆酶活力测定。
图6为本发明实施例4中CsLAC18基因VIGS材料鉴定及表达量分析图。图中A是指CsLAC18干涉材料（TRV2-CsLAC18）和空载材料TRV1鉴定，“M”代表marker，“P”代表plasmid，“W”代表ddH2O，“Wt”代表野生型枳；B是指随机选取10株阳性材料鉴定其表达量。
图7为本发明实施例4中CsLAC18转化烟草低温处理前后的表型图。图中A是指低温处理前后的表型；B是指电导率测定和MDA含量测定；C是指处理前后叶绿素荧光表型；D是指处理前Fv/Fm值；E是指处理后Fv/Fm值。
图8为本发明实施例4中CsLAC18基因枳株系及野生型（WT）生理指标测定图。图中A是指低温处理后DAB染色； B是指低温处理后NBT染色； C是指低温处理处理后H2O2含量测定；D是指低温处理后POD酶活；E是指低温处理后抗超氧阴离子含量测定；F是指低温处理后CAT酶活。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护权限不限于下述的实施例。
实施例1 甜橙漆酶基因CsLAC18全长cDNA的克隆
本实施例在甜橙基因组数据库（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/）中获得其CDS序列，并在该序列的5’非编码区和3’非编码区设计引物，其中正向引物：CsLAC18forward:
5’- ATGGGAGCTTCTCTTCTTCGATC -3’；
反向引物：CsLAC18 reverse :
5’- TCAGCACTGAGGAAGATCTG -3’。然后，以甜橙cDNA为模板，采用McLab高保真酶（购自北京擎科生物科技有限公司）进行扩增其全长。
研究材料甜橙种植在扬州大学园艺与植物保护学院植物培养室，其苗龄为60天。挑选生长势健壮的甜橙幼苗，随机称取0.1 g叶片样品，迅速用液氮进行速冻。甜橙RNA的提取采用北京擎科公司的植物总RNA快速提取试剂盒，具体方法如下：
1）将超低温中保存的样品转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵充分研磨组织，期间可不断加入液氮，直至研磨成粉状。取适量研磨好的粉状样品转移到新的1.5 mL无RNase的离心管中，并立即加入1 mL预冷的裂解液RL，充分匀浆（手动摇或涡旋仪涡旋）。
2）室温（15～30 ℃）下静置5 min以使核蛋白完全分解。
3）在每1 mLRL中加入200 μL预冷的氯仿，盖紧样品管盖，剧烈振荡15 s并将其在室温下孵育3 min。
4）于4 ℃、12000 r/min条件下离心10 min，样品分成三层：下层为有机相，中间层和上层为无色的水相，RNA存在于水相中，水相层的容量约为所加RL体积的50%，将水相转移到新管中，进行下一步操作。
5）向新管加入水相体积一半的无水乙醇混匀，得到溶液。将溶液转入吸附柱子RA中。吸附柱套在收集管中，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱RA中，可两次转入吸附柱RA中。
6）于4 ℃、12000 r/min条件下离心45秒，弃废液，将吸附柱重新套回收集管。
7）向步骤6）的收集管加入500 μL去蛋白液RE，于12000 rpm条件下离心45秒，弃废液。
8）再加入500 μL漂洗液RW，于12000 rpm条件下离心45秒，弃废液。
9）重复步骤8）一次。
10）将吸附柱RA放回空收集管中，于13000 rpm条件下离心2 min，除去漂洗液，以免漂洗液中残留的乙醇抑制下游反应。
11）取出吸附柱RA，放入RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50～80 μL RNase free water，室温下放置2 min，于12000rpm条件下离心1 min，得到甜橙RNA。
12）RNA浓度及质量检测，使用琼脂糖凝胶电泳（1 %琼脂糖）和NanoDropTM 2000紫外分光光度计（Thermo）进行检测，其OD260/OD280 比值在1.7-2.1为好。
以甜橙RNA为模板，逆转录合成cDNA。cDNA的合成使用RevertAid First StrandcDNA Synthesis Kit试剂盒#K1622（Thermo，USA），合成方法按照说明书进行。所得的cDNA用于CsLAC18基因的PCR扩增。PCR扩增以上述设计的CsLAC18 forward和CsLAC18 reverse为引物。PCR基因扩增的详细步骤如下：98℃预变性3 min；98℃变性30 s，58℃退火90 s，72℃延伸40 s，35个循环，循环完成后72℃延伸5 min。扩增完成后产生单一条带的PCR产物，经1%的琼脂糖凝胶电泳后，采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（Axygene, USA）对扩增得到的凝胶产物进行纯化回收。将纯化产物与pMD® 18-T载体（TaKaRa, Japan）进行连接反应，反应体系总体积是10 µl，其中6 µl 5× Solution I（购自宝日医生物技术(北京)有限公司），3 µl的PCR纯化的产物，1 µl pMD®18-T vector，于16℃条件下孵育30 min后转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α（购自北京擎科有限公司）。然后，以目的基因序列引物（此处引物是指CsLAC18 forward和CsLAC18 reverse）进行菌液PCR阳性鉴定并测序（由北京擎科有限公司完成），最终获得测序结果正确的目的基因提取质粒，该质粒中包含甜橙抗寒基因CsLAC18，抗寒基因CsLAC18的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
经生物信息学分析cDNA序列显示，CsLAC18基因全长1743 bp，它包括的编码阅读框可编码580个氨基酸，等电点为9.10，预测的分子量为6.401 KDa。MEGAX分析（https://www.megasoftware.net）该序列发现其与已知的（所有已发表的文献和数据库中）的植物序列高度同源。WoLF PSORT分析（wolfpsort.hgc.jp/）表明编码的CsLAC18有一个膜定位信号。根据氨基酸的多序列比对构建的进化树来看，甜橙CsLAC18基因同水稻的AtLAC5和AtLAC15进化上亲缘关系最近。
实施例2 甜橙漆酶基因CsLAC18的亚细胞定位
根据CsLAC18基因的核苷酸序列和p101-YFP载体图谱（载体p101-YFP购自广州辉骏生物有限公司），将基因序列前后分别加入EcoRI和BamHI酶切位点。酶切位点的序列如下所示：
EcoRI：GAATTC
BamHI：GGATCC。
采用CloneExpress® II One Step Cloning Kit试剂盒（Vazyme, China）进行一步法构建载体，连接方法参见试剂盒说明书。扩增采用Phanta® Max Super-Fidelity DNApolymerase高保真酶（Vazyme, China），将测序结果正确的目的基因提取质粒作为模板，用加入酶切位点的引物进行扩增，其PCR扩增程序为：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性15 s，58℃退火30 s，72 ℃延伸40 s， 35个循环；72 ℃延伸5 min。酶切位点的引物序列如下所示：
D-F1：GAATTC ATGGGAGCTTCTCTTCTTCGATCAC
E-R1：GGATCC GCACTGAGGAAGATCTGCTGGTGG
CsLAC18基因CDS的3′端去除了终止密码子TAG，目的是让CsLAC18基因CDS与p101-YFP载体融合。上述的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（Axygene, USA）回收目的条带。将回收纯化的扩增片段克隆到事先用EcoR I和BamH I进行双酶切并回收的p101-YFP载体中，之后采用一步法进行载体构建，连接方法参照CloneExpress® II One Step Cloning Kit试剂盒说明书，然后将克隆后的载体转化到大肠杆菌感受态DH5α中。将转化后的菌液用PCR检测，PCR鉴定呈阳性的菌液送去测序，提取测序结果正确的菌液中的质粒，得到的重组载体命名为p101-YFP-CsLAC18。
将重组质粒p101-YFP-CsLAC18以及空载质粒p101-YFP转化到农杆菌感受态细胞GV3101（购自北京擎科生物技术有限公司）中，其转化步骤如下：
1）从-80℃取出感受态农杆菌GV3101，于冰上或室温放置解冻，并快速加入5～10μg含有目的基因的双元质粒DNA；
2）插入冰里放置30 min；
3）液氮速冻3 min；
4）37℃热激5 min，加入500μl 不含抗生素的LB液体培养基，在28℃，250 r/min条件下振荡培养4～5 h；
5）离心收集菌体，加入200 μL LB重悬菌体，吸打均匀；
6）将转化过的农杆菌铺于含有适当Kan抗生素的LB平板培养基上，28 ℃培养箱，培养2～3天；
7）挑取单菌落培养并鉴定。
利用烟草叶片，进行该基因的瞬时表达以及荧光观察。准备注射菌液，每个组合准备10 mL注射液，每个组合中两种菌液的终OD600值为：p101-YFP-LAC18/p101-YFP : p19=0.7 : 0.5，用清洗液补足至10 mL。最后在每个10 mL注射菌液中加入10 μL乙酰丁香酮（150 mmol/L），颠倒混匀，常温放置2～3 h，等待注射；取4～6周苗龄的本氏烟草（N.benthamiana），注射烟草叶片背面，一个组合注射2～3片叶片，叶片最好随机分布在不同植株上；光照培养箱中，培养2～3天，用Leica TCS SP8型激光共聚焦显微镜（Leica,Germany）观察荧光。结果如图2所示，黄色荧光分布在细胞膜上，而未在其他地方发现黄色荧光。结果表明，CsLAC18基因定位在细胞膜，是一个膜蛋白。
实施例3 甜橙漆酶基因CsLAC18在提高烟草抗寒性中的应用
1. 植物转化载体构建
根据CsLAC18基因的核苷酸序列和植物双元表达载体pBI121（购自北京擎科生物技术有限公司），设计引物CsLAC18-pBI121-F/R并将CsLAC18基因全长扩增后插入至pBI121载体上的Xba I 和 Sma I 两个酶切位点中间。以甜橙cDNA为模板，引物设计如下：
CsLAC18-pBI121-F:
5’-TCTAGAATGGGAGCTTCTCTTCTTCGATC-3’
CsLAC18-pBI121-R:
5’- CCCGGGTCAGCACTGAGGAAGATCTG-3’。
扩增片段回收、用限制性内切酶Xba I和Sma I分别对质粒pBI121进行双酶切，酶切后电泳并回收，之后采用一步法进行载体构建，将扩增片段与载体质粒pBI121连接，连接方法参照CloneExpress® II One Step Cloning Kit试剂盒说明书。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取单克隆进行阳性鉴定后选取阳性单克隆于含有卡那（Kan）抗生素的LB液体培养基内摇菌、阳性克隆检测及送样测序。待测序结果正确后，对阳性菌株采用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂盒（Axygen，USA）提取质粒，并将该质粒命名为pBI121-CsLAC18，至此超表达载体pBI121-CsLAC18构建完成。将构建好的超表达载体转入农杆菌感受态细胞GV3101中备用。
2. 农杆菌介导的烟草遗传转化
其详细转化步骤如下：
1）菌株准备—从- 80℃取出保存好的pBI121-CsLAC18-农杆菌菌液，用接种环沾少量农杆菌液，在LB固体培养基（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平、25 mg/L庆大霉素）上划线，28 ℃培养2～3 d；挑取单克隆，在新的LB固体培养基（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平、25 mg/L庆大霉素）上再次划线，培养2～3 d，用灭菌的手术刀片将菌体刮下，并置于不含抗生素的MS液体培养基中，28℃、200 r/min培养1～2 h，充分摇散菌体，并用MS液体培养基调整OD600值到0.6-0.8，以备侵染用。
2）外植体准备—选取长势良好的无菌烟草，取最大的叶片2～3片，去掉主脉及叶边缘，切成0.5cm2左右大小的方块，放入无菌且加有少量MS液体培养基的三角瓶中，供侵染用。
3）侵染及共培养—将第一步中培养好的菌液倒入装有外植体的三角瓶中，侵染10min，侵染过程中不断轻摇。侵染后，用灭菌的滤纸吸干外植体带有的菌液，叶背面向下，放于铺有无菌滤纸的共生培养基上，培养室中暗培养3 d。
4）筛选培养—将共培养后的全部外植体收集放入无菌的三角瓶中，加入含400mg/L Cef的无菌水清洗2-3次，然后再用无菌水清洗2～3次，最后用无菌滤纸吸干外植体表面的水，置于筛选培养基上培养。
5）生根培养—将长至1～2 cm长的抗性芽切下来，置于生根培养基中进行生根培养。
6）烟草苗转入土培—待生根后的转化苗长满培养瓶，由生根培养基中取出，用自来水洗净转化苗上的培养基，并将转化苗栽植于已灭菌的营养土中。
烟草转化苗所用培养基见表1，上述培养基中均含有3.0 % 蔗糖和0.8 % 琼脂，且pH值调至5.9～-6.0。培养基高温高压灭菌后，待其冷却至60℃以下时，加入已过滤灭菌的抗生素（每一种培养基都具有不同的抗生素，具体见表1），分装备用。
表1 烟草转化苗所用培养基配方
Table 2 Culture medium formulation for tobacco transformed seedlings
| 培养基名称 | 组分及含量（培养基均含有30 g/L.蔗糖和7.5 g/L琼脂，PH调至5.8-6.0） |
| 共生培养基 | MS基本培养基+2.0～2.25 mg/L 6-BA +0.3 mg/L NAA |
| 筛选培养基 | 共培养培养基+100 mg/L Km+400～500 mg/L Cef |
| 生根培养基 | MS基本培养基+0.3 mg/L NAA+100 mg/L Kan +400～500 mg/L Cef |
3. 转基因阳性苗的的筛选
按照上述方法得到转CsLAC18基因烟草，每株烟草提取其DNA，设计引物（此处引物是指CsLAC18 forward和CsLAC18 reverse）并进行PCR扩增鉴定阳性苗。
3.1 烟草叶片DNA提取
1）取少量叶片放入1.5 mL离心管中，液氮研磨至粉末状，加入600 μL CATB提取液，CTAB提取液配制方法见表2。
表2 CTAB提取液配方
Table 3 Components of CTAB solution
2）充分混匀后放入65℃水浴锅中水浴90 min，期间每30min颠倒混匀一次。
3）水浴完成后，加入700 μL混合抽提液（混合抽提液中各组分体积比为氯仿：异戊醇=24:1），剧烈颠倒混匀，常温下12000 r/min离心15 min，吸取上层清液（约500 μL）转移至新的1.5 mL离心管中。
4）加入与上清等体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀后，放于-20 ℃冰箱沉淀。
5）沉淀完成后取出，12000 r/min离心10 min。倒掉上清，加入1 mL 预冷的75 %乙醇，清洗2～3两次，弃酒精，于通风橱内风干。
6）每管加入20～30 μL ddH2O以溶解DNA，溶解好的DNA保存于-20℃冰箱中。
7）浓度检测，每个样品取1 μL，于NanoDrop2000超微量分光光度计（Thermo, USA）测量，其OD260/OD280比值在1.8～2.0范围内时，DNA纯度较高。同时也通过凝胶电泳检测。
3.2 阳性转基因植株检测
转基因阳性植株的鉴定，以上述提取的DNA为模板，用两对引物检测，即35S启动子正向引物和基因反向引物（引物序列如下）。PCR反应程序和体系参照表3和表4，选取的转基因株系中，若有转基因株系能扩增出预期大小的片段，表明这它们为阳性转基因株系。
35S-F:5’-TCCTCGGATTCCATTGCCCAGC-3’
CsLAC18 reverse：5’- TCAGCACTGAGGAAGATCTG -3’
表3 PCR反应程序
Table 4 PCR program
| 步骤 | 94℃ | 94℃ | 60℃ | 72℃ | 72℃ | 4℃ | 循环数 |
| 步骤1 | 5 min | 1 | |||||
| 步骤2 | 30 s | 30 s | 90 s | 35 | |||
| 步骤3 | 10 min | 1 | |||||
| 步骤4 | ∞ | 1 |
表4 PCR反应体系
Table 5 PCR reaction system
| 反应组分 | 用量（μl） |
| 模板DNA | 2 |
| 2 x Taq PCR Mix | 10 |
| 10μm Primer F | 0.4 |
| 10μm Primer R | 0.4 |
| ddH<sub>2</sub>O | 7.2 |
| total | 20 |
3.3 转基因阳性植株的超表达分析
提取移栽成活的22株转基因阳性苗（依次记为# 1、# 2、…# 22）的RNA并反转录成cDNA（RNA提取方法同实施例1），再用烟草的NPT II基因作为内参进行扩增。Ubiqutin引物的核苷酸序列为：
NPT II正向引物：5’-TAATACGACTCACTATAGGGC -3’
NPT II反向引物：5’-AGATGGTGCACGATGCACAG-3’
用NPT II扩增出来的条带亮度均一致，说明反转录的cDNA浓度相同，再用CsLAC18特异引物作为模板扩增目的条带，CsLAC18特异引物的核苷酸序列为：
CsLAC18正向引物：
5’-GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGAGCTTCTCTTCTTCGATC-3’
CsLAC18反向引物：
5’-ATAAGGGACTGACCACCCGGGTCAGCACTGAGGAAGATCTG-3’
用qRT-PCR法鉴定基因CsLAC18的表达量，可以判断CsLAC18基因在阳性转基因烟草中的表达量，选择表达量高的的# 4和# 7植株（见图3），并将表达量高的两个超表达株系命名为OE4和OE7，二者作为单独的转基因株系，分别收种子至T2代。
4. CsLAC18转基因阳性植株抗寒功能的检测
30 d苗龄的盆栽转基因烟草和野生型烟草（WT）被用于低温抗性鉴定。在低温处理前，超表达CsLAC18基因的烟草和野生型烟草没有明显的表型差异，但在-4℃处理12 h后，野生型受到的伤害比转基因系更严重，绝大多数的叶片都呈水渍化状态，而转基因系只有部分烟草呈现水渍化（见图4）。恢复后统计成活率，转基因植株具有更高的成活率，其中#4系为89.1 %，#22系为84.3 %，而野生型植株的存活率仅为14.7 %。电导率测定发现野生型烟草在低温处理后的相对电导率更高，说明更严重的细胞膜伤害发生在了野生型烟草中，从而导致了更严重的电解质泄漏。此外，相对于WT烟草，转基因烟草积累的MDA含量更低。
叶绿素荧光是一个测定植株遭受到胁迫伤害程度的指标，而死亡的植物叶片不能进行光合作用，在叶绿素荧光成像系统中不能激发出蓝色荧光，呈现褐色，而进行光合作用的存活叶片呈蓝色。如图4所示，处理前野生型和转基因植株叶绿素荧光都呈现深蓝色，而在处理后野生型呈现蓝色部位的面积小于转基因系，褐色部位面积大于转基因系。叶绿素荧光参数Fv/Fm值用于表征 PSⅡ反应中心光能的转化效率，在没有外界胁迫时该数值趋于稳定，变化极小，而当植物遭受外界胁迫时，该参数明显降低。因此，可以通过对植物叶片叶绿素荧光参数Fv/Fm值的测定来评价植物的抗逆能力。通过测定发现，处理前转基因系与野生型的Fv/Fm值无明显差异，而处理后转基因Fv/Fm值明显高于野生型，说明野生型在低温胁迫下伤害程度更大。总之，通过表型观察以及生理数据测定表明超表达CsLAC18使转基因烟草具有更高的耐寒抗冻能力。
此外，本实施例还检测了处理后转基因和野生型烟草的活性氧积累情况。结果表明，低温处理后的CsLAC18超表达烟草积累了更少的活性氧，如H2O2和O2-（见图5）。同时，转基因烟草低温处理后抗氧化酶活力显著上升，而对照无明显变化。可见，在低温处理下转基因植株表现出更强的活性氧清除的能力，这可能是导致其低温抗性增强的重要原因。漆酶活力变化分析表明，未处理时转基因系漆酶活力显著高于野生型烟草，在低温处理后转基因系烟草酶活力显著上升，而野生型烟草却显著降低，这与CsLAC18表达水平相一致。
实施例4 甜橙漆酶基因CsLAC18在降低枳抗寒性中的应用
病毒诱导的基因沉默（VIGS）可将含有目的基因的重组病毒载体导入到宿主植物中，抑制植物体内源基因表达，从而使其表现出目标基因功能丧失或表达水平下降的表型。相对较于传统技术，VIGS技术操作简便、无需构建转基因植株、可快速获得沉默表型，因此被广泛的应用于植物基因组学研究中。
1 植物转化载体构建，具体方法如下：
以甜橙cDNA为模板，设计特异引物扩增CsLAC18基因3’端非保守区域约450 bp左右的片段，将扩增片段并插入到pTRV2载体（购自北京擎科生物技术有限公司）上的BamH I及Sma I两个位点之间。载体构建方法参照实施例3，构建好的载体经测序无误后转化至农杆菌感受态细胞 GV3101。构建载体的引物如下：
CsLAC18-pTRV2-F (BamH I):
5’-GGATCCTAGCCAGGCCCTACAAACAGG-3’
CsLAC18-pTRV2-R (Sma I):
5’-CCCGGGTTCATACTCTAAGATACCAGC-3’
扩增片段回收、用限制性内切酶BamH I和Sma I分别对质粒pTRV2进行双酶切，酶切后电泳并回收，之后采用一步法进行载体构建，扩增片段与质粒pTRV2连接，连接方法参照CloneExpress® II One Step Cloning Kit试剂盒说明书。将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取单克隆进行阳性鉴定后选取阳性单克隆于含有卡那（Kan）抗生素的LB液体培养基内摇菌、阳性克隆检测及送样测序，待测序结果正确后，对阳性菌株用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂盒（Axygen，USA）提取质粒，质粒命名为pTRV2-CsLAC18，至此沉默表达载体pTRV2-CsLAC18构建完成。将构建好的载体转入农杆菌感受态细胞GV3101备用。
同时，将空载质粒pTRV1（购自北京擎科生物技术有限公司）、pTRV2转化至农杆菌感受态细胞GV3101备用。
2. VIGS的侵染转化，具体操作如下：
1）农杆菌侵染液制备—挑取pTRV1、pTRV2、pTRV2-CsLAC18等农杆菌的单克隆于5mL LB液体培养基（含25 mg/L庆大霉素、50 mg/L利福平、50 mg/L卡那霉素）中，于28℃、250r/min条件下充分活化菌体24～48 h。将活化完成的农杆菌菌液按照1:100的比例接种到含有Kan的抗生素的新鲜LB培养基中，于28℃、250 r/min条件下培养过夜。4000 r/min离心，收集菌体，加入MES缓冲液 (缓冲液配方为10 mmol/L MES, 10 mmol/L MgCl2，200 μmol/LAS, pH=5.6-5.7) 悬浮菌体，并调节OD600至1.0。按照1:1的比例混合pTRV1与pTRV2或pTRV2-CsLAC18菌体重悬液。暗处静置2-3 h后即可用于侵染。
2）侵染—新鲜的枳种子从果实中取出，1 mol/L NaOH溶液浸泡15 min 去除果胶，后用无菌水冲洗干净，平铺于湿润的干净纱布上，放置于培养箱内（28℃，黑暗）催芽，待种子幼芽萌发至1～2 cm长时即可用于VIGS侵染。用细针在萌发芽上扎一些小孔（有助于农杆菌侵染），而后浸泡于步骤1）配置好的侵染液中，真空抽气装置（GM-1.0A, JINGTENG,China）抽真空1 min，迅速放气使农杆菌浸入萌发的种子，此步骤可重复2～3次。而后静置10 min，取出种子，在干滤纸上晾干菌液。放入铺有无菌水浸湿滤纸的皿中，暗室放置2～3d。取出种子用清水冲洗干净残留菌液，播于基质中（基质中各组分的质量比为土壤：蛭石=3:1），培养箱中生长25 d后进行阳性鉴定。
3. 转基因阳性苗的的筛选
3.1枳叶片DNA提取
枳叶片DNA方法见实施例3（将烟草叶片换成枳叶片）。
3.2阳性转基因植株检测
转基因阳性植株的鉴定，以上述提取的DNA为模板，用两对引物进行检测，并采用两对引物鉴定阳性植株，其中引物为 pTRV1正反引物，pTRV2正向引物和pTRV2-CsLAC18载体构建的反向引物。选取的转基因株系中，若有转基因株系能扩增出预期大小的片段，表明它们为阳性转基因株系。上述引物的核苷酸序列如下：
TRV1-F：5’-ATTGAGGCGAAGTACGATGG-3’
TRV1-R：5’-CCATCCACAATTATTTTCCGC-3’
TRV2-F：5’-ATTCACTGGGAGATGATACGCT-3’
CsLAC18-pTRV2-R (Sma I):
5’-CCCGGGTTCATACTCTAAGATACCAGC-3’
3.3转基因阳性植株的超表达分析
随选取10棵阳性植株并标号，用qRT-PCR法鉴定CsLAC18的表达量，发现阳性植株中CsLAC18的表达量相对于空载被抑制到28%至67 %，且普遍具有较低表达量，说明VIGS具有较高的干涉效率（见图6）。
4. CsLAC18转基因阳性植株抗寒功能的检测
CsLAC18干涉植株与对照植株在表型上并没有明显的区别，但是-4 ℃处理12 h后，干涉植株的叶片萎蔫程度远高于对照组（见图7），说明其受低温伤害的程度更严重。相比于对照，在低温处理后CsLAC18干涉植株有更高的相对电导率，同时积累了更多的MDA（见图7）。叶绿素荧光成像发现干涉植株的叶片在处理后几乎全部呈现褐色，而对照组只有顶部的嫩叶呈现褐色，处理之前二者没有差别。其次，转基因系与对照组的最大光合速率值Fv/Fm在处理前没有显著差异，但处理后显著低于对照组。综上所述，干涉CsLAC18基因严重抑制了植株的抗寒性，从而进一步证明了该基因在柑橘抗寒中具有重要作用。
另外，本实施例还研究了干涉植株中H2O2的清除或积累情况（见图8）。首先，处理前，CsLAC18干涉植株的抗氧化酶活力比对照组稍低，而在处理后，虽然两者的抗氧化酶活力都有所上升，但是干涉植株的抗氧化酶活力却显著的低于对照。其次，在处理后的CsLAC18干涉植株中积累了更多的H2O2，DAB染色和H2O2的含量测定证明了这一点。这些结果说明干涉CsLAC18基因使枳在低温处理下H2O2的清除受到了抑制，从而导致了植株H2O2的积累，进而使植物更容易受到低温胁迫的伤害。
由以上实施例可以得出，本发明提供的一种柑橘抗寒基因CsLAC18能够提高植物的抗寒性能。
以上所述，仅为本发明中的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解想到的变换或替换，都应涵盖在本发明的包含范围之内，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种甜橙抗寒基因CsLAC18及其应用
<141> 2020-08-28
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1743
<212> DNA
<213> 甜橙(Citrus sinensis)
<400> 1
atgggagctt ctcttcttcg atcaccagca tttctaggag tcatttgctc atttatcaac 60
ttgtgtctgc ttgctgagcc tgcactcggt gtcaccaggc actacaagtt tgatatcaag 120
ttgcaaaatg tgacgcgtct ttgtaacacc aagagcatta tatcagtaaa tgggaagttt 180
ccagggcctc gcattgtagc aagggagggt gaccagcttc ttatcaaagt tatgaaccat 240
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tttatgcatt gccaccttga agtgcataca agctggggtc tgaagatggc ttggattgtt 1680
ttagatggaa agcatcctaa tcagaagcta ccccctccac cagcagatct tcctcagtgc 1740
tga 1743
<210> 2
<211> 580
<212> PRT
<213> 甜橙(Citrus sinensis)
<400> 2
Met Gly Ala Ser Leu Leu Arg Ser Pro Ala Phe Leu Gly Val Ile Cys
1 5 10 15
Ser Phe Ile Asn Leu Cys Leu Leu Ala Glu Pro Ala Leu Gly Val Thr
20 25 30
Arg His Tyr Lys Phe Asp Ile Lys Leu Gln Asn Val Thr Arg Leu Cys
35 40 45
Asn Thr Lys Ser Ile Ile Ser Val Asn Gly Lys Phe Pro Gly Pro Arg
50 55 60
Ile Val Ala Arg Glu Gly Asp Gln Leu Leu Ile Lys Val Met Asn His
65 70 75 80
Val Gln Asn Asn Ile Ser Ile His Trp His Gly Ile Arg Gln Leu Arg
85 90 95
Ser Gly Trp Ala Asp Gly Pro Ala Tyr Ile Thr Gln Cys Pro Ile Gln
100 105 110
Thr Gly Gln Ser Tyr Val Tyr Asn Phe Thr Ile Val Gly Gln Arg Gly
115 120 125
Thr Leu Trp Trp His Ala His Leu Ser Trp Leu Arg Ser Thr Leu Tyr
130 135 140
Gly Pro Ile Ile Ile Leu Pro Lys Arg Gly Ile Pro Tyr Pro Phe Thr
145 150 155 160
Lys Pro Tyr Lys Glu Val Pro Ile Ile Phe Gly Glu Trp Phe Lys Ala
165 170 175
Asp Pro Glu Thr Ile Ile Ser Gln Ala Leu Gln Thr Gly Gly Gly Pro
180 185 190
Asn Val Ser Asp Ala Tyr Thr Ile Asn Gly Leu Pro Gly Pro Leu Tyr
195 200 205
Asn Cys Ser Ala Lys Asp Thr Phe Lys Leu Lys Val Lys Pro Gly Lys
210 215 220
Thr Tyr Leu Leu Arg Leu Ile Asn Ala Ala Leu Asn Asp Glu Leu Phe
225 230 235 240
Phe Ser Ile Ala Asn His Thr Leu Thr Val Val Glu Ala Asp Ala Ile
245 250 255
Tyr Val Lys Pro Phe Glu Thr Glu Thr Leu Leu Ile Ala Pro Gly Gln
260 265 270
Thr Thr Asn Val Leu Leu Lys Thr Lys Pro His Tyr Pro Ser Ala Thr
275 280 285
Phe Phe Met Lys Ala Arg Pro Tyr Val Thr Gly Gln Gly Thr Phe Asp
290 295 300
Asn Ser Thr Val Ala Gly Ile Leu Glu Tyr Glu Lys Pro Leu Asn Phe
305 310 315 320
His Leu Ser Ser Asn Ser Ile Lys Asn Leu Pro Leu Phe Lys Pro Val
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Ser Val Asn Asn Ile Ser Phe Val Met Pro Thr Thr Ala Leu Leu Gln
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Ser Val Glu Leu Ile Met Gln Asp Thr Ser Ile Leu Gly Ala Glu Ser
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485 490 495
Phe Gly Asn Phe Asp Pro Asn Lys Asp Pro Thr Lys Phe Asn Leu Val
500 505 510
Asp Pro Val Glu Arg Asn Thr Val Gly Val Pro Ser Gly Gly Trp Val
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Leu Asp Gly Lys His Pro Asn Gln Lys Leu Pro Pro Pro Pro Ala Asp
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1.一种甜橙抗寒基因CsLAC18在植物抗寒中的应用，其特征在于：其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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