CN111718938B

CN111718938B - 一种植物绿色组织特异表达的高温诱导型启动子及应用

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Publication number: CN111718938B
Application number: CN202010710765.XA
Authority: CN
Inventors: 王秀云; 李铮; 刘冰; 周泓; 夏宜平
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-07-22
Filing date: 2020-07-22
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2040-07-22
Also published as: CN111718938A

Abstract

本发明公开了一种植物绿色组织特异表达的高温诱导型启动子及应用。所述高温诱导型启动子命名为pRCA1，序列如SEQ ID No.1所示。本申请启动子pRCA1兼具高温诱导型和植物绿色组织特异表达特点，通过构建pRCA1::目的基因的表达载体，再将表达载体通过转基因导入目标植物中，目的基因能够在高温条件下目标植物的绿色组织中表达，达到高温逆境下增加目的基因在叶片等部位表达量的目的。在全球气候变暖的趋势下，对于植物抗逆基因工程具有重要的应用前景。

Description

一种植物绿色组织特异表达的高温诱导型启动子及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及一种植物绿色组织特异表达的高温诱导型启动子及应用。

背景技术

植物启动子是一段能与RNA聚合酶及其转录因子特异结合、决定基因转录起始的DNA序列。启动子是基因转录的调控中心，不仅拥有CAAT-box、TATA-box等基本作用元件，还存在某些响应逆境胁迫的顺式作用元件，能够受到环境、外源处理等因素影响来调控基因在不同条件下转录。植物启动子按其转录方式可以分为：组成型、诱导型和组织特异性启动子。组成型启动子能在不同类型的细胞及细胞发育的不同阶段，持续高效地驱动基因转录，并且转录活性相对恒定，典型的是烟草花叶病毒(cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子,被广泛应用于双子叶植物转基因工程。组成型启动子能高效地启动外源基因表达，并且这种超表达没有时间与空间的限制，在植物生长发育的任何阶段以及任何组织中外源基因的表达量都很高。但是，这种外源基因的组成型表达往往会造成资源的非必要浪费，同时大量异源蛋白的积累也会打破植物原有的代谢平衡，阻碍植物的正常生长，所以使用组成型启动子的基因工程往往多表现为植株矮小等性状，为了改善这个问题，组织特异性启动子与诱导型启动子的开发利用成为基因工程研究的一个热点。

组织特异性启动子能够使目的基因在特定器官或组织中表达，而在其他器官和组织中不表达或者表达量很低，该类启动子一般存在一些与组织特异性相关的特异调控元件。目前植物组织特异性启动子应用较多的是根特异启动子和种子特异启动子，绿色组织特异启动子研究非常少。根特异性启动子可以驱动一些与根部生产发育与水分及矿物质运输相关的基因在植物的根部特异表达；种子特异性启动子可以驱动一些与油脂合成以及一些调控作物产量相关的基因在种子中表达。逆境胁迫如干旱、高温、低温、损伤等非生物胁迫和病虫害等生物胁迫严重影响植物的生长发育及产量，甚至死亡。诱导型启动子能够接受逆境条件下的诱导信号，特异启动目的基因表达，在植物体内产生大量的目的蛋白，从而做出调节反应，抵抗外界环境胁迫。在抗逆基因工程中，选择响应逆境胁迫的诱导型启动子构建植物表达载体，用以驱动目的基因在特定逆境条件下高效表达，是解决植物逆境胁迫问题的一个重要策略，对于研究植物抗逆能力调控具有重要意义。

光合作用是植物生命活动的重要组成部分，是产量形成的基础。受恶劣气候的影响，全球多地区夏季气温逐步上升，持续时间长，高温已经成为影响植物正常生长的主要因素之一。而光合作用是植物对高温最为敏感的生理反应之一，在其他高温诱导的伤害症状出现之前，光合作用已经受到高温的抑制。植物进行光合作用的主要场所是绿色组织，在高温及其他逆境条件下，植物绿色组织的光合作用极易受到逆境胁迫而下降，生长量从而降低。

发明内容

本申请的目的是为解决组成型启动子在植物非必要条件下超表达带来的能量消耗、植株矮小等缺陷，提供了一个兼具诱导型和组织特异性的启动子，该启动子能在高温条件下、植物绿色组织中驱动目标基因大量表达，可应用于植物抗逆基因工程。

一种植物绿色组织特异表达的高温诱导型启动子，命名为pRCA1，序列如SEQ IDNo.1所示。

本发明又提供了所述高温诱导型启动子的应用，所述应用为：在高温环境中使目的基因在植物绿色组织中稳定表达。在该应用下，本身植物是种植在高温环境中，利用pRCA1启动子可以使导入的基因在高温环境下在植物绿色组织中特异启动并稳定表达。

本发明又提供了所述高温诱导型启动子的应用，所述应用为：利用高温条件诱导目的基因在植物绿色组织中瞬时表达。在该应用下，本身植物种植的环境温度为较低的温度，但是可以通过提供一段时间的高温条件，特异性诱导导入的基因进行瞬时表达。

经实验验证，pRCA1启动子在37℃条件下比25℃条件下会有更高效的启动表达能力。

高温诱导表达的植物可以是海南杜鹃、拟南芥或烟草，当然也可以是其他植物。

本发明又提供了包含所述高温诱导型启动子的植物表达载体。优选的，载体的骨架为pCAMBIA 3301或pGreenⅡ0800-LUC质粒。

本发明还提供了一种高温诱导表达转入基因的转基因植物构建方法，包括以下步骤：

(1)构建具有所述高温诱导型启动子的植物表达载体；

(2)将待高温诱导表达的基因插入到步骤(1)植物表达载体中由所述高温诱导型启动子启动表达；

(3)将步骤(2)构建好的植物表达载体转化农杆菌；

(4)用步骤(3)转化后的农杆菌侵染植物，获得高温诱导表达转入基因的转基因植物。

优选的，所述植物表达载体的骨架为pCAMBIA 3301或pGreenⅡ0800-LUC质粒。

本申请启动子pRCA1兼具高温诱导型和植物绿色组织特异表达特点，通过构建pRCA1::目的基因的表达载体，再将表达载体通过转基因导入目标植物中，目的基因能够在高温条件下目标植物的绿色组织中表达，达到高温逆境下增加目的基因在叶片等部位表达量的目的。在全球气候变暖的趋势下，对于植物抗逆基因工程具有重要的应用前景。

附图说明

图1为RCA1在海南杜鹃不同组织中的表达量。

图2为将pRCA1构建于载体pCAMBIA3301中的示意图。

图3为将pRCA1构建于载体pGreenⅡ0800-LUC中的示意图。

图4为转基因拟南芥和野生型拟南芥GUS染色结果。

图5为高温诱导LUC荧光成像结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1：实时荧光定量PCR分析RCA1基因的表达特性

1、利用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取待测样本(海南杜鹃三年生扦插苗37℃高温处理3h后的的嫩叶、成熟叶、茎、花瓣、雌蕊、雄蕊)各样品RNA，琼脂糖电泳检测完整性，Nanodrop测定浓度。

2、取1μg RNA用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time)试剂盒(TaKaRa公司)反转录生成cDNA，稀释后作为定量PCR模板。利用SYBR染料法进行荧光定量PCR，所用仪器为Roche LightCycler 480Ⅱ，以18S rRNA作为内参，根据2^-△△CT法分析mRNA表达量。

检测pRCA1的正向引物为：5’-TGCTGGTTCAAGAGCAGGAG-3’，反向引物为：5’-GTTGAGCTGCTTTGCCATAGA-3’。

检测海南杜鹃18S内参基因的正向引物为：5’-CGCATTCCCCACTGTATTAGAC-3’，反向引物为：5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG-3’。

实时定量PCR反应体系为：SYBR混合液10μL、cDNA模板5μL、上下引物各0.8μL、ddH2O补足20μL。

实时定量PCR反应程序：95℃2min；95℃5s，58℃30s，40个循环；95℃5s，65℃5s，95℃5s绘制溶解曲线。

结果显示(图1)，RCA1主要在成熟叶、嫩叶、茎、萼片等绿色组织中表达，在成熟叶片中表达量最高，雄蕊中表达量最低，说明RCA1的表达具有绿色组织特异性。

实施例2：pRCA1启动GUS基因的稳定表达

一、pRCA1的克隆

1、采用CTAB法提取海南杜鹃基因组DNA。

2、以海南杜鹃基因组DNA为模板，利用高保真酶PrimeSTAR Max，采用引物pRCA1-F1：5’-ACTCGGCACAGCTACTACC-3’和pRCA1-R1：5’-CAAAGGTGGAAACGGCAG-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物。

反应体系为25μL：上下引物各1μL、Max mix 12.5μL、基因组DNA 1μL、ddH2O 9.5μL；PCR反应程序为98℃预变性60s；之后98℃变性10s，57℃退火15s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。

3、将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa公司)回收与目的启动子片段大小相近的条带，将回收的片段连接至克隆载体pEASY-Blunt(购于北京全式金生物公司)并转化大肠杆菌DH5α。经筛选和测序比对后，将测序正确的菌液用质粒DNA提取试剂盒提取质粒，-20℃保存。测序结果表明，PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。SEQ ID NO.1自5’末端第1位至1624位所示的DNA分子即为pRCA1的核苷酸序列。

二、pRCA1启动GUS基因的表达

1、重组质粒pRCA1：：GUS的构建。

重组质粒pRCA1：：GUS的结构示意图见图2。

(1)利用无缝克隆方法构建植物表达载体。对植物表达载体pCAMBIA3301用NcoⅠ和HindⅢ进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收线性化的载体片段。

(2)根据pCAMBIA3301双酶切后缺口处的序列设计包含载体序列的特异性引物pRCA1-F2：

5’-ACCTGCAGGCATGCAAGCTTTCACTCAAAGTTGAGGGTTCC-3’(下划线为限制性内切酶NcoⅠ的识别位点)

和pRCA1-R2：

5-’TTACCCTCAGATCTACCATGGAGAAATCAAGGGTCTGTTTGGGA-3’(下划线为限制性内切酶HindⅢ的识别位点)，

利用高保真酶PrimeSTAR Max扩增获得两端带载体序列的启动子。

(3)将步骤(1)回收的载体骨架和步骤(2)回收的DNA片段进行连接，构建重组质粒pRCA1：：GUS，转化大肠杆菌DH5α，用设计的引物pRCA1-F3：ACCTGCAGGCATGCAAGCTT和pRCA1-R3：TTACCCTCAGATCTACCATGG经PCR检测后，用质粒DNA提取试剂盒(TaKaRa公司)提取测序正确的重组质粒，并用冻融法转入农杆菌菌株GV3101(购于上海唯地生物技术公司)，检测后保存甘油菌于-80℃。

对重组质粒pRCA1：：GUS进行结构描述如下：将pCAMBIA3301载体的限制性内切酶NcoI和HindIII识别序列间的序列替换为SEQ ID NO.1自5’末端第1位至1624位所示的DNA分子。重组质粒pRCA1：：GUS中，由pRCA1启动GUS基因的表达。

2、pRCA1的表达分析

(1)根据农杆菌介导的花序浸染法将重组质粒prRCA1：：GUS转化拟南芥，将收获的T1代拟南芥种子消毒后播种在含有20mg/L草铵膦的MS培养基中，筛选抗性苗，移栽到土中。

(2)提取T1代抗性苗的DNA，用引物对

pRCA1-F4：5’-ACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3’

和pRCA1-R4：5’-CACGGGTTGGGGTTTCTACA-3’

进行PCR鉴定转基因植株。收获T2代种子，筛选分离比为3:1的单拷贝插入株系。收获T3代种子，筛选拟南芥转基因纯合株系。

(3)将获得的T3代转基因拟南芥的种子播种在MS培养基上，待到长出第一片真叶后，分别在37℃和25℃处理3h，对拟南芥幼苗进行GUS染色。将拟南芥T3代植株大苗分别25℃和37℃处理3h，取其叶、根、茎、花、果荚进行GUS染色。GUS染色：将不同组织放入GUS染液(北京华越洋生物科技有限公司)中常温染色12h，用75％的酒精完全脱色后，在体式显微镜下拍照观察。未转化的野生型拟南芥(Col-0)作为对照。

转入重组质粒pRCA1：：GUS的拟南芥幼苗、根、成熟叶、花、果荚的GUS染色结果见图4。野生型拟南芥的各组织GUS染色结果见图4中的野生型。

结果表明，转prRCA1：：GUS拟南芥中叶、茎、花萼、果荚等绿色组织中均检测到蓝色，而根和花瓣中没有变蓝，说明该启动子具有启动活性，并且特异在绿色组织中表达，具备组织特异性。37℃处理3h的叶、茎、花萼、果荚的蓝色更深，说明高温能够显著加强其表达，表现出热诱导特性。

实施例3：pRCA1启动LUC基因的瞬时表达

1、重组质粒pRCA1：：LUC的构建。

重组质粒pRCA1：：LUC的结构示意图见图3。

(1)利用无缝克隆方法构建植物表达载体。对植物表达载体pGreenⅡ0800-LUC用Pst I进行单酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收线性化的载体片段。

(2)根据pGreenⅡ0800-LUC单酶切后缺口处的序列设计包含载体序列的特异性引物pRCA1-F5：

5’-GCTTGATATCGAATTCCTGCAGCTACTACCAAGCACCTCCGC-3’

和pRCA1-R5：

5’-GGATCCCCCGGGCTGCAGAGAAATCAAGGGTCTGTTTGGGA-3’(下划线为限制性内切酶PstI的识别位点)，

利用高保真酶PrimeSTAR Max扩增获得两端带载体序列的启动子。

(3)将步骤(1)回收的载体骨架和步骤(2)回收的DNA片段进行连接，构建重组质粒pRCA1：：LUC，转化大肠杆菌DH5α，用设计的引物pRCA1-F6：GGCGATTAAGTTGGGTAACGC和pRCA1-R6：GGTTCCATCTTCCAGCGGATA经PCR检测后，用质粒DNA提取试剂盒(TaKaRa公司)提取测序正确的重组质粒，并用冻融法转入农杆菌菌株GV3101(pSoup-p19)(购于上海唯地生物技术公司)，检测后保存甘油菌于-80℃。

对重组质粒pRCA1：：LUC进行结构描述如下：在pGreenⅡ0800-LUC载体的限制性内切酶PstⅠ识别序列处插入SEQ ID NO.1自5’末端第1位至1624位所示的DNA分子。重组质粒pRCA1：：LUC中，由pRCA1启动Luciferase基因的表达。

2、pRCA1启动LUC基因的表达

(1)将含有prRCA1：：LUC重组质粒的农杆菌菌液扩增培养，摇至OD600约为1.0，4000rpm离心10min，收集菌体，用含45mg/L乙酰丁香酮的1/2MS悬浮菌体。

(2)选取2-3周长势较好的本氏烟草，用注射器将悬浮液从叶片下表皮注射到烟草叶片内。

(3)注射后的烟草放置于人工气候室中培养，2d后分别进行25℃和37℃处理3h，然后在叶片反面涂抹1mM的萤火虫荧光素(购于Promega公司)，置于暗处5min，剪下叶片在暗箱内进行荧光检测，所用的荧光检测仪器为Photek单光子计数影像系统。

转入重组质粒pRCA1：：LUC的荧光成像结果如图5。

结果显示，25℃对照条件下的烟草叶片出现了较弱的荧光，而37℃热胁迫处理后的烟草叶片荧光强度显著高于对照。结果说明pRCA1能够驱动LUC基因表达，具有启动子活性，可用于进一步研究调控功能；而且pRCA1能够强烈响应高温胁迫，具有典型的热诱导特性。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种植物绿色组织特异表达的高温诱导型启动子及应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1624

<212> DNA

<213> 海南杜鹃(Rhododendron hainanense Merr.)

<400> 1

actcggcaca gctactacca agcacctccg cttagcaata tctcccaata atccgaccgg 60

ggattcaggg ttgaatggag tttggagaag aacaatctgg aaataggaag ccaacaagaa 120

tggaaaactt ctagtagtac ccaggagggg actgggagga ccacttctca atcttgccgg 180

atagtgacca caagcataca ccaactatgc acaaacaaga taatgaagat gagatctcat 240

gaggttgtga cacgtggccc taagagtggg tcataggaaa tttgtttggg aaaatgacgc 300

acatgacgtg ttttgataat taatacccac caaagacatt ttcagtatta acaaatgttc 360

tctgcatatt cttggcgggt attaattatc aaaatatatt actgaccgtc attttcccga 420

ttcgtttcac tggttttcat gagatctcat gaggtttgtg acaaattact tgtctaattg 480

ggacattaat gttttattct taaaatcaag agatttttgg ctcaacgact tcagggttcc 540

acttaagtga tcaggagttt aacgtaataa ataggtatat tacttttcaa cgaaacgata 600

tttatttttt cctttttgac atatactatc acttaatctt tcatccttta attgcttctc 660

taaacagaga atccatcatt tcttttaaag aaaaatggct tcagattggg tacttaatta 720

actatcaggt gttcaaatta aaatgagttt ggagttcata gtttcattga atagccacca 780

gtggatccca gagttttttt ttttgaacct acgagtttag aggagtaaac cccattttgc 840

ttttattctt tcactcaaag ttgagggttc ctaatttcat aattaacaaa taattaatga 900

gtttattgta tgagtatgcc ttgaaagttt ctcttttcga aaataaaatt taaaaaaaaa 960

aaaaaaaaac acagagaaga ctgtagattt tccctttcaa aattttgtga aaatcaaatt 1020

acctaatttt gtatggagga aagagaagct taaaccctaa cctcaaaccc acccagttcc 1080

cagaagcctc cattttgttc tcattttgta caatcaatcc cccttccaca ctgttggcac 1140

ctttttgtta tgttagtggt gatctcaggt agtcacatga tctttcaaag ttttcatacg 1200

cactcgattt aaatcatcgc attgcgctca cgctctcaat ctactctact gaatgtttag 1260

tagtacatct atgatgtgtt tcaaagacgc tttcatccac gctttcgcgt tctcattccc 1320

ccatgcactc gcacccccgc ttgcacactc aaatgacgtg gccacataat aaatccaaaa 1380

tcccccattt ctgtggccgt tgggagtttc gtaacccaat ccacaggttt cccccctatt 1440

caattttcca cactccaaca acccacactc aatgacactg accttcgcct atatatagat 1500

cccattcccc atactatttc cccaactaaa ctcttgattc agtttcaatt ttccacttcg 1560

tcagctttct ttctttcaga tattagatcc caaacagacc cttgatttct tcaataccca 1620

aatg 1624

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgctggttca agagcaggag 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttgagctgc tttgccatag a 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcattcccc actgtattag ac 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtaacaagg tttccgtagg tg 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actcggcaca gctactacc 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caaaggtgga aacggcag 18

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acctgcaggc atgcaagctt tcactcaaag ttgagggttc c 41

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttaccctcag atctaccatg gagaaatcaa gggtctgttt ggga 44

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acctgcaggc atgcaagctt 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttaccctcag atctaccatg g 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acctgcaggc atgcaagctt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cacgggttgg ggtttctaca 20

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcttgatatc gaattcctgc agctactacc aagcacctcc gc 42

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggatcccccg ggctgcagag aaatcaaggg tctgtttggg a 41

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggcgattaag ttgggtaacg c 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggttccatct tccagcggat a 21

Claims

1.一种植物绿色组织特异表达的高温诱导型启动子，其特征在于，命名为pRCA1，序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述高温诱导型启动子的应用，其特征在于，所述应用为：在高温环境中使目的基因在植物绿色组织中稳定表达。

3.如权利要求1所述高温诱导型启动子的应用，其特征在于，所述应用为：利用高温条件诱导目的基因在植物绿色组织中瞬时表达。

4.包含如权利要求1所述高温诱导型启动子的植物表达载体。

5.如权利要求4所述的植物表达载体，其特征在于，载体的骨架为pCAMBIA3301或pGreenⅡ0800-LUC质粒。

6.一种高温诱导表达转入基因的转基因植物构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建具有如权利要求1所述高温诱导型启动子的植物表达载体；

(3)将步骤(2)构建好的植物表达载体转化农杆菌；

7.如权利要求6所述的转基因植物构建方法，其特征在于，所述植物表达载体的骨架为pCAMBIA 3301或pGreenⅡ 0800-LUC质粒。