[go: up one dir, main page]

CN111909101B - 一种egfr激酶抑制剂及其在制备抗癌药物方面的应用 - Google Patents

一种egfr激酶抑制剂及其在制备抗癌药物方面的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111909101B
CN111909101B CN201910538865.6A CN201910538865A CN111909101B CN 111909101 B CN111909101 B CN 111909101B CN 201910538865 A CN201910538865 A CN 201910538865A CN 111909101 B CN111909101 B CN 111909101B
Authority
CN
China
Prior art keywords
present
egfr
compound
cells
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910538865.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111909101A (zh
Inventor
金洪传
冯利锋
应士龙
杨丽贤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to PCT/CN2020/089390 priority Critical patent/WO2020228635A1/zh
Publication of CN111909101A publication Critical patent/CN111909101A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111909101B publication Critical patent/CN111909101B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/70—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D239/72—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines
    • C07D239/86—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines with hetero atoms directly attached in position 4
    • C07D239/94—Nitrogen atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/48—Two nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/04—Ortho-condensed systems
    • C07D491/056—Ortho-condensed systems with two or more oxygen atoms as ring hetero atoms in the oxygen-containing ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种EGFR激酶抑制剂及其在制备抗癌药物方面的应用，所述的EGFR激酶抑制剂通过减弱EGFR TKI的碱性的方式，可有效改善由SQSTM1积聚引起的EGFR TKI获得性耐药性，对提高EGFR TKI的临床治疗收益具有重要意义。

Description

一种EGFR激酶抑制剂及其在制备抗癌药物方面的应用
技术领域
本发明涉及药物领域；具体来说，本发明涉及一种新型EGFR激酶抑制剂及其在治疗癌症方面的应用。
背景技术
肺癌是全球范围内发病率最高、导致死亡人数最多的恶性肿瘤，对人类健康造成了严重的威胁。然而，传统的化学治疗方法治疗晚期肺癌的疗效却十分有限。表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR，ErbB1)属于受体酪氨酸激酶ErbB家族中的一员。现有的研究证据表明，在多种实体瘤内普遍存在EGFR高表达、基因扩增或激活型突变(L858R)的现象。EGFR过表达或者激活型突变，会引起下游Ras/Raf/MAPK、PI3K/Akt等细胞增殖、生存信号通路的过度活化。因此，EGFR被认为是一种驱动肺癌、胰腺癌、乳腺癌等恶性肿瘤发生发展的关键癌基因。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKI) 在治疗上述EGFR异常激活的恶性肿瘤方面，临床收益十分显著，曾一度为人们带来巨大的希望。
吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)等第一代EGFR-TKI通过可逆性地结合EGFR的ATP 结合位点而抑制肿瘤细胞EGFR信号通路的激活。然而，临床实践发现，吉非替尼只能维持半年到一年的有效缓解期，很快便产生耐药性。目前，研究揭示吉非替尼的耐药机制主要有以下几个方面：①EGFR 基因的突变：特异性EGFR外显子20的二次突变，引起第790位的苏氨酸被体积较大的甲硫氨酸取代 (T790M)，阻止吉非替尼和厄洛替尼与ATP位点的结合；其他二次耐药突变包括L747S、D761Y以及 T854A等；②EGFR信号转导路径的变化，如Ras活化引起Raf-MEK-MAPK的上调，与EGFR失去偶联， ERK、Met高表达以及PTEN失活引起AKT通路的过度活化等；③EGFR旁路效应：如血小板源性生长因子受体(PDGFR)、胰岛素样生长因子受体-1(IGFR-1)受体等生长因子受体直接活化其下游信号通路。针对EGFR的T790M突变开发的第二代EGFR-TKI阿法替尼(Afatinib，BIBW2992)、第三代EGFR-TKI 奥西替尼(Osimertinib，AZD9291)已经开始应用于临床，但亦不可避免地产生了各种耐药性，其机制包括产生C797S突变、EGFR、HER2、c-Met基因扩增等。
自噬是在应激状态下，细胞通过降解大分子物质和损伤的细胞器来维持能量供应及清除有害物质，从而维持自身稳态的一种生物学过程。近年来，大量研究发现自噬对于恶性肿瘤的进展和EGFR TKI获得性耐药的产生密切相关。自噬既可以阻止正常细胞恶变，又可以帮助已经恶变的细胞抵抗不利的生存环境，促进耐药性的产生。作为介导细胞自噬、能量感应、氧化应激等多个信号通路的关键配体蛋白SQSTM1 (Sequestosome-1，又称为p62)，其在肿瘤的发生发展及耐药中均发挥了非常重要的作用。作为配体蛋白， SQSTM1对多个促癌信号通路有重要调控作用，其不仅介导mTORC1在溶酶体中的活化，也可以通过与 keap1的直接作用使其与Nrf2的相互作用解离，从而抑制keap1介导Nrf2的泛素化降解。SQSTM1的蛋白水平升高，不仅意味着细胞自噬相关降解途径被削弱，同时也可以帮助肿瘤细胞抵抗凋亡。有研究发现铂类药物耐药性细胞内SQSTM1的表达出现上调，相反地，降低SQSTM1的蛋白水平可有效提高肿瘤对药物的敏感性。此外，SQSTM1可发生浆核穿梭，从而参与对放疗、化疗等引起的DNA损伤的修复，同样地证明SQSTM1是促进肿瘤耐药性产生的关键调节因子。然而，对于SQSTM1在EGFR TKI耐药性产生过程中扮演着怎样的角色，目前仍未可知。通过阐明SQSTM1在EGFR TKI耐药性产生过程的重要作用，并通过针对SQSTM1调控EGFR TKI耐药性的作用机制，进行EGFR TKI的合理改造，有望克服临床上EGFR TKI获得性耐药性这一难题，对提高EGFR TKI的临床治疗收益具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种抗癌作用强，同时又不会影响细胞自噬进程和溶酶体功能的新型EGFR激酶抑制剂及其在制备预防和/或治疗与受体酪氨酸蛋白激酶有关的疾病和病症(例如，癌症，特别是非小细胞肺癌)的药物中的应用。
本发明提供一种如式Ⅰ所示的化合物及其药学上可接受的盐，
Figure GDA0003576518700000021
式Ⅰ中，
A环为5至18元环，或，A环不存在；
X为-O-、-S-、-N(R4)-或-(CHR4)n-，n为0或1；
R1选自：芳基、芳烷基、芳香族或非芳香族杂环基和杂环烷基；
R2选自：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳香族或非芳香族杂环基、杂环烷基、-COR4、-C(O)OR4、-C(O)NR4R5、-CH＝NR4、-CN、-OR4、-OC(O)R4、-S(O)t-R4、-NR4R5、-NR4C(O)R5、 -NO2、-N＝CR4R5和卤素；
R3每次出现时独立地选自：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳香族或非芳香族杂环基、杂环烷基、-COR4、-C(O)OR4、-C(O)NR4R5、-CH＝NR4、-CN、-OR4、-OC(O)R4、-S(O)t-R4、 -NR4R5、-NR4C(O)R5、-NO2、-N＝CR4R5和卤素；
m为0-3的整数(具体如0、1、2、3)；
t为1、2或3；
R4和R5分别独立地选自：氢、烷基、环烷基、烯基、芳基、芳香族或非芳香族杂环基、烷氧基、芳氧基和卤素；
并且，式Ⅰ所示的化合物结构中含有至少一个酸性取代基，该酸性取代基含有至少一个酸性官能团。
在本发明的一个实施方式中，酸性官能团选自：酚羟基、羧基、磺酸基和磷酸基中的一种或多种。
在本发明的一个实施方式中，酸性取代基选自：羟基苯基、羧基苯基、磺酸基苯基、磷酸基苯基、羟基苯甲酰氧基取代烷基、磺酸基取代烷基、羧基取代烷基、磷酸基取代烷基、磺酸基苯基取代烷基、羧基苯基取代烷基、磷酸基苯基取代烷基、羟基苯甲酰氧基取代烷氧基、磺酸基取代烷氧基、羧基取代烷氧基、磷酸基取代烷氧基、磺酸基苯基取代烷氧基、羧基苯基取代烷氧基和磷酸基苯基取代烷氧基中的一个或多种。
在本发明的一个实施例中，羟基苯基中，羟基位于苯基的2-5位中的至少一个。
在本发明的一个实施例中，羧基苯基中，羧基位于苯基的2-5位中的至少一个。
在本发明的一个实施例中，磺酸基苯基中，磺酸基位于苯基的2-5位中的至少一个。
在本发明的一个实施例中，磷酸基苯基中，磷酸基位于苯基的2-5位中的至少一个。
在本发明的一个实施例中，羟基苯甲酰氧基为二羟基苯甲酰氧基(例如，2,3-二羟基苯甲酰氧基、2,4- 二羟基苯甲酰氧基、2,5-二羟基苯甲酰氧基、2,6-二羟基苯甲酰氧基、3,4-二羟基苯甲酰氧基、3,5-二羟基苯甲酰氧基、3,6-二羟基苯甲酰氧基、4,5-二羟基苯甲酰氧基、4,6-二羟基苯甲酰氧基或5,6-二羟基苯甲酰氧基)或三羟基苯甲酰氧基(例如，2,3,4-三羟基苯甲酰氧基、2,3,5-三羟基苯甲酰氧基、2,3,6-三羟基苯甲酰氧基、2,4,5-三羟基苯甲酰氧基、2,4,6-三羟基苯甲酰氧基、2,5,6-三羟基苯甲酰氧基、3,4,5-三羟基苯甲酰氧基、3,4,6-三羟基苯甲酰氧基或4,5,6-三羟基苯甲酰氧基)。
在本发明的一个实施方式，烷基为C1-C6烷基，优选为C1-C3烷基。
在本发明的一个实施方式，烷氧基为C1-C6烷氧基，优选为C1-C3烷氧基。
在本发明的一个实施例中，式Ⅰ所示的化合物结构中含有至少一个如下结构的取代基：
Figure GDA0003576518700000031
在本发明的一个实施例中，X为-O-。
在本发明的另一个实施例中，X为-NH-。
在本发明的另一个实施例中，X为-(CHR4)n-，n为0，即X不存在。
在本发明的一个实施方式中，R1为取代的芳基，如取代的苯基。
在本发明的另一个实施方式中，R1为取代的杂环基，如取代的吲哚基(如3-吲哚基)。
在本发明的一个实施例中，m为2。
在本发明的另一个实施例中，m为0。
在本发明的一个实施方式中，A环为芳环，优选为苯环，其与相连的嘧啶环形成喹唑啉环结构。
在本发明的另一个实施方式中，A环为杂芳环，优选为单杂原子五元芳环，例如，吡咯环、呋喃环或噻吩环，其与嘧啶环稠合形成五元单杂芳环[3,2-d]并嘧啶环结构。
在本发明的另一个实施方式中，A环不存在。
在本发明的一个具体实施方式中，式Ⅰ中，A环为芳环，R1为取代苯基，所述化合物具有通式Ⅱ所示结构：
Figure GDA0003576518700000032
式Ⅱ中，X为-O-、-S-、-N(R17)-或-(CHR17)n-，n为0或1；
R11、R12和R13独立地选自：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳香族或非芳香族杂环基、杂环烷基、-COR17、-C(O)OR17、-C(O)NR17R18、-CH＝NR17、-CN、-OR17、-OC(O)R17、-S(O)t-R17、 -NR17R18、-NR17C(O)R18、-NO2、-N＝CR17R18和卤素；
R14选自：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳香族或非芳香族杂环基、杂环烷基、-COR17、-C(O)OR17、-C(O)NR17R18、-CH＝NR17、-CN、-OR17、-OC(O)R17、-S(O)t-R17、-NR17R18、 -NR17C(O)R18、-NO2、-N＝CR17R18和卤素；
R15和R16独立地选自：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳香族或非芳香族杂环基、杂环烷基、-COR17、-C(O)OR17、-C(O)NR17R18、-CH＝NR17、-CN、-OR17、-OR19-R18、-OC(O)R17、 -S(O)t-R17、-NR17R18、-NR17C(O)R18、-NO2、-N＝CR17R18和卤素；或R15和R16与其所连接的苯环形成任意取代的稠环体系；
t为1、2或3；
R17和R18独立地选自：氢、烷基、环烷基、烯基、芳基、芳香族或非芳香族杂环基、烷氧基、芳氧基、卤素和氨基；
R19为亚烷基；
并且，式Ⅱ所示的化合物结构中含有至少一个酸性取代基，该酸性取代基含有至少一个酸性官能团。所述酸性官能团和酸性取代基具有本发明上述定义。
在本发明的一个实施方式中，R11、R12、R13、R14、R15和R16中至少一个含有酸性官能团。
在本发明的一个具体实施方式中，R15含有至少一个酸性官能团。
在本发明的一个具体实施方式中，R15选自：羟基苯基、羧基苯基、磺酸基苯基、磷酸基苯基、羟基苯甲酰氧基取代烷基、磺酸基取代烷基、羧基取代烷基、磷酸基取代烷基、磺酸基苯基取代烷基、羧基苯基取代烷基、磷酸基苯基取代烷基、羟基苯甲酰氧基取代烷氧基、磺酸基取代烷氧基、羧基取代烷氧基、磷酸基取代烷氧基、磺酸基苯基取代烷氧基、羧基苯基取代烷氧基和磷酸基苯基取代烷氧基。
在本发明的一个实施例中，R15为
Figure GDA0003576518700000041
在本发明的一个实施例中，X为-NH-。
在本发明的一个实施方式中，R11、R12和R13独立地选自：氢、卤素(如F、Cl)、-NO2、烯基、炔基和-O(CH2)xAr，x为0或1，Ar为芳基(例如苯基)或杂环基(例如，含氮杂环基)。
在本发明的一个实施例中，R11为F，R12为Cl，R13为氢。
在本发明的另一个实施例中，R11为氢，R12为Cl，R13为F。
在本发明的一个实施方式中，R11为氢，R13为氢，R12选自：卤素、乙烯基和乙炔基。
在本发明的一个实施方式中，R14选自：氢、烷基、-CN和卤素。
在本发明的一个实施例中，R14为氢。
在本发明的一个实施方式中，R16为-OR19-R18，其中R19为亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基，R18选自：芳香族或非芳香族杂环基(如吗啉基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基等)、烷氧基(如甲氧基、乙氧基、丙氧基)、芳氧基(如苯氧基)和取代的氨基(如甲氨基、二甲氨基)。
在本发明的一个具体实施方式中，R16为-OR19-R18，其中R19为亚乙基或亚丙基，R18选自：吗啉基、哌嗪基、二甲氨基、吡咯烷基、哌啶基、甲氧基和乙氧基。
具体地，R16可选自：3-(4-吗啉基)丙氧基、3-(1-哌嗪基)丙氧基、3,3-二甲氨基丙氧基、3-(1-吡咯烷基) 丙氧基、3-(1-哌啶基)丙氧基、3-(4-哌啶基)丙氧基、甲氧乙氧基和乙氧乙氧基。
在本发明的一个实施例中，R16为
Figure GDA0003576518700000042
在本发明的一个实施方式中，R16为-NHC(O)R18，其中R18选自：取代或未取代的烯基(如乙烯基、 1-丙烯基、1-丁烯基)，该烯基上的取代基可选自：芳香族或非芳香族杂环基(如吡咯烷基、哌啶基)、烷氧基(如甲氧基、乙氧基)和取代的氨基(如甲氨基、二甲氨基)。
在本发明的一个具体实施方式中，R16选自：4-甲氧基-2-丁烯酰胺基、4-吡咯烷基-2-丁烯酰胺基、4- 二甲氨基-2-丁烯酰胺基和4-哌啶基-2-丁烯酰胺基。
在本发明的一个实施例中，所述化合物具有如下结构：
Figure GDA0003576518700000043
在本发明的另一个实施方式中，式Ⅰ中，A环为单杂原子五元芳环，R1为取代苯基，所述化合物具有通式Ⅲ所示结构：
Figure GDA0003576518700000044
式Ⅲ中，
X为-O-、-S-、-N(R29)-或-(CHR29)n-，n为0或1；
Y为-O-、-S-或-N(R29)-；
Z为-O-、-S-或-N(R29)-；
R21、R22和R23独立地选自：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳香族或非芳香族杂环基、杂环烷基、-COR29、-C(O)OR29、-C(O)NR29R28、-CH＝NR29、-CN、-OR29、-OC(O)R29、-S(O)t-R29、 -NR29R210、-NR29C(O)R210、-NO2、-N＝CR29R210和卤素；
R24、R25和R26独立地选自：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳香族或非芳香族杂环基、杂环烷基、-COR29、-C(O)OR29、-C(O)NR29R28、-CH＝NR29、-CN、-OR29、-OC(O)R29、-S(O)t-R29、 -NR29R210、-NR29C(O)R210、-NO2、-N＝CR29R210和卤素；
R27和R28独立地选自：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳香族或非芳香族杂环基、杂环烷基、-COR29、-C(O)OR29、-C(O)NR29R28、-CH＝NR29、-CN、-OR29、-OC(O)R29、-S(O)t-R29、 -NR29R210、-NR29C(O)R210、-NO2、-N＝CR29R210和卤素；R27和R28与其所连接的杂环形成任意取代的稠环体系；
t为1、2或3；
R29和R210独立地选自：氢、烷基、环烷基、烯基、芳基、芳香族或非芳香族杂环基、烷氧基、芳氧基、卤素和氨基；
并且，式Ⅲ所示的化合物结构中含有至少一个酸性取代基，该酸性取代基含有至少一个酸性官能团。所述酸性官能团和酸性取代基具有本发明上述定义。
在本发明的一个实施方式中，R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27和R28中至少一个含有酸性官能团。
在本发明的一个具体实施方式中，R26含有至少一个酸性官能团。
在本发明的一个具体实施方式中，R26选自：羟基苯基、羧基苯基、磺酸基苯基、磷酸基苯基、羟基苯甲酰氧基取代烷基、磺酸基取代烷基、羧基取代烷基、磷酸基取代烷基、磺酸基苯基取代烷基、羧基苯基取代烷基、磷酸基苯基取代烷基、羟基苯甲酰氧基取代烷氧基、磺酸基取代烷氧基、羧基取代烷氧基、磷酸基取代烷氧基、磺酸基苯基取代烷氧基、羧基苯基取代烷氧基和磷酸基苯基取代烷氧基。
在本发明的一个实施例中，R26为
Figure GDA0003576518700000051
在本发明的一个实施例中，X为-NH-。
在本发明的另一个实施例中，X为-O-。
在本发明的一个实施例中，Y为-S-。
在本发明的一个实施例中，Z为-NH-。
在本发明的一个实施方式中，R21和R23独立地选自：氢、烷基和卤素。
在本发明的一个实施例中，R21为氢。
在本发明的一个实施例中，R23为氢。
在本发明的一个实施方式中，R22为-NHC(O)R210、其中，R210为取代或未取代的烯基，如乙烯基、 3-丙烯基。具体地，R22可为
Figure GDA0003576518700000052
在本发明的一个实施方式中，R24为杂环基，如取代或未取代的含氮非芳香杂环基(具体如，哌嗪基、哌啶基)，其上取代基选自：烷基(如甲基、乙基)、酰基(如乙酰基、丙酰基)、杂环基(如吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基等)，所述取代位点为含氮非芳香杂环基的氮位。
在本发明的一个具体实施方式中，R24选自：4-(1-乙酰基)哌嗪基、4-(1-甲基)哌嗪基、4-(1-吡咯烷基) 哌嗪基、4-(1-哌啶基)哌嗪基和4-甲基哌嗪基-1-哌啶基。
在本发明的一个实施例中，R24为
Figure GDA0003576518700000061
在本发明的另一个实施方式中，R24为-NR27R28，R27和R28独立地选自：氢和取代或未取代的烷基 (如甲基、3-(甲氨基)丙基)。
在本发明的一个实施例中，R24为N,N-二甲氨基或N1,N1,N2-三甲基乙二胺基。
在本发明的一个实施例中，R25为氢。
在本发明的一个实施方式中，R27和R28独立地选自：氢、烷基和卤素。
在本发明的一个实施例中，R27为氢。
在本发明的一个实施例中，R28为氢。
在本发明的一个实施例中，所述化合物具有如下结构：
Figure GDA0003576518700000062
在本发明的另一个实施方式中，式Ⅰ中，A环不存在，R1为取代苯基，所述化合物具有通式Ⅳ所示结构：
Figure GDA0003576518700000063
式Ⅳ中，
X为-O-、-S-、-N(R39)-或-(CHR39)n-，n为0或1；
Z为-O-、-S-或-N(R39)-；
R31为氢、取代或未取代的芳基或杂环基；
R32、R33、R34、R35和R36独立地选自：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳香族或非芳香族杂环基、杂环烷基、-COR39、-C(O)OR39、-C(O)NR39R310、-CH＝NR39、-CN、-OR39、-OC(O)R39、 -S(O)t-R39、-NR39R310、-NR39C(O)R310、-NO2、-N＝CR39R310和卤素；
R37和R38独立地选自：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳香族或非芳香族杂环基、杂环烷基、-COR39、-C(O)OR39、-C(O)NR39R310、-CH＝NR39、-CN、-OR39、-OC(O)R39、-S(O)t-R39、 -NR39R310、-NR39C(O)R310、-NO2、-N＝CR39R310和卤素；
t为1、2或3；
R39和R310独立地选自：氢、烷基、环烷基、烯基、芳基、芳香族或非芳香族杂环基、烷氧基、芳氧基、卤素和氨基；
并且，式Ⅳ所示的化合物结构中含有至少一个酸性取代基，该酸性取代基含有至少一个酸性官能团。所述酸性官能团和酸性取代基具有本发明上述定义。
在本发明的一个实施方式中，R31、R32、R33、R34、R35、R36、R37和R38中至少一个含有酸性官能团。
在本发明的一个具体实施方式中，R36含有至少一个酸性官能团。
在本发明的一个具体实施方式中，R36选自：羟基苯基、羧基苯基、磺酸基苯基、磷酸基苯基、羟基苯甲酰氧基取代烷基、磺酸基取代烷基、羧基取代烷基、磷酸基取代烷基、磺酸基苯基取代烷基、羧基苯基取代烷基、磷酸基苯基取代烷基、羟基苯甲酰氧基取代烷氧基、磺酸基取代烷氧基、羧基取代烷氧基、磷酸基取代烷氧基、磺酸基苯基取代烷氧基、羧基苯基取代烷氧基和磷酸基苯基取代烷氧基。
在本发明的一个实施例中，R36为
Figure GDA0003576518700000071
在本发明的一个实施例中，X为-(CHR39)n-，n为0，即X不存在。
在本发明的一个实施例中，Z为-NH-。
在本发明的一个实施方式中，R31为取代的芳基，如取代的苯基，具体如
Figure GDA0003576518700000072
其中， R310为取代或未取代的烯基，如乙烯基、3-丙烯基，烯基上的取代基选自：烷氧基(如甲氧基、乙氧基)、杂环基(如哌啶基、吡咯烷基)和取代的氨基(如甲氨基、二甲氨基)。
在本发明的一个具体实施方式中，R31选自：3-丙烯酰胺基苯基、3-(4-甲氧基-2-丁烯酰胺基)苯基、3-(4- 哌啶基-2-丁烯酰胺基)苯基、3-(4-吡咯烷基-2-丁烯酰胺基)苯基、3-(4-二甲胺基-2-丁烯酰胺基)苯基。
在本发明的另一个实施方式中，R31为取代或未取代的杂环基，如吡唑[1,5-a]并吡啶基或取代的吲哚基，吲哚基的取代基选自：氢、烷基和酰基。
在本发明的一个实施例中，R31为
Figure GDA0003576518700000073
在本发明的一个实施例中，R32为氢。
在本发明的一个实施方式中，R33为
Figure GDA0003576518700000074
其中X3为-NH-或-O-，R39为取代或未取代的烯基，如乙烯基、3-丙烯基，烯基上的取代基选自：烷氧基(如甲氧基、乙氧基)、杂环基(如哌啶基、吡咯烷基)和取代的氨基(如甲氨基、二甲氨基)。
在本发明的一个具体实施方式中，R33选自：丙烯酰氧基、丙烯酰胺基、4-甲氧基-2-丁烯酰氧基、4- 甲氧基-2-丁烯酰胺基、4-哌啶基-2-丁烯酰氧基、4-哌啶基-2-丁烯酰胺基、4-吡咯烷基-2-丁烯酰氧基、4- 吡咯烷基-2-丁烯酰胺基、4-二甲胺基-2-丁烯酰氧基和4-二甲胺基-2-丁烯酰胺基。
在本发明的一个实施例中，R33为
Figure GDA0003576518700000075
在本发明的一个实施例中，R35为氢。
在本发明的一个实施方式中，R34为取代或未取代的杂环基，如取代的含氮非芳香杂环基(具体如，哌嗪基、哌啶基)，其上取代基选自：烷基(如甲基、乙基)、酰基(如乙酰基、丙酰基)、杂环基(如吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基等)，所述取代位点为含氮非芳香杂环基的氮位。
在本发明的一个具体实施方式中，R34选自：4-(1-乙酰基)哌嗪基、4-(1-甲基)哌嗪基、4-(1-吡咯烷基) 哌嗪基、4-(1-哌啶基)哌嗪基和4-甲基哌嗪基-1-哌啶基。
在本发明的另一个实施方式中，R34为-NR27R28，R27和R28独立地选自：氢和取代或未取代的烷基 (如甲基、3-(甲氨基)丙基)。
在本发明的一个具体实施方式中，R34为N,N-二甲氨基或N1,N1,N2-三甲基乙二胺基。
在本发明的一个实施例中，R34为
Figure GDA0003576518700000076
在本发明的一个实施方式中，R37和R38独立地选自：氢、卤素、硝基、氰基和三氟甲基。
在本发明的一个实施例中，R37为氢。
在本发明的一个实施例中，R38为氢。
在本发明的一个实施例中，所述化合物具有如下结构：
Figure GDA0003576518700000081
本发明还提供一种上述化合物的制备方法，其包括向具有EGFR抑制活性的化合物(例如，已知EGFR TKI化合物)结构中通过反应引入至少一个酸性官能团的步骤。
在本发明的一个实施方式中，酸性官能团选自：酚羟基、羧基、磺酸基和磷酸基中的一种或多种。
在本发明的一个实施方式中，上述制备方法包括通过反应引入一个或多个选自以下的基团：羟基苯基、羧基苯基、磺酸基苯基、磷酸基苯基、羟基苯甲酰氧基取代烷基、磺酸基取代烷基、羧基取代烷基、磷酸基取代烷基、磺酸基苯基取代烷基、羧基苯基取代烷基、磷酸基苯基取代烷基、羟基苯甲酰氧基取代烷氧基、磺酸基取代烷氧基、羧基取代烷氧基、磷酸基取代烷氧基、磺酸基苯基取代烷氧基、羧基苯基取代烷氧基和磷酸基苯基取代烷氧基。
在本发明的一个实施方式中，上述制备方法中，EGFR TKI化合物为吉非替尼。
在本发明的一个实施例中，上述制备方法包括如下反应步骤：
Figure GDA0003576518700000082
其中，X、R11、R12、R13、R14、R16具有本发明上述定义，
Ra为卤原子，
Rp为羟基保护基团；
第2步反应为羟基脱保护反应。
在本发明的另一个实施例中，上述制备方法包括如下反应步骤：
Figure GDA0003576518700000083
其中，X、Y、Z、R21、R22、R23、R24、R25、R27、R28具有本发明上述定义，
Ra为卤原子，
Rp为羟基保护基团；
第2步反应为羟基脱保护反应。
在本发明的另一个实施例中，上述制备方法包括如下反应步骤：
Figure GDA0003576518700000091
其中，X、Z、R31、R32、R33、R34、R35、R37、R38具有本发明上述定义，
Ra为卤原子，
Rp为羟基保护基团；
第2步反应为羟基脱保护反应。
为实现羟基保护和脱保护的目的，所述羟基保护基团和羟基脱保护反应可选择本领域常规的羟基保护基团和羟基脱保护反应，本发明对此不作具体限定。
本发明还提供一种改造EGFR TKI的方法，其包括减弱EGFR TKI的碱性的步骤，例如，在该EGFR TKI的结构中引入至少一个酸性官能团的步骤。
所述酸性官能团具有本发明上述定义。
本发明还提供一种上述化合物或其药学上可接受的盐的立体异构体、几何异构体、互变异构体、消旋体、溶剂化物、水合物、代谢前体和前药。
本发明还提供一种药物组合物，其包含上述化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、几何异构体、互变异构体、消旋体、溶剂化物、水合物、代谢前体或前药，以及一种或多种药学上可接受的辅料。
所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体。例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮等；湿润剂如甘油等；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠等；吸收促进剂如季铵化合物等；表面活性剂如十六烷醇等；吸附载体如高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。另外，还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明所述的药物组合物可以为片剂(包括糖衣片剂、膜包衣片剂、舌下片剂、口腔崩解片、口腔片剂等等)、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂(包括软胶囊、微胶囊)、锭剂、糖浆剂、液体、乳剂、混悬剂、控制释放制剂(例如，瞬时释放制剂、缓释制剂、缓释微囊)、气雾剂、膜剂(例如，口服崩解膜剂、口腔粘膜-粘附膜剂)、注射剂(例如，皮下注射、静脉注射、肌内注射、腹膜内注射)、静脉滴注剂、透皮吸收制剂、软膏剂、洗剂、粘附制剂、栓剂(例如，直肠栓剂、阴道栓剂)、小药丸、鼻制剂、肺制剂(吸入剂)、眼睛滴剂等等、口服或胃肠外制剂(例如，通过静脉内、肌内、皮下、器官内、鼻内、皮内、滴注、脑内、直肠内等给药形式，给药至肿瘤的附近和直接给药至病变处)。在本发明的一个实施方式中，所述的药物组合物为注射剂。
本发明的药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种辅料混合，然后将其制成所需的剂型。
本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1-99.5％的活性成分，更优选含有重量比为0.5-95％的活性成分。
本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，可以一次或多次施用。
本发明还提供一种上述化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、几何异构体、互变异构体、消旋体、溶剂化物、水合物、代谢前体和前药在制备预防和/或治疗与受体酪氨酸蛋白激酶有关的疾病和病症的药物中的应用。
本发明还提供一种预防和/或治疗与受体酪氨酸蛋白激酶有关的疾病和病症的方法，其包括将本发明所述化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、几何异构体、互变异构体、消旋体、溶剂化物、水合物、代谢前体和前药、或所述药物组合物施用至由此需求的个体的步骤。
所述与受体酪氨酸蛋白激酶有关的疾病和病症为肿瘤，其包括但不限于：肺癌、胰腺癌、乳腺癌或结肠癌，特别是肺癌，更特别是非小细胞肺癌。
本发明的发明人经过大量实验首创性地发现EGFR TKIs的抗肿瘤效果和其自身的酸碱性密切相关，目前临床上使用的EGFR TKI(如吉非替尼和AZD9291)会使肿瘤细胞溶酶体酸化过程减弱，进而造成促癌蛋白SQSTM1的积累，最终导致肿瘤获得性耐药性的产生。发明人通过减弱EGFR TKI的碱性的方式，开发了一系列EGFR TKI化合物，其可有效改善由SQSTM1积聚引起的EGFR TKI获得性耐药性，对提高EGFR TKI的临床治疗收益具有重要意义。
附图说明
图1所示为实施例1中用吉非替尼处理后的A549、HCC827和H460细胞中SQSTM1表达量的测定结果。
图2所示为实施例1中用AZD9291处理后的A549、HCC827和H460细胞中SQSTM1表达量的测定结果。
图3所示为实施例2中A549和H460细胞中LC3和SQSTM1表达量的测定结果。
图4所示为实施例3的检测结果；图4中的 A为免疫荧光显微镜检测GFP-LC3和RFP-LC3的斑点照片，其中，第一列图中斑点均为绿色荧光斑点，第二列图中斑点均为红色荧光斑点，第三列图中斑点均为黄色荧光斑点；图4中的 B所示为各实验组LC3黄色斑点/红色斑点(％)的结果。
图5所示为实施例4的检测结果；其中，第一列图表示在A549细胞中瞬转SQSTM1-Flag的质粒，接着用抗生素G418筛选得到稳定转染的单克隆细胞团后，用不同浓度的Gefitinib和AZD9291处理48 小时，MTS法检测细胞活力的结果。第二列图表示在H460细胞中敲减SQSTM1 48小时后，用不同浓度的Gefitinib和AZD9291处理24小时，MTS法检测细胞活力的结果。
图6所示为实施例5的检测结果；图6中的 A为采用吉非替尼和AZD9291处理A549不同时间后，免疫荧光法检测LC3蛋白表达变化的结果；图6中的 B所示为图6中的 A中结果的统计分析，分别统计10个随机视野，标尺为10μm，星号(*)代表P<0.05，为有统计差异。
图7所示为实施例6的检测结果；其中，图7中的 A为LAMP1和LC3的免疫荧光检测照片，图7中的 B所示为各实验组的共定位系数的统计结果。
图8所示为实施例7中吉非替尼、AZD9291、CQ和CQ联用Baf A1处理后A549和HCC827细胞中成熟体CTSB表达量的测定结果。
图9所示为实施例8的检测结果；其中，图9中的A为荧光显微镜检测照片，其中，比例尺为10μM，第一、三行图中的斑点均为红色荧光斑点，第二、四行图片中的斑点均为绿色荧光斑点，图9中的B所示为各实验组AO-红色斑点的检测结果。
图10所示为化合物Ⅱ-1(Gefi-2OH)的合成路径。
图11所示为化合物Ⅲ-1的合成路径。
图12所示为化合物Ⅳ-1(AZD-2OH)的合成路径。
图13所示为实施例13的检测结果。其中，图13中的A为H460细胞中吉非替尼和化合物Gefi-2OH 处理后SQSTM1和成熟体CTSB的表达量的测定结果，图13中的B为A549和HCC827细胞中吉非替尼和化合物Gefi-2OH处理后，EGFR及其下游Akt、Erk1/2蛋白的磷酸化修饰程度以及其蛋白本身表达量的检测结果。
图14所示同样为实施例13的检测结果。其中，图14中的A为H460细胞中AZD9291和化合物 AZD-2OH处理后SQSTM1和成熟体CTSB的表达量的测定结果，图14中的B为HCC827细胞中AZD9291 和化合物AZD-2OH处理后，EGFR及其下游Akt、Erk1/2蛋白的磷酸化修饰程度以及其蛋白本身表达量的检测结果。
图15所示为实施例14的检测结果。其中，左侧为荧光显微镜检测照片，其中，比例尺为10μM，图片中的斑点均为Lysotracker-blue形成的蓝色荧光斑点，右侧所示为各实验组酸性囊泡斑点(蓝色斑点数量)的检测结果。
图16所示为实施例15的检测结果，其分别为吉非替尼和化合物Gefi-2OH对A549(左侧)和H460 细胞(右侧)的增殖抑制作用的检测结果。
图17所示同样为实施例15的检测结果，为AZD9291和化合物AZD-2OH对H460细胞的增殖抑制作用的检测结果。
图18所示为实施例16的检测结果；其中，左侧为流式细胞术检测结果图，右侧所示为各实验组的细胞凋亡率的结果。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的所有的技术和科学术语具有与本发明涉及领域的技术人员通常理解的相同的含义。在描述和要求保护本发明中，将使用以下术语。
“卤素”表示氟、氯、溴或碘，优选为氟或氯。
“烷基”是指直链或支链的且不含不饱和键的烃链自由基，典型的烷基含有1-12个、1-8个或1-6个碳原子，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基等。如果烷基被芳基取代，那么其相应为“芳烷基”自由基，如苯甲基或苯乙基。如果烷基被杂环基取代，那么其相应为“杂环烷基”自由基。
“烯基”指的是至少含两个碳原子、至少一个不饱和键的直链或支链的烃链自由基，且该烃链自由基以单键与分子其它部分连接。典型的烯基基团含有2-12个、2-8个或者2-6个碳原子，例如，乙烯基、1-丙烯基或丁烯基。
“炔基”指的是含至少两个碳原子、至少一个碳碳三键的直链或支链的烃链自由基，且该烃链自由基以单键与分子其它部分连接。典型的炔基基团含有2-12个、2-8个或者2-6个碳原子，例如，乙炔基、丙炔基(例如1-丙炔基、2-丙炔基)。
“环烷基”指的是脂环烃。典型的环烷基含1至3个单环和/或稠环、含3-18个碳原子，优选3-10 个碳原子，如环丙基、环己基或金刚烷基。在具体实施方式中，环烷基含3-6个碳原子。
“芳基”指的是单环或多环自由基，包括含单芳基基团和/或稠芳基基团的多环自由基。典型的芳基基团包含1-3个单环或稠环及6-18个碳环原子，如苯基、萘基(如2-萘基)自由基。
“杂环基”指的是稳定的、典型地为3元至18元的环自由基，其由碳原子和一至五个选自氮、氧和硫的杂原子构成，优选为具有一个或多个杂原子的4元至8元环，更优选为具有一个或多个杂原子的5元或6元环，其可以是芳香族的或者非芳香族的。对于本发明的目的，杂环可以是单环、双环或三环体系，其可以包括稠环体系；且杂环自由基中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化；氮原子可以任选地被季胺化；且杂环自由基可以是部分饱和或完全饱和的或为芳族的。杂环基的例子包括但不限于：苯并咪唑、苯并噻唑、呋喃、异噻唑、咪唑、吲哚、哌啶、哌嗪、嘌呤、喹啉、噻二唑、四氢呋喃、香豆素、吗啉、吡咯、吡唑、恶唑、异恶唑、三唑、咪唑等。
“烷氧基”是指式为-ORa的自由基，其中Ra为如上定义的烷基自由基，具有一个或多个(如1、 2、3或4)氧键，且通常含有1-12个、1-8个或者1-6个碳原子，如甲氧基、乙氧基、丙氧基等。
“芳氧基”是指式为-O-芳基的自由基，其中芳基为如上所定义的。芳氧基化合物的一些例子为-O- 苯基、-O-对甲苯基、-O-间甲苯基、-O-邻甲苯基或-O-萘基。
除非在本发明中特别说明，否则，如果适用的话，所有的基团均可被任选地取代。
下面将结合实施例及说明书附图详细说明本发明。
这里所列举的化合物只是为了更好地说明本发明的化合物类别和结构形式，并非限制本发明。
本发明在以下的实施例中进一步说明。这些实施例只是为了说明的目的，而不是用来限制本发明的范围。由于通式(Ⅱ)-(Ⅳ)中每个通式所包含化合物的合成采用了完全相同的方法，只在反应原料上有差别，因此，实施例10-12中仅选用了通式化合物Ⅱ-1、Ⅲ-1、Ⅳ-1为代表，对通式(Ⅱ) -(Ⅳ)化合物的合成进行概述。
实验中所用部分实验材料和设备信息如下：
A549(野生型EGFR)、HCC827(外显子19缺失型EGFR)和NCI-H460(H460，野生型EGFR)，购自中国科学院细胞库(中国上海)；
RPMI1640培养基、DMEM培养基和胎牛血清(FBS)，均购自杭州四季青有限公司(中国杭州)；
PBS缓冲液、EBSS缓冲液、含0.02％EDTA的0.25％胰酶和Opti-MEM培养基(吉诺生物医药技术有限公司，中国)；
二甲基亚砜DMSO(AMRESCO，美国)；
细胞培养皿及培养板(Corning Costar，美国)；
吉非替尼、奥西替尼(AZD9291)、巴弗洛霉素A1(Baf A1)，购自Selleck(中国上海)；
雷帕霉素(Rapamycin)，购自Beyotime(中国上海)；
氯喹(CQ)、吖啶橙染料(AO)，购自Sigma Aldrich(中国上海)；
BCA蛋白质测定试剂盒，购自Bio-Rad Laboratories(美国加州)；
辣根过氧化物酶偶联二抗，购自Jackson ImmunoResearch(中国上海)；
化学发光检测试剂盒，购自Biological Industries(美国)；
Amersham Imager 600系统，购自通用电气医疗集团生命科学部(中国上海)；
siRNA转染试剂：LipofectamineTM RNAiMAX(Invivogen，美国)；
质粒转染试剂：X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(Roche，瑞士)；
CellTiter
Figure GDA0003576518700000121
AQueous非放射性细胞增殖检测试剂盒，购自Promega(中国北京)；
BD Pharmingen FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒，购自BD Biosciences(中国上海)；
BD FACSCaliburTM流式细胞仪，购自BD Biosciences(中国上海)。
发明人前期进行了如下实验：
在下述的细胞生物学实验步骤中，“处理”是指将待试化合物用细胞培养液稀释到特定浓度后，加入培养皿中与细胞孵育特定时间。
实施例1
用指定浓度(如图1所示)的吉非替尼处理非小细胞肺癌细胞(NSCLC)24小时(对A549和H460 细胞)或36小时(对HCC827细胞)，并通过蛋白质印迹法(Western Blot)测定SQSTM1的表达。肌动蛋白用作内部参照蛋白。实验结果如图1所示。
用指定浓度(如图2所示)的AZD9291处理A549、HCC827和H460细胞24小时，并通过Western Blot测定SQSTM1的表达。肌动蛋白用作内部参照蛋白。实验结果如图2所示。
Western Blot操作步骤：
用含有2％SDS、0.1％溴酚蓝、10％甘油、1.5％DTT(二硫苏糖醇)和0.1M tris-HCl(pH6.8)的裂解缓冲液裂解细胞。通过BCA法蛋白定量试剂盒测定细胞裂解物中蛋白浓度。通过SDS-PAGE分离煮沸变性的裂解物，再将其转移至聚偏二氟乙烯膜上，用5％无脂牛奶(溶解在TBST中)封闭。然后，将该膜与指定的一抗在4℃孵育过夜，用TBST(含0.1％Tween-20的TBS)洗涤3次后，与辣根过氧化物酶 (HRP)偶联的二抗室温下孵育2小时。TBST洗涤3次。最后，在Amersham Imager 600系统中，通过化学发光试剂盒检测膜上HRP的水平，以此表征相应抗原的含量。
由图1和2中结果可知，吉非替尼、AZD9291在三种具有不同遗传背景的NSCLC细胞(A549、HCC827 和H460)中，均以剂量依赖性的方式上调SQSTM1蛋白水平。
实施例2
用DMSO、雷帕霉素、吉非替尼处理A549和H460细胞7小时，然后对上述细胞给药BafA1(巴弗洛霉素A1)或不给药，培养5小时。通过Western Blot(参照实施例1中的WesternBlot步骤)检测LC3 和SQSTM1表达。实验结果如图3所示。
由图3结果可知，单用吉非替尼的作用和自噬抑制剂Baf A1类似，而和自噬诱导剂雷帕霉素相反；雷帕霉素和BafA1联用后，LC3-II和SQSTM1的蛋白水平均明显上升，而吉非替尼和BafA1联合后却没有表现出明显的增强效果。以上实验结果表明吉非替尼很可能通过抑制细胞自噬而阻断SQSTM1自噬性降解，导致其在细胞内积聚。
实施例3
用GFP-RFP-LC3质粒转染A549细胞48小时，然后分别用EBSS、CQ、吉非替尼或AZD9291处理该细胞。通过免疫荧光显微镜检测GFP-LC3和RFP-LC3的斑点，实验结果如图4中的 A所示。
LC3黄色斑点/红色斑点(％)的定量表示为3个独立实验的平均值±SD，n＝10个细胞。统计结果如图4中的 B所示，其中，星号(*)表示统计学差异(学生t检验，P<0.05)。
由实施例2和3的结果可知，吉非替尼、AZD9291对自噬的抑制作用与已知的自噬抑制剂巴佛洛霉素A1(Baf A1)和氯喹(CQ)类似，虽然能上调LC3Ⅱ的表达(如图3所示)，但却负向调控细胞的自噬流进程(如图4所示)。
实施例4
SQSTM-1基因的高表达：将处于对数生长期的细胞种到相应的孔板内，培养过夜使细胞贴壁。转染前将培养液更换为无抗含10％胎牛血清的相应培养基，取适量体积的Opti-MEM培养基于EP管中，加入适量质粒和转染试剂X-treme GENE HD，吹打混匀后室温静置20-25min。将混合物以滴的形式均匀加到细胞培养基中，轻轻晃动使其混匀。根据实验需要转染48-72h。并采用Western blot法评估过表达效果。
SQSTM-1基因的敲低：将处于对数生长期的细胞种到相应的孔板内，培养过夜使细胞贴壁(不同的待转染细胞需要不同的覆盖率)。转染前将培养液更换为无抗含10％胎牛血清的相应培养基，取适量的 Opti-MEM培养基于EP管中，根据实验说明书加入适量的Lipofectamine RNAiMAX transfection reagent，混匀，再取等体积的Opti-MEM培养基加入适量siRNA，混匀(siRNA和阴性对照negative control siRNA 由上海吉玛制药技术有限公司合成)。再将两管液体混合，吹打混匀，室温静置约15min。将混合物以滴的形式均匀加到细胞培养基中，轻轻晃动使其混匀。根据实验需要转染48-72h。并采用Western blot法评估敲低效果。
实验结果如图5所示。由图5中结果证明高表达SQSTM1导致细胞对吉非替尼、AZD9291的耐受性，而敲低SQSTM1可增加细胞对二者的敏感性。
根据实施例1-4的实验结果，发明人推断，吉非替尼、AZD9291等EGFR TKI通过抑制细胞的自噬性降解，导致SQSTM1的积聚从而促进细胞产生对EGFR TKI的获得性耐药性。
实施例5
免疫荧光实验步骤：将灭菌过的盖玻片置于孔板中，细胞密度接种为常规的1/5到1/3，过夜培养，加入药物处理特定时间后，从孵箱中取出。1×PBS洗1次，再用无水甲醇洗1次，室温固定10分钟。PBS 洗3次。然后用0.25％Triton X-100透化25分钟。PBS再洗3次。加入3％的BSA(1×PBS配制)室温封闭30分钟。加稀释好的一抗(用3％BSA稀释)，放在湿盒内，4℃过夜。次日，PBS洗3次后，加稀释好的荧光二抗(用3％BSA稀释，1:200稀释)室温孵育1小时，避光。PBS再洗3次。使用混有DAPI的封片剂封片，封片后室温静置1小时，荧光显微镜下检测DAPI和LC3荧光的强度。实验结果如图6所示。
已知，自噬可分成3个主要的过程，即自噬体的形成、自噬体和溶酶体的融合、自噬溶酶体的降解。
由图6中结果可知，以细胞内表达的LC3Ⅱ产生的荧光为检测信号，吉非替尼、AZD9291对自噬体的形成不仅没有抑制作用，反而起到促进作用。
实施例6
以溶酶体膜蛋白LAMP1和LC3Ⅱ的共定位为评价指标，用雷帕霉素或吉非替尼处理A549细胞24小时，通过免疫荧光检测LAMP1和LC3的共定位，实验结果如图7中的 A所示。
共定位系数(Colocalization coefficient)表示为LC3和LAMP1的共定位点与总LC3点的比率。共定位系数的定量表示为3个独立实验的平均值±SD，n＝10个细胞。统计结果如图7中的 B所示，其中，NS表示无显著意义(学生t检验，P>0.05)。
由图7中结果可知，吉非替尼并不影响自噬体与溶酶体的融合。
由实施例5和6，发明人认为，吉非替尼、AZD9291等EGFR-TKI并不影响自噬体形成(反而起到促进作用，以LC3Ⅱ的表达量为标记物，如图6所示)和自噬体与溶酶体的融合(以溶酶体膜蛋白LAMP1 和LC3Ⅱ的共定位为评价指标，如图7所示)，而可能是通过抑制溶酶体的功能。
实施例7
CTSB是溶酶体的一个特征性水解酶，其需要在溶酶体的酸性环境中被剪切为成熟体后才能发挥水解蛋白的作用。因此，很多研究将CTSB成熟体的表达量作为溶酶体功能强弱的指标。
分别用吉非替尼、AZD9291、CQ或Baf A1处理A549和HCC827细胞24小时，以肌动蛋白作为对照，通过Western Blot(参照实施例1中的Western Blot步骤)评估CTSB成熟体的表达。实验结果如图8 所示。
由图8结果可知，吉非替尼、AZD9291可显著地下调CTSB成熟体的表达，由此说明了这两个化合物确实存在削弱溶酶体功能的作用。
实施例8
吖啶橙染料(AO)是一种亲质子的荧光染料，其非质子化单体能发出绿色荧光，而进入溶酶体被质子化后形成聚合体并发出红色荧光。
分别用DMSO、吉非替尼、AZD9291、CQ或BafA1处理A549和HCC827细胞12小时，然后将A549 和HCC827细胞与AO孵育15分钟。通过荧光显微镜检测AO-红色荧光斑点的数量。实验结果如图9中的A所示。
每个细胞的AO-红色荧光斑点的定量表示为3个独立实验的平均值±SD，n＝10个细胞。统计结果如图9中的B所示，其中，星号(*)表示统计学差异(学生t检验，P<0.05)，ND表示未检测到。
由图9结果可知，吉非替尼、AZD9291均抑制溶酶体的酸化过程。
根据实施例4-8的实验结果，发明人推测，吉非替尼、AZD9291等EGFR TKI通过抑制溶酶体酸化，导致自噬溶酶体的功能减弱及其所包裹的底物的降解受阻。
实施例9
代表性EGFR TKI化学结构酸碱性分析：从第一代到第三代EGFR TKI中挑选了目前临床上最常用的8个代表性药物，通过在免费开源的药物数据库中(https://www.drugbank.ca/)检索其理化性质。8个代表性EGFR TKI化学结构中的氮原子个数都在三个或三个以上，而没有缺电子的路易斯酸酸性基团，均属于路易斯碱碱性药物。其中，吉非替尼、阿法替尼、达克替尼(Dacomtinib)、奥西替尼、奥姆替尼(Olmutinib)等都具有碱性较强的脂肪胺基，其碱性pKa值如下表1所示。
表1代表性EGFR TKI的碱性pKa值
Figure GDA0003576518700000141
Figure GDA0003576518700000151
根据以上实验结果，发明人推断，造成吉非替尼、AZD9291等EGFR TKI抑制溶酶体酸化，进而导致自噬溶酶体降解受阻的根本原因可能是由于吉非替尼、AZD9291等EGFR TKI在化学结构上存在碱性较强的官能团，使其容易进入到酸性微环境的溶酶体中，通过减少溶酶体的酸化，进而造成了对自噬溶酶体的功能性阻断和促癌蛋白SQSTM1的积累，最终导致肿瘤细胞对吉非替尼、 AZD9291等EGFR TKI产生耐药性。在此基础上，发明人对结构上含有强碱性基团的EGFR TKI进行碱性中和改造而得到一系列EGFR TKI碱性中和类似物，例如以下实施例10-12中所合成的化合物。
实施例10通式化合物Ⅱ-1的合成(合成路线如图10所示)
步骤Ⅰ、3-溴丙基-3,5-二甲氧基苯甲酸酯(中间体1-3)的制备：称取3,5-二甲氧基苯甲酰氯(中间体 1-1)(2g，10mmol)和3-溴-1-丙醇(中间体1-2)(1.07mL，5mmol)，将其溶解在20mL二氯甲烷中，搅拌至溶解，再缓慢滴加三乙胺(1.5mL，15mmol)，在室温下搅拌，TLC监测反应过程，约5小时后反应完毕。加入20mL超纯水猝灭反应后，再加入20mL二氯甲烷进行萃取，饱和NaCl溶液洗涤3次，二氯甲烷层用无水MgSO4干燥，过滤后，旋转蒸发除去后浓缩得粗产物，硅胶柱层析纯化得到无色油状液体中间体1-3，产率：80％。
步骤Ⅱ、3-溴丙基-3,5-二羟基苯甲酸酯(中间体1-4)的制备：称取中间体1-3(604mg，2mmol)溶于20mL的二氯甲烷中，边搅拌边将三氯化铝(1333mg，10mmol，分三次)，碘化钠(150mg，1mmol)依次加入，室温下反应过夜。待反应完全，加入20mL饱和氯化铵溶液中和反应，再加入20mL二氯甲烷进行萃取，用饱和NaCl溶液洗涤二氯甲烷层3次，并用无水MgSO4干燥。滤液浓缩后，通过快速硅胶柱层析纯化得到淡黄色油状液体中间体1-4，产率：30％。1H-NMR(CDCl3,600MHz)δ:7.087(d,J＝2.4Hz,2H, H-2,H-6),6.572(t,J＝2.4Hz,1H,H-4),5.486(s,2H,-OH×2),4.449(t,J＝6.0Hz,2H,-OCH 2CH2CH2Br), 3.676(t,J＝6.6Hz,2H,-OCH2CH2CH 2Br),2.212(t,J＝6.0Hz,2H,-OCH2CH 2CH2Br).
步骤Ⅲ、3-溴丙基-3,5-二四氢吡喃基苯甲酸酯(中间体1-6)的制备：称取中间体1-4(550mg，2mmol)、二氢吡喃(中间体1-5)(841.2mg，10mmol)和对甲苯磺酸吡啶盐(502mg，0.2mmol)，溶于20mL二氯甲烷中，室温下反应6小时。反应完全后，加入20mL水和20mL二氯甲烷，萃取并旋干二氯甲烷。硅胶柱层析法分离纯化后得到淡黄色油状物中间体1-6，产率：63％。1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ:7.348(t,J＝ 2.5Hz,2H,H-2,H-6),6.984(q,J＝2.5Hz,1H,H-4),5.435-5.463(m,2H,-O-pyranyl-H-2×2),4.447(t,J＝6.0 Hz,2H,-OCH 2CH2CH2Br),3.886(td,J1＝2.5Hz,J2＝10.5Hz,2H,-O-pyranyl-H-6×2),3.688(t,J＝6.5Hz,2H, -OCH2CH2CH 2Br),3.596-3.632(m,2H,-O-pyranyl-H-6×2),2.196-2.246(m,2H,-OCH2CH 2CH2Br), 1.958-2.016(m,2H,-O-pyranyl-H-3×2),1.844-1.894(m,4H,-O-pyranyl-H-3×2,-O-pyranyl-H-4×2), 1.644-1.712(m,4H,-O-pyranyl-H-4×2,-O-pyranyl-H-5×2),1.584-1.613(m,2H,-O-pyranyl-H-5×2).
步骤Ⅳ、4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-6-(3-吗啡啉丙氧基)喹唑啉-7-醇(中间体1-8)的制备：称取原料药吉非替尼(中间体1-7)(89.4mg，0.2mmol)和L-甲硫氨酸(49.23mg，0.33mmol)，溶解于5mL的甲磺酸中，165℃下回流反应约24小时。反应完全后，加入5mL的超纯水猝灭反应，并置于室温下冷却。再逐渐滴加40％NaOH水溶液至体系pH接近7左右后，加入20mL乙酸乙酯萃取并旋干溶剂，硅胶柱层析法分离纯化后得到白色固体粉末中间体1-8，产率：52％。1H-NMR(CD3OD,400MHz)δ:8.367(s,1H,H-2), 7.964(dd,J1＝2.8Hz,J2＝6.8Hz,1H,H-8),7.762(s,1H,H-5),7.616-7.656(m,1H,H-2’),7.230(t,J＝8.8Hz, 1H,H-6’),7.033(s,1H,H-5’),4.267(t,J＝6.0Hz,2H,-NCH2CH2CH 2O-),3.783(t,J＝4.8Hz,4H,-OCH2×2), 2.871(t,J＝7.2Hz,2H,-NCH 2CH2CH2O-),2.784(s,4H,-NCH2×2),2.145-2.208(m,2H,-NCH2CH 2CH2O-). MS(ESI)m/z:432.97(M+1)+,calculated for C21H22ClFN4O3:432.14.
步骤Ⅴ-Ⅵ、3-((4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-6-(3-吗啡啉丙氧基)喹唑啉-7-基)氧基)丙基-3,5-二羟基苯甲酸酯(通式化合物Ⅱ-1，Gefi-2OH)的制备：称取中间体1-8(43.2mg，0.1mmol)和中间体 1-6(88.4mg，0.2mmol)，溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入碳酸钾(55.2mg，0.4mmol)和碘化钠(15mg，0.1mmol)后，80℃反应过夜。反应完全后，加入5mL的超纯水和20mL的乙酸乙酯进行萃取，然后旋干溶剂。经柱层析色谱纯化，得到无色油状液体。将此油状物重新溶解在5mL的无水乙醇中，加入1mL 10％HCl溶液，室温下搅拌反应2h。旋干体系中的无水乙醇后，加入4mL 的超纯水和10mL乙酸乙酯进行萃取。旋干乙酸乙酯后，通过快速柱层析法分离纯化得到白色粉末状的目标产物Gefi-2OH，产率：30％。1H-NMR(DMSO-d6,600MHz)δ:8.471(s,1H,H-2),8.116(d,J ＝4.8Hz,1H,H-8),7.849(s,1H,H-5),7.785(s,1H,H-2’),7.410(t,J＝9.0Hz,1H,H-6’),7.222(s,1H, H-5’),6.803(d,J＝2.4Hz,2H,H-2”,H-6”),6.410(t,J＝2.4Hz,1H,H-4”),4.400(t,J＝6.0Hz,2H, O＝COCH 2),4.280(t,J＝6.0Hz,2H,O＝COCH2CH2CH 2),4.177(s,2H,-NCH2CH2CH 2O-),3.556(s,4H, -OCH2×2),2.475(t,J＝1.8Hz,2H,-NCH 2CH2CH2O-),2.359(s,4H,-NCH2×2),2.218(m,J＝6.0Hz,2H,O＝COCH2CH 2CH2),1.983(m,J＝7.8Hz,2H,-NCH2CH 2CH2O-).MALDI-TOF MS m/z:627.475(M+1)+,calculated for C31H32ClFN4O7:626.19.
实施例11通式化合物Ⅲ-1的合成(合成路线如图11所示)
步骤Ⅰ、4-氟-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯胺(中间体2-2)的制备：将2-氨基-5-氟苯酚(中间体2-1)(1.27g，10mmol)、二氢吡喃(2.52g，30mmol)和对甲苯磺酸吡啶盐(502mg，1mmol)，溶于20mL 二氯甲烷中，室温下反应6小时。反应完全后，加入20mL水和20mL二氯甲烷，萃取并旋干二氯甲烷。硅胶柱层析法分离纯化后得到无色油状物中间体2-2，产率：77％。MS(ESI)m/z:212.10(M+1)+,calculated for C11H14FNO2:211.10.
步骤Ⅱ、4-甲基哌嗪基-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯胺(中间体2-3)的制备：称取中间体2-2(1.05g， 5mmol)和N-甲基哌嗪(1.36mL，15mmol)溶于20mL 2-戊醇中，120℃下反应3小时。反应完全后，旋干溶剂，加入乙酸乙酯萃取，浓缩后经硅胶柱层析法分离纯化后得到红色粉末状中间体2-3，产率：71％。MS(ESI)m/z:292.30(M+1)+,calculated forC16H25N3O2:291.19.
步骤Ⅲ、2-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-4(3H)-酮(中间体2-5)的制备：称取2,4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶(中间体2-4)(1.025g，5mmol)溶于10mL乙醇/水＝4:1的混合溶剂中，再称取500mg氢氧化钠溶于3mL蒸馏水中，并将此溶液滴加进入反应体系，40℃下反应4小时。反应完全后，加入1mL乙酸，在35℃下继续反应2小时，将所得沉淀抽滤，蒸馏水洗涤后，得到白色粉末状中间体2-5，产率：89％。MS(ESI)m/z: 187.96(M+2)+,calculated for C6H3ClN2OS:185.97.
步骤Ⅳ、2-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯基)氨基)噻吩[3,2-d]嘧啶-4(3H)-酮(中间体2-6)的制备：称取中间体2-5(930mg，5mmol)溶于50mL乙醇中，加入中间体2-3(1.75g，6mmol) 和5mL乙酸，回流反应6小时。待反应完全后将反应物冷却至室温，将6mL三乙胺缓慢滴加进反应物，然后将抽滤，并用20mL乙醇洗涤2次，真空干燥得到黄色固体粉末状中间体2-6，产率：69％。MS(ESI) m/z:442.30(M+1)+,calculatedfor C22H27N5O3S:441.18.
步骤Ⅴ、4-氯-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯基)噻吩[3,2-d]嘧啶-2-胺(中间体 2-7)的制备：称取中间体2-6(1.76g，4mmol)溶于5mL乙腈中，将反应温度升至75℃。加入1mL三氯氧磷和1mL乙腈的混合溶液，75℃下反应1小时。反应完全后，分别加入10mL冰水和40％氢氧化钠溶液，在室温下搅拌1小时后，抽滤后，用20mL蒸馏水洗2次，烘干得到粗产品。然后，将此粗产品重新溶于20mL体积比为3:2的二氯甲烷/甲醇混合溶剂中，室温下搅拌1小时后，旋干溶剂。再将产物重新溶于10mL体积比为8:2的乙腈/水混合溶剂中，室温下搅拌2小时后，减压抽滤，得到白色固体粉末状中间体2-7，产率：77％。MS(ESI)m/z:461.20(M+2)+,calculated for C22H26ClN5O2S:459.15.
步骤Ⅵ、N-(3-((2-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4- 基)氧基)苯基)丙烯酰胺(中间体2-8)的制备：称取中间体2-7(1.76g，4mmol)、N-(3-羟苯基)丙烯酰胺 (815mg，5mmol)和碳酸钾(1.66g，12mmol)溶于25mL体积比为8:2的乙腈/水混合溶剂中，回流反应6小时。反应完全后，将反应物降至室温，加入50mL蒸馏水，在室温下反应过夜。将反应液抽滤，用 10mL体积比为1:2的乙腈/水混合溶剂洗涤1次，得到白色固体粉末中间体2-8，产率：84％。MS(ESI)m/z: 587.30(M+1)+,calculated for C31H34N6O4S:586.24.
步骤Ⅶ-Ⅷ、N-(3-((2-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯基)氨基)噻吩并 [3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)苯基)丙烯酰胺(通式化合物Ⅲ-1)的制备：参照实施例10中步骤Ⅴ和步骤Ⅵ的方法，将中间体2-8和中间体2-6进行反应，得到白色固体粉末目标化合物Ⅲ-1，产率：52％。MS(ESI)m/z:697.30(M+1)+,calculated forC36H36N6O7S:696.24.
实施例12通式化合物Ⅳ-1的合成(合成路线如图12所示)
步骤Ⅰ、3-(2-氯嘧啶-4-基)-1-甲基-1H-吲哚(中间体3-3)的制备：将2,4-二氯嘧啶(中间体3-2)(1.49g， 10mmol)和氯化铝(1.33g，10mmol)悬浮在20mL的N,N-二甲基乙酰胺(DME)中，室温下搅拌5分钟后，向反应体系中加入1-甲基吲哚(中间体3-1)(1.25mL，10mmol)，80℃反应2小时，TLC监测反应过程。在5分钟内，将50mL超纯水缓慢滴入反应体系中猝灭反应，搅拌30分钟，将所得固体减压过滤后，快速硅胶柱层析纯化得到白色固体中间体3-3，产率93％。MS(ESI)m/z:244.10(M+1)+,calculated for C13H10ClN3:243.06.
步骤Ⅱ、2-氨基-4-硝基-5-氟苯酚(中间体3-5)的制备：称取4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(中间体3-4) (372mg，2mmol)溶于20mL的二氯甲烷中，边搅拌边将三氯化铝(1333mg，10mmol，分三次)、碘化钠(150mg，1mmol)依次加入，室温下反应过夜。待反应完全，加入20mL饱和氯化铵溶液中和反应，再加入20mL二氯甲烷进行萃取，用饱和NaCl溶液洗涤二氯甲烷层3次，并用无水MgSO4干燥。滤液浓缩后，通过快速硅胶柱层析纯化得到淡黄色油状液体中间体3-5，产率：37％。MS(ESI)m/z:173.10(M+1)+, calculated for C6H5FN2O3:172.03.
步骤Ⅲ、4-氟-5-硝基-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯胺(中间体3-6)的制备：称取中间体3-5(860mg， 5mmol)、二氢吡喃(1680mg，20mmol)和对甲苯磺酸吡啶盐(125.5mg，0.5mmol)，溶于20mL二氯甲烷中，室温下反应6小时。反应完全后，加入20mL水和20mL二氯甲烷，萃取并旋干二氯甲烷。硅胶柱层析法分离纯化后得到无色油状物中间体3-6，产率：70％。MS(ESI)m/z:257.13(M+1)+,calculated for C11H13FN2O4:256.09.
步骤Ⅳ、N-(4-氟-5-硝基-2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-胺(中间体3-7)的制备：称取中间体3-6(1280mg，5mmol)和中间体3-3(1215mg，5mmol)溶于20mL2-戊醇中，加入对甲基苯磺酸一水合物(1140mg，6mmol)，105℃反应3小时。待反应完全后将反应物冷却至室温，抽滤，并用10mL2-戊醇洗涤2次。再用5mL乙腈洗涤1次，真空干燥得到黄色固体粉末中间体 3-7，产率：95％。MS(ESI)m/z:464.30(M+1)+,calculated for C24H22FN5O4:463.17.
步骤Ⅴ、4-氟-N1-(4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)-6-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯基-1,3-二胺(中间体3-8)的制备：称取中间体3-7(927mg，2mmol)、铁粉(560mg，10mmol)和氯化铵(80.25mg， 1.5mmol)，溶解于16mL的乙醇/水＝3:1的混合溶剂中，78℃回流反应2小时。反应完全后，通过磺酸基离子交换柱将溶液初步提纯，再通过快速硅胶柱层析法，分离纯化后得到浅褐色油状物中间体3-8，产率： 82％。MS(ESI)m/z:434.30(M+1)+,calculated for C24H24FN5O2:433.19.
步骤Ⅵ、N-(2-氟-5-((4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)胺基)-4-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯基)丙烯酰胺(中间体3-9)的制备：称取中间体3-8(867mg，2mmol)和N,N-二异丙基乙胺(310mg，2.4mmol)，溶解于10mL的二氯甲烷中，将丙烯酰氯(181mg，2mmol)缓慢滴加进入反应液，在冰水浴中反应约2 小时。反应完全后，分别加入50mL二氯甲烷和50mL饱和碳酸氢钠，萃取3次，硅胶柱层析法分离纯化后得到白色粉末中间体3-9，产率：32％。MS(ESI)m/z:488.30(M+1)+,calculated for C27H26FN5O3:487.20.
步骤Ⅶ-Ⅷ、N-(2-氟-5-((4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)胺基)-4-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯基) 丙烯酰胺(中间体3-10)的制备：参照实施例10中步骤Ⅴ和步骤Ⅵ的方法，将中间体3-9和中间体1-6 进行反应，得到白色粉末状中间体3-10，产率：63％。MS(ESI)m/z:598.30(M+1)+,calculated for C32H28FN5O6:597.20.
步骤Ⅸ、3-(4-丙烯酰胺-5-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-((4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶 -2-基)氨基)苯氧基)丙基-3,5-二羟基苯甲酸酯(通式化合物Ⅳ-1，AZD-2OH)的制备：称取中间体 3-10(597.6mg，1mmol)和N,N-二异丙基乙胺(306mg，3mmol)，溶解于10mL的2-戊醇中，在 120℃中反应约3小时。反应完全后，旋干溶剂，分别加入10mL乙酸乙酯和10mL饱和硫酸钠，萃取3次，快速硅胶柱层析法分离得到白色固体粉末目标化合物Ⅳ-1，产率：72％。MS(ESI)m/z:680.30 (M+1)+,calculated for C37H41N7O6:679.31.
实施例13免疫印迹法检测化合物Gefi-2OH对细胞中p62、CTSB等蛋白表达量的影响
将A549、H460细胞分别以1×105/孔和0.8×105/孔的密度接种于6孔板中，过夜培养后，将吉非替尼和化合物Gefi-2OH用完全培养基稀释成特定浓度，分别加入6孔板中，作用24小时后，加入裂解缓冲液裂解细胞，将此细胞裂解液煮沸变性后，进行Western Blot实验(步骤参照实施例1中的Western Blot 方法)，结果如图13所示。
实验结果如图13中的A所示，改造后的碱性中和类似物Gefi-2OH(实施例10制备所得)对SQSTM1 的积聚效果以及对溶酶体功能的影响(CTSB的表达量)较吉非替尼均大大减弱，提示碱性中和的改造策略有效地削弱了吉非替尼对溶酶体功能的阻断。如图13中的B所示，相同浓度的Gefi-2OH和吉非替尼均可以有效抑制EGFR以及其下游Akt、Erk1/2的磷酸化程度，表示此类改造并不会影响吉非替尼等EGFR TKI原有的EGFR激酶抑制活性。此外，我们同样检测了改造后的类似物AZD-2OH对SQSTM1和CTSB 表达量的影响以及其对EGFR信号通路的抑制作用。实验结果如图14中的A和图14中的B所示，以 AZD9291为对照，AZD-2OH对SQSTM1的积聚效果以及对溶酶体功能的影响同样明显减弱，并对EGFR 信号通路产生与AZD9291相同的抑制作用。
实施例14采用溶酶体示踪荧光探针(Lysotracker)检测化合物Gefi-2OH对细胞中溶酶体功能的影响
荧光染料Lysotracker的荧光实验检测原理及具体步骤：Lysotracker是用能发出蓝色荧光的化学基团标记的带有弱碱性的探针，其中弱碱部分可提供质子，以维持pH在中性,可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。其具体步骤如下：将盖玻片置于孔板中，细胞密度接种为平时的1/5到1/3，贴壁后进行相应的处理。将Lysotracker染料与培养液进行1:1000稀释后加入细胞内，孵育2小时。倒掉培养液，用1×PBS洗3次，每次5分钟。使用20％的甘油与PBS的混合液作为封片液，直接将活细胞封片并在显微镜下观察荧光。
前面的研究中，发明人观察到吉非替尼和AZD9291等化合物通过影响溶酶体的功能而抑制自噬溶酶体的降解。因此，针对改造后的类似物Gefi-2OH，发明人同样检测了其对溶酶体功能的影响。通过将不同药物处理组的细胞用溶酶体的特异性探针Lysotracker进行示踪，并进行荧光检测，结果如图15所示。实验结果显示，吉非替尼使溶酶体的体积明显增加，数量明显减少，表明吉非替尼显著削弱细胞内溶酶体的功能；而相较于吉非替尼组，其碱性中和类似物Gefi-2OH对溶酶体的体积影响较微弱，对溶酶体的数量改变也弱于吉非替尼组。基于上述结果，揭示了经过碱性中和改造的类似物Gefi-2OH对溶酶体功能的阻断比吉非替尼减弱，并且这种作用有望使Gefi-2OH对肿瘤细胞的杀伤作用提升。
实施例15化合物Gefi-2OH对非小细胞肺癌的增殖抑制作用
取对数生长期细胞A549和H460细胞分别以5000个/孔和6000/孔的密度接种于96孔板内，每个实验组设置5个平行重复孔；培养24h后，加入配制好的药物浓度梯度的培养液，继续培养48h；检测前吸尽每孔内的培养基，并加入已经配制好的含10％MTS的1640培养基100μl，在37℃孵箱中避光孵育20-60 分钟，酶联免疫检测仪上震荡1分钟后用490nm波长读取吸光度值，当净OD值达到0.5-0.8范围时停止检测，计算细胞的相对增殖率，并使用Graphpad prism 6画出增殖曲线，结果如图16所示。
由图16结果可知，碱性中和的吉非替尼衍生物Gefi-2OH对非小细胞肺癌细胞A549、H460的增殖抑制作用要明显优于吉非替尼，其半数抑制浓度(IC50)较吉非替尼分别提高了约1.8倍(A549细胞中) 和3倍(H460细胞中)。此外，按照上述方法亦检测了本发明的化合物AZD-2OH对H460细胞的增殖抑制作用，其增殖曲线如图17所示。由图17结果可知，本发明的化合物AZD-2OH对H460细胞的增殖抑制作用同样明显优于改造前化合物AZD9291，其半数抑制浓度(IC50)仅为AZD9291的一半不到。
实施例16流式细胞术检测化合物Gefi-2OH对NSCLC细胞凋亡的影响
分别收集A549和H460细胞上清于离心管中，用预冷的PBS洗涤一次，同样收集到上述离心管中。在细胞中加入适量不含EDTA的0.25％的胰酶，一定时间后，用2倍胰酶体积的含10％FBS的1640培养液中和，收集细胞悬液至之前的离心管中。离心1500rpm，5min，倒去上清，PBS重悬细胞沉淀，再次 1500rpm离心5min，弃上清。加入100μl 1×Binding Buffer重悬细胞，将细胞的密度调整为5-10×105/mL。各加入5μl的Annexin V-FITC和5μl的PIStaining Solution，轻柔地混匀细胞悬液。避光、室温孵育15min。加入400μl 1×BindingBuffer稀释，轻轻混匀，1小时内上机检测。每个样采集10000events。结果如图18 所示。
由图18结果可知，Gefi-2OH显著诱导A549、H460细胞凋亡，且在相同浓度作用下，Gefi-2OH 诱导凋亡的效果要明显优于吉非替尼。
实施例17不同通式化合物的H460细胞增殖抑制活性筛选
为了说明本发明的通式化合物对非小细胞肺癌细胞的增殖抑制作用，以下合成了典型的通式(Ⅰ) 化合物，并进行了细胞增殖实验检测，化合物具体合成方法同实施例10-12，检测方法同实施例15，其检测结果表2-4所示；其中表2、3、4结果分别表示通式化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对H460细胞的增殖活性的影响。由表2-4结果可知，对吉非替尼、奥姆替尼以及奥西替尼进行碱性中和改造，极大地提升了其对H460细胞的杀伤作用。改造所得的通式化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均表现出良好的肺癌细胞增殖抑制活性，其中，奥西替尼的改造物(通式Ⅳ-1-通式Ⅳ-8)活性最优，其IC50值在1.21-5.13μM之间。此外，通过对三类化合物的构效关系分析，发现R取代基的酸性对活性的高低起决定性作用，其酸性越强，化合物整体的抗肿瘤活性也越好，具体表现为不同取代基对化合物增殖抑制活性提升的贡献排名：烷基磺酸>烷基羧酸>苯磺酸>苯甲酸>三元酚>二元酚，由此进一步说明了EGFR TKIs 分子结构所带碱性的确是导致肿瘤细胞对其敏感性降低、耐药性产生的重要原因，而本发明首次针对EGFR TKIs进行碱性中和改造，取得了意想不到的良好效果，探索出了一条提高其活性的新途径。
表2
Figure GDA0003576518700000201
化合物Ⅱ-1-化合物Ⅱ-8
Figure GDA0003576518700000202
表3
Figure GDA0003576518700000203
化合物Ⅲ-1-化合物Ⅲ-8
Figure GDA0003576518700000211
表4
Figure GDA0003576518700000212
化合物Ⅳ-1-化合物Ⅳ-8
Figure GDA0003576518700000213
Figure GDA0003576518700000221

Claims (8)

1.一种化合物，其特征在于，具有如下结构式之一：
Figure FDA0003608965250000011
其中：R1、R2或R3选自
Figure FDA0003608965250000012
Figure FDA0003608965250000013
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有如下结构之一：
Figure FDA0003608965250000014
Figure FDA0003608965250000021
3.一种权利要求1或2任一项所述化合物的制备方法，其包括向具有EGFR抑制活性的化合物结构中引入至少一个酸性官能团的步骤。
4.一种药物组合物，其包含权利要求1或2任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的辅料。
5.一种权利要求1或2任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求4所述的药物组合物在制备预防和/或治疗与受体酪氨酸蛋白激酶有关的疾病和病症的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其中所述与受体酪氨酸蛋白激酶有关的疾病和病症选自肺癌、胰腺癌、乳腺癌或结肠癌。
7.如权利要求6所述的应用，其中所述疾病和病症为肺癌。
8.如权利要求6所述的应用，其中所述疾病和病症为非小细胞肺癌。
CN201910538865.6A 2019-05-10 2019-06-20 一种egfr激酶抑制剂及其在制备抗癌药物方面的应用 Active CN111909101B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2020/089390 WO2020228635A1 (zh) 2019-05-10 2020-05-09 一种egfr激酶抑制剂及其在制备抗癌药物方面的应用

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2019104019762 2019-05-10
CN201910401976 2019-05-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111909101A CN111909101A (zh) 2020-11-10
CN111909101B true CN111909101B (zh) 2022-07-19

Family

ID=73241811

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910538865.6A Active CN111909101B (zh) 2019-05-10 2019-06-20 一种egfr激酶抑制剂及其在制备抗癌药物方面的应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN111909101B (zh)
WO (1) WO2020228635A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113354591B (zh) * 2021-06-09 2023-03-24 广东湛江海洋医药研究院 烷氨基喹唑啉的合成及其抗肿瘤活性
CN114740108B (zh) * 2022-03-28 2023-07-14 天津键凯科技有限公司 一种聚合物修饰抗体类药物的修饰度的测定方法
CN116284001B (zh) * 2023-01-30 2025-06-06 中国药科大学 Dclk1抑制剂、制备方法、药物组合物和应用
CN115819406B (zh) * 2023-02-24 2023-06-02 淄博百极荣创医药科技有限公司 3-(4-嘧啶)-1h-吲哚类化合物的合成方法
CN116396229A (zh) * 2023-04-12 2023-07-07 四川大学华西医院 一种喹唑啉类化合物的制备及其抗肿瘤应用
CN116925055B (zh) * 2023-07-19 2025-01-28 宁夏大学 香豆素-哌嗪-呋喃酮杂化物及其制备方法和应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102775356A (zh) * 2011-05-13 2012-11-14 江苏恒谊药业有限公司 4-氨基喹唑啉衍生物及其应用
CN102947316A (zh) * 2010-06-23 2013-02-27 韩美科学株式会社 用于抑制酪氨酸激酶活性的新型稠合嘧啶衍生物
CN103102342A (zh) * 2011-11-14 2013-05-15 广东东阳光药业有限公司 氨基喹唑啉类衍生物及其盐和使用方法
CN106995437A (zh) * 2016-01-22 2017-08-01 齐鲁制药有限公司 取代吲哚或吲唑嘧啶衍生物及其制备方法和用途
CN107793413A (zh) * 2016-09-05 2018-03-13 天津滨江药物研发有限公司 嘧啶杂环化合物及其制备方法和应用
CN108017620A (zh) * 2016-10-31 2018-05-11 北京睿创康泰医药研究院有限公司 甲磺酸奥希替尼工艺杂质的制备方法
CN108558832A (zh) * 2018-01-17 2018-09-21 浙江树人学院 一种新型抗肿瘤药物奥希替尼衍生物及其制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102947316A (zh) * 2010-06-23 2013-02-27 韩美科学株式会社 用于抑制酪氨酸激酶活性的新型稠合嘧啶衍生物
CN102775356A (zh) * 2011-05-13 2012-11-14 江苏恒谊药业有限公司 4-氨基喹唑啉衍生物及其应用
CN103102342A (zh) * 2011-11-14 2013-05-15 广东东阳光药业有限公司 氨基喹唑啉类衍生物及其盐和使用方法
CN106995437A (zh) * 2016-01-22 2017-08-01 齐鲁制药有限公司 取代吲哚或吲唑嘧啶衍生物及其制备方法和用途
CN107793413A (zh) * 2016-09-05 2018-03-13 天津滨江药物研发有限公司 嘧啶杂环化合物及其制备方法和应用
CN108017620A (zh) * 2016-10-31 2018-05-11 北京睿创康泰医药研究院有限公司 甲磺酸奥希替尼工艺杂质的制备方法
CN108558832A (zh) * 2018-01-17 2018-09-21 浙江树人学院 一种新型抗肿瘤药物奥希替尼衍生物及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Synthesis and Preliminary in-vitro Cytotoxic Activity of Morpholino Propoxy Quinazoline Derivative;Bhavesh Prajapati等;《International Journal of ChemTech Research》;20141231;第6卷(第1期);547-555 *
The Design and Synthesis of a New Class of RTK/HDAC Dual-Targeted Inhibitors;Xuan Zhang等;《Molecules》;20130603;第18卷;6491-6503 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020228635A1 (zh) 2020-11-19
CN111909101A (zh) 2020-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111909101B (zh) 一种egfr激酶抑制剂及其在制备抗癌药物方面的应用
AU2014350729B2 (en) N-benzyl tryptanthrin derivative, and preparation method and application thereof
JP3348859B2 (ja) プロテインキナーゼｃインヒビター
JP6457623B2 (ja) ２，４−二置換７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン誘導体、その製造方法および医薬における使用
JP7145873B2 (ja) ５員環および６員環が縮合したアザ環式芳香族系化合物、その製造方法、医薬組成物およびその応用
PT1389617E (pt) Composto heterocíclico e agente antitumoral contendo o mesmo como igrediente activo
WO2021238827A1 (zh) Egfr抑制剂、其制备方法及用途
JP6963598B2 (ja) チエノピリミジン系化合物、その製造方法、医薬組成物およびその応用
RU2748696C2 (ru) Пиридиновые соединения, содержащие семь атомов в кольце, способ их получения, фармацевтическая композиция, содержащая указанные соединения, и их применение
WO2017220007A1 (zh) 作为egfr抑制剂的苯胺嘧啶化合物的结晶
ES2820553T3 (es) Compuesto y composición farmacéutica para trastorno neuropsicológico o tumor maligno
WO2007114213A1 (ja) 置換二環式環状誘導体及びその用途
KR102765158B1 (ko) 티에노피리미딘 유도체 및 이의 용도
CN104072480B (zh) 喹啉类化合物及其制备方法和应用
CN103930408A (zh) 用于癌症治疗的吗啉基苯并三嗪
JP2022517396A (ja) Ｅｇｆｒ阻害剤の塩、結晶形及びその製造方法
JP2021165270A (ja) 置換アリールエーテル系化合物、その調製方法、医薬組成物およびその応用
CN106810552A (zh) 硫代乙内酰脲三元并环类雄激素受体拮抗剂及其用途
WO2015021894A1 (zh) 新型羟肟酸衍生物及其医疗应用
CN113461687B (zh) 2,8-氮杂-[4,5]十螺环酮衍生物及其制备方法和用途
CN113416181B (zh) 喹唑啉类衍生物及其用途
WO2020238179A1 (zh) 作为选择性jak2抑制剂的吡咯并嘧啶类化合物、其合成方法及用途
JP2007507467A (ja) 誘導性ｎｏシンターゼ阻害剤としてのイミダゾピリジン誘導体
WO2022148439A1 (zh) 作为bcl-2抑制剂的杂环化合物
CN112851679B (zh) 2，4，7-三取代嘧啶并吲哚化合物抗肿瘤作用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant