CN109825526A - 一种用于通用型car-t制备的重组腺相关病毒载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生理性通用型CAR‑T制备的重组腺相关病毒载体及其构建方法和应用，所述重组腺相关病毒载体能够用于CAR基因的表达，CAR‑T细胞的制备。本发明还涉及所述载体、CAR‑T细胞的在抗肿瘤方面的应用。

Description

一种用于通用型CAR-T制备的重组腺相关病毒载体及其构建 方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及用于CAR-T制备的重组腺相关病毒载体及其构建方法和应用。

背景技术

CAR-T是利用能够与特定抗原结合的抗体片段来识别肿瘤细胞表面的抗原。近年来，CD19抗原特异性CAR-T细胞用于治疗B细胞白血病和淋巴瘤临床试验中，显示出持续的疾病缓解效果。嵌合抗原受体(CAR)赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相对于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。近年来，CAR-T技术在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。

CAR-T治疗的原理如下：通过基因工程修饰，使体外分离收集的癌症患者的T细胞表达识别单一肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)，并在体外大量扩增CAR-T细胞后将其输回癌症患者体内进行细胞免疫治疗。CAR作为一种基因表达的嵌合蛋白包含与T细胞信号传导结构域连接的、抗体的抗原结合结构域(如：单链抗体scFv)。CAR-T细胞过继性免疫的显著优势在于：细胞免疫治疗更具精确性。CAR-T细胞过继免疫治疗系统应用基因修饰病人自体的T细胞，利用抗原抗体结合原理规避了依赖MHC限制的抗原呈递，从而具有精确的靶向性。同时克服了肿瘤细胞可能通过下调MHC分子表达以降低抗原呈递的免疫逃逸。

目前CAR-T疗法的研发主要集中在CAR的构建，通过多方面的修饰以增强CAR-T细胞的靶向性，免疫杀伤性、效用持久性及安全性。尽管CAR的构建已取得了诸多显著进展，然而，基于传统的CAR-T细胞过继性免疫治疗系统始终存在以下明显缺陷：(1)只能自体输注。目前CAR-T治疗血液系统疾病虽然能够取得很好的疗效，但是只能自体输注，即从患者体内抽取T细胞，进行基因修饰后扩增，然后再回输给患者。因此这种治疗方式不能像药物一样广泛应用。有的患者由于无法获得足够数量的T细胞而无法进行CAR-T回输，丧失了治疗的可能性。(2)制备繁琐：每一套靶向某单一肿瘤相关抗原的CAR-T系统均需要单独构建，并通过实验检测其安全性、靶向性和有效性，应用于临床的评价周期较长，耗时费力，经济性较差。(3)在CAR-T细胞过继免疫治疗过程中，对CAR-T细胞在体内的靶向能力、生物代谢情况缺乏有效的评价和监控手段，因而常导致治疗过度或治疗无效。

在CAR蛋白在T细胞表面表达的过程中，需要借助病毒载体，通过DNA合成技术合成能够在细胞中表达CAR蛋白的DNA序列；然后通过分子克隆技术将CAR的DNA序列装进质粒载体的更长的环状DNA中。质粒载体把装在多克隆位点的基因或DNA序列在细胞中表达成蛋白质。质粒载体DNA是经过人工改造的，包含其他的DNA组件比如表达抗生素的基因序列、启动子序列、多克隆位点(multiple cloning site,MCS)等等，并且，其可以和其他一些经过基因工程改造的辅助质粒(helper plasmid)一起在工程细胞(比如293T细胞)中自动组装成有感染(infection)能力的慢病毒。这样的慢病毒就具有在细胞中表达CAR蛋白的作用。将这样的慢病毒加入培养T细胞的培养基中，其就能够感染T细胞，即进入T细胞，然后利用T细胞内的元素来表达CAR蛋白，这些CAR蛋白表达之后就锚定在T细胞的表面。目前通常采用病毒介导的基因表达技术，比如慢病毒(lentivirus)、逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)、腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)等。

然而，这些病毒技术都有一定的不足，例如主要就在于慢病毒和逆转录病毒进入细胞之后，就会随机地插入(insertion)到基因组中，而腺病毒和腺相关病毒也会有一定的概率插入到基因组中，都可能会破坏细胞中的基因，从而导致细胞异常，甚至可能会让细胞转变成肿瘤细胞，进而引发肿瘤。因此，采用这些病毒技术来制备CART进行细胞免疫治疗会有引发肿瘤的风险。

发明内容

具体的，本发明涉及一种重组腺相关病毒载体，所述腺相关病毒载体包含如下操作性连接的序列元件：5’末端反向重复序列、3’末端反向重复序列以及编码CAR基因的序列。具体的，所述编码CAR基因的序列为CD19CAR(4-1BB)。

其中，所述腺相关病毒载体还可进一步包含如下操作性连接的序列元件：SA序列、2A序列、polyA序列、5’基因组同源序列(5’HA)、3’基因组同源序列(3’HA)。

所述的5’HA序列包含SEQ ID NO:1所示的序列；

所述的SA序列包含SEQ ID NO:2所示的序列；

所述的2A序列包含SEQ ID NO:3所示的序列；

所述的CD19CAR(4-1BB)序列包含SEQ ID NO:4所示的序列；

所述的polyA序列包含SEQ ID NO:5所示的序列；

所述的3’HA序列包含SEQ ID NO:6所示的序列

所述的5’末端反向重复序列包含SEQ ID NO:7所示的序列

所述的3’末端反向重复序列包含SEQ ID NO:8所示的序列。

进一步的，所述重组腺相关病毒载体包含与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少约70％、至少约80％、至少约90％序列同一性或更多的序列同一性的核苷酸序列。

本发明还涉及所述的重组腺相关病毒载体的制备方法，所述方法包括以下步骤：提供前述病毒载体的包装细胞系；和从所述包装细胞系的上清液中回收重组AAV病毒。

本发明还涉及一种重组腺相关病毒，所述病毒由前述任意的重组腺相关病毒载体包装获得。

另一方面，本发明还涉及一种用于表达CAR基因的方法，所述方法包括提供包括编码前述任意的重组腺相关病毒(AAV)的核苷酸序列；结合CRISPR/cas9基因编辑技术，将所述AAV同源重组到T细胞的基因组内，所述AAV在T细胞中表达所述CAR基因。

另一方面，本发明还涉及前述任意的重组腺相关病毒载体、重组腺相关病毒在制备CAR-T细胞或抗肿瘤药物中的应用。

另一方面，本发明还涉及前述一种重组腺相关病毒载体的CAR-T细胞制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

第一步，构建前述任意的重组腺相关病毒载体；

第二步，病毒包装；

第三步，T细胞分离、激活与扩增，CRISPR/cas9基因编辑，AAV病毒介导的基因重组；

前述任意的重组腺相关病毒载体是通过基因编辑手段，将其表达于癌症患者或健康人外周血中分离收集的T细胞以获得CAR-T细胞。

因此，本发明还涉及由上述方法制备获得的CAR-T细胞。

本发明还涉及一种试剂盒，所述试剂盒中包含前述任意的重组腺相关病毒载体、重组腺相关病毒，或所述CAR-T细胞。

本发明还涉及所述CAR-T细胞或所述试剂盒在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明人经过深入的研究，鉴于CAR-T免疫疗法的高成本，治疗效果个体差异大，安全性低，有引发肿瘤的风险等问题，本申请利用基因编辑技术，结合基因重组技术，从表达CAR基因的载体入手，对AAV载体的结构进行了改进，从而实现CAR的基因片段定点精确整合，确保了CAR基因的持续稳定表达，避免了引发肿瘤的风险。同时还将CAR的表达至于内源性启动子的控制之下，使得CAR的表达受正常生理调控，显著减少治疗副作用，获得了一种生理性的通用型CAR-T。

总的来说，本发明的有益效果在于：

1、本发明所述的获得的结构改进的AAV载体制备的无致病性；

2、发明所述的通用型T细胞和通用型CAR-T细胞可以通过同种异体回输的方式应用于恶性肿瘤或感染性疾病的治疗，极大地降低了治疗成本；

3、制备获得的CAR整合在TCR恒定区外显子之前，并且受到内源性启动子的调控，保证了CAR的表达是受生理调控的，且表达均一。由于这种生理性及均一性，CAR不会出现过度的表达，且CAR的表达水平与原来TCR的表达水平一致，各CAR-T细胞之间的个体差异性小；

4、安全性更高，由于CAR的表达是在生理范围内的，当CAR-T细胞激活后，释放的细胞因子也在生理范围内，不会出现过度的释放，从而避免细胞因子风暴的产生。

5、不存在引发肿瘤的风险，利用基因编辑技术，将CAR通过同源重组的方式精确的整合到指定的TCR恒定区基因上，而非随机整合到T细胞的基因组上，因此不会出现引发肿瘤的风险。

术语

如本文所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。

所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能，其通过插入或删除一些碱基(如1-50bp；较佳地1-30bp，更佳地1-20bp，更佳地1-10bp)，或进行随机或定点突变等来获得。

质粒

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因的载体。腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)是一种不能自我复制的病毒，具有较低的免疫原性。目前有约10种血清型AAV，不同血清型的AAV能够选择性地靶向不同组织。但是AAV病毒载体装载容量有限，不超过5.0kb。

根据上述所提供的元件的信息，进行了适当的变化且仍然保留其原有功能的上述元件的变异体也包括在本发明中。例如，在严格条件下与本发明限定的序列杂交且具有相同功能的序列变异体。

本发明的各元件所指向的基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

所述的载体中上述元件的上游以及下游的位置，还可包括限制性的酶切位点，这样有利于各元件的有机连接。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于进行病毒的包装。

试剂盒

本发明还提供了包含有所述表达CAR的重组腺相关病毒载体或由该载体包装而成的病毒的试剂盒。其它常用于进行病毒包装、转染、注射等的试剂也可被包含在所述的试剂盒中，以方便本领域技术人员使用。此外，所述试剂盒中还可包含有指导本领域技术人员操作的使用说明书。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

附图说明

图1-图3为三个质粒结构示意图，依次为：AAV6-TCR-CD19CAR(4-1BB)(实验载体)，AAV6-TCR-GFP(阴性对照)，LV-EF-1a-CD19CAT(4-1BB)-mCherry(阳性对照)；

图4：基因编辑的AAV6-TCR-CD19CAR(4-1BB)质粒结构图；

图5：经基因编辑后两个不同个体的T细胞TCR敲除流式检测结果；

图6：AAV6介导的CD19CAR(4-1BB)同源重组的流式检测结果；

图7：AAV6-TCR-CD19CAR-T的肿瘤杀伤能力流式细胞检测结果；

图8：不同时间点细胞因子浓度的检测及对比结果，其中，柱形图中每天从左到右的柱的数值分别代表Kmix、LV、AAV、LV+Kmix、AAV+Kmix；

图9：CAR-T细胞的衰竭标志物的流式检测及对比结果，其中，折线图中位于上方的折线为LV CD19CAR-T+Kmix，位于下方的折线为AAV CD19CAR-T+Kmix；

图10a、b：CAR-T抗肿瘤体内实验结果，其中图10b为生存曲线，慢病毒转导的LVCAR-T与AAV转导的AAV-TCR-CAR-T均显著延长小鼠的生存期，两组效果无显著差异。

具体实施方式

实施例1质粒的构建

1、本实施例构建的质粒包括

LV-EF-1a-CD19CAR(4-1BB)-mCherry(阳性对照，结构示意图见图3)

AAV6-TCR-CD19CAR(4-1BB)(实验载体，结构示意图见图1、4)

AAV6-TCR-GFP(阴性对照，结构示意图见图2)

2、质粒构建及病毒包装过程

2.1LV-EF-1a-CD19CAT(4-1BB)-mCherry质粒构建

序列为SEQ ID NO：10所示。：

1)获得LV-EF-1a-CD19CAR(4-1BB)-mCherry质粒

先在ApE或Snapgene软件上构建该质粒图谱。

质粒的功能区域：LTR-EF-1a-CD19CAT(4-1BB)-mCherry-LTR进行基因合成。

将该段序列克隆入慢病毒载体质粒。

质粒转化、涂板、挑克隆、提取质粒(小提)，测序确认无误，再次提取质粒(大提，去内毒素)，质粒待包病毒使用。

2.2AAV6-TCR-CD19CAR(4-1BB)质粒构建

先在ApE或Snapgene软件上构建该质粒的图谱。

质粒功能区域的结构：ITR-5’HA-SA-2A-CD19CAR(4-1BB)-polyA-3’HA-ITR

序列为SEQ ID NO：11所示。

首先合成基因片段：5’HA-SA-2A-CD19CAR(4-1BB)-polyA-3’HA

将上述基因片段克隆入AAV6病毒载体质粒

质粒转化、涂板、挑克隆、提取质粒(小提)，测序确认无误，再次提取质粒(大提，去内毒素)，质粒待包病毒使用。

2.3AAV6-TCR-GFP质粒构建

先在ApE或Snapgene软件上构建该质粒的图谱。

质粒功能区域的结构为：ITR-5’HA-SA-2A-GFP-polyA-3’HA-ITR

序列为SEQ ID NO：12所示。

按照Infusion原理，设计GFP引物，PCR获得GFP片段。

以上述2.2质粒为模板，按照Infusion原理，设计引物，PCR获得AAV6载体。

Infusion连接，质粒转化、涂板、挑克隆、提取质粒(小提)，测序确认无误，再次提取质粒(大提，去内毒素)，质粒待包病毒使用。

实施例2病毒包装过程

2.1LV包装

准备DMEM+10％FBS培养基+抗生素

复苏293T细胞，传代培养，判断细胞状态良好

包毒前一日，分6个10cm培养皿，各seed 2.5M细胞，24h后达到70％汇聚即可包毒。

包毒质粒包括：pSLQ5367，pCMV-dR8.91，pMD2-G,TransIT-VirusReagent，Opti MEM.

具体配比依照表1中的10-cm盘。

表1 DNA转染的条件配比

2.2.AAV6病毒包装

以T75flask为例，前一天下午传代，细胞数量9M-10M

4.AAV病毒收毒：病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中。

5.AAV病毒浓缩与纯化。

实施例3 T细胞分选

一、T细胞分选

1、获得健康捐献者的血液样品(至少50mL)。经过如下疾病的检测(不仅局限于这些检测)，合格的患者。包括：甲肝，乙肝，丙肝，艾滋病，梅毒抗体，结核，遗传性疾病等。2、获得外周血单个核细胞(PBMC)

1)将Ficoll-PaqueTM PLUS(#07957)混合均匀后置于空管中；

2)用PBS+2％FBS稀释血液样品(2X)；

3)将步骤2)中的血液样品置于步骤1)溶液的上层，尽量减少血液与Ficoll-PaqueTM PLUS的混合，室温下400g离心30分钟后自然降速；

4)移弃步骤3)离心后的上层血浆，取血浆与Ficoll-PaqueTM PLUS液交界层即为外周血单个核细胞(其中，离心后管中分为四层，从上到下依次为血浆、外周血单个核细胞、Ficoll-PaqueTM PLUS液、红细胞与粒细胞层)。

5)用PBS+2％FBS清洗外周血单个核细胞，待用。

3、获得T细胞(T memory stem cells，Tmsc)

使用Miltenyi的Pan T cell isolation Kit human获得总T细胞。此试剂盒为阴选试剂盒。二、T细胞培养

1)T细胞培养基(IL-2)：OpTmizer^TMCTS^TMT-cell Expansion SFM+5％CTS^TMImmuneCell SR+1％Penicillin-Streptomycin 100X Solution+1％L-glutamine+IL-2 200IU/mL。

2)T细胞培养基(IL-7/15)：OpTmizer^TMCTS^TMT-cell Expansion SFM+5％CTS^TMImmune Cell SR+1％Penicillin-Streptomycin 100X Solution+1％L-glutamine+IL-710ng/ml+IL-15 10ng/mL。起始细胞浓度为1M/mL，在Flask里培养基液面高度不高于1cm。

三、T细胞激活

1)T细胞激活使用：Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28磁珠

2)洗磁珠用Beads Wash Buffer：PBS+1％BSA+2mMEDTA，pH＝7.4。

3)按等量1:1比例将T细胞与磁珠混合。

4)T25Flask或6孔板里培养。

四、T细胞扩增

T细胞激活48-72小时后，去除Beads，进行基因转导。之后更换T细胞培养基(IL-7/15)将激活的T细胞以1M/mL为起始细胞密度，进行细胞培养，每2天补充培养基并添加适量细胞因子。

实施例4 T细胞的CAR基因转导

实施例3中的T细胞激活48-72小时以后，AAV6病毒介导的CAR基因同源重组，原位插入剪切位点进行基因修饰，即刻转导，AAV6病毒MOI：2.5×10e5-10e6。

1、TCR基因敲除

1.1采用CRISPR/cas9系统

1.2电转体系：

T细胞：3M

cas9蛋白10ug(2ul)

sgRNA 2.5ug(5ul)

总体积：Buffer T 100μL

电转条件：1600V，10ms，3pulses

其中，所述的sgRNA序列如下：

CTGGATATCTGTGGGACAAGAGG(SEQ ID NO:13)

1.3 CAR基因转导

AAV6病毒介导的CAR基因同源重组，原位插入剪切位点。电转后即刻转导，AAV6MOI：2.5×10e5-10e6。

1.4 TCR-/CAR+T细胞的分选

4天后，采用Miltenyi的CD3Biotin Microbeads分选TCR阴性的T细胞。

结果如图5，T细胞分别来自两个不同个体。流式细胞仪检测TCR，CD3的表达情况。两个不同个体的T细胞TCR敲除率分别为87.2％和68.6％。

图6所示：T细胞分别来自两个不同个体。流式细胞仪检测CAR的表达情况，分别为69.1％和67.5％。与慢病毒转导的CAR-T相比，本CAR-T细胞CAR的表达更为均一。

实施例5 CAR-T细胞的功能，表型的检测

1.细胞毒性的检测

K562-CD19+/K562-CD19-细胞共培养，起始细胞数量各5×10e4,其中CD19+细胞表达mCherry荧光蛋白

再与CAR-T细胞共培养，E/T比例8:1，4:1，2:1，1:1，0.5:1，0:1

各设三个复孔

NegativeCtrl：8:1，4:1，2:1，1:1，0.5:1，0:1

PositiveCtrl：8:1，4:1，2:1，1:1，0.5:1，0:1

Test 1：8:1，4:1，2:1，1:1，0.5:1，0:1

Test 2：8:1，4:1，2:1，1:1，0.5:1，0:1

Blank k562-CD19+：0:1,

Blank k562-CD19-：0:1,

Test1+CD19-：8:1，4:1

Test2+CD19-：8:1，4:1

所有4:1组均设6个复孔，1用来检测细胞表型：12,24,48h；2检测CAR的表达情况

96孔板培养

48小时后流式细胞仪检测K562-CD19+细胞的mCherry荧光

计算公式为：

100％×(1-(％CD19pos/％CD19neg at notedE:T)/(％CD19pos/CD19neg at 0:1E:T))by flow cytometry

结果如图7所示，AAV6-TCR-CD19CAR-T的肿瘤杀伤能力与CAR-T细胞与靶细胞的比值成正比，CAR-T细胞：肿瘤细胞＝4:1或8:1时效果最明显。

细胞毒性试验，不同时间点取20ul培养液上清，测细胞因子：IL-2，IFN-r，TNF-a

结果如图8所示，流式细胞因子检测细胞毒性试验不同时间点，细胞培养基中细胞因子的浓度。AAV6-TCR-CD19CAR-T的三个主要细胞因子IL-2，IFN-r，TNF-a的浓度显著降低。

3.T细胞衰竭的检测

细胞毒性试验开始后，不同时间点检测T细胞衰竭的标志物：PD-1，TIM-3，LAG-3

结果如图9所示，细胞毒性试验开始后检测T细胞的衰竭标志物：PD-1，LAG-3，TIM-3。AAV-TCR-CD19CAR-T细胞的衰竭标志物表达量显著低于对照组。

4.小鼠肿瘤模型的建立及AAV-TCR-CAR-T细胞的体内功能检测

体内实验表明(图10)：本发明所制备的AAV-TCR-CAR-T表现出等效的抗肿瘤活性，能够有效地控制小鼠体内肿瘤的生长。小鼠的生存期显著延长。

本发明虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围准。

序列表

<110> 北京门罗生物科技有限公司

<120> 一种用于通用型CAR-T制备的重组腺相关病毒载体及其构建方法和应用

<130> 申请日

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 560

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgcaggtgt tctgatttat agttcaaaac ctctatcaat gagagagcaa tctcctggta 60

atgtgataga tttcccaact taatgccaac ataccataaa cctcccattc tgctaatgcc 120

cagcctaagt tggggagacc actccagatt ccaagatgta cagtttgctt tgctgggcct 180

ttttcccatg cctgccttta ctctgccaga gttatattgc tggggttttg aagaagatcc 240

tattaaataa aagaataagc agtattatta agtagccctg catttcaggt ttccttgagt 300

ggcaggccag gcctggccgt gaacgttcac tgaaatcatg gcctcttggc caagattgat 360

agcttgtgcc tgtccctgag tcccagtcca tcacgagcag ctggtttcta agatgctatt 420

tcccgtataa agcatgagac cgtgacttgc cagccccaca gagccccgcc cttgtccatc 480

actggcatct ggactccagc ctgggttggg gcaaagaggg aaatgagatc atgtcctaac 540

cctgatcctc ttgtcccaca 560

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctagggacag cgatcgggta catcgatcgc aggcgcaatc ttcgcatttc ttttttccag 60

<210> 3

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct 57

<210> 4

<211> 1524

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc cgccaggccg 60

gagcagaaac ttatcagtga ggaggacctg gacatccaga tgacacagac tacatcctcc 120

ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagt 180

aaatatttaa attggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctaccat 240

acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat 300

tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag 360

ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt 420

ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga 480

cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca 540

ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg 600

ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac tataattcag ctctcaaatc cagactgacc 660

atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat 720

gacacagcca tttactactg tgccaaacat tattactacg gtggtagcta tgctatggac 780

tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcagcgg ccgcattcgt gccggtcttc 840

ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 900

gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 960

cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 1020

tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa 1080

ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 1140

ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc 1200

agcaggagcg cagacgcccc cgcgtacaag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1260

aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1320

atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1380

gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1440

gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1500

cacatgcagg ccctgccccc tcgc 1524

<210> 5

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225

<210> 6

<211> 560

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgagag actctaaatc cagtgacaag 60

tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct 120

gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta gacatgaggt ctatggactt caagagcaac 180

agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc 240

attattccag aagacacctt cttccccagc ccaggtaagg gcagctttgg tgccttcgca 300

ggctgtttcc ttgcttcagg aatggccagg ttctgcccag agctctggtc aatgatgtct 360

aaaactcctc tgattggtgg tctcggcctt atccattgcc accaaaaccc tctttttact 420

aagaaacagt gagccttgtt ctggcagtcc agagaatgac acgggaaaaa agcagatgaa 480

gagaaggtgg caggagaggg cacgtggccc agcctcagtc tctccaactg agttcctgcc 540

tgcctgcctt tgctcagact 560

<210> 7

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct 130

<210> 8

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag ctgcctgcag g 141

<210> 9

<211> 3315

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct gcggccgcac gcgtacgcag gtgttctgat ttatagttca aaacctctat 180

caatgagaga gcaatctcct ggtaatgtga tagatttccc aacttaatgc caacatacca 240

taaacctccc attctgctaa tgcccagcct aagttgggga gaccactcca gattccaaga 300

tgtacagttt gctttgctgg gcctttttcc catgcctgcc tttactctgc cagagttata 360

ttgctggggt tttgaagaag atcctattaa ataaaagaat aagcagtatt attaagtagc 420

cctgcatttc aggtttcctt gagtggcagg ccaggcctgg ccgtgaacgt tcactgaaat 480

catggcctct tggccaagat tgatagcttg tgcctgtccc tgagtcccag tccatcacga 540

gcagctggtt tctaagatgc tatttcccgt ataaagcatg agaccgtgac ttgccagccc 600

cacagagccc cgcccttgtc catcactggc atctggactc cagcctgggt tggggcaaag 660

agggaaatga gatcatgtcc taaccctgat cctcttgtcc cacactaggg acagcgatcg 720

ggtacatcga tcgcaggcgc aatcttcgca tttctttttt ccagacgcta ctaacttcag 780

cctgctgaag caggctggag acgtggagga gaaccctgga cctgccttac cagtgaccgc 840

cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg ccggagcaga aacttatcag 900

tgaggaggac ctggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg 960

agacagagtc accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta 1020

tcagcagaaa ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc 1080

aggagtccca tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag 1140

caacctggag caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta 1200

cacgttcgga ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg 1260

gtcgggtggc ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc 1320

ctcacagagc ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt 1380

aagctggatt cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag 1440

tgaaaccaca tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc 1500

caagagccaa gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta 1560

ctgtgccaaa cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac 1620

ctcagtcacc gtctcctcag cggccgcatt cgtgccggtc ttcctgccag cgaagcccac 1680

cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc 1740

cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga 1800

cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct 1860

gtcactggtt atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa 1920

acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt 1980

tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc 2040

ccccgcgtac aagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga 2100

ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag 2160

aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc 2220

ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta 2280

ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc 2340

ccctcgctga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 2400

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tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 2520

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ccagaaccct gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg acaagtctgt 2640

ctgcctattc accgattttg attctcaaac aaatgtgtca caaagtaagg attctgatgt 2700

gtatatcaca gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg gacttcaaga gcaacagtgc 2760

tgtggcctgg agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca acagcattat 2820

tccagaagac accttcttcc ccagcccagg taagggcagc tttggtgcct tcgcaggctg 2880

tttccttgct tcaggaatgg ccaggttctg cccagagctc tggtcaatga tgtctaaaac 2940

tcctctgatt ggtggtctcg gccttatcca ttgccaccaa aaccctcttt ttactaagaa 3000

acagtgagcc ttgttctggc agtccagaga atgacacggg aaaaaagcag atgaagagaa 3060

ggtggcagga gagggcacgt ggcccagcct cagtctctcc aactgagttc ctgcctgcct 3120

gcctttgctc agactctgat tttgtaggta accacgtgcg gaccgagcgg ccgcaggaac 3180

ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc 3240

gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 3300

gcagctgcct gcagg 3315

<210> 10

<211> 12298

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60

ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 120

tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 180

agcatctaga attaattccg tgtattctat agtgtcacct aaatcgtatg tgtatgatac 240

ataaggttat gtattaattg tagccgcgtt ctaacgacaa tatgtacaag cctaattgtg 300

tagcatctgg cttactgaag cagaccctat catctctctc gtaaactgcc gtcagagtcg 360

gtttggttgg acgaaccttc tgagtttctg gtaacgccgt cccgcacccg gaaatggtca 420

gcgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc agatcctcta cgccggacgc atcgtggccg 480

gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg 540

aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag 600

gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg 660

cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg 720

gagagcgtcg aatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag 780

ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc 840

gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca 900

tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc 960

atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc 1020

cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc 1080

tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc 1140

gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg 1200

gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat 1260

ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc 1320

acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa 1380

ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa 1440

aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt 1500

gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct 1560

tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat 1620

gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg 1680

cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg 1740

atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt 1800

attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg 1860

ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg 1920

gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg 1980

tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa 2040

aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 2100

tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 2160

tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 2220

ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 2280

ataccaaata ctgtctttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 2340

gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 2400

aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 2460

ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 2520

agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 2580

aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 2640

aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 2700

ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 2760

cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat 2820

tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg 2880

accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct 2940

ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg 3000

gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag 3060

caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc 3120

tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc 3180

ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg 3240

aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag 3300

gcttttgcaa aaagcttgga cacaagacag gcttgcgaga tatgtttgag aataccactt 3360

tatcccgcgt cagggagagg cagtgcgtaa aaagacgcgg actcatgtga aatactggtt 3420

tttagtgcgc cagatctcta taatctcgcg caacctattt tcccctcgaa cactttttaa 3480

gccgtagata aacaggctgg gacacttcac atgagcgaaa aatacatcgt cacctgggac 3540

atgttgcaga tccatgcacg taaactcgca agccgactga tgccttctga acaatggaaa 3600

ggcattattg ccgtaagccg tggcggtctg taccgggtgc gttactggcg cgtgaactgg 3660

gtattcgtca tgtcgatacc gtttgtattt ccagctacga tcacgacaac cagcgcgagc 3720

ttaaagtgct gaaacgcgca gaaggcgatg gcgaaggctt catcgttatt gatgacctgg 3780

tggataccgg tggtactgcg gttgcgattc gtgaaatgta tccaaaagcg cactttgtca 3840

ccatcttcgc aaaaccggct ggtcgtccgc tggttgatga ctatgttgtt gatatcccgc 3900

aagatacctg gattgaacag ccgtgggata tgggcgtcgt attcgtcccg ccaatctccg 3960

gtcgctaatc ttttcaacgc ctggcactgc cgggcgttgt tctttttaac ttcaggcggg 4020

ttacaatagt ttccagtaag tattctggag gctgcatcca tgacacaggc aaacctgagc 4080

gaaaccctgt tcaaaccccg ctttaaacat cctgaaacct cgacgctagt ccgccgcttt 4140

aatcacggcg cacaaccgcc tgtgcagtcg gcccttgatg gtaaaaccat ccctcactgg 4200

tatcgcatga ttaaccgtct gatgtggatc tggcgcggca ttgacccacg cgaaatcctc 4260

gacgtccagg cacgtattgt gatgagcgat gccgaacgta ccgacgatga tttatacgat 4320

acggtgattg gctaccgtgg cggcaactgg atttatgagt gggccccgga tctttgtgaa 4380

ggaaccttac ttctgtggtg tgacataatt ggacaaacta cctacagaga tttaaagctc 4440

taaggtaaat ataaaatttt taagtgtata atgtgttaaa ctactgattc taattgtttg 4500

tgtattttag attccaacct atggaactga tgaatgggag cagtggtgga atgcctttaa 4560

tgaggaaaac ctgttttgct cagaagaaat gccatctagt gatgatgagg ctactgctga 4620

ctctcaacat tctactcctc caaaaaagaa gagaaaggta gaagacccca aggactttcc 4680

ttcagaattg ctaagttttt tgagtcatgc tgtgtttagt aatagaactc ttgcttgctt 4740

tgctatttac accacaaagg aaaaagctgc actgctatac aagaaaatta tggaaaaata 4800

ttctgtaacc tttataagta ggcataacag ttataatcat aacatactgt tttttcttac 4860

tccacacagg catagagtgt ctgctattaa taactatgct caaaaattgt gtacctttag 4920

ctttttaatt tgtaaagggg ttaataagga atatttgatg tatagtgcct tgactagaga 4980

tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc 5040

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cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggatca 5220

actggataac tcaagctaac caaaatcatc ccaaacttcc caccccatac cctattacca 5280

ctgccaatta cctagtggtt tcatttactc taaacctgtg attcctctga attattttca 5340

ttttaaagaa attgtatttg ttaaatatgt actacaaact tagtagttgg aagggctaat 5400

tcactcccaa agaagacaag atatccttga tctgtggatc taccacacac aaggctactt 5460

ccctgattag cagaactaca caccagggcc aggggtcaga tatccactga cctttggatg 5520

gtgctacaag ctagtaccag ttgagccaga taaggtagaa gaggccaata aaggagagaa 5580

caccagcttg ttacaccctg tgagcctgca tgggatggat gacccggaga gagaagtgtt 5640

agagtggagg tttgacagcc gcctagcatt tcatcacgtg gcccgagagc tgcatccgga 5700

gtacttcaag aactgctgat atcgagcttg ctacaaggga ctttccgctg gggactttcc 5760

agggaggcgt ggcctgggcg ggactgggga gtggcgagcc ctcagatcct gcatataagc 5820

agctgctttt tgcctgtact gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 5880

ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag 5940

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agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt agaaacatca gaaggctgta gacaaatact 6360

gggacagcta caaccatccc ttcagacagg atcagaagaa cttagatcat tatataatac 6420

agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag gatagagata aaagacacca aggaagcttt 6480

agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag taagaccacc gcacagcaag cggccggccg 6540

ctgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt ggagaagtga attatataaa 6600

tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg 6660

gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca 6720

gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg tacaggccag acaattattg 6780

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ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaatcctggc tgtgaaagat 6900

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ctgctgtgcc ttggaatgct agttggagta ataaatctct ggaacagatt tggaatcaca 7020

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taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt tctatagtga 7260

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cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt 8580

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gccgccaggc cggagcagaa acttatcagt gaggaggacc tggacatcca gatgacacag 9000

actacatcct ccctgtctgc ctctctggga gacagagtca ccatcagttg cagggcaagt 9060

caggacatta gtaaatattt aaattggtat cagcagaaac cagatggaac tgttaaactc 9120

ctgatctacc atacatcaag attacactca ggagtcccat caaggttcag tggcagtggg 9180

tctggaacag attattctct caccattagc aacctggagc aagaagatat tgccacttac 9240

ttttgccaac agggtaatac gcttccgtac acgttcggag gggggaccaa gctggagatc 9300

acaggtggcg gtggctcggg cggtggtggg tcgggtggcg gcggatctga ggtgaaactg 9360

caggagtcag gacctggcct ggtggcgccc tcacagagcc tgtccgtcac atgcactgtc 9420

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tccagactga ccatcatcaa ggacaactcc aagagccaag ttttcttaaa aatgaacagt 9600

ctgcaaactg atgacacagc catttactac tgtgccaaac attattacta cggtggtagc 9660

tatgctatgg actactgggg ccaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagc ggccgcattc 9720

gtgccggtct tcctgccagc gaagcccacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 9780

gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 9840

gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 9900

ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 9960

ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 10020

caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 10080

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 10140

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 10200

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 10260

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 10320

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 10380

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctgag acgaatgccg agataccgtc 10440

ggatatcgaa ttcccacggg gttggggttg cgccttttcc aaggcagccc tgggtttgcg 10500

cagggacgcg gctgctctgg gcgtggttcc gggaaacgca gcggcgccga ccctgggtct 10560

cgcacattct tcacgtccgt tcgcagcgtc acccggatct tcgccgctac ccttgtgggc 10620

cccccggcga cgcttcctgc tccgccccta agtcgggaag gttccttgcg gttcgcggcg 10680

tgccggacgt gacaaacgga agccgcacgt ctcactagta ccctcgcaga cggacagcgc 10740

cagggagcaa tggcagcgcg ccgaccgcga tgggctgtgg ccaatagcgg ctgctcagcg 10800

gggcgcgccg agagcagcgg ccgggaaggg gcggtgcggg aggcggggtg tggggcggta 10860

gtgtgggccc tgttcctgcc cgcgcggtgt tccgcattct gcaagcctcc ggagcgcacg 10920

tcggcagtcg gctccctcgt tgaccgaatc accgacctct ctccccaggg ggatccaccg 10980

gtcgccacca tggtgagcaa gggcgaggag gataacatgg ccatcatcaa ggagttcatg 11040

cgcttcaagg tgcacatgga gggctccgtg aacggccacg agttcgagat cgagggcgag 11100

ggcgagggcc gcccctacga gggcacccag accgccaagc tgaaggtgac caagggtggc 11160

cccctgccct tcgcctggga catcctgtcc cctcagttca tgtacggctc caaggcctac 11220

gtgaagcacc ccgccgacat ccccgactac ttgaagctgt ccttccccga gggcttcaag 11280

tgggagcgcg tgatgaactt cgaggacggc ggcgtggtga ccgtgaccca ggactcctcc 11340

ctgcaggacg gcgagttcat ctacaaggtg aagctgcgcg gcaccaactt cccctccgac 11400

ggccccgtaa tgcagaagaa gaccatgggc tgggaggcct cctccgagcg gatgtacccc 11460

gaggacggcg ccctgaaggg cgagatcaag cagaggctga agctgaagga cggcggccac 11520

tacgacgctg aggtcaagac cacctacaag gccaagaagc ccgtgcagct gcccggcgcc 11580

tacaacgtca acatcaagtt ggacatcacc tcccacaacg aggactacac catcgtggaa 11640

cagtacgaac gcgccgaggg ccgccactcc accggcggca tggacgagct gtacaagtaa 11700

agcgtcgaca atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac 11760

tatgttgctc cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt 11820

gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat 11880

gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca 11940

acccccactg gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc 12000

cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg 12060

gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaagctgac gtcctttcca 12120

tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct 12180

tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt 12240

ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgc 12298

<210> 11

<211> 5200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct gcggccgcac gcgttcaagg ccttatatcg agtaaacggt agtgctgggg 180

cttagacgca ggtgttctga tttatagttc aaaacctcta tcaatgagag agcaatctcc 240

tggtaatgtg atagatttcc caacttaatg ccaacatacc ataaacctcc cattctgcta 300

atgcccagcc taagttgggg agaccactcc agattccaag atgtacagtt tgctttgctg 360

ggcctttttc ccatgcctgc ctttactctg ccagagttat attgctgggg ttttgaagaa 420

gatcctatta aataaaagaa taagcagtat tattaagtag ccctgcattt caggtttcct 480

tgagtggcag gccaggcctg gccgtgaacg ttcactgaaa tcatggcctc ttggccaaga 540

ttgatagctt gtgcctgtcc ctgagtccca gtccatcacg agcagctggt ttctaagatg 600

ctatttcccg tataaagcat gagaccgtga cttgccagcc ccacagagcc ccgcccttgt 660

ccatcactgg catctggact ccagcctggg ttggggcaaa gagggaaatg agatcatgtc 720

ctaaccctga tcctcttgtc ccacactagg gacagcgatc gggtacatcg atcgcaggcg 780

caatcttcgc atttcttttt tccagacgct actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga 840

gacgtggagg agaaccctgg acctgtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg 900

cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag 960

ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag 1020

ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc 1080

cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac 1140

gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg 1200

aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag 1260

gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc 1320

atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag 1380

gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc 1440

gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac 1500

gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 1560

atggacgagc tgtacaagta ctcagatctc gagctcaagt agctgtgcct tctagttgcc 1620

agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 1680

ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta 1740

ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc 1800

atgctgggga tgcggtgggc tctatgggat atccagaacc ctgaccctgc cgtgtaccag 1860

ctgagagact ctaaatccag tgacaagtct gtctgcctat tcaccgattt tgattctcaa 1920

acaaatgtgt cacaaagtaa ggattctgat gtgtatatca cagacaaaac tgtgctagac 1980

atgaggtcta tggacttcaa gagcaacagt gctgtggcct ggagcaacaa atctgacttt 2040

gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt attccagaag acaccttctt ccccagccca 2100

ggtaagggca gctttggtgc cttcgcaggc tgtttccttg cttcaggaat ggccaggttc 2160

tgcccagagc tctggtcaat gatgtctaaa actcctctga ttggtggtct cggccttatc 2220

cattgccacc aaaaccctct ttttactaag aaacagtgag ccttgttctg gcagtccaga 2280

gaatgacacg ggaaaaaagc agatgaagag aaggtggcag gagagggcac gtggcccagc 2340

ctcagtctct ccaactgagt tcctgcctgc ctgcctttgc tcagactgtt tgccccttac 2400

tgctcttcta ggcctcattc taactgattt tgtaggtaac cacgtgcgga ccgagcggcc 2460

gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga 2520

ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga 2580

gcgagcgcgc agctgcctgc aggggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg 2640

cggtatttca caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta 2700

agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg 2760

cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 2820

gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 2880

aaaaaacttg atttgggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt 2940

cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 3000

acactcaacc ctatctcggg ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc 3060

tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta 3120

acgtttacaa ttttatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc 3180

cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca 3240

tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg 3300

tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat 3360

gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga 3420

acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 3480

ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt 3540

gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg 3600

ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg 3660

gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg 3720

agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag 3780

caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca 3840

gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg 3900

agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc 3960

gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg 4020

aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg 4080

ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac 4140

tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg 4200

tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg 4260

gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact 4320

atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa 4380

ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 4440

aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 4500

ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 4560

ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 4620

tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 4680

cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 4740

gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 4800

gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 4860

tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 4920

ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 4980

gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 5040

ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 5100

tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 5160

ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 5200

<210> 12

<211> 2603

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct gcggccgcac gcgttcaagg ccttatatcg agtaaacggt agtgctgggg 180

cttagacgca ggtgttctga tttatagttc aaaacctcta tcaatgagag agcaatctcc 240

tggtaatgtg atagatttcc caacttaatg ccaacatacc ataaacctcc cattctgcta 300

atgcccagcc taagttgggg agaccactcc agattccaag atgtacagtt tgctttgctg 360

ggcctttttc ccatgcctgc ctttactctg ccagagttat attgctgggg ttttgaagaa 420

gatcctatta aataaaagaa taagcagtat tattaagtag ccctgcattt caggtttcct 480

tgagtggcag gccaggcctg gccgtgaacg ttcactgaaa tcatggcctc ttggccaaga 540

ttgatagctt gtgcctgtcc ctgagtccca gtccatcacg agcagctggt ttctaagatg 600

ctatttcccg tataaagcat gagaccgtga cttgccagcc ccacagagcc ccgcccttgt 660

ccatcactgg catctggact ccagcctggg ttggggcaaa gagggaaatg agatcatgtc 720

ctaaccctga tcctcttgtc ccacactagg gacagcgatc gggtacatcg atcgcaggcg 780

caatcttcgc atttcttttt tccagacgct actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga 840

gacgtggagg agaaccctgg acctgtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg 900

cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag 960

ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag 1020

ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc 1080

cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac 1140

gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg 1200

aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag 1260

gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc 1320

atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag 1380

gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc 1440

gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac 1500

gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 1560

atggacgagc tgtacaagta ctcagatctc gagctcaagt agctgtgcct tctagttgcc 1620

agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 1680

ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta 1740

ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc 1800

atgctgggga tgcggtgggc tctatgggat atccagaacc ctgaccctgc cgtgtaccag 1860

ctgagagact ctaaatccag tgacaagtct gtctgcctat tcaccgattt tgattctcaa 1920

acaaatgtgt cacaaagtaa ggattctgat gtgtatatca cagacaaaac tgtgctagac 1980

atgaggtcta tggacttcaa gagcaacagt gctgtggcct ggagcaacaa atctgacttt 2040

gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt attccagaag acaccttctt ccccagccca 2100

ggtaagggca gctttggtgc cttcgcaggc tgtttccttg cttcaggaat ggccaggttc 2160

tgcccagagc tctggtcaat gatgtctaaa actcctctga ttggtggtct cggccttatc 2220

cattgccacc aaaaccctct ttttactaag aaacagtgag ccttgttctg gcagtccaga 2280

gaatgacacg ggaaaaaagc agatgaagag aaggtggcag gagagggcac gtggcccagc 2340

ctcagtctct ccaactgagt tcctgcctgc ctgcctttgc tcagactgtt tgccccttac 2400

tgctcttcta ggcctcattc taactgattt tgtaggtaac cacgtgcgga ccgagcggcc 2460

gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga 2520

ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga 2580

gcgagcgcgc agctgcctgc agg 2603

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctggatatct gtgggacaag agg 23

Claims (14)

1.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体包含如下操作性连接的序列元件：5’末端反向重复序列、3’末端反向重复序列以及编码CAR基因的序列。

2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述编码CAR基因的序列为CD19CAR(4-1BB)。

3.如权利要求1或2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体进一步包含如下操作性连接的序列元件：SA序列、2A序列、polyA序列、5’基因组同源序列(5’HA)、3’基因组同源序列(3’HA)。

4.如权利要求3所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述的CD19CAR(4-1BB)序列包含SEQ ID NO:4所示的序列。

5.如权利要求1-4任意一项所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述序列元件的序列选自如下序列：所述的5’HA序列包含SEQ ID NO:1所示的序列；所述的SA序列包含SEQID NO:2所示的序列；所述的2A序列包含SEQ ID NO:3所示的序列；；所述的polyA序列包含SEQ ID NO:5所示的序列；所述的3’HA序列包含SEQ ID NO:6所示的序列；所述的5’末端反向重复序列包含SEQ ID NO:7所示的序列；所述的3’末端反向重复序列包含SEQ ID NO:8所示的序列。

6.如权利要求1-5任意一项所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体包含与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少约70％、至少约80％、至少约90％序列同一性或更多的序列同一性的核苷酸序列。

7.如权利要求1-6任意一项所述的重组腺相关病毒载体的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：提供权利要求1-6任意一项所述的病毒载体的包装细胞系；和从所述包装细胞系的上清液中回收重组AAV病毒。

8.一种重组腺相关病毒，其特征在于，所述病毒由权利要求1或2所述的重组腺相关病毒载体包装获得。

9.一种用于表达CAR基因的方法，其特征在于：所述方法包括提供包括编码权利要求1-6任意一项的重组腺相关病毒(AAV)的核苷酸序列；结合CRISPR/cas9基因编辑技术，将所述AAV同源重组到T细胞的基因组内，所述AAV在T细胞中表达所述CAR基因。

10.如权利要求1-6任意一项所述的重组腺相关病毒载体、权利要求8所述重组腺相关病毒，在制备CAR-T细胞或抗肿瘤药物中的应用。

11.一种重组腺相关病毒载体的CAR-T细胞制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

第一步，构建权利要求1-6任意一项所述的重组腺相关病毒载体；

第二步，病毒包装；

第三步，T细胞分离、激活与扩增，CRISPR/cas9基因编辑，AAV病毒介导的基因重组；

制备权利要求1-6任意一项所述的重组腺相关病毒载体是通过基因编辑手段，将其表达于癌症患者或健康人外周血中分离收集的T细胞以获得CAR-T细胞。

12.一种由权利要求11所述方法制备获得的CAR-T细胞。

13.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求1-6任意一项所述的重组腺相关病毒载体、权利要求8所述重组腺相关病毒，或权利要求12所述CAR-T细胞。

14.权利要求12所述CAR-T细胞或权利要求13所述试剂盒在制备抗肿瘤药物中的应用。