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CN111826352A - 通用型car-t细胞、其制备及应用 - Google Patents

通用型car-t细胞、其制备及应用 Download PDF

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CN111826352A
CN111826352A CN201910323948.3A CN201910323948A CN111826352A CN 111826352 A CN111826352 A CN 111826352A CN 201910323948 A CN201910323948 A CN 201910323948A CN 111826352 A CN111826352 A CN 111826352A
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car
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protein
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CN201910323948.3A
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李俊
张鹏潮
徐昭
何玲
刘伟康
江雨辰
秦含笑
夏宇
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Fundamenta Therapeutics Inc
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Abstract

本发明通过在CAR‑T细胞中表达相关功能蛋白，下调细胞表面HLA‑I类分子，从而制备得到通用型CAR‑T细胞。本发明还涉及这类通用型CAR‑T细胞的应用。

Description

通用型CAR-T细胞、其制备及应用
技术领域
本发明涉及通用型CAR-T细胞、其制备及应用。
背景技术
随着肿瘤治疗的发展，嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor-T，CAR-T)免疫疗法逐渐成为备受关注的治疗手段。CAR-T细胞所表达的CAR一般包含胞外抗原结合域、跨膜域和胞内信号传导域。通常CAR-T细胞是由患者T细胞经CAR基因转导并扩增而来，最后再回输到该患者体内。CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，而不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)的限制。目前，美国FDA已经批准了两款自体CAR-T细胞产品上市，分别是诺华的Kymriah和凯特的YesCAR-Ta，用于难治性复发性非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病的治疗。大量临床试验证明，CAR-T作为个性化的活细胞药极具抗肿瘤潜力(Maude et al.2018；Park etal.2018；Schuster et al.2017；)。
传统的CAR-T制备及回输策略是采集患者或供者的外周血，进行T细胞分离，通过慢病毒或逆转录病毒等方式将包含CAR结构的质粒或mRNA转染到细胞内，进行扩大培养再回输到患者体内。每位患者的CAR-T需要单独制备，成本较高且不确定因素较多。如分离得到的细胞不足、患者T细胞功能失常、CAR-T细胞制备失败、CAR-T细胞制备中患者疾病进程较快等因素，都可能造成CAR-T治疗失败。因此，需要健康供者T细胞制备通用型CAR-T解决上述困扰。为了有效制备通用型CAR-T，需要解决2个问题：①因为异体T细胞表面的TCR(Tcell receptor，TCR)会识别患者的异体抗原，从而导致同种异体T细胞回输带来的移植物抗宿主反应(graft-versus-host disease，GVHD)；②宿主的免疫系统会识别异体细胞表面的HLA(human leukocyte antigen)，从而导致回输的异体T细胞被快速清除，影响通用型CAR-T疗效。
目前传统制备通用型CAR-T的方式是通过基因编辑的方式敲除同种异体CAR-T细胞表面的TCR以及HLA-I类分子的表达，以减少GVHD和宿主排斥。已报道多种基因敲除编辑技术(zinc-finger nucleases，ZFN；transcription activator-like effectornucleases，TALENs；clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)在通用型CAR-T方面的应用(Provasi et al.2012；Berdien et al.2014；Ren etal.2017)。基因编辑虽然给细胞疗法带来了很多可能性，但同样也存在很多未知的风险和障碍，例如脱靶导致错误的基因编辑，工艺繁琐等等。而且，虽然通过基因编辑方式敲除异体T细胞表面的HLA-I能解决患者一部分的排斥反应，但完全敲除HLA-I的异体CAR-T细胞易受到患者的NK(natural killer cell)细胞的攻击，同样影响了通用型CAR-T的疗效(Torikai et al.2013)。因此通过基因编辑方式制备通用型CAR-T的开发之路遇到了一定的阻碍，找寻一种新型的工艺简便、实用安全的蛋白翻译水平调控的非基因编辑方式制备通用型CAR-T至关重要。
发明内容
本发明提供一种CAR-T细胞，其含有特异性靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体和能下调细胞表面HLA-I类分子表达的功能蛋白。
在一个或多个实施方案中，该CAR-T细胞细胞表面HLA-I类分子的表达水平为表达相同嵌合抗原受体但未表达所述功能蛋白的对照CAR-T细胞的50％以下。
在一个或多个实施方案中，所述CAR-T细胞含有所述嵌合抗原受体的编码序列和所述功能蛋白的编码序列；优选地，所述CAR-T细胞含有所述嵌合抗原受体的表达框和所述功能蛋白的表达框，或所述嵌合抗原受体的编码序列和所述功能蛋白的编码序列处于同一表达框内。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体特异性结合选自以下的肿瘤抗原中的一种或多种：EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸、Fos-相关抗原、中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4和呈递在MHC上的这些抗原中任一者的多肽片段，以及CD5、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD34、CD37、CD38、CD40、CD53、CD69、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD123、CD135、CD138、CD179、CD269、Flt3、ROR1、BCMA、FcRn5、FcRn2、CS-1、CXCR4、CXCR5、CXCR7、IL-7/3R、IL7/4/3R和IL4R。
在一个或多个实施方案中，所述能下调细胞表面HLA-I类分子表达的功能蛋白选自：HSV、BHV-1、EHV-1/4、PRV、HSV-1/2、VZV、EBV、hCMV、mCMV、RhCMV、HHV-6/7、KSHV、MHV-68、牛痘病毒和腺病毒中能直接靶向降解HLA-I的功能蛋白、能经由TAP蛋白来下调HLA-I类分子表达的功能蛋白和能经由溶酶体来下调HLA-I类分子表达的功能蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述功能蛋白选自：来自HCMV的蛋白US11和US6、来自BHV-1的蛋白UL49.5、来自EHV-1的蛋白UL49.5和来自KSHV的蛋白k5。
本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子选自：
(1)含嵌合抗原受体的编码序列和能下调细胞表面HLA-I类分子表达的功能蛋白的编码序列的核酸分子；和
(2)(1)所述核酸分子的互补序列；
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体和所述功能蛋白如本文任一实施方案所述。
本发明还提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本文所述的核酸分子。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物含有所述嵌合抗原受体的表达框和所述功能蛋白的表达框；或所述核酸构建物为一表达框，其中所述嵌合抗原受体的编码序列和所述功能蛋白的编码序列处于该表达框内。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体或表达载体。
本发明还提供一种慢病毒，其含有本文所述的核酸构建物。
本发明还提供一种宿主细胞，其含有本文所述的核酸分子、核酸构建物或慢病毒。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文任一实施方案所述的CAR-T细胞。
本发明还提供本文任一实施方案所述的功能蛋白或其编码序列在制备其细胞表面的HLA-I类分子的表达下调的CAR-T细胞中的应用，或在制备癌症治疗用的CAR-T细胞中的应用。
本发明还提供一种抑制CAR-T细胞表面表达HLA-I类分子的方法，所述方法包括在T细胞内同时表达本文任一实施方案所述的CAR和功能蛋白的步骤。
附图说明
图1：各组慢病毒转染T细胞，体外培养T细胞至第8天，流式检测CAR19+T细胞群体HLA平均荧光强度。
图2：各组T细胞体外培养第9天，用靶细胞K562-CD19刺激各组T细胞，效靶比10：1，连续反复刺激2天，流式检测各组T细胞CAR19+细胞群体HLA-I平均荧光强度，其中PCTL200、PCTL201、PCTL205、PCTL206、PCTL213这5个分子具有制备HLA-I类分子表达下调的CAR-T细胞的能力。
图3：全血淋巴细胞比例流式分析。100ml外周血Ficoll密度梯度离心分离1.24E+08 PBMC，流式检测CD3+T占白膜细胞比例62.4％，CD4+T/CD8+T比例为1.2，24h活化效率68.9％。
图4：各组细胞体外扩增8天扩增倍数。各组细胞体外扩增8天，扩增倍数显著高于PCTL135组。
图5：各组T细胞HLA平均荧光强度。经流式检测，各组细胞CAR阳性细胞群体，HLA平均荧光强度均显著下调，其中PCTL206组下调最显著。
图6：各组T细胞杀伤效率。各组细胞体外细胞毒性实验，杀伤效率在效靶比5：1时均达大于90％，与对照组无显著差异。
图7：各组T细胞表型分析。各组细胞检测细胞分化表型，大于65％T细胞在T-naive分化表型，与对照组135无显著差异。
图8：经靶细胞K562-CD19刺激各组T细胞HLA-I平均荧光强度。体外培养至第9天，用靶细胞K526-CD19刺激各组T细胞，刺激后流式检测各组细胞CAR阳性细胞群体HLA-I平均荧光强度均显著低于对照组。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本发明通过表达相关功能蛋白下调细胞表面HLA-I类分子，制备能抑制细胞表面HLA-I类分子的表达的CAR-T细胞，从而制备得到通用型CAR-T细胞。采用本发明方法制备得到的CAR-T细胞中，HLA-I类分子的表达并未完全被抑制，这些T细胞仍然在细胞表面表达一定量的HLA-I类分子，因此很好地避免了受体NK细胞的攻击，同时也解决了受体的排斥反应。优选地，以流式细胞术检测，本发明CAR-T细胞中HLA-I类分子的表达水平为未表达所述功能蛋白的对照CAR-T细胞的80％以下，优选60％以下，更优选50％以下，更优选30％以下，更以下25％以下。在一些实施方案中，以流式细胞术检测，本发明CAR-T细胞中HLA-I类分子的表达水平为未表达所述功能蛋白的对照CAR-T细胞的10-50％，如15-50％。在一些实施方案中，即便经过相同的靶细胞刺激，本发明CAR-T细胞中HLA-I类分子的表达水平仍为未表达所述功能蛋白的对照CAR-T细胞的10-50％，如15-50％。
因此，本发明提供一类CAR-T细胞，该类细胞含有编码靶向感兴趣肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子与编码能下调细胞表面HLA-I类分子表达的功能蛋白的核酸分子。本文中，合适的T细胞可以是本领域周知的各种T细胞，尤其是细胞免疫疗法中常规使用的各种T细胞，包括但不限于外周血T淋巴细胞、细胞毒杀伤T细胞、辅助T细胞、抑制/调节性T细胞、γδT细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞等，以及上述细胞的任意一种或多种的混合物。本文中，CAR-T细胞指至少表达嵌合抗原受体的T细胞。
本文中，嵌合抗原受体具有本领域周知的含义，它是一种人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原并杀死肿瘤细胞。
适用于本文的嵌合抗原受体可以是本领域周知的各种CAR。通常，CAR依次包含结合肿瘤抗原的多肽、铰链区、跨膜区和胞内信号区。结合肿瘤抗原的多肽可以是天然多肽或人工合成多肽；优选地，人工合成多肽为单链抗体或Fab片段。
本文中，感兴趣的肿瘤抗原包括但不限于实体瘤抗原、髓系肿瘤抗原以及非B细胞谱系血液肿瘤的抗原。合适的实体瘤抗原包括但不限于EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如，ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白(Legumain)、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸、Fos-相关抗原、中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4和呈递在MHC上的这些抗原中任一者的多肽片段。合适的B细胞抗原包括但不限于CD5、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD34、CD37、CD38、CD40、CD53、CD69、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD123、CD135、CD138、CD179、CD269、Flt3、ROR1、BCMA、FcRn5、FcRn2、CS-1、CXCR4、CXCR5、CXCR7、IL-7/3R、IL7/4/3R和IL4R。
在优选的实施方案中，本发明结合肿瘤抗原的多肽是特异性结合上述任一种肿瘤抗原的单链抗体。本文中，单链抗体(scFv)指由抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列和重链可变区(VH区)氨基酸序列经铰链连接而成的具有结合抗原能力的抗体片段。感兴趣的单链抗体可来自感兴趣的抗体。感兴趣的抗体可以是人抗体，包括人鼠嵌合抗体和人源化抗体。抗体可以是分泌型或膜锚定型；优选地为膜锚定型。本文中，特异性结合是指抗体或其抗原结合片段与其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
单链抗体可含有感兴趣抗体的重链可变区和轻链可变区，或由重链可变区和轻链可变区以及任选的接头组成。重链可变区和轻链可变区之间可通过熟知的接头连接。本文中，接头或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。示例性的接头包括含有G和/或S的接头，以及Furin2A肽(F2A)。接头的长度可以是3-25个氨基酸残基，例如3-15、5-15、10-20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2-20个，例如2-15、2-10、2-8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。接头长度通常为15-20个氨基酸。在某些实施方案中，接头为(GGGS)n，n为1-5的整数。
在某些实施方案中，感兴趣的肿瘤抗原是CD19，感兴趣的单链抗体是特异性结合CD19的单链抗体。示例性的特异性结合CD19的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第23-267位氨基酸残基所示，其中，重链可变区和轻链可变区通过含G和S的接头序列连接。
CAR中所含的其它部分，如铰链区、跨膜区和胞内信号区可以是常规用于构建各类CAR的铰链区、跨膜区和胞内信号区。
本文中，铰链区指免疫球蛋白重链CH1和CH2功能区之间的区域，该区富含脯氨酸，不形成α螺旋，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合。适用于本文的铰链区可选自CD8胞外铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28胞外铰链区、IgG4 Fc CH2CH3铰链区和CD4胞外铰链区。在某些实施方案中，本文使用CD8α铰链区。
本文中，跨膜区可选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种。优选地，用于本文的嵌合抗原受体的跨膜区为CD8跨膜区。示例性的铰链区和跨膜区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:2第268-336位氨基酸残基所示。
本文中，胞内信号区可选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS、DAP10、CD3ζ和Fc310/中的任意一种或多种的胞内信号区，优选为4-1BB胞内信号区和CD3ζ胞内信号区。本文示例性的胞内信号区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:2第337-490位氨基酸残基所示。
嵌合抗原受体还可包括信号肽。信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链(长度5-30个氨基酸)，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列。信号肽可以是膜蛋白信号肽，如CD8信号肽、CD28信号肽和CD4信号肽。示例性的信号肽氨基酸序列可如SEQ ID NO:2第1-22位氨基酸残基所示。
因此，本发明嵌合抗原受体的氨基酸序列，从N端到C端，通常为任选的信号肽、靶向感兴趣重链抗原的单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号区。示例性的嵌合抗原受体的氨基酸序列可如SEQ ID NO:2第23-490位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:2第1-490位氨基酸残基所示。
形成本文嵌合抗原受体的上述各部分，如信号肽、单链抗体的轻链可变区和重链可变区、铰链区、跨膜区和胞内信号区等，相互之间可直接连接，或者可通过本领域周知的接头序列连接，例如前文所述的含G和S的接头序列。
本文中，能下调细胞表面HLA-I类分子表达的功能蛋白可以是病毒蛋白，优选是来自其天然宿主细胞不是T细胞的病毒的蛋白。虽然HIV-1是T细胞的天然宿主，且HIV-1nef病毒蛋白能下调T细胞表面的HLA-I类分子的表达，但在慢病毒中引入HIV-1nef蛋白来制备CAR-T时会引起RCL(replication competent lentivirus)，因此，本发明优选使用来自诸如HSV、BHV-1、EHV-1/4、PRV、HSV-1/2、VZV、EBV、hCMV、mCMV、RhCMV、HHV-6/7、KSHV、MHV-68、牛痘病毒和腺病毒的病毒蛋白，包括但不限于：来自HSV的UL41/vhs蛋白，来自BHV-1、EHV-1/4或PRV的UL49.5，来自HSV-1/2的ICP47，来自VZV的ORF66，来自EBV的EBNA1、BNLF2a、BGLF5和BILF1，来自hCMV的US2/gp24、US3/gp23、US6/gp21、US10和US11/gp33，来自mCMV的m4/gp34、m6/gp48、m27和m152/gp40，来自RhCMV的rh178/VIHCE，来自HHV-6/7的U21和LANA1，来自KSHV的ORF37/SOX、kK3/MIR1和kK5/MIR2，来自MHV-68的mK3，来自牛痘病毒的CPXV012和CPXV203，以及来自腺病毒的E3-19K。
优选的功能蛋白是能直接靶向降解MHC I的功能蛋白，或者是能经由TAP蛋白(如抑制TAP，包括阻止TAP蛋白结合ATP和/或诱导TAP蛋白降解)来下调HLA-I类分子表达的功能蛋白，或者是能经由溶酶体来下调HLA-I类分子表达的功能蛋白。示例性的优选蛋白包括但不限于来自HCMV的病毒蛋白，如US11和US6，来自BHV-1的病毒蛋白，如UL49.5，来自EHV-1的病毒蛋白，如UL49.5，以及来自KSHV的病毒蛋白，如k5。在某些实施方案中，本发明使用来自EHV-1的UL49.5，其氨基酸序列可如SEQ ID NO:2第516-615位氨基酸残基所示。
病毒蛋白可通过本领域常用的接头与本发明的CAR相连。例如，在某些实施方案中，该接头是常规的F2A序列。示例性的F2A的氨基酸序列可如SEQ ID NO:2第494-515位氨基酸残基所示。F2A也可通过常规的含G和S的接头与CAR相连。
本发明的核酸分子可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。本发明的核酸分子可以是CAR的编码序列和能下调细胞表面HLA-I类分子表达的功能蛋白的编码序列，或者是CAR的表达框和该功能蛋白的表达框。本文中，编码序列指核酸序列中直接确定其蛋白产物(例如CAR、单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内信号区、病毒蛋白或其融合蛋白等)的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。本文中，表达框指表达感兴趣基因所需的完整元件，包括启动子、基因编码序列和PolyA加尾信号序列。本文所述的核酸分子可以是独立的两个核酸分子，分别含CAR的编码序列和含所述功能蛋白的编码序列，如分别是CAR的表达框和功能蛋白的表达框；或者，所述含CAR的编码序列和所述功能蛋白的编码序列可经由接头连接为一个核酸分子，如CAR的编码序列和功能蛋白的编码序列在同一表达框内，或者是两个表达框经由合适的接头连接为同一核酸分子。在某些实施方案中，本发明的核酸分子为CAR的编码序列和功能蛋白的编码序列同处一表达框的核酸分子，其含有启动子、编码所述嵌合抗原受体和功能蛋白的核酸序列以及PolyA加尾信号。
在某些实施方案中，所述编码序列或表达框整合到CAR-T细胞的基因组中。因此，在这些实施方案中，本文所述的CAR-T细胞的基因组中稳定整合了包含编码本文所述CAR和功能蛋白的表达框。
在某些实施方案中，所述核酸分子是核酸构建物，其含有本文所述CAR和/或功能蛋白的编码序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本文。
在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。载体可以是克隆载体，也可以是表达载体，或者是同源重组载体。具体而言，可将本文CAR和/或功能蛋白的编码序列克隆入许多类型的载体，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。克隆载体可用于提供本发明CAR与功能蛋白的编码序列，如含CAR的编码序列与功能蛋白的编码序列的一个核酸分子。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒等。同源重组载体用于将本文所述的表达框整合到宿主基因组中。
通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，当使用逆转录病毒载体时，逆转录病毒载体通常含有复制起始位点、3’LTR、5’LTR、本文所述融合蛋白的编码序列以及任选的可选择的标记。
合适的启动子包括但不限于即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列、延伸生长因子-1伸(EF-1因)、类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子等。
可选择的标记包括可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从被病毒载体感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。有用的可选择标记基因包括例如抗生素抗性基因，如neo。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白的基因。
本文所述的核酸分子通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。或者，也可直接合成本文所述的核酸分子。
本文示例性的含CAR与功能蛋白的编码序列的核酸分子的核苷酸序列可如SEQ IDNO:1所示。可采用常规的方法将本文的核酸分子(尤其是载体)导入宿主细胞中，这些方法包括显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等。
本文所述，宿主细胞含有本文所述的核酸分子。宿主细胞既包括最终用于疾病治疗目的的T细胞，也包括生产CAR-T细胞过程中使用到的各种细胞，如大肠杆菌细胞，以用于如提供本发明蛋白的编码序列或提供本文所述的载体。在某些实施方案中，本文提供一种稳定表达本文所述功能蛋白的CAR-T细胞。
本文也包括本文所述的核酸分子。如前文所述，可采用本领域常规的方法制备得到本文所述的核酸分子。在某些实施方案中，本文还包括慢病毒，其包括本文所述的表达框，并能将本文所述的表达框整合到宿主细胞的基因组中。可采用本领域周知的方法制备本文所述的慢病毒。例如，首先制备得到含有本文所述表达框的慢病毒载体，然后在合适的宿主细胞中进行病毒包装，并分离纯化得到所需的慢病毒。用于慢病毒包装的试剂为本领域所周知，如常规的慢病毒载体系统(Tronolab)包括pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G和目的干扰质粒。
本文还包括一种CAR-T细胞培养物，该培养物含有本文所述的CAR-T细胞以及合适的培养基。培养基可以是本领域常规用于培养CAR-T细胞的培养基。
本文还提供一种药物组合物，该药物组合物中含有本文所述的CAR-T细胞以及药学上可接受的辅料。本文中，药学上可接受的辅料是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。更具体而言，合适的药学上可接受的辅料可以是本领域常用于CAR-T细胞给药的辅料。
通常，药物组合物中含有治疗有效量的CAR-T细胞。治疗有效量是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解疾病或病症的剂量。可根据患者年龄、性别、所患病症及其严重程度、患者的其它身体状况等因素确定治疗有效量。本文中，受试者或患者通常指哺乳动物，尤其指人。
本文中，适合使用本文所述的核酸分子、CAR-T细胞以及药物组合物治疗的疾病与所述核酸分子以及CAR-T细胞所表达的嵌合抗原受体中的单链抗体有关。因此，本文所述的疾病包括与前文所述的肿瘤抗原相关的各类癌症，包括实体瘤和血液肿瘤，如腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌和前列腺癌等实体瘤，以及白血病和淋巴瘤，如B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病和急性髓性白血病等。
在某些实施方案中，本文还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本文所述的载体。试剂盒还可含有适用于将所述载体转染入细胞中的各种试剂，以及任选的指导本领域技术人员将所述重组表达载体转染入细胞的说明书。
下面将结合实施案例对本发明所涉及的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施案例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施案例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
一.实验材料和结果
(1)仪器和材料：
仪器：生物安全柜(海尔、HR40-IIA2)，CO2培养箱(Thermo、3111)，流式细胞仪(BD、FACSCantoll)，酶标仪(Molecular Derices、SpectraMax M4)
试剂：Anti-HLA-I抗体(APC)(Biolegend、311410)，Anti-CD3抗体(BV421)(Biolegend、300434)，Anti-TCR抗体(PE-Cy7)(Biolegend、306720)，FBS(Lonsera、S711-001S)，X-vivo15(Lonza、04-418Q)，Dynabeads CD3/CD28(Lifetechnology、40203D)，Ficoll(达优、DKW-LSH-0250)，Tscm(Novoprotein，GMP-1647)，Novonectin(Novoprotein、GMP-CH38)，抗人CCR7(BV421)(BD、562555)，抗人CD45RA(PE-Cy7)(BD、560675)，Luciferase检测(Promega、E6120)，抗人CD3(FITC)(BD、562555)，抗人CD4(BV510)(BD、563094)，抗人CD8(APC-Cy7)(BD、557834)，抗人CD25(PE)(BD、555432)、抗人CD69(APC)(BD、553237)、CAR19-ideotype(自标)，INF-r ELISA检测试剂盒(R&D、DIF50)。
(2)测试方法
实验方法
1)载体构建
从NCBI网站数据库搜索到人CD8α铰链区、人CD8跨膜区、41BB胞内区、人CD3、和EHV1 UL49.5基因序列信息，抗CD19单链抗体克隆号为FMC63，这些序列在网站https://www.thermofisher.com/order/geneartgenes上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。
采用重叠PCR将上述序列依次按抗CD19-scFv基因、人CD8铰链区基因、人CD8跨膜区基因、41BB胞内区基因、人CD3胞内区、F2A和EHV1 UL49.5基因序列进行连接，形成完整的CD19-CAR-F2A-EHV1 UL49.5基因序列信息(其包含信号肽编码序列的序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)。
该CAR分子的核苷酸序列经无缝克隆到慢病毒质粒pWPXL(Addgene)的Bamh1-Ecor1位点，转化到感受态大肠杆菌(DH5转)。
将重组质粒送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的CD19-CAR-F2A-EHV1 UL49.5序列比对来验证序列是否正确。测序引物为TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC(SEQ ID NO:3)。
经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，采用磷酸钙法将纯化的质粒转染293T细胞，进行慢病毒包装实验(Molecular Therapy-Methods&Clinical Development,2016,3:16017)，由此制备得到的慢病毒命名为PCTL206。
采用相同的方法，但用不同的病毒蛋白替换PCTL206中的病毒蛋白，制备得到慢病毒PCTL135(CAR19-F2A-GFP，对照)、PCTL199(CAR19-F2A-HCMV US2)、PCTL200(CAR19-F2A-HCMV US11)、PCTL201(CAR19-F2A-HCMV US6)、PCTL202(CAR19-F2A-HSV-1 ICP47)、PCTL203(CAR19-F2A-5 E3-19K)、PCTL204(CAR19-F2A-RhCMV Rh178)、PCTL205(CAR19-F2A-BHV-1UL49.5)、PCTL207(CAR19-F2A-EBV BNLF2a)、PCTL208(CAR19-F2A-CPXV012)、PCTL209(CAR19-F2A-HCMV US3)、PCTL210(CAR19-F2A-MHV68 mK3)、PCTL211(CAR19-F2A-CPXV203)、PCTL212(CAR19-F2A-KSHV k3)、PCTL213(CAR19-F2A-KSHV k5)，其中病毒蛋白HCMV US2、HSV-1 ICP47、人腺病毒5 E3-19K、RhCMV Rh178、EBV BNLF2a、牛痘病毒CPXV012、HCMV US3、MHV68 mK3、牛痘病毒CPXV203、KSHV k3、HCMV US11、HCMV US6、BHV-1 UL49.5和KSHV k5的氨基酸序列分别如以下UniprotKB登陆号所示的氨基酸序列所示：C8CFI0、P03170、Q8BEL5、Q7TFG4、P0C739、U5TIW7、Q910T7、O41933、G0XWR7、A0A386AVI8、P09727、P14334、Q77CE4和F5H9K4。更具体而言，HCMV US11的编码序列如SEQ ID NO:4第1546-2193位碱基所示；HCMVUS6的编码序列如SEQ ID NO:5第1546-2097位碱基所示；BHV-1 UL49.5的编码序列如SEQID NO:6第1546-2097位碱基所示；KSHV k5的编码序列如SEQ ID NO:7第1546-2316位碱基所示。
2)外周血PBMC的分离、T细胞分离活化、慢病毒转导、体外培养
选择HBV、HCV和HIV检测阴性的健康供者，肘正中静脉抽血100ml，Ficoll密度梯度离心分离PBMC白膜层，根据全血流式检测CD3+T细胞百分比，计算CD3+T细胞数，按DynaBeads CD3/CD28与CD3+T细胞比例3：1，吸取使用量磁珠，与白膜层细胞孵育30min，分离CD3+T细胞，CD3+T细胞经Dynabeads CD3/CD28(Lifetechnology、40203D)活化24小时后流式检测CD25+CD69+T细胞比例。CD3+T活化后，进行慢病毒转导。用Novonectin包被24孔板37℃孵育2小时，将细胞悬液与分别与前述制备得到的各种慢病毒(MOI＝8)、F108(10ug/ml)、Tscm(2U/ml)配置成转导体系置于包被的24孔板中，细胞密度调整至1.0E+06/ml，500g离心30min，离心后37℃CO2培养箱静置培养48h。转染后以含5％FBS Xvivo15培养液培养，隔日补充Tscm(终浓度2U/ml)，计数细胞，调整细胞密度至0.5E+06/ml，培养至第8-10天收获细胞。
3)靶细胞刺激各组CAR-T细胞
各组CAR-T细胞体外培养至8-10天，计数细胞取1.0E+07细胞，调整细胞密度至1.0E+06/ml，以Xvivo15培养(不含Tscm)，按效靶比10：1添加靶细胞K562-CD19刺激CAR-T细胞，连续两天反复刺激两次，流式检测各组细胞CAR阳性率以及CAR阳性细胞HLA-I平均荧光强度。
4)流式检测各组CAR-T细胞CAR阳性率以及CAR+T细胞HLA平均荧光强度
计数各组CAR-T细胞，分别取5.0E+05细胞于不同1.5ml EP管，2000rpm，5min离心收集细胞，弃去培养液，用无菌4％BSA重悬洗涤细胞2次，后用100ul4％BSA重悬细胞，每管细胞加入抗人HLA(APC)抗体8ul，旋涡混匀，4℃孵育30min；染色完毕，重复洗涤细胞，将CAR19-ideotype抗体1：500稀释，用稀释后的抗体溶液重悬细胞，每管200ul，旋涡混匀，4℃孵育30min，染色完毕，重复洗涤细胞，500ul4％BSA重悬细胞，每管加入7AAD抗体4ul，旋涡混匀，常温避光孵育10min，孵育完成后，转移至流式管，上机检测。
5)细胞表型分析
计数各组CAR-T细胞，分别取1.0E+06细胞于不同1.5ml EP管，2000rpm，5min离心收集细胞，弃去培养液，用无菌4％BSA重悬洗涤细胞2次，后用200ul4％BSA重悬细胞，样本管每管加入抗人CD45RA(PE-Cy7)、抗人CCR7(BV421)抗体各5ul，旋涡混匀仪混匀，4℃孵育30min，染色完毕，重复洗涤细胞，用500ul4％BSA重悬细胞，每管加入7AAD抗体4ul，旋涡混匀，常温避光孵育10min，孵育完成后，转移至流式管，上机检测。
6)细胞杀伤
取出NC-T(未进行慢病毒转染的T细胞)、各组CAR-T细胞，于显微镜下观察细胞生长状态是否正常，吹打混匀，将NC-T、各组CAR-T细胞收集于离心管中，计数细胞，离心收集细胞，用T细胞培养液X-VIVO15(不含Tscm)重悬离心收集的细胞沉淀，并将细胞密度调整至5.0E+07细胞/mL；取出靶细胞，于显微镜下观察细胞状态是否正常，将靶细胞分别收集于15mL或50mL离心管中，并计数细胞，用RPMI 1640(不含FBS)重悬离心收集的细胞沉淀，并将细胞密度调整至5.0E+06细胞/mL；于1.5mL离心管中将上述调整好密度的效应细胞NC-T和CAR-T分别与靶细胞按不同效靶比(1:1、2.5:1、5:1、10:1、20:1)混合，用X-VIVO15将总体积补足200积补(靶细胞10ul，效应细胞量根据效靶比确定)，将上述配制的200配制杀伤体系分别移入96孔V型板中共孵育24小时后，轻轻吹打混匀96孔板V型板中各孔细胞，并分别转移100μ0细胞悬液入白壁底不透96孔板中，加入80μL ONE-GloTMLuciferase AssaySubstrate，吹吸混匀，室温避光孵育10分钟后上Luminoskan Ascent化学发光分析仪检测荧光强度。
二.实验结果
1、筛选具有下调CAR-T细胞表面HLA-I类分子表达的功能蛋白
选取14种具有下调细胞表面功能的病毒蛋白合成构建到CAR19的慢病毒中，各组慢病毒转染T细胞，体外培养T细胞至第8天，流式检测CAR19转染效率以及CAR19+T细胞群体HLA平均荧光强度(图1，表1)。
表1：各组T细胞HLA平均荧光强度
Figure BDA0002035682820000171
Figure BDA0002035682820000181
体外培养第9天，用靶细胞K562-CD19刺激各组T细胞，效靶比10：1，连续反复刺激2天，流式检测各组T细胞CAR19+细胞群体HLA-I平均荧光强度，结果如图2所示。结果显示，PCTL200、PCTL201、PCTL205、PCTL206、PCTL213这5种慢病毒具有较强的制备HLA-I类分子表达下调的CAR-T细胞的能力。
2、PCTL200、PCTL201、PCTL205、PCTL206、PCTL213分子的功能确定
1)外周血分离PBMC及T细胞活化
100ml外周血分离1.24E+08 PBMC，流式检测外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T比例，其中CD3+T占白膜层细胞(单核细胞和淋巴细胞)62.4％，CD4+T/CD8+T为1.2，DynaBeads CD3/CD28分选并活化CD3+T，24h后活化效率为68.9％(图3)。
2)T细胞转染效率、HLA平均荧光强度、体外扩增倍数、细胞毒性实验、T细胞表型分析
各组慢病毒转染T细胞，隔日计数T细胞，体外培养T细胞至第8天，流式检测CAR19转染效率，同时计算细胞增殖倍数(第8天的细胞数/用于转染的细胞数)。结果如下表2和图4所示，其中PCTL135组的CAR19阳性率为65.6％，PCTL200组的CAR19阳性率为37.4％，PCTL201组的CAR19阳性率为46％，PCTL205组的CAR19阳性率为55.8％，PCTL206组的CAR19阳性率为54.6％，PCTL213组的CAR19阳性率为55.7％。
表2：各组T细胞转染效率及扩增倍数
组别 病毒 滴度 转染效率(第8天) 扩增倍数
1 PCTL135 1.36E+07 65.6％ 165.60
2 PCTL200 7.20E+07 37.4％ 284.40
3 PCTL201 1.40E+08 46％ 206.15
4 PCTL205 1.32E+08 55.8％ 477.00
5 PCTL206 1.22E+08 54.6％ 274.00
6 PCTL213 1.04E+08 55.7％ 306.25
流式分析CAR19+T细胞群体HLA平均荧光强度。结果如表3和图5所示，各实验组T细胞HLA平均荧光强度均较对照组PCTL135显著下调，表明测试的5种病毒蛋白能下调T细胞表面的HLA-I类分子的表达，可以通过表达相关病毒蛋白靶向抑制HLA-I类分子的技术制备通用型CAR-T。
表3：各组T细胞HLA平均荧光强度
病毒 效率％ HLA平均值
PCTL135 65.6％ 9273
PCTL200 37.4％ 4100
PCTL201 46％ 3382
PCTL205 55.8％ 4179
PCTL206 54.6％ 2090
PCTL213 55.7％ 2776
各组T细胞体外培养至第8天，与靶细胞系k562-CD19-luc分别按效靶比20：1、10：1、5：1、2.5：1、1：1共培养24h，经荧光素酶报告基因检测系统检测各组T细胞细胞毒性，结果如表4和图6所示。
表4：各组T细胞体外杀伤效率
效靶比 PCTL135 PCTL200 PCTL201 PCTL205 PCTL206 PCTL213
1:1 -247％ 46％ 68％ 45％ -6％ 3％
2.5:1 -42％ 93％ 81％ 94％ 90％ 83％
5:1 91％ 99％ 95％ 99％ 97％ 97％
10:1 95％ 100％ 99％ 99％ 95％ 99％
20:1 95％ 100％ 99％ 100％ 100％ 100％
各组T细胞体外培养至第8天，经流式检测各组T细胞CCR7和CD45RA表达，分析T细胞表型，各组细胞表型无明显差异，约60％细胞在T-naive分化阶段(图7)。
3)经靶细胞刺激，各组T细胞HLA平均荧光强度
体外培养第9天，用靶细胞K562-CD19刺激各组T细胞，效靶比10：1，连续反复刺激2天，流式检测各组T细胞CAR19+细胞群体HLA-I平均荧光强度，结果如表5和图8所示。结果显示，各组HLA-I平均荧光强度显著低于对照组，其中PCTL206组最显著。
表5：经靶细胞刺激各组T细胞HLA-I平均荧光强度
病毒 杀伤效率％(E：T＝10：1) HLA平均值
PCTL135 69.5 14259
PCTL200 52.9 6328
PCTL201 61.8 3839
PCTL205 69.8 4525
PCTL206 68.7 2598
PCTL213 71.8 4300
序列表
<110> 苏州方德门达新药开发有限公司
<120> 通用型CAR-T细胞、其制备及应用
<130> 192053
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1848
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggatatga gggtgcctgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggct gaggggcgct 60
aggtgtgaca tccagatgac ccagagccct tcctccctga gcgcctccgt gggcgataga 120
gtgacaatca catgtagagc ctcccaggac atcagcaagt acctgaactg gtaccagcag 180
aagcccggca aggcccccaa gctgctgatc taccacacct ccagactgca cagcggcgtg 240
cctagcaggt tcagcggctc cggcagcggc accgacttta cactgaccat cagctccctg 300
cagcctgagg atttcgccac ctactactgt cagcagggca atacactgcc ctacaccttt 360
ggccagggca ccaagctgga gatcaaggga tccaccagcg gcggaggaag cggcggaggt 420
agcggaggag gcggaagctc ccaggtgaca ctgaaggaga gcggccctgc cctggtgaag 480
cctacacaga cactgacact gacgtgtacc ttctccggct tcagcctgtc cgattacggc 540
gtgagctgga tcagacagcc tcctggcaag gccctggagt ggctggccgt gatctggggc 600
agcgagacca cctactacaa ttccgccctg aagagcaggc tgaccatctc caaggacacc 660
tccaagaacc aggtggtgct gaccatgacc aatatggatc ctgtggacac cgccacatac 720
tactgtgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggattactg gggccagggc 780
accctggtga ccgtgagctc caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840
accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900
gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 960
gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 1020
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1080
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1140
aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1200
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1260
cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320
cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440
gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc ggctccggag taaagcaaac actgaacttt 1500
gaccttctca agttggctgg agacgttgag tccaatcctg ggcccatgct gtccacgaga 1560
ttcgtgacgc tggccattct cgcctgcctt ttggtggtgc ttggtctggc cagaggggct 1620
ggtggcgacc caggtgtgaa gcaacgaatc gacgttgcta gagaagagga gagacgcgac 1680
ttctggcatg cagcctgctc cggacacgga ttcccaatta ccaccccaag cacggctgct 1740
attctatttt atgtgtctct gcttgcagtg ggagtggctg ttgcctgcca ggcataccgc 1800
gccgtcttgc gaatcgtgac gctggagatg ttgcaacacc tgcattga 1848
<210> 2
<211> 615
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys
145 150 155 160
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
165 170 175
Ser Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Ala Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln
210 215 220
Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
275 280 285
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
290 295 300
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
305 310 315 320
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
325 330 335
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
340 345 350
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
355 360 365
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
370 375 380
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
385 390 395 400
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
405 410 415
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
420 425 430
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
435 440 445
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
450 455 460
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
465 470 475 480
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Val Lys Gln
485 490 495
Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
500 505 510
Pro Gly Pro Met Leu Ser Thr Arg Phe Val Thr Leu Ala Ile Leu Ala
515 520 525
Cys Leu Leu Val Val Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Gly Gly Asp Pro
530 535 540
Gly Val Lys Gln Arg Ile Asp Val Ala Arg Glu Glu Glu Arg Arg Asp
545 550 555 560
Phe Trp His Ala Ala Cys Ser Gly His Gly Phe Pro Ile Thr Thr Pro
565 570 575
Ser Thr Ala Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Leu Leu Ala Val Gly Val
580 585 590
Ala Val Ala Cys Gln Ala Tyr Arg Ala Val Leu Arg Ile Val Thr Leu
595 600 605
Glu Met Leu Gln His Leu His
610 615
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaagcctca gacagtggtt c 21
<210> 4
<211> 2193
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggatatga gggtgcctgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggct gaggggcgct 60
aggtgtgaca tccagatgac ccagagccct tcctccctga gcgcctccgt gggcgataga 120
gtgacaatca catgtagagc ctcccaggac atcagcaagt acctgaactg gtaccagcag 180
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cctagcaggt tcagcggctc cggcagcggc accgacttta cactgaccat cagctccctg 300
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gctctgtgga ccctgcgcgg gaacctgtcc gtgcccacgc cgacaccccg ggtgtactac 1800
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atgatggtgg cagtgattca agtgttttgg gggctgtatg tgaaaggttg gctgcaccga 2160
cattttccct ggatgttttc ggaccagtgg tga 2193
<210> 5
<211> 2097
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<211> 1836
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggatatga gggtgcctgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggct gaggggcgct 60
aggtgtgaca tccagatgac ccagagccct tcctccctga gcgcctccgt gggcgataga 120
gtgacaatca catgtagagc ctcccaggac atcagcaagt acctgaactg gtaccagcag 180
aagcccggca aggcccccaa gctgctgatc taccacacct ccagactgca cagcggcgtg 240
cctagcaggt tcagcggctc cggcagcggc accgacttta cactgaccat cagctccctg 300
cagcctgagg atttcgccac ctactactgt cagcagggca atacactgcc ctacaccttt 360
ggccagggca ccaagctgga gatcaaggga tccaccagcg gcggaggaag cggcggaggt 420
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cctacacaga cactgacact gacgtgtacc ttctccggct tcagcctgtc cgattacggc 540
gtgagctgga tcagacagcc tcctggcaag gccctggagt ggctggccgt gatctggggc 600
agcgagacca cctactacaa ttccgccctg aagagcaggc tgaccatctc caaggacacc 660
tccaagaacc aggtggtgct gaccatgacc aatatggatc ctgtggacac cgccacatac 720
tactgtgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggattactg gggccagggc 780
accctggtga ccgtgagctc caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840
accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900
gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 960
gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 1020
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aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1200
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1260
cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320
cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440
gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc ggctccggag taaagcaaac actgaacttt 1500
gaccttctca agttggctgg agacgttgag tccaatcctg ggcccatgcc gcggtcgccg 1560
ctcatcgttg cggttgtggc cgccgcgctg tttgccatcg tgcgcggccg cgaccccctg 1620
ctagacgcga tgcggcgcga gggggcaatg gacttttgga gcgcaggctg ctacgcgcgc 1680
ggggtgccgc tctcggagcc accgcaggcc ctggttgttt tttacgtggc cctgaccgcg 1740
gtaatggtcg ccgtggccct gtacgcgtac gggctttgct ttaggctcat gggcgccagc 1800
gggcccaata aaaaggagtc gcgggggcgg ggctga 1836
<210> 7
<211> 2316
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggatatga gggtgcctgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggct gaggggcgct 60
aggtgtgaca tccagatgac ccagagccct tcctccctga gcgcctccgt gggcgataga 120
gtgacaatca catgtagagc ctcccaggac atcagcaagt acctgaactg gtaccagcag 180
aagcccggca aggcccccaa gctgctgatc taccacacct ccagactgca cagcggcgtg 240
cctagcaggt tcagcggctc cggcagcggc accgacttta cactgaccat cagctccctg 300
cagcctgagg atttcgccac ctactactgt cagcagggca atacactgcc ctacaccttt 360
ggccagggca ccaagctgga gatcaaggga tccaccagcg gcggaggaag cggcggaggt 420
agcggaggag gcggaagctc ccaggtgaca ctgaaggaga gcggccctgc cctggtgaag 480
cctacacaga cactgacact gacgtgtacc ttctccggct tcagcctgtc cgattacggc 540
gtgagctgga tcagacagcc tcctggcaag gccctggagt ggctggccgt gatctggggc 600
agcgagacca cctactacaa ttccgccctg aagagcaggc tgaccatctc caaggacacc 660
tccaagaacc aggtggtgct gaccatgacc aatatggatc ctgtggacac cgccacatac 720
tactgtgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggattactg gggccagggc 780
accctggtga ccgtgagctc caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840
accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900
gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 960
gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 1020
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1080
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1140
aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1200
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1260
cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320
cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440
gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc ggctccggag taaagcaaac actgaacttt 1500
gaccttctca agttggctgg agacgttgag tccaatcctg ggcccatggc gtccaaggac 1560
gtagaagagg gtgtagaggg acccatctgc tggatatgta gggaagaggt ggggaacgag 1620
ggcatacacc cctgcgcctg taccggagag ctggatgtcg tccacccgca gtgtttaagc 1680
acttggctaa cagtgtctcg aaacacggcc tgtcaaatgt gtcgcgttat ataccgcacg 1740
cgcacgcagt ggcgtagtcg ccttaacctg tggccggaga tggagcgcca agaaattttt 1800
gaactgtttt tgctgatgtc tgtggtggtg gctgggcttg tcggcgtggc gttgtgcacc 1860
tggacgctcc tggtcatcct aactgctcct gcgggaacat tctcccccgg ggccgtgctc 1920
ggttttctct gcttctttgg gttttaccaa atatttattg tgtttgcatt tggcggcata 1980
tgccgcgtaa gtggcactgt gagggcatta tacgcggcaa ataacacccg ggtgaccgta 2040
ctgccatacc gacggccgcg ccggccaacc gcgaacgaag ataacatcga attgacggtc 2100
cttgtcggac ccgcgggcgg gacggacgag gagcccacgg acgagtcatc tgaaggagac 2160
gtcgcctctg gagacaaaga acgtgacggt tcatccggag acgagccgga cgggggcccg 2220
aacgaccgtg cgggacttag ggggacagcg cgtaccgacc tatgcgcgcc cacaaaaaag 2280
ccggtgcgga aaaatcatcc aaaaaacaac ggttga 2316

Claims (10)

1.一种CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞表达嵌合抗原受体和能下调细胞表面HLA-I类分子表达的功能蛋白；优选地，表达所述嵌合抗原受体和功能蛋白的所述CAR-T细胞细胞表面HLA-I类分子的表达水平为表达相同嵌合抗原受体但未表达所述功能蛋白的对照CAR-T细胞的50％以下。
2.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞含有所述嵌合抗原受体的编码序列和所述功能蛋白的编码序列；优选地，所述CAR-T细胞含有所述嵌合抗原受体的表达框和所述功能蛋白的表达框，或所述嵌合抗原受体的编码序列和所述功能蛋白的编码序列处于同一表达框内。
3.如权利要求1或2所述的CAR-T细胞，其特征在于，
所述嵌合抗原受体特异性结合选自以下的肿瘤抗原中的一种或多种：EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸、Fos-相关抗原、中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、muthsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4和呈递在MHC上的这些抗原中任一者的多肽片段，以及CD5、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD34、CD37、CD38、CD40、CD53、CD69、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD123、CD135、CD138、CD179、CD269、Flt3、ROR1、BCMA、FcRn5、FcRn2、CS-1、CXCR4、CXCR5、CXCR7、IL-7/3R、IL7/4/3R和IL4R；或
所述能下调细胞表面HLA-I类分子表达的功能蛋白选自：HSV、BHV-1、EHV-1/4、PRV、HSV-1/2、VZV、EBV、hCMV、mCMV、RhCMV、HHV-6/7、KSHV、MHV-68、牛痘病毒和腺病毒中能直接靶向降解HLA-I的功能蛋白、能经由TAP蛋白来下调HLA-I类分子表达的功能蛋白和能经由溶酶体来下调HLA-I类分子表达的功能蛋白；优选地，所述功能蛋白选自：来自HCMV的蛋白US11和US6、来自BHV-1的蛋白UL49.5、来自EHV-1的蛋白UL49.5和来自KSHV的蛋白k5。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子选自：
(1)含嵌合抗原受体的编码序列和能下调细胞表面HLA-I类分子表达的功能蛋白的编码序列的核酸分子；和
(2)(1)所述核酸分子的互补序列；
优选地，所述嵌合抗原受体和所述功能蛋白如权利要求3所述。
5.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物含有权利要求4所述的核酸分子。
6.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，
所述核酸构建物含有所述嵌合抗原受体的表达框和所述功能蛋白的表达框；或所述核酸构建物为一表达框，其中所述嵌合抗原受体的编码序列和所述功能蛋白的编码序列处于该表达框内；或
所述核酸构建物是克隆载体或表达载体。
7.一种慢病毒，其含有权利要求5或6所述的核酸构建物。
8.一种宿主细胞，其含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5或6所述的核酸构建物或权利要求7所述的慢病毒。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1-3中任一项所述的CAR-T细胞。
10.权利要求3所述的功能蛋白或其编码序列在制备细胞表面的HLA-I类分子的表达下调的CAR-T细胞中的应用，或在制备癌症治疗用的CAR-T细胞中的应用。
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