CN111774111B - 一种用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片及其检测方法，该微流控芯片自上而下依次设有一盖片层、一设有镂空通道结构的流体层以及一基底层，镂空通道结构与基底层共同构成样品检测单元。在盖片层上分别设有一进样通孔和一废液导出通孔。样品检测单元包括一个或多个进样室以及一稀释腔室、一亲和层析通道、一检测腔室和一废液池。进样通孔连通于进样室，废液导出通孔连通于废液池。本发明通过微流控芯片集样品进样、样品稀释和光、电检测于一体，极大地简化了操作流程，降低了样品和试剂消耗，并且不需要配备昂贵的仪器，极大地降低了使用成本，使糖化血红蛋白现场即时检测成为可能，具有可预见的巨大的经济价值和社会价值。

Description

一种用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片及其检测方法

技术领域

本发明涉及微流控芯片技术领域，且特别涉及一种用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片及其检测方法。

背景技术

糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的代谢性疾病。目前糖尿病主要通过血糖参数的检测来进行判定，但血糖参数只能代表抽血时的血糖水平，对糖尿病的确诊有其局限性。近年来医学研究证明：血液中的糖化血红蛋白(GHb)浓度相对稳定，其浓度值能准确反映最近2～3个月期间内的血糖水平，便于医生对糖尿病进行早期诊断和了解糖尿病的控制情况。

目前，临床实验室中检测糖化血红蛋白的方法主要有两大类：一类方法基于糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白所带的电荷不同，如离子层析法、电泳等方法；另一类方法则是基于血红蛋白上糖化基团的结构特点，如亲和层析法、离子捕获法和免疫法等。上述方法中，虽然高效液相离子层析法(HPLC)被公认为金标法，但其存在操作程序复杂、仪器成本高等缺点，并且往往需要配备实验室水平的操作环境和专业的技术操作人员，因此该方法并不利于糖尿病即时快速检测的应用及推广。

微流控芯片又称芯片实验室(Lab on a Chip)，指的是一种在一块几平方厘米的芯片上构建的生物或化学实验室。它把生物和化学领域中所涉及的进样、反应、分离、分选、检测等基本操作单元集成到一块很小的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以实现常规生物或化学实验室的各种功能。由于微流控芯片技术具有进样量小、集成度高、易实现自动化控制和高通量分析的特点，使得在微流控芯片上进行生化反应操作较常规的分析样品前处理更方便和快速，且成本低廉。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片，此微流控芯片具有进样方便、样品消耗量少、检测速度快和成本低廉等特点，并且能够实现糖化血红蛋白的全自动检测。

本发明的另一目的在于提供一种糖化蛋白检测方法，该方法反应效率高、检测时间短，且检测分辨率和灵敏度显著提高。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提供了一种用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片，所述微流控芯片自上而下依次设有一盖片层、一设有镂空通道结构的流体层以及一基底层，所述镂空通道结构与所述基底层共同构成样品检测单元；

所述盖片层上分别设有一用于进样室进样的进样通孔和一用于废液池废液导出的废液导出通孔；

所述样品检测单元包括一个或多个的进样室以及一稀释腔室、一亲和层析通道、一检测腔室和一废液池，所述进样通孔连通于所述进样室，所述废液导出通孔连通于所述废液池。

一种糖化血红蛋白检测方法，其包括以下步骤：

S1、将待检测的全血样品通过进样通孔导入进样室中，开启外接泵使得所述全血样品经由微流体通道进入所述稀释腔室内；

S2、所述全血样品中的血红细胞在所述溶血素试剂的作用下破碎并释放其中的蛋白质；

S3、将稀释液从进样通孔注入到进样室，所述稀释液经所述进样室流动到所述稀释腔室内对所述全血样品进行稀释，得到稀释样品，此时，疏水阀处于关闭状态；

S4、加大外接泵的泵压，并从进样通孔将流动相天门冬酞胺缓冲液导入进样室，所述流动相天门冬酞胺缓冲液经所述进样室和所述稀释腔室将所述稀释样品带入所述亲和层析通道内；

S5、所述稀释样品中的糖化血红蛋白与所述氨基苯硼酸琼脂糖凝胶特异性结合，非糖化血红蛋白则被所述流动相天门冬酞胺缓冲液带走并从废液导出通孔导出；

S6、从进样通孔将流动相山梨糖醇缓冲液导入进样室，所述流动相山梨糖醇缓冲液经所述进样室和所述稀释腔室流动到所述亲和层析通道，并将特异性结合在所述氨基苯硼酸琼脂糖凝胶上的糖化血红蛋白洗脱下来；

S7、洗脱下来的所述糖化血红蛋白流经所述检测腔室，通过微电极传感器或光电传感器进行糖化血红蛋白的检测。

本发明实施例的用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片的有益效果是：

1、本发明基于微流控芯片技术平台，微流控芯片技术具有进样量小、集成度高、易实现自动化控制和高通量分析的特点，在微流控芯片设置样品检测单元，且该样品检测单元包括一个或多个进样室、稀释腔室、亲和层析通道、检测腔室和废液池。通过微流控芯片集样品进样、样品稀释和光、电检测于一体，极大地简化了操作流程，降低了样品和试剂消耗，并且不需要配备昂贵的仪器，极大地降低了使用成本，使糖化血红蛋白现场即时检测成为可能，具有可预见的巨大的经济价值和社会价值。

2、相比于离子层析法而言，亲和层析法操作简单、快速、价廉，而且特异性强，不受异常血红蛋白的干扰，对经翻译以后修饰的血红蛋白和病理血红蛋白的影响相对不敏感，对血标本储存的时间也不象离子交换法那样严格，因此在微流控芯片上实现糖化血红蛋白的亲和层析检测，不仅使得样品处理时间大幅缩短、试剂和仪器成本大幅降低、检测分辨率和灵敏度显著提高，而且使得糖化血红蛋白的现场即时检测成为可能，有望在糖化血红蛋白的临床检测上广泛推广。

3、本发明在稀释腔室和亲和层析通道之间还设有疏水阀，通过疏水阀与外接泵的配合，实现从稀释腔室到亲和层析通道之间溶液的阻断或导入。一方面在血红细胞在稀释腔室内能得到充分的破碎和稀释，避免了因血红蛋白在未完全破碎即进入亲和层析通道造成的亲和层析通道内糖化血红蛋白含量较低，进而减少样品和试剂的消耗。另一方面在外接泵的泵压增大过程中，稀释腔室中的溶液流速会相应的增大，进一步增加了全血样品与溶血素试剂的接触，从而充分破碎其中的血红细胞，提高稀释样品中糖化血红蛋白的含量，提高后续糖化血红蛋白检测的精确度。

4、本发明的废液池与废液导出通孔连通用于废液的导出。由于废液能及时地从废液通孔中导出，避免了因废液与后续加入的试剂接触而造成的交叉污染，保证检测的准确度。

5、本发明中可采用微电极传感器对或光电传感器糖化血红蛋白进行检测。微电极传感器通过直接在微流控芯片的检测腔室内制备金电极或铂电极，从而实现糖化血红蛋白的电化学检测，便于该微流控芯片的现场即时检测。而且本发明无需配备实验室水平的操作环境和专业的技术操作人员，不仅操作程序简单、而且降低了检测的仪器成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1的用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片的平面结构示意图；

图2为本发明实施例1的用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片的立体结构示意图；

图3为本发明实施例2的用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片的平面结构示意图；

图4为本发明实施例3的用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片的平面结构示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片进行具体说明。

实施例1

参照图1和图2所示，本发明实施例提供的一种用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片，所述微流控芯片自上而下依次设有盖片层1、一设有镂空通道结构的流体层2和基底层3，所述镂空通道结构与所述基底层共同构成样品检测单元。

所述盖片层上分别设有一用于进样室进样的进样通孔11和一用于废液池废液导出的废液导出通孔12。

所述样品检测单元包括一个或多个的进样室21以及一稀释腔室22、一亲和层析通道23、一检测腔室24和一废液池25，所述进样通孔11连通于所述进样室21，所述废液导出通孔12连通于所述废液池25。

进一步地，在本实施例中，所述微流控芯片由玻璃、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯和聚碳酸酯中的一种或多种加工而成。所述镂空通道结构的加工方法为激光刻蚀、软刻蚀、光刻、湿法刻蚀或CNC精密加工。所述基底层3为空白基底层。

参照图1和图2所示，进一步地，在本实施例中，所述进样室21、所述稀释腔室22、所述亲和层析通道23、所述检测腔室24和所述废液池25之间依次通过微流体通道26串行连接。

进一步地，在本实施例中，所述稀释腔室22的内部设有用于破碎血红细胞的溶血素试剂，所述溶血素试剂通过物理吸附或化学吸附固定于所述稀释腔室22的内壁。所述溶血素试剂的剂量为10～50μL，该溶血素试剂与全血样品的反应时间为3～8分钟。溶血素试剂可选自上海迪奥生物科技有限公司等。当全血进入到稀释腔室22后，血红细胞在溶血素试剂的作用下破碎，从而释放出血红蛋白，继而再导入稀释缓冲液将血红蛋白稀释至一定倍数。

进一步地，在本实施例中，所述稀释腔室22与所述亲和层析通道23之间设有一截流阀。该截流阀可用于将稀释腔室22中的溶液阻断或导入到亲和层析通道23中。

进一步地，在本实施例中，所述截流阀为截止阀、气动阀或疏水阀。

当微流控芯片的材质为弹性聚二甲基硅氧烷，其可采用截止阀或气动阀。截止阀开启时，微流体通道26流通，溶液由稀释腔室22导入亲和层析通道23内。截止阀关闭时，微流体通道26封闭，溶液被阻断在稀释腔室22内。

气动阀采用的是具有弹性的薄膜。气动阀开启时，该气动阀通过空气泵加压，使得气动阀的弹性薄膜膨胀，从而封闭通道，将溶液阻断在稀释腔室22内。气动阀关闭时，关闭空气泵减压，气动阀的弹性薄膜恢复到原有的薄膜状态，通道流通，从而将溶液导入亲和层析通道23。

本实施例中采用的是疏水阀。疏水阀是通过在稀释腔室22和亲和层析腔室23之间的微流体通道26的特定区域内制备疏水表面。在表面张力作用下，溶液被限定于疏水表面前。当加大外接泵的泵压时，该微流体通道内处于一定的压力，溶液会突破该疏水表面，从而导入到亲和层析通道23内。

所述亲和层析通道23内设有用于与血红蛋白特异性结合的氨基苯硼酸琼脂糖凝胶。氨基苯硼酸琼脂糖凝胶作为糖化血红蛋白亲和色谱的载体，当总的糖化血红蛋白通过载体时，稳定型的糖化血红蛋白分子表面含葡萄糖的顺式二糖醇部分与载体固定相上的硼酸基因呈配位特异性结合。氨基苯硼酸琼脂糖凝胶可选自上海抚生实业有限公司等。

进一步地，在本实施例中，所述氨基苯硼酸琼脂糖在所述亲和层析通道23内以填充柱形式存在，且充满所述亲和层析通道23的内部。

进一步地，在本实施例中，所述氨基苯硼酸琼脂糖在所述亲和层析通道23内以开管柱形式存在，且其涂覆于所述亲和层析通道23的内表面。

氨基苯硼酸琼脂糖在亲和层析通道23内以填充柱形式或开管柱形式存在，这样可以保证血红蛋白充分地与氨基苯硼酸琼脂糖接触，进而特异性吸附在该氨基苯硼酸琼脂糖上，确保检测的精确度。

进一步地，在本实施例中，所述检测腔室24中设有用于检测糖化血红蛋白的微电极传感器。该微电极传感器采用MEMS工艺，直接在微流控芯片的检测腔室内制备金电极或铂电极，从而实现糖化血红蛋白的电化学检测，便于微流控芯片的现场即时检测。

进一步地，在本实施例中，所述检测腔室24外设有光电传感器。本实施例中的光电传感器选自日本滨松的微型硅光电池。

本发明实施例的一种糖化血红蛋白检测方法，包括以下步骤：

S1、将数微升～数十微升的全血样品通过进样通孔11加入到进样室21中，开启外接泵使得所全血样品经由微流体通道26进入稀释腔室22内。

S2、所述全血样品中的血红细胞在所述溶血素试剂的作用下破碎并释放其中的蛋白质。

S3、将稀释液从进样通孔11注入到进样室21，所述稀释液经所述进样室21流动到所述稀释腔室22内对所述全血样品进行稀释，得到稀释样品，此时，疏水阀处于关闭状态。由于疏水阀的限制作用以及外接泵的泵压较小，稀释过程中，全血样品和稀释液均被限制于稀释腔室22内。

S4、加大外接泵的泵压，并从进样通孔11将流动相天门冬酞胺缓冲液导入进样室21，所述流动相天门冬酞胺缓冲液经所述进样室21和所述稀释腔室22将所述稀释样品带入所述亲和层析通道23内。

S5、所述稀释样品中的糖化血红蛋白与所述氨基苯硼酸琼脂糖凝胶特异性结合，非糖化血红蛋白则被所述流动相天门冬酞胺缓冲液带走并从废液导出通孔12导出。

S6、从进样通孔11将流动相山梨糖醇缓冲液导入进样室21，所述流动相山梨糖醇缓冲液经所述进样室21和所述稀释腔室22流动到所述亲和层析通道23，并将特异性结合在所述氨基苯硼酸琼脂糖凝胶上的糖化血红蛋白洗脱下来。

S7、洗脱下来的所述糖化血红蛋白流经所述检测腔室24，通过微电极传感器或光电传感器进行糖化血红蛋白的检测。

本发明提供的用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片，使用时只需从进样室21中依次注入全血、稀释液和流动相，可以实现全自动化检测，其3～10分钟内就能够实现糖化血红蛋白的检测。本发明具有进样便捷、样品消耗少、反应效率高、检测时间短等优点。

实施例2

参照图3所示，本实施例提供的一种用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片，与实施例1的区别之处在于：

样品检测单元包括两个进样室21，两个进样室21分别与稀释腔室22连接，用于将不同样品导入稀释腔室22。使用时，全血样品从第一进样室211中导入，而在步骤S2中，稀释液从第二进样室212中注入，并按照实施例1中的检测步骤进行检测。

本实施例提供的用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片，使用时只需从进样室21中依次注入全血、稀释液和流动相，可以实现全自动化检测，其3～10分钟内就能够实现糖化血红蛋白的检测。本实施例具有进样便捷、样品消耗少、反应效率高、检测时间短等优点。

实施例3

参照图4所示，本实施例中提供了一种用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片，与实施例1的区别之处在于：

本实施例的微流控芯片包括三个样品检测单元。检测时，将三个不同的全血样品分别加入对应的进样室21中，并按照实施例1中的检测步骤进行检测，则可以在10分钟内获得三种样品的糖化血红蛋白的检测结果。本实施例具有进样便捷、样品消耗少、反应效率高、检测时间短等优点。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (9)

1.一种用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片自上而下依次设有一盖片层、一设有镂空通道结构的流体层以及一基底层，所述镂空通道结构与所述基底层共同构成样品检测单元；

所述盖片层上分别设有一用于进样室进样的进样通孔和一用于废液池废液导出的废液导出通孔；

所述样品检测单元包括一个或多个的进样室以及一稀释腔室、一亲和层析通道、一检测腔室和一废液池，所述进样通孔连通于所述进样室，所述废液导出通孔连通于所述废液池，其中，所述稀释腔室内设有用于破碎血红细胞的溶血素试剂，所述稀释腔室与所述亲和层析通道之间设有一截流阀，所述截流阀为疏水阀。

2.根据权利要求1所述的用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片由玻璃、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯和聚碳酸酯中的一种或多种加工而成，所述镂空通道的加工方法为激光刻蚀、软刻蚀、光刻、湿法刻蚀或CNC精密加工，所述基底层为空白基底层。

3.根据权利要求1所述的用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片，其特征在于，所述进样室、所述稀释腔室、所述亲和层析通道、所述检测腔室和所述废液池之间依次通过微流体通道串行连接。

4.根据权利要求1所述的用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片，其特征在于，所述溶血素试剂通过物理吸附或化学吸附固定于该稀释腔室的内壁，所述溶血素试剂的剂量为10～50μL，该溶血素试剂与全血样品的反应时间为3～8分钟；所述亲和层析通道内设有用于与糖化血红蛋白特异性结合的氨基苯硼酸琼脂糖凝胶。

5.根据权利要求4所述的用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片，其特征在于，所述氨基苯硼酸琼脂糖在所述亲和层析通道内以填充柱形式存在，且充满所述亲和层析通道的内部。

6.根据权利要求4所述的用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片，其特征在于，所述氨基苯硼酸琼脂糖在所述亲和层析通道内以开管柱形式存在，且其涂覆于所述亲和层析通道的内表面。

7.根据权利要求1所述的用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片，其特征在于，所述检测腔室中设有用于检测糖化血红蛋白的微电极传感器。

8.根据权利要求1所述的用于检测糖化血红蛋白的微流控芯片，其特征在于，所述检测腔室外设有光电传感器。

9.一种糖化血红蛋白检测方法，其特征在于，应用如权利要求1～8任一所述的微流控芯片，其包括以下步骤：

S1、将待检测的全血样品通过进样通孔导入进样室中，开启外接泵使得所述全血样品经由微流体通道进入所述稀释腔室内；

S2、所述全血样品中的血红细胞在所述溶血素试剂的作用下破碎并释放其中的蛋白质；

S3、将稀释液从进样通孔注入到进样室，所述稀释液经所述进样室流动到所述稀释腔室内对所述全血样品进行稀释，得到稀释样品，此时，疏水阀处于关闭状态；

S4、加大外接泵的泵压，并从进样通孔将流动相天门冬酞胺缓冲液导入进样室，所述流动相天门冬酞胺缓冲液经所述进样室和所述稀释腔室将所述稀释样品带入所述亲和层析通道内；

S5、所述稀释样品中的糖化血红蛋白与氨基苯硼酸琼脂糖凝胶特异性结合，非糖化血红蛋白则被所述流动相天门冬酞胺缓冲液带走并从废液导出通孔导出；

S6、从进样通孔将流动相山梨糖醇缓冲液导入进样室，所述流动相山梨糖醇缓冲液经所述进样室和所述稀释腔室流动到所述亲和层析通道，并将特异性结合在所述氨基苯硼酸琼脂糖凝胶上的糖化血红蛋白洗脱下来；

S7、洗脱下来的所述糖化血红蛋白流经所述检测腔室，通过微电极传感器或光电传感器进行糖化血红蛋白的检测。

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