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CN115433734B - 核酸片段及其在制备肿瘤疫苗中的应用 - Google Patents

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CN115433734B CN202210615397.XA CN202210615397A CN115433734B CN 115433734 B CN115433734 B CN 115433734B CN 202210615397 A CN202210615397 A CN 202210615397A CN 115433734 B CN115433734 B CN 115433734B
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Abstract

本发明涉及免疫治疗技术领域，尤其涉及核酸片段及其在制备肿瘤疫苗中的应用。本发明提供的核酸片段能够用于构建肿瘤疫苗，其利用肿瘤细胞过表达XCL1/CCL21/IL‑7/IL‑12，招募和活化CD8α+DC和杀伤效应细胞，达到增强肿瘤免疫反应，释放大量TAA，活化多种TAA特异性的杀伤细胞，进而抑制肿瘤生长发展的效果。

Description

核酸片段及其在制备肿瘤疫苗中的应用
技术领域
本发明涉及免疫治疗技术领域，尤其涉及核酸片段及其在制备肿瘤疫苗中的应用。
背景技术
癌症是世界上最难治愈的疾病之一。传统的癌症治疗手段包括手术切除、放疗和化疗，但并非适用于所有患者，且疗效有限。从20世纪初开始，免疫治疗(immunotherapy)逐渐成为新的肿瘤治疗手段，包括异基因造血细胞移植、过继细胞移植(包括T、NK、DC等细胞)、靶向单克隆抗体、免疫检查点抑制和其他细胞疗法等。尽管取得了一定疗效，但靶向治疗和免疫检查点抑制剂常常出现肿瘤耐受现象；过继细胞移植目前在实体瘤治疗中几乎无效。肿瘤治疗失败的原因主要在于肿瘤的异质性和肿瘤的免疫抑制性微环境。药物治疗往往会形成筛选压力，使药物耐受的肿瘤细胞具备生存优势而造成肿瘤复发和转移；过继细胞治疗使用的细胞很难进入肿瘤组织，且肿瘤的免疫抑制性微环境常常使杀伤性的细胞脱敏而失去抗瘤效果。因此，肿瘤治疗仍需要开发新的策略。为克服肿瘤细胞异质性，可利用肿瘤组织来源的肿瘤细胞作为疫苗，为肿瘤治疗提供丰富的潜在的多种肿瘤相关抗原(TAA)，活化多种TAA特异性的T细胞，从而实现肿瘤治疗的目的。
克服肿瘤组织的免疫细胞浸润困难和免疫抑制性微环境可以由趋化因子和免疫活化细胞因子入手。抗瘤免疫反应依赖于抗原提呈细胞(APC)和抗原特异性T细胞的活化。外源性抗原只有被APC摄取、加工，才能有效地提呈至细胞表面，活化初始T细胞。近年来，大量研究认为，在小鼠体内，CD8α+DC是诱导CD8+T细胞活化最有效的APC，可将抗原从肿瘤转移到引流淋巴结(人体内对应的细胞为CD141+DC，又称为BDCA3+DC)。
细胞因子中，白细胞介素-7(IL-7)和白细胞介素-12(IL-12)在抗击肿瘤中具备重要作用。IL-7是IL-2超家族成员之一，通过与细胞表面具有一个共同γ链亚单位的受体结合而发挥效应。IL-7具备抗肿瘤免疫反应，可诱导单核细胞产生IL-1α、IL-1β和TNF-α，是增加细胞毒性CD8+T淋巴细胞最有效的细胞因子。IL-7治疗可增强长期肿瘤抗原特异性CD8+T细胞反应。IL-12由两个共价连接的p35和p40亚单位组成。作为抗肿瘤免疫治疗最有效的药物之一，IL-12的免疫调节和抗血管生成功能是其抗癌效用的基础。IL-12可连接先天免疫和适应性免疫，通过促进NK细胞和T细胞的IFN-γ产生、增殖和细胞裂解活性，诱导细胞免疫。此外，IL-12通过IFN-γ和淋巴细胞-内皮细胞相互作用诱导抗血管生成程序。因此，以白细胞介素-7(IL-7)和白细胞介素-12(IL-12)制备具有抗肿瘤功能的疫苗具有良好的应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供核酸片段及其在制备肿瘤疫苗中的应用。
本发明提供的核酸片段包括IL-12表达模块和IL-7表达模块；
所述IL-12表达模块包括：编码CCL21的核酸和编码IL-12的核酸；
所述IL-7表达模块包括：编码XCL1的核酸和编码IL-7的核酸。
本发明中，所述IL-12表达模块依次包括启动子A、编码CCL21的核酸、编码自剪切2A核糖体跳跃肽的核酸和编码IL-12的核酸；
本发明中，所述IL-7表达模块依次包括：启动子B、编码XCL1的核酸、编码自剪切2A核糖体跳跃肽的核酸和编码IL-7的核酸。
本发明实施例中，所述核酸片段包括顺序连接的：启动子A、编码CCL21的核酸、编码自剪切2A核糖体跳跃肽的核酸、编码IL-12B的核酸、linker、编码IL-12A的核酸、启动子B、编码XCL1的核酸、编码自剪切2A核糖体跳跃肽的核酸、编码IL-7的核酸、IRES片段和报告基因。
本发明中，所述编码IL-12的核酸包括：编码IL-12B的核酸、linker和编码IL-12A的核酸。
本发明中，所述启动子A和启动子B独立地选自：
SV40启动子、
包含增强子序列和内含子的EF1a哺乳动物启动子、
或包含增强子序列和内含子的CMV哺乳动物启动子。
一些实施例中，启动子A为EF-1α启动子，启动子B为SV40启动子。
本发明中，所述linker编码的短肽的氨基酸序列为VPGVGVPAVG。
本发明中，所述报告基因为mRFP。
一些具体实施例中，所述核酸片段的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了一种重组载体，其包括本发明所述的核酸片段和骨架载体。
一些实施例中，本发明所述的重组载体的骨架载体上还包括EF1apromotor、IRES、WPRE、3’LTR、3’LTR(ΔU)、HIV-1Ψ、RRE和cPPT/CTS元件。
一些具体实施例中，本发明所述的重组载体的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供了一种慢病毒，其由所述重组载体转染细胞获得。
本发明所述慢病毒的构建由所述重组载体和pPAX2、pMD2G质粒转染细胞获得。一些实施例中，所述细胞为293T细胞。所述转染的方法采用磷酸钙共沉淀法。
宿主由所述的慢病毒转染细胞获得。
本发明所述宿主的构建由所述慢病毒颗粒转染细胞获得，转染过程中添加polybrene。所述polybrene的浓度为8μg/ml。一些实施例中，本发明所述宿主的细胞为TC-1细胞。
本发明所述的如下I)～IV)中至少一项在制备肿瘤疫苗中的应用；
I)、所述的核酸片段；
II)、所述重组载体；
III)、所述的慢病毒；
IV)、所述的宿主。
本发明还提供了肿瘤疫苗，其由本发明所述的宿主制得。
本发明所述肿瘤疫苗的制备方法，其将所述宿主以丝裂霉素孵育后，经胰蛋白酶消化获得所述肿瘤疫苗。一些实施例中，所述丝裂霉素的浓度为1mg/ml。所述孵育的条件为37℃孵育4小时。所述孵育后，以PBS缓冲液清洗3～5遍。
本发明所述的肿瘤疫苗在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明所述肿瘤包括宫颈癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、胆囊癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肝癌转移或尤因氏肉瘤。
本发明还提供了提供了预防，治疗和/或减轻患者癌症症状的方法，其为给予本发明所述的肿瘤疫苗。
本发明提供的核酸片段能够用于构建肿瘤疫苗，其利用肿瘤细胞过表达XCL1/CCL21/IL-7/IL-12，招募和活化CD8α+DC和杀伤效应细胞，达到增强肿瘤免疫反应，释放大量TAA，活化多种TAA特异性的杀伤细胞，进而抑制肿瘤生长发展的效果。
附图说明
图1-a.骨架载体图谱；
图1-b CCL21，IL-12，XCL1，IL-7表达载体质粒的示意图；
图2.CCL21，IL-12，XCL1，IL-7表达载体质粒转染的TC-1细胞的报告基因mRFP表达的流式检测结果；
图3.CCL21，IL-12，XCL1，IL-7表达载体质粒转染的TC-1细胞的基因表达检测结果；
图4.CCL21，IL-12，XCL1，IL-7表达载体质粒转染的丝裂霉素处理的TC-1细胞癌症疫苗对TC-1细胞系荷瘤小鼠肿瘤生长曲线(预防性模型)，在第-21、-14、-7天注射疫苗，第0天接种肿瘤细胞。
具体实施方式
本发明提供了核酸片段及其在制备肿瘤疫苗中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的核酸片段包含编码CCL21、IL12、XCL-1、IL-7的4个片段；本发明对这4个片段的连接顺序不做限定，且这4个片段均可与启动子、linker、自剪切2A核糖体跳跃肽或报告基因连接。
在本发明中，所述核酸片段中的IL-12与CCL21融合成为一个表达模块，而IL-7与XCL1融合形成一个表达模块。
在所述IL-12表达模块中包括：编码CCL21的核酸和编码IL-12的核酸。具体包括启动子A、编码CCL21的核酸、编码自剪切2A核糖体跳跃肽的核酸和编码IL-12的核酸。更具体的，从5’端至3’端，所述IL-12表达模块依次包括启动子A、编码CCL21的核酸、编码自剪切2A核糖体跳跃肽的核酸和编码IL-12的核酸。
在所述IL-7表达模块中包括：编码XCL1的核酸和编码IL-7的核酸。具体包括启动子B、编码XCL1的核酸、编码自剪切2A核糖体跳跃肽的核酸和编码IL-7的核酸。更具体的，从5’端至3’端，所述IL-7表达模块依次包括启动子B、编码XCL1的核酸、编码自剪切2A核糖体跳跃肽的核酸和编码IL-7的核酸。
在本发明中，所述IL-12表达模块和IL-7表达模块可存在于同一质粒载体，也可以分别存在于两个不同的载体。当其存在于同一载体，所述IL-12表达模块和IL-7表达模块可以直接连接，也可间隔其他片段。在本发明的实施例中，所述IL-12表达模块和IL-7表达模块直接连接。本发明对所述IL-12表达模块和IL-7表达模块的连接顺序不做限定。在本发明实施例中以5’端为IL-12表达模块的核酸片段为例进行验证。
因此，在本发明具体实施例中，所述核酸片段包括顺序连接的：启动子A、编码CCL21的核酸、编码自剪切2A核糖体跳跃肽的核酸、编码IL-12B的核酸、linker、编码IL-12A的核酸、启动子B、编码XCL1的核酸、编码自剪切2A核糖体跳跃肽的核酸、编码IL-7的核酸、IRES片段和报告基因。
本发明中涉及片段的核酸序列如下表：
本发明提供的核酸片段中，各序列来自小鼠，在本发明实施例中，以小鼠移植瘤细胞TC-1为实验对象，验证所述肿瘤疫苗的效果。临床应用中，用于人体肿瘤的防治，各片段应选择人源核酸片段。
一些实施例中，所述核酸片段的序列为：
ggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaagcggccgcgccaccatggctcagatgatgactctgagcctccttagcctggtcctggctctctgcatcccctggacccaaggcagtgatggagggggtcaggactgctgccttaagtacagccagaagaaaattccctacagtattgtccgaggctataggaagcaagaaccaagtttaggctgtcccatcccggcaatcctgttctcaccccggaagcactctaagcctgagctatgtgcaaaccctgaggaaggctgggtgcagaacctgatgcgccgcctggaccagcctccagccccagggaaacaaagccccggctgcaggaagaaccggggaacctctaagtctggaaagaaaggaaagggctccaagggctgcaagagaactgaacagacacagccctcaagaggatacccctatgacgtcccagactacgcagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctatgtgtcctcagaagctaaccatctcctggtttgccatcgttttgctggtgtctccactcatggccatgtgggagctggagaaagacgtttatgttgtagaggtggactggactcccgatgcccctggagaaacagtgaacctcacctgtgacacgcctgaagaagatgacatcacctggacctcagaccagagacatggagtcataggctctggaaagaccctgaccatcactgtcaaagagtttctagatgctggccagtacacctgccacaaaggaggcgagactctgagccactcacatctgctgctccacaagaaggaaaatggaatttggtccactgaaattttaaaaaatttcaaaaacaagactttcctgaagtgtgaagcaccaaattactccggacggttcacgtgctcatggctggtgcaaagaaacatggacttgaagttcaacatcaagagcagtagcagttcccctgactctcgggcagtgacatgtggaatggcgtctctgtctgcagagaaggtcacactggaccaaagggactatgagaagtattcagtgtcctgccaggaggatgtcacctgcccaactgccgaggagaccctgcccattgaactggcgttggaagcacggcagcagaataaatatgagaactacagcaccagcttcttcatcagggacatcatcaaaccagacccgcccaagaacttgcagatgaagcctttgaagaactcacaggtggaggtcagctgggagtaccctgactcctggagcactccccattcctacttctccctcaagttctttgttcgaatccagcgcaagaaagaaaagatgaaggagacagaggaggggtgtaaccagaaaggtgcgttcctcgtagagaagacatctaccgaagtccaatgcaaaggcgggaatgtctgcgtgcaagctcaggatcgctattacaattcctcgtgcagcaagtgggcatgtgttccctgcagggtccgatccgtaccaggagtaggagtaccagcagtaggaatggtcagcgttccaacagcctcaccctcggcatccagcagctcctctcagtgccggtccagcatgtgtcaatcacgctacctcctctttttggccacccttgccctcctaaaccacctcagtttggccagggtcattccagtctctggacctgccaggtgtcttagccagtcccgaaacctgctgaagaccacagatgacatggtgaagacggccagagaaaaactgaaacattattcctgcactgctgaagacatcgatcatgaagacatcacacgggaccaaaccagcacattgaagacctgtttaccactggaactacacaagaacgagagttgcctggctactagagagacttcttccacaacaagagggagctgcctgcccccacagaagacgtctttgatgatgaccctgtgccttggtagcatctatgaggacttgaagatgtaccagacagagttccaggccatcaacgcagcacttcagaatcacaaccatcagcagatcattctagacaagggcatgctggtggccatcgatgagctgatgcagtctctgaatcataatggcgagactctgcgccagaaacctcctgtgggagaagcagacccttacagagtgaaaatgaagctctgcatcctgcttcacgccttcagcacccgcgtcgtgaccatcaacagggtgatgggctatctgagctccgcctagtaaagtttaaacacgcgtggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggccgccaccatgagacttctcctcctgactttcctgggagtctgctgcctcaccccatgggttgtggaaggtgtggggactgaagtcctagaagagagtagctgtgtgaacttacaaacccagcggctgccagttcaaaaaatcaagacctatatcatctgggagggggccatgagagctgtaatttttgtcaccaaacgaggactaaaaatttgtgctgatccagaagccaaatgggtgaaagcagcgatcaagactgtggatggcagggccagtaccagaaagaacatggctgaaactgttcccacaggagcccagaggtccaccagcacagcgataaccctgactggggattacaaggatgacgacgataaggctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctatgttccatgtttcttttagatatatctttggaattcctccactgatccttgttctgctgcctgtcacatcatctgagtgccacattaaagacaaagaaggtaaagcatatgagagtgtactgatgatcagcatcgatgaattggacaaaatgacaggaactgatagtaattgcccgaataatgaaccaaacttttttagaaaacatgtatgtgatgatacaaaggaagctgcttttctaaatcgtgctgctcgcaagttgaagcaatttcttaaaatgaatatcagtgaagaattcaatgtccacttactaacagtatcacaaggcacacaaacactggtgaactgcacaagtaaggaagaaaaaaacgtaaaggaacagaaaaagaatgatgcatgtttcctaaagagactactgagagaaataaaaacttgttggaataaaattttgaagggcagtatatagtaagctagctcgagtctagaggatccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaagg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一些实施例中，插入本发明所述的核酸片段的载体能够用于制备疫苗的细胞可为自体肿瘤细胞，但也可使用异种移植扩增的自体肿瘤细胞，异基因肿瘤细胞，异种移植扩增的异基因肿瘤细胞或其组合。
本发明所述重组载体，是指重组的核酸载体，是一种重组DNA分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列。对原核细胞中的表达必需的核酸序列包括启动子，任选包括操纵基因序列，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知原核细胞利用启动子，增强子以及终止和多腺苷酸化信号。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本发明意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。
本发明所述的宿主细胞，为含有核酸载体和/或目标基因的原核或真核宿主。用使用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞。这样的转化宿主细胞有能力复制编码蛋白质的载体或表达期望蛋白质。
本发明所述的预防，治疗和/或减轻患者癌症症状的方法，其具体包括步骤：确定需要预防，治疗和/或减轻癌症症状的患者，并给予肿瘤细胞疫苗。
本发明所述的包含CCL21，IL-12，XCL1，IL-7的表达载体质粒为在骨架载体中插入本发明所述的核酸片段构建获得。本发明所述核酸片段在构建的过程中，可同时连入一个完整的片段，也可分步骤分别连入其中一部分，最终形成连接有所述核酸片段的载体，本发明对此不做限定。
本发明所述的疫苗能够用于预防，治疗和/或减轻癌症症状，其中所述癌症选自宫颈癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、胆囊癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肝癌转移和尤因氏肉瘤以及来自患者的其他癌症。
在一个实施例中，本发明通过给予表达CCL21，IL-12，XCL1，IL-7的全肿瘤细胞癌症疫苗来治疗、预防和/或减轻HPV阳性肿瘤模型小鼠的肿瘤发展的方法，包括步骤：确定需要预防，治疗和/或减轻癌症症状的HPV阳性肿瘤模型小鼠，并给予全肿瘤细胞癌症疫苗，所述细胞疫苗包含CCL21，IL-12，XCL1，IL-7表达载体质粒。
在该方法的一个方面中，一个或多个癌细胞采集自患有癌症的患者，所述癌症选自宫颈癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、胆囊癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肝癌转移和尤因氏肉瘤以及来自患者的其他癌症。在另一个方面中，通过丝裂霉素处理或辐照使基因修饰的细胞无法增殖。在又一个方面中，基因修饰的细胞为自体、异基因或异种移植扩增细胞。
一些实施例中，以自体肿瘤的疫苗的构建为例，该方法包括如下步骤：(i)从患者中无菌采集一个或多个癌细胞，(ii)将所采集的细胞置于无菌容器中的抗生素溶液中，(iii)由所采集的溶液形成细胞悬浮液，其中细胞形成(iv)悬浮液通过酶分解，机械解聚或两者来实现，(v)通过复制缺陷型慢病毒颗粒转染而对细胞进行基因修饰，以制备包含CCL21，IL-12，XCL1，IL-7表达载体质粒的自体细胞疫苗。(vi)收获该疫苗，(vii)丝裂霉素处理该疫苗和(vii)冷冻该疫苗。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
CCL21，IL-12，XCL1，IL-7表达载体质粒构建：
首先，全片段合成CCL21-HA-P2A-IL12B-linker-IL12A-SV40promotor-XCL1-FLAG-P2A-IL7的核酸片段，通过同源重组的方式用上述片段替换掉图1-a所示载体骨架EF1a promotor和IRES之间的序列，得到质粒1(图1-b)。然后，全片段合成编码mRFP的核酸片段，通过同源重组的方式用上述片段替换质粒1中的ZsGreen1序列，即得到最终表达载体质粒。
实施例2：
TC-1全肿瘤细胞癌症疫苗的制备，包括如下步骤：
(1)TC-1细胞系按照1×106细胞/只小鼠，皮下移植C57/BL6n小鼠，待20天后大肿瘤形成后，无菌条件下手术剪剥离肿瘤组织并剪碎，胶原酶和胰蛋白酶37℃消化5-10min,将酶解后的悬液由40μM筛网过滤后收集至PE离心管中，即得异体小鼠来源的TC-1肿瘤细胞。
(2)200-300g离心3min，获得TC-1肿瘤细胞沉淀；加入适量的含10％FBS的RPMI1640培养基重悬细胞并接种至10cm培养皿，保证每皿约5×106细胞；长满的细胞由胰蛋白酶消化传代，可连续传代3-5次。
(3)通过磷酸钙共沉淀法将实施例1制得的CCL21，IL-12，XCL1，IL-7表达载体质粒和pPAX2、pMD2G质粒瞬时转入293T细胞中，48小时后收集培养基上清，即得包含表达载体的慢病毒颗粒悬液。
(4)按MOI值约等于10-100将上述慢病毒颗粒悬液加入TC-1细胞，同时添加polybrene(终浓度8μg/ml)增强病毒转染效率，转染后72小时，由流式检测报告基因mRFP的表达比例和强度(图2)，并用qPCR方法检测CCL21，IL-12a，IL-12b,XCL1和IL-7的表达强度(图3)。
结果表明，制备的细胞中mRFP阳性比例超过80％，且CCL21，IL-12a，IL-12b,XCL1和IL-7的表达均显著上调，说明构建的细胞合格，可以进一步用来做细胞癌症疫苗。
(5)合格的上述转染后的TC-1细胞用丝裂霉素(终浓度1mg/ml)于37℃孵育4小时，而后PBS清洗3-5遍，胰蛋白酶消化所得细胞即全肿瘤细胞癌症疫苗，冻存于-80℃或液氮中备用。
实施例3：
将实施例2获得的全肿瘤细胞癌症疫苗免疫小鼠模型，另以仅含CCL21-IL-12的疫苗作为对照1，以仅含XCL1，IL-7的疫苗作为对照2。免疫试验包括如下步骤：
(1)将TC-1全肿瘤细胞癌症疫苗悬液按200μL的体积由尾静脉注射入C57/BL6n小鼠体内，每只小鼠接种细胞量为1×107，对照组小鼠注射等体积PBS。连续接种3次，每隔7天接种1次。
(2)距第一次接种疫苗第21天，对每只小鼠接种TC-1肿瘤细胞。每只小鼠肿瘤细胞接种量为1×106，接种方式为皮下注射。随后观测肿瘤生长情况(图4)。结果表明，给予实施例2疫苗的动物肿瘤体积显著降低，与对照存在显著性差异(p<0.05)。并且，实施例2的疫苗与对照1和对照2相比，对动物肿瘤体积降低的水平也存在显著性差异(p<0.05)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京奇糖科技有限公司
<120> 核酸片段及其在制备肿瘤疫苗中的应用
<130> MP21026511
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5918
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60
ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120
gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180
gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240
gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300
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gtgggagagt tcgaggcctt gcgcttaagg agccccttcg cctcgtgctt gagttgaggc 420
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ctgcaagaga actgaacaga cacagccctc aagaggatac ccctatgacg tcccagacta 1620
cgcagctact aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac gtggaggaga accctggacc 1680
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gacctcagac cagagacatg gagtcatagg ctctggaaag accctgacca tcactgtcaa 1920
agagtttcta gatgctggcc agtacacctg ccacaaagga ggcgagactc tgagccactc 1980
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caaaaacaag actttcctga agtgtgaagc accaaattac tccggacggt tcacgtgctc 2100
atggctggtg caaagaaaca tggacttgaa gttcaacatc aagagcagta gcagttcccc 2160
tgactctcgg gcagtgacat gtggaatggc gtctctgtct gcagagaagg tcacactgga 2220
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cgaggagacc ctgcccattg aactggcgtt ggaagcacgg cagcagaata aatatgagaa 2340
ctacagcacc agcttcttca tcagggacat catcaaacca gacccgccca agaacttgca 2400
gatgaagcct ttgaagaact cacaggtgga ggtcagctgg gagtaccctg actcctggag 2460
cactccccat tcctacttct ccctcaagtt ctttgttcga atccagcgca agaaagaaaa 2520
gatgaaggag acagaggagg ggtgtaacca gaaaggtgcg ttcctcgtag agaagacatc 2580
taccgaagtc caatgcaaag gcgggaatgt ctgcgtgcaa gctcaggatc gctattacaa 2640
ttcctcgtgc agcaagtggg catgtgttcc ctgcagggtc cgatccgtac caggagtagg 2700
agtaccagca gtaggaatgg tcagcgttcc aacagcctca ccctcggcat ccagcagctc 2760
ctctcagtgc cggtccagca tgtgtcaatc acgctacctc ctctttttgg ccacccttgc 2820
cctcctaaac cacctcagtt tggccagggt cattccagtc tctggacctg ccaggtgtct 2880
tagccagtcc cgaaacctgc tgaagaccac agatgacatg gtgaagacgg ccagagaaaa 2940
actgaaacat tattcctgca ctgctgaaga catcgatcat gaagacatca cacgggacca 3000
aaccagcaca ttgaagacct gtttaccact ggaactacac aagaacgaga gttgcctggc 3060
tactagagag acttcttcca caacaagagg gagctgcctg cccccacaga agacgtcttt 3120
gatgatgacc ctgtgccttg gtagcatcta tgaggacttg aagatgtacc agacagagtt 3180
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catgctggtg gccatcgatg agctgatgca gtctctgaat cataatggcg agactctgcg 3300
ccagaaacct cctgtgggag aagcagaccc ttacagagtg aaaatgaagc tctgcatcct 3360
gcttcacgcc ttcagcaccc gcgtcgtgac catcaacagg gtgatgggct atctgagctc 3420
cgcctagtaa agtttaaaca cgcgtggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga 3480
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ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc 3600
ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc 3660
tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag 3720
aagtagtgag gaggcttttt tggaggccgc caccatgaga cttctcctcc tgactttcct 3780
gggagtctgc tgcctcaccc catgggttgt ggaaggtgtg gggactgaag tcctagaaga 3840
gagtagctgt gtgaacttac aaacccagcg gctgccagtt caaaaaatca agacctatat 3900
catctgggag ggggccatga gagctgtaat ttttgtcacc aaacgaggac taaaaatttg 3960
tgctgatcca gaagccaaat gggtgaaagc agcgatcaag actgtggatg gcagggccag 4020
taccagaaag aacatggctg aaactgttcc cacaggagcc cagaggtcca ccagcacagc 4080
gataaccctg actggggatt acaaggatga cgacgataag gctactaact tcagcctgct 4140
gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg ttccatgttt cttttagata 4200
tatctttgga attcctccac tgatccttgt tctgctgcct gtcacatcat ctgagtgcca 4260
cattaaagac aaagaaggta aagcatatga gagtgtactg atgatcagca tcgatgaatt 4320
ggacaaaatg acaggaactg atagtaattg cccgaataat gaaccaaact tttttagaaa 4380
acatgtatgt gatgatacaa aggaagctgc ttttctaaat cgtgctgctc gcaagttgaa 4440
gcaatttctt aaaatgaata tcagtgaaga attcaatgtc cacttactaa cagtatcaca 4500
aggcacacaa acactggtga actgcacaag taaggaagaa aaaaacgtaa aggaacagaa 4560
aaagaatgat gcatgtttcc taaagagact actgagagaa ataaaaactt gttggaataa 4620
aattttgaag ggcagtatat agtaagctag ctcgagtcta gaggatccct cccccccccc 4680
taacgttact ggccgaagcc gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt 4740
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gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt 4860
cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct 4920
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ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt 5040
ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa 5100
ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta 5160
gtcgaggtta aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa 5220
aacacgataa taccatgacc atggcctcct ccgaggacgt catcaaggag ttcatgcgct 5280
tcaaggtgcg catggagggc tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg 5340
agggccgccc ctacgagggc acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc 5400
tgcccttcgc ctgggacatc ctgtcccctc agttccagta cggctccaag gcctacgtga 5460
agcaccccgc cgacatcccc gactacttga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg 5520
agcgcgtgat gaacttcgag gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc 5580
aggacggcga gttcatctac aaggtgaagc tgcgcggcac caacttcccc tccgacggcc 5640
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acgccgaggt caagaccacc tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca 5820
agaccgacat caagctggac atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt 5880
acgagcgcgc cgagggccgc cactccaccg gcgcctaa 5918
<210> 2
<211> 11764
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120
tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180
ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240
agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300
agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360
ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420
cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660
cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720
caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780
aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840
aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900
caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960
gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020
cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080
ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140
aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200
tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260
aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320
gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380
cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440
gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500
ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560
actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620
gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680
aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740
ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800
tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860
actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920
cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980
cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccgaa ttcacaaatg 2040
gcagtattca tccacaattt taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa 2100
agaatagtag acataatagc aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca 2160
aaaattcaaa attttcgggt ttattacagg gacagcagag atccagtttg gactagtcgt 2220
gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg 2280
ggggaggggt cggcaattga accggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa 2340
gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg 2400
cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggtaagtg 2460
ccgtgtgtgg ttcccgcggg cctggcctct ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa 2520
ttacttccac gcccctggct gcagtacgtg attcttgatc ccgagcttcg ggttggaagt 2580
gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag 2640
gcctggcctg ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc 2700
gctgctttcg ataagtctct agccatttaa aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt 2760
ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc caagatctgc acactggtat ttcggttttt 2820
ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc 2880
ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc aagctggccg gcctgctctg 2940
gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg 3000
gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc ctgctgcagg gagctcaaaa 3060
tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc 3120
tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac 3180
ctcgattagt tctcgagctt ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga ggggttttat 3240
gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg 3300
atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt gagtttggat cttggttcat tctcaagcct 3360
cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt cgtgaagcgg ccgcgccacc 3420
atggctcaga tgatgactct gagcctcctt agcctggtcc tggctctctg catcccctgg 3480
acccaaggca gtgatggagg gggtcaggac tgctgcctta agtacagcca gaagaaaatt 3540
ccctacagta ttgtccgagg ctataggaag caagaaccaa gtttaggctg tcccatcccg 3600
gcaatcctgt tctcaccccg gaagcactct aagcctgagc tatgtgcaaa ccctgaggaa 3660
ggctgggtgc agaacctgat gcgccgcctg gaccagcctc cagccccagg gaaacaaagc 3720
cccggctgca ggaagaaccg gggaacctct aagtctggaa agaaaggaaa gggctccaag 3780
ggctgcaaga gaactgaaca gacacagccc tcaagaggat acccctatga cgtcccagac 3840
tacgcagcta ctaacttcag cctgctgaag caggctggag acgtggagga gaaccctgga 3900
cctatgtgtc ctcagaagct aaccatctcc tggtttgcca tcgttttgct ggtgtctcca 3960
ctcatggcca tgtgggagct ggagaaagac gtttatgttg tagaggtgga ctggactccc 4020
gatgcccctg gagaaacagt gaacctcacc tgtgacacgc ctgaagaaga tgacatcacc 4080
tggacctcag accagagaca tggagtcata ggctctggaa agaccctgac catcactgtc 4140
aaagagtttc tagatgctgg ccagtacacc tgccacaaag gaggcgagac tctgagccac 4200
tcacatctgc tgctccacaa gaaggaaaat ggaatttggt ccactgaaat tttaaaaaat 4260
ttcaaaaaca agactttcct gaagtgtgaa gcaccaaatt actccggacg gttcacgtgc 4320
tcatggctgg tgcaaagaaa catggacttg aagttcaaca tcaagagcag tagcagttcc 4380
cctgactctc gggcagtgac atgtggaatg gcgtctctgt ctgcagagaa ggtcacactg 4440
gaccaaaggg actatgagaa gtattcagtg tcctgccagg aggatgtcac ctgcccaact 4500
gccgaggaga ccctgcccat tgaactggcg ttggaagcac ggcagcagaa taaatatgag 4560
aactacagca ccagcttctt catcagggac atcatcaaac cagacccgcc caagaacttg 4620
cagatgaagc ctttgaagaa ctcacaggtg gaggtcagct gggagtaccc tgactcctgg 4680
agcactcccc attcctactt ctccctcaag ttctttgttc gaatccagcg caagaaagaa 4740
aagatgaagg agacagagga ggggtgtaac cagaaaggtg cgttcctcgt agagaagaca 4800
tctaccgaag tccaatgcaa aggcgggaat gtctgcgtgc aagctcagga tcgctattac 4860
aattcctcgt gcagcaagtg ggcatgtgtt ccctgcaggg tccgatccgt accaggagta 4920
ggagtaccag cagtaggaat ggtcagcgtt ccaacagcct caccctcggc atccagcagc 4980
tcctctcagt gccggtccag catgtgtcaa tcacgctacc tcctcttttt ggccaccctt 5040
gccctcctaa accacctcag tttggccagg gtcattccag tctctggacc tgccaggtgt 5100
cttagccagt cccgaaacct gctgaagacc acagatgaca tggtgaagac ggccagagaa 5160
aaactgaaac attattcctg cactgctgaa gacatcgatc atgaagacat cacacgggac 5220
caaaccagca cattgaagac ctgtttacca ctggaactac acaagaacga gagttgcctg 5280
gctactagag agacttcttc cacaacaaga gggagctgcc tgcccccaca gaagacgtct 5340
ttgatgatga ccctgtgcct tggtagcatc tatgaggact tgaagatgta ccagacagag 5400
ttccaggcca tcaacgcagc acttcagaat cacaaccatc agcagatcat tctagacaag 5460
ggcatgctgg tggccatcga tgagctgatg cagtctctga atcataatgg cgagactctg 5520
cgccagaaac ctcctgtggg agaagcagac ccttacagag tgaaaatgaa gctctgcatc 5580
ctgcttcacg ccttcagcac ccgcgtcgtg accatcaaca gggtgatggg ctatctgagc 5640
tccgcctagt aaagtttaaa cacgcgtggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca 5700
gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct 5760
ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc 5820
ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg 5880
gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc 5940
agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc gccaccatga gacttctcct cctgactttc 6000
ctgggagtct gctgcctcac cccatgggtt gtggaaggtg tggggactga agtcctagaa 6060
gagagtagct gtgtgaactt acaaacccag cggctgccag ttcaaaaaat caagacctat 6120
atcatctggg agggggccat gagagctgta atttttgtca ccaaacgagg actaaaaatt 6180
tgtgctgatc cagaagccaa atgggtgaaa gcagcgatca agactgtgga tggcagggcc 6240
agtaccagaa agaacatggc tgaaactgtt cccacaggag cccagaggtc caccagcaca 6300
gcgataaccc tgactgggga ttacaaggat gacgacgata aggctactaa cttcagcctg 6360
ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac cctggaccta tgttccatgt ttcttttaga 6420
tatatctttg gaattcctcc actgatcctt gttctgctgc ctgtcacatc atctgagtgc 6480
cacattaaag acaaagaagg taaagcatat gagagtgtac tgatgatcag catcgatgaa 6540
ttggacaaaa tgacaggaac tgatagtaat tgcccgaata atgaaccaaa cttttttaga 6600
aaacatgtat gtgatgatac aaaggaagct gcttttctaa atcgtgctgc tcgcaagttg 6660
aagcaatttc ttaaaatgaa tatcagtgaa gaattcaatg tccacttact aacagtatca 6720
caaggcacac aaacactggt gaactgcaca agtaaggaag aaaaaaacgt aaaggaacag 6780
aaaaagaatg atgcatgttt cctaaagaga ctactgagag aaataaaaac ttgttggaat 6840
aaaattttga agggcagtat atagtaagct agctcgagtc tagaggatcc ctcccccccc 6900
cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta 6960
ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc 7020
ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat 7080
gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc 7140
ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt 7200
gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt 7260
gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag 7320
aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt 7380
tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga 7440
aaaacacgat aataccatga ccatggcctc ctccgaggac gtcatcaagg agttcatgcg 7500
cttcaaggtg cgcatggagg gctccgtgaa cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg 7560
cgagggccgc ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg aaggtgacca agggcggccc 7620
cctgcccttc gcctgggaca tcctgtcccc tcagttccag tacggctcca aggcctacgt 7680
gaagcacccc gccgacatcc ccgactactt gaagctgtcc ttccccgagg gcttcaagtg 7740
ggagcgcgtg atgaacttcg aggacggcgg cgtggtgacc gtgacccagg actcctccct 7800
gcaggacggc gagttcatct acaaggtgaa gctgcgcggc accaacttcc cctccgacgg 7860
ccccgtaatg cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc accgagcgga tgtaccccga 7920
ggacggcgcc ctgaagggcg agatcaagat gaggctgaag ctgaaggacg gcggccacta 7980
cgacgccgag gtcaagacca cctacatggc caagaagccc gtgcagctgc ccggcgccta 8040
caagaccgac atcaagctgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca 8100
gtacgagcgc gccgagggcc gccactccac cggcgcctaa atcgatagat cctaatcaac 8160
ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 8220
cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 8280
tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 8340
ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 8400
gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 8460
cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca 8520
ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg 8580
ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag 8640
cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc 8700
gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcctgagatc ctttaagacc 8760
aatgacttac aaggcagctg tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga 8820
agggctaatt cactcccaac gaagacaaga tctgcttttt gcttgtactg ggtctctctg 8880
gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 8940
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 9000
taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtagtagttc 9060
atgtcatctt attattcagt atttataact tgcaaagaaa tgaatatcag agagtgagag 9120
gcccgggtta attaaggaaa gggctagatc attcttgaag acgaaagggc ctcgtgatac 9180
gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt 9240
ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 9300
atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 9360
tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 9420
tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 9480
gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 9540
aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 9600
gtgttgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 9660
ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 9720
gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 9780
gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 9840
atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 9900
ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 9960
cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 10020
cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 10080
gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 10140
cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 10200
cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt 10260
taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 10320
ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 10380
aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 10440
caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 10500
taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag 10560
gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 10620
cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 10680
taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 10740
agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 10800
ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 10860
gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 10920
acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 10980
acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 11040
tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg 11100
ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 11160
agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagcaagc 11220
tcatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct 11280
attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctccccgt 11340
ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt 11400
agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg 11460
gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgacatgatt acgaatttca 11520
caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat 11580
cttatcatgt ctggatcaac tggataactc aagctaacca aaatcatccc aaacttccca 11640
ccccataccc tattaccact gccaattacc tgtggtttca tttactctaa acctgtgatt 11700
cctctgaatt attttcattt taaagaaatt gtatttgtta aatatgtact acaaacttag 11760
tagt 11764

Claims (9)

1.核酸片段，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.重组载体，其特征在于，包括权利要求1所述的核酸片段和骨架载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述骨架载体上还包括EF1apromotor、IRES、WPRE、3’LTR、3’LTR(ΔU)、HIV-1 Ψ、RRE和cPPT/CTS元件。
4.根据权利要求2或3所述的重组载体，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.慢病毒，其特征在于，由权利要求2~4任一项所述重组载体转染细胞获得。
6.宿主细胞，其由权利要求5所述的慢病毒转染细胞获得。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为TC-1细胞。
8.肿瘤疫苗，其特征在于，由权利要求6或7所述的宿主细胞制得。
9.权利要求8所述肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，将所述宿主细胞以丝裂霉素孵育后，经胰蛋白酶消化获得所述肿瘤疫苗。
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