CN111718957A

CN111718957A - 一种嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒及其应用

Info

Publication number: CN111718957A
Application number: CN201910224056.8A
Authority: CN
Inventors: 吴喜林; 吴稚伟; 瓦卡斯; 黄碧莲
Original assignee: Nanjing Anrui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Y-CLONE MEDICAL SCIENCE Co.,Ltd.
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2020-09-29
Also published as: WO2020192803A1

Abstract

本发明涉及一种嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒，其为携带有嵌合抗原受体基因的重组腺相关病毒颗粒，本发明还提供了该嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒的应用以及包含有上述嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒的药物组合物。本发明将装载有嵌合抗原受体的重组腺相关病毒颗粒直接注射体内，在体内该嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒直接感染T细胞或者NK细胞，在体内直接形成CAR细胞，从而实现直接靶细胞杀伤的细胞治疗。

Description

一种嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒及其应用

技术领域

本发明涉及嵌合抗原受体技术领域，具体涉及一种嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)修饰的T细胞(CAR-T)免疫疗法是近几年被改良使用到临床上的新型细胞疗法。CAR-T细胞免疫治疗通过采集患者外周静脉血中分离出T细胞，在多种细胞因子诱导下大量扩增，并引入靶向肿瘤抗原的CAR分子。CAR分子的修饰可使T细胞在获得靶向杀伤能力时其肿瘤杀伤作用的发挥不会受到主要组织相容性复合体(MHC)的限制，最后通过静脉或皮内注射等手段将CAR-T细胞回输入患者体内来达到杀伤肿瘤的目的。CAR-T细胞具有持续扩增能力和肿瘤靶向杀伤活性，保证了其对肿瘤细胞造成持续有效的杀伤力，从而使病人得到治愈。目前在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上，CAR-T细胞治疗有着显著疗效，CAR-T细胞免疫治疗被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。

然而部分患者由于疾病进展太快，在对T细胞进行基因改造与培养过程中死亡，从而失去CAR-T细胞治疗的机会；另外利用自体T细胞体外扩增，制备自体CAR-T回输进行个性化治疗，大大增加了CAR-T治疗的时间和成本同时也限制了CAR-T治疗的规模。因此，急需开发出可供临床应用的通用型CAR-T细胞或者获得类似的药物，只需要将该药物直接输入人体即可实现CAR-T细胞治疗。

CAR分子与杀伤性T细胞的嵌合需要通过病毒载体转导，方法包括逆转录病毒系统、慢病毒系统、腺病毒、DNA质粒及RNA转染系统等。目前CAR-T细胞治疗中能达到稳定整合且转染效率高、使用较为广泛的是逆转录病毒及慢病毒。逆转录病毒不易转染静息T细胞；慢病毒可以转染静息T细胞，但成本较高，且两者都存在遗传毒性，有插入致癌的风险，因此急需一种更安全有效的病毒载体装载CAR分子。腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体被广泛应用于基因的表达和抗体的体内表达，由于AAV病毒载体以附加体的形式存在于细胞质里，所以不存在插入突变，且能持续很长的表达时间。

发明内容

本发明为解决上述技术问题提供了一种嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒及其应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒，其为携带有嵌合抗原受体基因的重组腺相关病毒载体。

进一步，所述嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒通过将嵌合抗原受体基因通过腺相关病毒包装系统进行包装得到。

进一步，所述嵌合抗原受体包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。

进一步，所述细胞外结构域为识别抗原结构域的抗体。

进一步，所述识别抗原结构域的抗体为scFV抗体或V_HH抗体。

进一步，所述scFV抗体对CD4、CD19、CCR5或CD20是特异性的。

本发明还提供了上述嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

进一步，所述药物为应用于肿瘤免疫疗法的靶向药物。

本发明还提供了一种药物组合物，包括上述嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

进一步，所述药物组合物的剂型为注射剂。

本发明的有益效果为：本发明利用重组腺相关病毒(AAV病毒)装载嵌合抗原受体(CAR分子)得到的嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒(AAV-CAR)直接注射体内，在体内AAV-CAR直接感染T细胞或者NK细胞，在体内直接形成CAR细胞，从而实现直接靶细胞杀伤的细胞治疗。本发明里成功的制备了装载不同CAR分子的AAV病毒(AAV-CD4-CAR，AAV-CCR5-CAR，AAV-CD19-CAR和AAV-CD20-CAR)，AAV-CAR能直接感染293TT贴壁细胞和293F悬浮细胞，并在细胞表面展示CAR分子。另外AAV-CAR也能直接感染PBMC细胞，并在40％以上的T细胞表面展示CAR分子，形成CAR-T细胞。该CAR-T细胞可特异性杀伤靶细胞，杀伤效率可达40％以上；另外将制备装载有CAR分子的AAV病毒直接注入小鼠体内，数天后检测发现小鼠体内形成了大量的CAR-T细胞，并且显示特异性杀伤靶细胞。本发明的AAV-CAR可以直接进行体内注射，直接跳过了传统CAR-T细胞治疗所需的血液采集，PBMC体外扩增和病毒体外感染T细胞和CAR-T自体回输等个体化治疗一序列步骤，只需要将嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒(AAV-CAR)直接注射到患者体内，实现了AAV-CAR通用型批量细胞治疗，大大的节省了治疗前期准备时间和治疗成本以及治疗效率。

附图说明

图1为本发明实施例3中AAV-CD4-CAR分别感染293TT贴壁细胞和293F悬浮细胞后细胞裂解液的Western-bloting结果，其中M为marker，泳道1为AAV-CD4-CAR感染293F细胞裂解液，泳道2为AAV-CD4-CAR感染293F细胞裂解液，泳道3为对照组；

图2为本发明实施例3流式细胞仪鉴定AAV-CD4-CAR感染细胞后细胞表面CAR分子的表达，其中高剂量的AAV-CD4-CAR转染组为AAV-CD4-CAR(H)，低剂量的AAV-CD4-CAR转染组为AAV-CD4-CAR(L)，AAV-GFP转染组为Mock；

图3为本发明实施例3用流式细胞仪鉴定AAV-CD4-CAR感染PBMC后CD3+细胞表面CAR分子的表达，分别用Anti-F(ab’)₂-FITC和Anti-CD4-Fc-FITC检测,其中高剂量的AAV-CD4-CAR转染组为AAV-CD4-CAR(H)，低剂量的AAV-CD4-CAR转染组为AAV-CD4-CAR(L)，AAV-GFP转染组为Mock；

图4为本发明实施例4流式检测AAV-CD4-CAR直接感染PBMC后针对CD4+T细胞的特异性杀伤，其中图4A为流式分析示意图，图4B为AAV-CD4-CAR处理不同来源的PBMC后，CD4+T细胞的比例；图4C为AAV-CD4-CAR处理不同来源的PBMC后，CD8+T细胞的比例，以对照组AAV-GFP处理组的值进行标准化，设定为100％；

图5为本发明实施例4流式检测AAV-CD4-CAR对肿瘤细胞的杀伤，图5A为流式分析示意图，图5B为AAV-CD4-CAR直接感染PBMC细胞后针对MT-2和Jurkat肿瘤细胞的杀伤比例，以Mock组肿瘤细胞的非特异性杀伤的比例标准化为0，AAV-CD4-CAR处理组特异性细胞杀伤数据是经过参照对照组进行标准化处理后所得；

图6为本发明实施例5人源化小鼠体内鉴定AAV-CD4-CAR病毒直接诱导的特异性靶向杀伤，图6A为AV-CD4-CAR病毒处理前人源化小鼠体内的CD3+CD4+T细胞的实际比例，图6B为流式检测AAV-CD4-CAR直接感染人源化小鼠2周后，人源CD3+T细胞表面特异性识别CD4蛋白的CAR分子表达，图6C为流式检测不同时间点人源化小鼠体内CD3+CD4+T细胞比例，图6D为不同处理组人源化小鼠体重的监测。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

发明人在前期工作中发现，腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)在体内至少可以持续表达9周以上，另外，clinicaltrials网站显示，目前有178个AAV载体相关的临床试验，至今没有严重副作用的报道，因此选择AAV病毒载体对嵌合抗原受体(CAR)进行装载得到嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒(AAV-CAR)。

实施例1利用AAV病毒载体装载CAR分子

1、pAAV-CAR质粒构建

通过PubMed以及HIV database网站获得特异性针对CD19、CD4、CCR5和CD20的scFv(VL-VH)抗体序列和第三代CAR的铰链区、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域序列。其中

CD19的scFv(VL-VH)抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFSSSWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPDDSDTRYSPSFQGQVTISADKSIRTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHVTMIWGVIIDFWGQGTLVTVSS

其中序列SEQ ID NO:1的第1-107位氨基酸为轻链可变区，108-122位氨基酸为连接肽，123-243位氨基酸为重链可变区。

CD4的scFv(VL-VH)抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示：

DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWANSTESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVRQKPGQGLDWIGYINPYNDGTDYDEKFKGKATLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREKDNYATGAWFAYWGQGTLVTVSS

其中序列SEQ ID NO:2的第1-112位氨基酸为轻链可变区，113-127位氨基酸为连接肽，128-249位氨基酸为重链可变区。

CCR5的scFv(VL-VH)抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示：

ISCRSSQRLLSSYGHTYLHWYLQKPGQSPQLLIYEVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPLTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFSNYWIGWVRQAPGKGLEWIGDIYPGGNYIRNNEKFKDKTTLSADTSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCGSSFGSNYVFAWFTYWGQGTLVTVSS

其中序列SEQ ID NO:3的第1-92位氨基酸为轻链可变区，93-107位氨基酸为连接肽，108-229位氨基酸为重链可变区。

CD20的scFv(VL-VH)抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA

其中序列SEQ ID NO:4的第1-107位氨基酸为轻链可变区，108-122位氨基酸为连接肽，123-243位氨基酸为重链可变区。

CAR的铰链区、跨膜区和细胞内信号传导结构域的选择属于本领域的常规选择，本实施例的CAR铰链区、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的结构为：CD28-4-1BB-CD3zeta，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示：

ATCGAGGTGATGTACCCCCCCCCCTACCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAGCCCCCTGTTCCCCGGCCCCAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGCAGCAAGCGCAGCCGCGGCGGCCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGCCGCCCCGGCCCCACCCGCAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCCGCGACTTCGCCGCCTACCGCAGCGGCGGTGGCGGCAGCAAGCGCGGCCGCAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGCCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCCGCTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGGGAGGCGGTGGCAGCCGCGTGAAGTTCAGCCGCAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGCCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGCCGCGGCCGCGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGCCGCAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGCCGCCGCGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGCGACTACAAGATGACCACCATCAGC

人工合成编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的CD19的scFv(VL-VH)抗体、CD4的scFv(VL-VH)抗体、CCR5的scFv(VL-VH)抗体和CD20的scFv(VL-VH)抗体的核苷酸序列，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。

SEQ ID NO:6

GCCATCCAGCTGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCATCACCTGCCGCGCCAGCCAGGGCATCAGCAGCGCCCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAGCCTGGAGAGCGGCGTGCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTTCAACAGCTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGAGAGCCTGAAGATCAGCTGCAAGGGCAGCGGCTACAGCTTCAGCAGCAGCTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCATCATCTACCCCGACGACAGCGACACCCGCTACAGCCCCAGCTTCCAGGGCCAGGTGACCATCAGCGCCGACAAGAGCATCCGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCAGCGACACCGCCATGTACTACTGCGCCCGCCACGTGACCATGATCTGGGGCGTGATCATCGACTTCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO:7

GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGCGCGTGACCATGAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGTACAGCACCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAACAGCACCGAGAGCGGCGTGCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACAGCTACCGCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGTGGCGGAGGTTCTGGAGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGCGGATCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGAGGTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACGTGATCCACTGGGTGCGCCAGAAGCCCGGCCAGGGCCTGGACTGGATCGGCTACATCAACCCCTACAACGACGGCACCGACTACGACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCAGCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGCAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGAGAAGGACAACTACGCCACCGGCGCCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO:8

GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCCGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGCCGCAGCAGCCAGCGCCTGCTGAGCAGCTACGGCCACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACGAGGTGAGCAACCGCTTCAGCGGCGTGCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCAGCCAGAGCACCCACGTGCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGAAGCCCGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTACACCTTCAGCAACTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCTACCCCGGCGGCAACTACATCCGCAACAACGAGAAGTTCAAGGACAAGACCACCCTGAGCGCCGACACCAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGGCAGCAGCTTCGGCAGCAACTACGTGTTCGCCTGGTTCACCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO:9

CAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACTTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGACTAGTAACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTGGTGGCGGAGGTTCTGGAGGAGGTGGAAGCGGAGGTGGCGGATCTCAGGTACAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAACAGACACCTGGTCGGGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTTATCCCGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCGACTTACTACGGCGGTGACTGGTACTTCAATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCTGCA

分别将SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示的scFv(VL-VH)抗体基因和CD28-4-1BB-CD3zeta基因酶切连接到pAAV-MCS质粒载体(Cell Biolabs,San Diego,USA)上，最终在pAAV-MCS质粒载体上装载一个scFv(VL-VH)-CD28-4-1BB-CD3zeta的单基因CAR分子，构建得到pAAV-CAR(分别为pAAV-CD19-CAR，pAAV-CD4-CAR和pAAV-CCR5-CAR和pAAV-CD20-CAR)。

2、AAV-CAR病毒包装

AAV Helper-Free病毒包装系统购于Cell Biolabs,San Diego USA。将上述pAAV-CAR与pHelper和pAAV-DJ质粒按照质量比1:1:1的方式使用PEI转染试剂共转染AAV-293T细胞。转染后分别于48、72、96和120小时收集上清，并用5x PEG8000(sigma)进行浓缩，最后用1.37g/mL氯化铯密度梯度离心进行纯化，得到装载不同CAR分子的AAV-CAR病毒颗粒，即嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒(AAV-CAR),包括AAV-CD4-CAR,AAV-CD19-CAR,AAV-CCR5-CAR,和AAV-CD20-CAR，纯化的AAV-CAR病毒颗粒溶解于PBS里，进行鉴定和分装后保存于-80℃。

实施例2 AAV-CAR病毒滴度定量

纯化的AAV-CAR通过Q-PCR进行拷贝数测定，DNaseI先酶切预处理纯化的AAV-CAR，应用CMV enhancer的引物(AAV-Mono-CMV-F和AAV-Mono-CMV-R)测定AAV-CAR病毒的拷贝，其它的试剂来源于SYBR Premix Ex Taq II(Takara)试剂盒。样品在7300仪器上进行三个复孔检测。实时PCR的循环条件如下:50℃2min一个循环，95℃10min一个循环，95℃15s和60℃60s 40个循环。病毒的拷贝数通过AAV-GFP质粒所做的标准曲线来计算得出,最终获得1x10^13gc/mL的AAV-CAR病毒。

其中，AAV-Mono-CMV-F的序列如SEQ ID NO:10所示：

CCATTGACGTCAATGGGTGGAGT

AAV-Mono-CMV-R的序列如SEQ ID NO:11所示：

GCCAAGTAGGAAAGTCCCATAAGG

实施例3 AAV-CAR感染细胞

用不同浓度的AAV-CAR病毒液直接添加到不同的细胞(293TT细胞、293F细胞和PBMC细胞)，培养24h后，通过Western-Blot和流式检测等方法检测CAR分子的表达。

以特异性针对CD4蛋白的AAV-CD4-CAR病毒颗粒感染293TT贴壁细胞和293F悬浮细胞为例，对照组采用AAV-GFP病毒颗粒感染293TT细胞，感染24h后，收集并裂解细胞，利用鼠抗人CD3zeta抗体，通过Western-Blot检测CAR分子在细胞裂解液中的表达，结果如图1所示，用AAV-CD4-CAR病毒颗粒感染的393TT细胞和293F细胞的细胞裂解液中均有一条74kD大小的特异性条带，对照组并没有该条带，表明AAV-CD4-CAR成功的感染了293TT细胞和293F细胞，并在这两个细胞内大量表达了CD4-CAR分子。

为了进一步验证AAV-CD4-CAR感染贴壁细胞和悬浮细胞后是否在细胞表面表达CAR分子，分别用低剂量的AAV-CD4-CAR(L)(1x10^4gc/cell)和高剂量的AAV-CD4-CAR(H)(1x10^5gc/cell)感染293TT贴壁细胞和293F悬浮细胞，对照组(Mock)采用AAV-GFP,利用特异性识别CAR分子VL-VH的Anti-F(ab’)₂-FITC的抗体进行流式细胞检测293TT贴壁细胞和293F悬浮细胞被感染后细胞表面CAR分子的表达，结果如图2所示，在低剂量AAV-CD4-CAR(L)感染的293TT细胞和293F细胞表面，能检测到大于20％的阳性细胞表达CAR分子；在高剂量AAV-CD4-CAR(H)处理组，大于50％的293TT和293F细胞表面表达CAR分子，说明AAV-CD4-CAR能直接感染贴壁细胞和悬浮细胞，并在细胞表面展示CAR分子。

为了进一步验证AAV-CD4-CAR能否感染PBMC细胞，并在CD3+T细胞表面展示CAR分子，最终形成CAR-T细胞，分别用低剂量的AAV-CD4-CAR(L)(1x10^4gc/cell)和高剂量的AAV-CD4-CAR(H)(1x10^5gc/cell)感染PBMC细胞，对照组(Mock)采用AAV-GFP，用特异性识别CAR分子VL-VH的Anti-F(ab’)₂-FITC的抗体进行流式细胞检测PBMC细胞表面CAR分子的表达，结果如图3所示，低剂量AAV-CD4-CAR(L)能使28％的T细胞形成CAR-T，高剂量AAV-CD4-CAR(H)感染PBMC能使49％的T细胞变为CAR-T。为了进一步验证AAV-CD4-CAR感染PBMC形成的CAR-T细胞能特异性识别CD4蛋白，利用Anti-CD4-Fc-FITC进行流式检测，流式结果如图3所示，被AAV-CD4-CAR直接感染后的PBMC中CD3+T细胞能特异性结合CD4蛋白；高低剂量AAV-CD4-CAR处理组，识别CD4蛋白的CD3+T细胞的阳性率分别为75％和31％，阳性率数据与Anti-F(ab’)₂-FITC的抗体检测结果大致相似。提示AAV-CD4-CAR直接感染PBMC后，能形成高比例的CAR-T细胞，并且这些CAR-T细胞能特异性识别CD4蛋白。

实施例4 AAV-CAR体外细胞功能鉴定

通过AAV-CAR构建成功的CAR-T细胞的细胞杀伤实验依据radioisotope-freeluminescence-based CytoTox-Glo kit(Promega)试剂盒的操作流程。该试剂盒通过检测蛋白酶活性来检测杀伤的死细胞。实验流程简述如下：在96孔板里2倍梯度稀释AAV-CAR转导后的PBMC，最高的细胞数为每孔2.0x10⁶，根据AAV-CAR PBMC细胞：靶细胞50:1的比例加入相应体积的靶细胞(靶细胞可以是表达CD4，CD19,CD20或者CCR5的肿瘤细胞，也可以是CD4+T细胞和CD19+B细胞)。细胞于37℃5％CO₂共孵育4小时；CytoTox-Glo reagent加到每个孔，室温15分钟后，通过仪器检测荧光值；以含靶细胞而无效应CAR-T细胞的细胞裂解液读值作为100％的裂解杀伤。

将AAV-CD4-CAR感染不同来源的PBMC，48小时后，检测PBMC里CD3+CD4+T细胞的比例，流式结果示意图如图4A所示。CD3+CD4+CD8-T为CD4+T细胞。CD4+T细胞的流式细胞结果如图4B所示，与阴性对照相比，AAV-CD4-CAR处理的PBMC细胞里的CD4+T细胞显著减少，并且成浓度梯度依赖，高剂量AAV-CD4-CAR处理的CD4+T细胞的数量低于低剂量AAV-CD4-CAR处理组的CD4+T细胞数量；提示AAV-CD4-CAR剂量越高，对CD4+T特异性杀伤能力越强；高剂量AAV-CD4-CAR直接感染6个不同来源的PBMC细胞后，CD4+T细胞减少的比例为50％左右，说明通过AAV-CD4-CAR直接感染PBMC能在不同的个体内特异性靶向杀伤CD4+T细胞，并且呈现剂量依赖，CD8+T细胞的流式细胞结果如图4C所示，6个不同来源的PBMC里CD8+T细胞不仅没出现减少，个别PBMC细胞的CD8+T细胞还出现了上升的趋势，以上结果说明AAV-CD4-CAR直接感染PBMC能特异性杀伤CD4+T细胞，而不会非特异性杀伤CD8+T细胞。

为了进一步验证AAV-CD4-CAR直接感染PBMC后能特异性杀伤CD4+肿瘤细胞，先将不同剂量的AAV-CD4-CAR(高剂量AAV-CD4-CAR组(H)和低剂量AAV-CD4-CAR组(L))直接感染PBMC细胞，对照组(Mock组)采用AAV-GFP，3天后按照1:1的细胞比例添加CD4+MT2或者CD4+Jurkat肿瘤细胞；共同孵育48小时后通过流式检测特异性死亡的MT-2细胞或者Jurkat；流式结果如图5所示，与对照组相比，AAV-CD4-CAR直接感染的PBMC能显著性的特异性杀伤CD4+MT2细胞和Jurkat细胞，减去非特异性杀伤，特异性杀伤的比例为25％，当提高感染AAV-CD4-CAR的剂量时，MT2细胞和Jurkat细胞被特异性杀伤比例也随之提高，最高特异性MT2细胞杀伤比例达到40％以上，以上结果说明AAV-CD4-CAR直接感染PBMC后，能形成特异性识别CD4蛋白的CAR-T，从而特异性靶向杀伤CD4肿瘤细胞，并且呈剂量依赖性的高效特异性靶向杀伤。

实施例5 AAV-CCR体内效果评估

1、构建人源化小鼠的肿瘤模型

Immunodeficient NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NCG)小鼠购自南京大学模式动物所，与NSG小鼠类似，该小鼠在SCID小鼠基础上缺失了IL2受体基因，导致体内没有小鼠T细胞，B细胞以及很少量的NK细胞。1.5x10⁷PBMC腹腔注射进4-6周的NCG小鼠体内；三周后，采血流式检测人的T细胞，通过染色人的CD45+,CD3+,CD4+和CD8+，人的CD45阳性细胞的比例到达10％以上，判定为小鼠人源化成功。结果所有的人源化小鼠体内均含有大于10％的人CD45+细胞，其中小鼠体内人CD4+T细胞的实际比例如图6A所示，，人CD4+T细胞比例多达20％以上，接种肿瘤细胞，连续四周监测肿瘤的大小。

2、人源化小鼠体内验证AAV-CD4-CAR治疗肿瘤的疗效

不同浓度的AAV-CAR腹腔注射到接种肿瘤的人源化小鼠体内，不同时间点采血检测；流式细胞仪检测人CD4+T细胞的变化趋势；同时监测小鼠的体重。

通过腹腔直接注射AAV-CD4-CAR病毒至人源化小鼠体内1，2和4周后分别检测人源化小鼠体内CD3+T细胞表面CAR分子的表达；流式结果如图6B所示，AAV-CD4-CAR处理组的人源化小鼠体内大于12％的CD3+T细胞表面表达CAR分子，而对照组AAV-CD20-CAR处理组的人源化小鼠体内，表达特异性识别CD4蛋白CAR分子的CD3+T细胞的比例小于2％。由此可见直接注射AAV-CD4-CAR病毒可以让人源化小鼠体内的大于12％的CD3+T细胞变成特异性识别CD4蛋白的CD4-CAR-T细胞，而对照组AAV-CD20-CAR则不能在体内形成特异性识别CD4蛋白CD4-CAR-T细胞。

为了进一步验证,AAV-CD4-CAR直接感染小鼠后形成的CAR-T细胞能否特异性杀伤体内人CD4+T细胞，在不同的时间点检测人的CD4+T细胞比例。流式检测结果如图6C所示，与对照组相比，AAV-CD4-CAR处理组的所有小鼠在处理1周后CD4+T均出现了下降，2周后小鼠体内人CD4+T细胞下降比例大于50％，4周后，CD4+T细胞的比例会进一步降低，而对照组AAV-CD20-CAR小鼠体内的CD4+T细胞没有观察到明显的下降。

以上结果提示，通过直接向人源化小鼠体内注射AAV-CD4-CAR病毒，能直接形成高比例的特异性识别CD4蛋白的CAR-T细胞，并且能达到高效靶向杀伤CD4+靶细胞的作用。通过监测AAV-CAR处理后不同时间点的体重变化，结果如图6D所示，AAV-CD4-CAR病毒直接感染后的小鼠体重并未出现明显的下降，说明AAV-CD4-CAR的病毒感染未对小鼠引起明显的副作用。

综上所述，本发明成功构建了一系列特异性靶向CD4，CCR5，CD19，CD20等分子的AAV-CAR病毒。实验结果显示AAV-CD4-CAR病毒感染的细胞表面能表达特异性识别CD4蛋白的CAR分子，另外AAV-CD4-CAR病毒直接感染PBMC后，能形成高比例的CAR-T细胞，并能特异性靶向杀伤CD4+T细胞和CD4+肿瘤细胞。体内实验结果进一步证实，直接向人源化小鼠体内注射AAV-CD4-CAR病毒，2周后，大于12％的T细胞会成为CAR-T细胞，并且在体内可以高效靶向杀伤CD4+靶细胞，CD4靶细胞的减少比例大于50％以上，并且随着时间延长会进一步降低。以上结果提示，向体内注射的AAV-CAR病毒可以直接感染体内PBMC细胞并在体内形成CAR-T细胞，而CAR-T细胞可以实现特异性杀伤靶细胞。与传统的CAR-T细胞治疗相比，该方法无需进行血液收集，分离PBMC，体外扩增T细胞和体外制备CAR-T以及回输本体等复杂的流程，我们只需要将AAV-CAR病毒直接注射体内即可实现CAR-T细胞治疗。因此AAV-CAR病毒可以发展成为一种通用型的高效新型细胞治疗。AAV-CAR病毒可以通过靶向杀伤肿瘤细胞广泛的应用于肿瘤细胞治疗，同时也可以通过靶向杀伤病毒潜在或潜伏感染细胞达到针对病毒感染的细胞治疗。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京安锐生物科技有限公司

<120> 一种嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln

115 120 125

Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys

130 135 140

Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Ser Trp Ile Gly Trp Val Arg

145 150 155 160

Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Asp

165 170 175

Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile

180 185 190

Ser Ala Asp Lys Ser Ile Arg Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu

195 200 205

Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Val Thr Met

210 215 220

Ile Trp Gly Val Ile Ile Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser

<210> 2

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Asn Ser Thr Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

115 120 125

Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser

130 135 140

Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val

145 150 155 160

Ile His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile Gly

165 170 175

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe Lys

180 185 190

Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met

195 200 205

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

210 215 220

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225 230 235 240

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245

<210> 3

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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1 5 10 15

Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu

20 25 30

Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly

85 90 95

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Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

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145 150 155 160

Gly Gly Asn Tyr Ile Arg Asn Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Thr Thr

165 170 175

Leu Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser

180 185 190

Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Ser Ser Phe Gly

195 200 205

Ser Asn Tyr Val Phe Ala Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

210 215 220

Val Thr Val Ser Ser

225

<210> 4

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln

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Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys

130 135 140

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys

145 150 155 160

Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly

165 170 175

Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu

180 185 190

Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu

195 200 205

Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr

210 215 220

Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ala

<210> 5

<211> 837

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atcgaggtga tgtacccccc cccctacctg gacaacgaga agagcaacgg caccatcatc 60

cacgtgaagg gcaagcacct gtgccccagc cccctgttcc ccggccccag caagcccttc 120

tgggtgctgg tggtggtggg cggcgtgctg gcctgctaca gcctgctggt gaccgtggcc 180

ttcatcatct tctgggtgcg cagcaagcgc agccgcggcg gccacagcga ctacatgaac 240

atgacccccc gccgccccgg ccccacccgc aagcactacc agccctacgc ccccccccgc 300

gacttcgccg cctaccgcag cggcggtggc ggcagcaagc gcggccgcaa gaagctgctg 360

tacatcttca agcagccctt catgcgcccc gtgcagacca cccaggagga ggacggctgc 420

agctgccgct tccccgagga ggaggagggc ggctgcgagc tgggaggcgg tggcagccgc 480

gtgaagttca gccgcagcgc cgacgccccc gcctaccagc agggccagaa ccagctgtac 540

aacgagctga acctgggccg ccgcgaggag tacgacgtgc tggacaagcg ccgcggccgc 600

gaccccgaga tgggcggcaa gccccgccgc aagaaccccc aggagggcct gtacaacgag 660

ctgcagaagg acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcgccgc 720

cgcggcaagg gccacgacgg cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggacacctac 780

gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc cgcgactaca agatgaccac catcagc 837

<210> 6

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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atcacctgcc gcgccagcca gggcatcagc agcgccctgg cctggtacca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgac gccagcagcc tggagagcgg cgtgcccagc 180

cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ttcaacagct acccctacac cttcggccag 300

ggcaccaagc tggagatcaa gggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 360

ggcagcgagg tgcagctggt gcagagcggc gccgaggtga agaagcccgg cgagagcctg 420

aagatcagct gcaagggcag cggctacagc ttcagcagca gctggatcgg ctgggtgcgc 480

cagatgcccg gcaagggcct ggagtggatg ggcatcatct accccgacga cagcgacacc 540

cgctacagcc ccagcttcca gggccaggtg accatcagcg ccgacaagag catccgcacc 600

gcctacctgc agtggagcag cctgaaggcc agcgacaccg ccatgtacta ctgcgcccgc 660

cacgtgacca tgatctgggg cgtgatcatc gacttctggg gccagggcac cctggtgacc 720

gtgagcagc 729

<210> 7

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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tggtaccagc agaagcccgg ccagagcccc aagctgctga tctactgggc caacagcacc 180

gagagcggcg tgcccgaccg cttcagcggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240

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cgcaccttcg gcggcggcac caagctggag atcaagggtg gcggaggttc tggaggaggt 360

ggaagcggag gtggcggatc tcaggtgcag ctgcagcaga gcggccccga ggtggtgaag 420

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<210> 8

<211> 747

<212> DNA

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<400> 8

gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc 60

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<210> 9

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatccact ggttccagca gaagccagga 120

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacttcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg actagtaacc cacccacgtt cggagggggg 300

accaagctgg aaatcaaacg tggtggcgga ggttctggag gaggtggaag cggaggtggc 360

ggatctcagg tacaactgca gcagcctggg gctgagctgg tgaagcctgg ggcctcagtg 420

aagatgtcct gcaaggcttc tggctacaca tttaccagtt acaatatgca ctgggtaaaa 480

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tcctacaatc agaagttcaa aggcaaggcc acattgactg cagacaaatc ctccagcaca 600

gcctacatgc agctcagcag cctgacatct gaggactctg cggtctatta ctgtgcaaga 660

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gtctctgca 729

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccattgacgt caatgggtgg agt 23

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccaagtagg aaagtcccat aagg 24

Claims

1.一种嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒，其特征在于，为携带有嵌合抗原受体基因的重组腺相关病毒颗粒。

2.根据权利要求1所述的一种嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒，其特征在于，将嵌合抗原受体基因通过腺相关病毒包装系统进行包装得到。

3.根据权利要求1所述的一种嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒，其特征在于，所述嵌合抗原受体基因编码的嵌合抗原受体包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。

4.根据权利要求3所述的一种嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒，其特征在于，所述细胞外结构域为识别抗原结构域抗体。

5.根据权利要求4所述的一种嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒，其特征在于，所述识别抗原结构域的抗体为scFV抗体或V_HH抗体。

6.根据权利要求5所述的一种嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒，其特征在于，所述scFV抗体对CD4、CD19、CCR5或CD20是特异性的。

7.一种如权利要求1-6任一项所述的嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物为应用于肿瘤免疫疗法的靶向药物。

9.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-6任一项所述的嵌合抗原受体重组腺相关病毒颗粒，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为注射剂。