CN111712573B - 针对骨硬化蛋白的适体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明涉及针对骨硬化蛋白的适体及其用途，特别是其用于治疗骨硬化蛋白相关疾病例如骨质疏松症中的用途。

Description

针对骨硬化蛋白的适体及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明涉及针对骨硬化蛋白(sclerostin)的适体及其用途，特别是其用于治疗骨硬化蛋白相关疾病例如骨质疏松症中的用途。

发明背景

骨质疏松症是一种骨量减少和骨强度降低的疾病，导致骨折风险增加(Hamersma,Gardner et al.,2003)。用于治疗骨质疏松症的各种药物主要是抗再吸收剂，其抑制骨再吸收以防止进一步的骨损失(Russell,Watts et al.,2008；Pennypacker,Duong et al.,2011)。甲状旁腺激素(PTH)是唯一可用于刺激骨形成以逆转已建立的骨质疏松症的合成代谢剂(Compston 2007；Greenspan,Bone et al.,2007)。然而，使用PTH的长期治疗有导致骨肉瘤的风险(Whitfield 2001；Orwoll,Scheele et al.,2003)。因此，迫切需要促进骨形成而没有副作用的替代性合成代谢药物。

骨硬化蛋白是开发骨质疏松症药物的有希望的靶标(Rey and Ellies,2010)。据报道抗人骨硬化蛋白的人源化单克隆抗体在临床试验中促进骨形成和增加骨量，具有良好的耐受性。然而，治疗性抗体有几个主要问题，包括高免疫原性(Padhi,Jang et al.,2011；Padhi,Allison et al.,2014)，生产成本高(Baker,2015；Bradbury and Pluckthun 2015；Groff,Brown et al.,2015)，不稳定，需要连续冷链运输和储存(Jayasena,1999)。因此，对于骨合成代谢疗法而言，期望无免疫原性、容易生产、低成本和高稳定性的替代性抗骨硬化蛋白剂。

适体是通过构象互补而与其靶标结合的短单链寡核苷酸(Ellington andSzostak,1990；Tuerk and Gold,1990)。与治疗性抗体相比，适体具有相似的亲和力和特异性，但是具有一些重要的优点。对于免疫原性，适体不会被免疫系统识别为外来的，并且因为低分子量而不刺激负面的免疫应答(Keefe,Pai et al.,2010)。就生产和成本而言，适体可以在各种选择条件下在体外鉴定，并且可以通过化学方法容易地合成，因此生产成本更低，风险更低(Banerjee,2010)。就稳定性而言，适体具有无限的保存期限，因为它们温度不敏感，并且在运输过程中没有任何冷却的特殊要求，因此不需要连续的冷链(Jayasena,1999)。Pegaptanib，一种针对血管内皮生长因子(VEGF)的适体，已成功用于临床治疗年龄相关性黄斑变性(Jellinek,Green et al.,1994；Ruckman,Green et al.,1998；Ng andAdamis 2006；Que-Gewirth and Sullenger2007)。

因此，期望开发针对骨硬化蛋白的适体来代替单克隆抗体用于治疗骨质疏松症。

发明简述

在一方面，本发明提供一种针对骨硬化蛋白的适体，所述适体

i)包含与SEQ ID NO:1-17中的任一具有至少大约90％相同性、至少大约91％相同性、至少大约92％相同性、至少大约93％相同性、至少大约94％相同性或至少大约95％相同性的核苷酸序列，或者，

ii)包含SEQ ID NO:1-17中的任一中的至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个或更多个连续的核苷酸，

优选地，所述适体包含SEQ ID NO:1-17或19-24中任一的序列，其中所述适体特异性结合骨硬化蛋白。

在一些实施方案中，所述适体对骨硬化蛋白具有小于100nM，优选小于50nM，优选小于40nM，优选小于30nM，优选小于20nM，优选小于10nM或更小的K_d。

在一些实施方案中，所述适体能够抑制骨硬化蛋白的生物学活性。在一些实施方案中，所述适体能在基于细胞的Wnt信号测试法中阻断骨硬化蛋白的拮抗作用。在一些实施方案中，所述适体以小于100μg/ml，优选小于50μg/ml，优选小于40μg/ml，优选小于30μg/ml，优选小于20μg/ml，优选小于10μg/ml或更小的EC50值抑制骨硬化蛋白的生物学活性，例如抑制骨硬化蛋白对Wnt信号通路的拮抗作用。

在一些实施方案中，所述适体还包含一或多种赋予所述适体增强的核酸酶抗性和/或增强所述适体的体内半衰期的修饰。在一些实施方案中，所述修饰包括3’反向脱氧胸苷(3’idT)修饰。在一些实施方案中，所述修饰包括用经修饰的核苷酸取代一或多个天然存在的核苷酸，所述经修饰的核苷酸选自2’-氟、2’-甲氧乙基、2’-甲氧基或2’丙烯氧基修饰的核苷酸，优选2’-甲氧基修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述修饰包括核苷酸间的修饰，例如核苷酸间的硫代磷酸酯键修饰。在一些实施方案中，所述修饰包括PEG修饰。在一些实施方案中，所述适体包含2’-甲氧基(2’-OMe)修饰、3’反向脱氧胸苷(3’idT)修饰和/或PEG修饰。

在另一方面，本发明提供一种治疗骨硬化蛋白相关疾病的方法，该方法包括给有需要的对象施用治疗有效量的本发明的针对骨硬化蛋白的适体，所述对象例如是人。

在一些实施方案中，所述骨硬化蛋白相关疾病选自骨质疏松症、骨质减少、骨软化、成骨不全(OI)、缺血性骨坏死、类风湿关节炎、骨折、骨关节炎和骨髓瘤。

在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含至少一种本发明的针对骨硬化蛋白的适体，和药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一方面，本发明提供本发明所述的针对骨硬化蛋白的适体或本发明所述的药物组合物在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗骨硬化蛋白相关疾病。

在一些实施方案中，所述骨硬化蛋白相关疾病选自骨质疏松症、骨质减少、骨软化、成骨不全(OI)、缺血性骨坏死、类风湿关节炎、骨折、骨关节炎和骨髓瘤。

附图简述

图1示出通过SELEX富集骨硬化蛋白高亲和力适体。(A)富集的ssDNA和未选择的文库对硬骨素的结合亲和力。(B)富集的ssDNA文库和未选择的文库与对照蛋白质的结合亲和力。

图2示出适体候选物的特异性表征。相比于与肝细胞和PBMC的结合，适体候选物显示对人骨硬化蛋白的高选择性。

图3示出从具有40nt随机区域的ssDNA文库鉴定的适体候选物对重组人骨硬化蛋白的亲和力。通过非线性曲线拟合分析计算适体候选物和抗体对骨硬化蛋白的解离常数(Kd)。各适体候选物对骨硬化蛋白的Kd值分别是：aptscl 6为4.2nM，aptscl 9为3.4nM，aptscl 15为45.6nM，aptscl 46为43.1nM，aptscl 56为43.1nM和aptscl 132为42.2nM。抗骨硬化蛋白抗体的Kd值为3.55nM。

图4示出从具有25nt随机区域的ssDNA文库鉴定的适配体候选物与重组人骨硬化蛋白的结合亲和力。通过非线性曲线拟合分析计算各候选物的解离常数(Kd)。各适体候选物和抗体的Kd值分别为：aptscl 32为0.18nM，aptscl 29为0.28nM，aptscl 22为0.76nM，aptscl 16为0.22，aptscl 3为0.04nM，aptscl 2为0.006nM，aptscl 1为0.02nM。抗骨硬化蛋白抗体的Kd值为3.55nM。

图5示出使用TOP-Wnt诱导的萤光素酶报道基因测定评估适体候选物和抗体的抑制能力。(A)与抗体比较，用适体候选物处理的MC3T3-E1细胞中Wnt信号传导介导的荧光素酶活性。Aptscl 56、aptscl 6、aptscl 3和抗骨硬化蛋白抗体能有效抑制骨硬化蛋白对Wnt信号传导的拮抗作用，并释放Wnt诱导的荧光素酶活性。当aptscl 56和aptscl 6的浓度分别达到25μg/ml和47.4μg/ml时，响应达到稳定。而当用抗体处理时，在该实验中浓度增加到20mg/ml时，响应仍未稳定。(B)aptscl 56的抑制能力分析，aptscl 56的EC50为19.7μg/ml。(C)aptscl 6的抑制能力分析，aptscl 6的EC50 36.8μg/ml。(D)aptscl 3的抑制能力分析，aptscl 3的EC50 18.2μg/ml。

图6示出截短的aptscl3与骨硬化蛋白结合的表征。(A)aptscl3-1、-2、-3、-4和-5对骨硬化蛋白保持高亲和力，而aptscl3-6显示对硬化蛋白的低结合能力并且不能拟合亲和力分析曲线；(B)截短的aptscl3-5仍保持高结合亲和力，保留了对骨硬化蛋白拮抗细胞中Wnt信号传导途径的高抑制效力(EC50＝28.4μg/ml)。

图7示出与未修饰的aptscl56相比，修饰的aptscl56的血清稳定性评估。所有适体均用10％和100％小鼠血清处理0至72小时。在10％小鼠血清中孵育48小时后，几乎所有未修饰的aptscl56降解。2’-OMe和3’-idT修饰的aptscl56可在10％小鼠血清中保持48小时。在100％血清中，未修饰的aptscl56在8小时后迅速完全降解；在72小时，仍然保留少量的修饰的适体。

图8示出与未修饰的aptscl3-5相比，修饰的aptscl3-5的血清稳定性评估。所有适体均用10％和100％小鼠血清处理0至72小时。在10％小鼠血清中孵育24小时后，Aptscl3-5降解。2’-OMe和3’idT修饰的aptscl3-5可在10％小鼠血清中保持48小时。在100％血清中，未修饰的aptscl3-5在8小时后迅速完全降解，而修饰的aptscl3-5在72小时后仍保持完整性。

图9示出化学修饰的aptscl56和aptscl3-5的亲和力和抑制效力。在化学修饰后，aptscl56和aptscl3-5都保持对骨硬化蛋白的高亲和力和体外抑制效力。

图10示出在6只大鼠中单次皮下注射Aptscl56的药代动力学：通过软件DAS拟合的药代动力学曲线(左)、实际药代动力学曲线(右)。

图11示出在6只大鼠中单次皮下注射PEG40K-aptscl56的药代动力学：通过软件DAS拟合的药代动力学曲线(左)、实际药代动力学曲线(右)。

图12示出分别在大鼠中单次皮下注射Aptscl56(蓝色)和PEG40K-aptscl56(橙色)的药代动力学。

图13示出PEG40K-aptscl56/aptscl3在卵巢切除术诱导的骨质疏松大鼠骨代谢效力的评估。(a)显示该研究的实验设计的示意图。(b)代表性3D微架构图像和每组股骨远端骨小梁的micro-CT参数。(c)代表性3D微架构图像和每组胫骨近端骨小梁的micro-CT参数。(d)代表性3D微架构图像和每组中第五椎骨的微CT参数。注：BMD：骨密度；Tb.BV/TV：骨小梁相对骨量；Tb.vBMD：小梁体积矿物质密度；Tb.Th：小梁厚度；Tb.N：小梁数；Tb.Sp：小梁间距；Tb.conn.D：小梁连接密度；Tb.SMI：小梁结构模型指数；MAR：矿物沉积率；BFR/BS：骨形成率；Ob.S/BS：成骨细胞表面；和Ob.N/B.Pm：成骨细胞数；PINP：原胶原I完整的N末端；OPG：骨保护作用。SHAM-BS：SHAM基线；OVX-BS：治疗前的OVS基线；SHAM+Veh：用载体治疗的SHAM大鼠；OVX+Veh：用载体治疗的OVX大鼠；OVX+aptscl56：用PEG40K-aptscl56处理的OVX大鼠；OVX+RS：用PEG40K-随机序列处理的OVX大鼠。随机序列：5'-ATGCAAGCACATTGTGATCGCTTCAAATGTCTTCCGTCCG-3'。数据表示为平均值±标准差与OVX-BS。每组n＝10。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.005；****P<0.0001。

发明详述

除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook et al.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”；Lewin,“Genes VIII”；及Roitt et al.,“Immunology”(第8版)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。

定义

如本文所用，术语“核苷酸”是指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或其修饰的形式及其类似物。核苷酸包括种类，其包括嘌呤(例如，腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤和它们的衍生物和类似物)以及嘧啶(例如，胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶和它们的衍生物和类似物)。

在本文中，互换地使用“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”来指核苷酸的聚合物，并包括DNA、RNA、DNA/RNA杂交体和这些种类的核酸、寡核苷酸和多核苷酸的修饰，其中包括在所述核苷酸单位的任何位置上附加各种实体或部分。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”包括双或单链分子。核酸、寡核苷酸和多核苷酸是比术语适体更宽的术语，因此术语核酸、寡核苷酸和多核苷酸包括适体但不限于适体。

如本文所用，“适体”指具有期望的对靶分子的作用的非天然存在的核酸。期望的作用包括但不限于与所述靶结合、催化改变所述靶、以修饰或改变所述靶或所述靶的功能活性的方式与靶反应、共价地连接所述靶和促进所述靶与其他分子间的反应。在一些实施方案中，所述作用是针对靶分子(例如骨硬化蛋白)的特异性结合亲和力，这样的靶分子是三维化学结构而不是多核苷酸，其通过不依赖于Watson/Crick碱基配对或三重螺旋形成的机制来结合所述适体，其中所述适体不是具有被所述靶分子结合的已知生理功能的核酸。在本上下文中，适体针对其靶(例如骨硬化蛋白)的“特异性结合”是指所述适体通常以比其结合至混合物或样品中其他的非靶组分高得多的亲和力来结合至其靶。

序列“相同性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性。(参见，例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,NewJersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；and Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,MStockton Press,New York,1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”是技术人员公知的(Carrillo,H.&Lipman,D.,SIAM J AppliedMath 48:1073(1988))。许多算法可用于确定序列相同性百分比。适合于确定序列相同性百分比的算法的一个实例是在基本局部比对搜索工具(以下为“BLAST”)中使用的算法，见例如Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410,1990和Altschul等人，Nucleic Acids Res.,15:3389-3402,1997。进行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(以下为“NCBI”)公开地可获得的。在使用从NCBI可获得的软件(如针对核酸序列的BLASTN)来确定序列相同性所使用的默认参数在McGinnis等人Nucleic Acids Res.,32:W20-W25,2004中有所描述。

针对骨硬化蛋白的适体

本发明人基于蛋白质-SELEX技术，采用骨硬化蛋白作为靶蛋白正向筛选，并采用不相关蛋白进行负筛选，最终选择出以高亲和力特异性地结合骨硬化蛋白的适体。本文所述骨硬化蛋白优选是人骨硬化蛋白，例如，氨基酸序列示于SEQ ID NO:18的骨硬化蛋白。

示例性人骨硬化蛋白氨基酸序列：

QGWQAFKNDATEIIPELGEYPEPPPELENNKTMNRAENGGRPPHHPFETKDVSEYSCRELHFTRYVTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELKDFGTEAARPQKGRKPRPRARSAKANQAELENAY(SEQ ID NO:18)。

因此，在一方面，本发明提供针对骨硬化蛋白的适体，所述适体包含与SEQ ID NO:1-17中的任一具有至少大约90％相同性、至少大约91％相同性、至少大约92％相同性、至少大约93％相同性、至少大约94％相同性、至少大约95％相同性、至少大约96％相同性、至少大约97％相同性、至少大约98％相同性或至少大约99％相同性的核苷酸序列，或者，所述适体包含SEQ ID NO:1-17中的任一中的至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个或更多个连续的核苷酸。在一些实施方案中，所述适体特异性结合骨硬化蛋白。在一些优选实施方案中，所述适体包含SEQ ID NO:1-17和19-24中的任一的核苷酸序列，更优选地，所述适体包含SEQ ID NO:1、3、10或19-23之一的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本发明的所述适体对骨硬化蛋白具有小于100nM，优选小于50nM，优选小于40nM，优选小于30nM，优选小于20nM，优选小于10nM或更小的K_d(解离常数)。所述K_d例如通过酶联寡核苷酸测定法(ELONA)测定。

在一些实施方案中，本发明的所述适体抑制骨硬化蛋白的生物学活性。“抑制”是指与不存在所述适体相比，骨硬化蛋白的生物学活性在所述适体存在下被降低，例如降低至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，甚至至少约90％。

如本文所用，术语“生物学活性”表示对一或多种细胞或细胞外的过程的作用，其可以影响生理或病生理过程。骨硬化蛋白的生物学活性包括但不限于拮抗Wnt信号通路。

在一些实施方案中，本发明的所述适体能够抑制骨硬化蛋白对Wnt信号通路的拮抗作用。例如，本发明的所述适体能在基于细胞的Wnt信号测试法中阻断骨硬化蛋白的拮抗作用。

在一些实施方案中，本发明的所述适体以小于100μg/ml，优选小于50μg/ml，优选小于40μg/ml，优选小于30μg/ml，优选小于20μg/ml，优选小于10μg/ml或更小的EC50值抑制骨硬化蛋白的生物学活性，例如抑制骨硬化蛋白对Wnt信号通路的拮抗作用。在一些实施方案中，所述EC50值在体外通过成骨细胞中的TOP-Wnt诱导萤光素酶报告基因测定法测定。

在一些实施方案中，本发明的所述适体还可以包含一或多种修饰。例如，所述修饰是赋予所述适体增强的核酸酶抗性和/或增强所述适体的体内半衰期的修饰。

所述修饰包括例如3’和5’的修饰，如3’和5’加帽。在一些实施方案中，所述适体在3’末端用反向脱氧胸苷加帽，即3’反向脱氧胸苷(3’idT)修饰。

所述修饰还可以包括用经修饰的核苷酸取代一或多个天然存在的核苷酸。例如，所述经修饰的核苷酸包括但不限于2’-氟、2’-甲氧乙基、2’-甲氧基和/或2’丙烯氧基修饰的核苷酸(即核糖的2’位置羟基被氟、甲氧乙基、甲氧基或丙烯氧基等取代)。所述经修饰的核苷酸还可以包括C-5修饰的嘧啶。术语“C-5修饰的嘧啶”是指C-5位上有修饰的嘧啶。C-5修饰的嘧啶能够增强寡核苷酸的核酸酶抗性，且是本领域已知的，例如可以参见国际专利申请WO 2011/130195及其引用的文献。在一些优选实施方式中，所述修饰是2’-甲氧基(2’-OMe)修饰。在一些实施方式中，在适体的5’和/或3’端的一或多个，例如4个核苷酸进行所述修饰，例如2’-甲氧基(2’-OMe)修饰。

所述修饰还包括核苷酸间的修饰，例如具有不带电荷的键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸胺酯、氨基甲酸酯等)的核苷酸间修饰和具有带电荷的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的核苷酸间修饰，有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的核苷酸间修饰，含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的核苷酸间修饰，含有烷化剂的核苷酸间修饰和有修饰的键(例如阿尔法异头核酸等)的核苷酸间修饰。

所述修饰还可以包括聚乙二醇化修饰(PEG修饰)。通过与PEG缀合可以延长适体的半衰期例如体内半衰期。在一些实施方式中，所述PEG的分子量为大约1kDa至大约100kDa，例如大约10kDa至大约80kDa，大约20kDa至大约60kDa，大约30kDa至大约50kDa，大约40kDa。在一些实施方案中，所述PEG可以缀合至适体的5’端。在一些实施方案中，所述PEG可以缀合至适体的3’端。

在一些实施方案中，所述适体可以包含上述多种修饰的组合。例如，所述适体可以包含2’-甲氧基(2’-OMe)修饰、3’反向脱氧胸苷(3’idT)修饰和/或PEG修饰。优选地，所述PEG分子量为大约40kDa。

疾病治疗

在另一方面，本发明提供通过本发明的针对骨硬化蛋白的适体治疗疾病的方法，该方法包括给有需要的对象施用治疗有效量的本发明的针对骨硬化蛋白的适体。

通过本发明的针对骨硬化蛋白的适体治疗的疾病例如是骨硬化蛋白相关疾病，例如骨硬化蛋白介导的疾病。

如本文所使用，“骨硬化蛋白相关疾病”包括其中骨矿质密度(BMD)相对于健康对象不正常和/或病理上低的病症。由低BMD和/或骨易碎性表征的疾病包括但不限于：原发性和继发性骨质疏松症、骨质减少、骨软化、成骨不全(OI)、缺血性坏死(骨坏死)、骨折和植入物愈合(牙种植体和髋植入物)、由于其它病症的骨丧失(例如，与HIV感染、癌症和关节炎相关)。其它“骨硬化蛋白相关疾病”包括但不限于：类风湿性关节炎、骨关节炎、关节炎，以及溶骨性病变。

如本文所使用，“骨硬化蛋白相关疾病”包括骨硬化蛋白相关癌症，例如骨髓瘤(例如，伴随溶骨性病变的多发性骨髓瘤)、乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤、肝细胞癌、上皮癌、食道癌、脑癌、肺癌、前列腺癌或胰癌，及其任何转移瘤。

“骨硬化蛋白相关疾病”还可包括至少由骨硬化蛋白在肾脏和在心血管中表达而引起的肾病及心血管疾病。所述病症包括但不限于诸如以下的肾病：肾小球疾病(例如，急性和慢性肾小球性肾炎，急进性肾小球性肾炎，肾病综合征，局灶增生性肾小球肾炎，与诸如系统性红斑狼疮、古德帕斯彻氏综合征、多发性骨髓瘤、糖尿病、多囊肾病、瘤形成、镰刀形红细胞病、以及慢性炎症等全身疾病相关的肾小球损害)、肾小管疾病(例如，急性肾小管坏死和急性肾衰竭、多囊肾病、髓质海绵肾、髓质囊性病、肾原性糖尿病，以及肾小管性酸中毒)、小管间质性疾病(例如，肾盂肾炎、药和毒素诱导的小管间质性肾炎、高钙性肾病，以及低钾血症性肾病)、急性和急进性肾衰竭、慢性肾衰竭、肾结石、痛风、血管疾病(例如，高血压和肾硬化、微血管病性溶血性贫血、动脉粥样硬化栓塞肾病、扩散皮层的坏死以及肾梗塞)，或肿瘤(例如，肾细胞癌和肾胚细胞瘤)。

所述疾病还包括但不限于诸如以下的心血管疾病：缺血性心脏病(例如，心绞痛、心肌梗死，以及慢性缺血性心脏病)、高血压心脏病、肺心病、心脏瓣膜病(例如，风湿热和风湿性心脏病、心内膜炎、二尖瓣脱垂以及主动脉瓣狭窄)、先天性心脏病(例如，瓣和血管堵塞性损害、房或室中隔缺损、以及久存性动脉导管)，或心肌病(例如，心肌炎、充血型心肌病，以及肥厚型心肌病)。

所述对象可以是任何动物(驯养的、家畜或野生的)，其包括但不限于猫、狗、马、猪和牛，并优选人类对象。如本文中所用，术语患者、个体和对象可以互换地使用。

对象可以是男性或女性。优选地，人类对象处于骨折的风险中，更优选地人类对象处于骨质疏松的风险中或患有骨质疏松症。人类对象优选为女性，并更优选为处于闭经后骨质疏松风险或患有闭经后骨质疏松的女性。预期本发明的方法可对骨质疏松症任何阶段的对象有益。

如本文所用，“治疗”患有疾病的对象表示所述对象的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。

如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。如本文所用，“疗效”表示由对象的治疗所导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。

按照多种因素选择利用所述针对骨硬化蛋白的适体的剂量方案，所述因素包括例如，所述患者的类型、种类、年龄、体重、性别和医疗病症，；所要治疗的病症的严重性；施用途径；所述患者的肾与肝的功能；和所使用的特定的针对骨硬化蛋白的适体或其盐。普通熟练的医生可以容易地确定并指定预防、对抗或抑制所述病症进展所需要的组合物的有效量。

通常，所述针对骨硬化蛋白的适体的剂量方案为每天大约1μg/kg体重至约100mg/kg体重。

示例性的治疗方案需要每天给药一次、每两天给药一次、每周给药一次、每周给药两次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、每3-6个月一次、或起始给药间隔略短(如每周一次至每三周一次)后期给药间隔加长(如每月一次至每3-6个月一次)。给药频率和间隔可以由本领域技术人员根据适体的药代动力学参数确定。

药物组合物

在另一方面，本发明还提供药物组合物，其包括至少一种本发明的针对骨硬化蛋白的适体，和药学上可接受的载体或赋形剂。所述药物组合物例如用于治疗骨硬化蛋白相关的疾病。

本文所描述的适体可以任何药学上可接受的剂量形式使用，包括但不限于以可注射剂量形式、液体分散体、凝胶、喷雾、软膏、霜剂、冻干制剂、干粉、片剂、胶囊、控制释放制剂、速熔制剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉动释放制剂、混合的立即释放和控制释放制剂等。具体地，本文所描述的适体可以配制为：(a)通过选自口腔、肺、静脉内、动脉内、鞘内、内关节、直肠、眼、结肠、胃肠外、脑池内、阴道内、腹腔内、局部、颊、鼻和局部施用中的任一项来施用；(b)选自液体分散体、凝胶、喷雾、软膏、霜剂、片剂、香囊和胶囊中任一项的剂量形式；(c)选自冻干制剂、干粉、速熔制剂、控制释放制剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉动释放制剂和混合的立即释放和控制释放制剂中任一项的剂量形式；或(d)它们的任意组合。

用于肠胃外、皮内或皮下的施用的溶液或悬浮液可以包含一或多种的以下组分：(1)无菌稀释剂，例如用于注射的水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；(2)抗菌剂，例如苯甲醇或对羟苯甲酯；(3)抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸钠；(4)螯合试剂，例如乙二胺四乙酸；(5)缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和(5)用于调节张力的物质，例如氯化钠或葡萄糖。用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)可以调整pH。肠胃外的制剂可以封装在玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适于注射使用的药物组合物可以包括无菌的水性溶液(其中是水溶的)或分散体和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，所述组合物应该是无菌的并且其流动程度应该为易于注射。在制造和储存的条件下所述药物组合物应该是稳定的并应当被保护以防微生物如细菌和真菌的污染作用。如本文中所用的术语“稳定的”意为保持在适合于给患者施用的状态或条件。

所述载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其适合的混合物。例如通过使用如卵磷脂的包衣，通过在分散体的情况下维持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂可以保持适当的流动性。通过各种抗菌和抗真菌的试剂，例如，对羟基苯甲酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸，硫柳汞等可以实现防止微生物的作用。在许多情况下，优选在所述组合物中包括等渗试剂，例如糖、多元醇(如甘露醇或山梨醇)和无机盐(如氯化钠)。通过在所述组合物中包括延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶可以带来可注射组合物的延长的吸收。

可以通过在适当的溶剂中用以上所列举的成分的一种或组合(如需要的)以需要的量并入活性剂(例如，针对骨硬化蛋白的适体)接着过滤灭菌来制备无菌的可注射溶液。通常，通过向含有基本分散介质和任何其他所需成分的无菌载体并入至少一种针对骨硬化蛋白的适体来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备的示例性方法包括真空干燥和冷冻干燥，这两者会获得所述针对骨硬化蛋白的适体的粉末以及来自之前其无菌过滤溶液的任何额外的所需的成分。

口服组合物通常包括惰性的稀释剂或可食用的载体。例如，可以将它们装入明胶胶囊或压成片剂。针对口服治疗施用的目的，所述针对骨硬化蛋白的适体可以并入赋形剂并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。可以包括药物相容的结合剂和/或佐剂材料作为所述组合物的一部分。

对于通过吸入的施用，以来自含有适合的推进物(例如气体(如二氧化碳)、雾化的液体或来自适合的装置的干粉末)的加压容器或分配器的气溶胶喷雾的形式来递送所述化合物。对于经粘膜或经皮的施用，在制剂中使用对要渗透的屏障是适当的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的，并包括例如，用于经粘膜施用的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂可以实现经粘膜的施用。对于经皮的施用，所述活性剂配制成如本领域所熟知的软膏、油膏、凝胶或霜剂。也可以栓剂(例如用常规的栓剂基质，如可可脂和其它甘油酯)或用于直肠递送的保留灌肠剂的形式来制备所述试剂。

在一个实施方案中，针对骨硬化蛋白的适体配制为用于局部施用。如本文所用，“局部施用”是指通过将(直接地或其他方式)包含所述针对骨硬化蛋白的适体的制剂与动物的全部或部分皮肤(表皮)接触来递送针对骨硬化蛋白的适体至所述动物。该术语包括了几种施用途径，包括但不限于局部施用和经皮施用。针对这些施用模式的普遍需求是有效递送至靶组织或层。一方面，使用局部施用作为渗透所述表皮和真皮的方式并最终实现针对骨硬化蛋白的适体的全身性递送。另一方面，使用局部施用作为选择性地递送针对骨硬化蛋白的适体至动物的表皮或真皮或其特定的层的方式。

对于局部施用，所述针对骨硬化蛋白的适体可以配制成药学上可接受的软膏剂、霜剂、洗剂、眼用软膏剂、滴眼剂、滴耳剂、浸渍敷料、和气雾剂、含药粉末、含药粘合剂、泡沫，并且可以含有适当的常规添加剂或赋形剂，包括，例如防腐剂或帮助药物渗透的溶剂和软膏剂、凝胶和霜剂中的软化剂。这种局部制剂也可以含有兼容的常规载体，例如用于乳液的乙醇或油醇。这样的载体可能构成所述制剂的大约1％至大约98％的重量，更通常地，这样的载体会构成所述制剂的高达大约80％的重量。针对适体的局部递送的具体制剂在现有技术中已有描述。

在一个实施方案中，用会防止从身体迅速除去的载体制备针对骨硬化蛋白的适体。例如，可以使用控制释放制剂，包括植入和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的、生物兼容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。这种制剂的制备方法对本领域技术人员会是显而易见的。

脂质体悬浮液(包括以被感染的细胞为靶的具有针对病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备。

此外，可以制备所述针对骨硬化蛋白的适体的悬浮液作为适当的油性注射悬浮液。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(如芝麻油)或合成脂肪酸酯(如油酸乙酯、甘油三酯)或脂质体。非脂的聚阳离子氨基酸聚合物也可以用于递送。任选地，所述悬浮液还可以包括适合的稳定剂或试剂以增加所述化合物的溶解度并允许用于制备高浓缩的溶液。

在某些情况下，以剂量单位来配制口服或胃肠外的组合物对便于施用和剂量均一可能是特别有利的。如本文中所用的剂量单位形式是指物理上离散的单位，适合作为用于要治疗的对象的单一剂量；每单位含有经计算能产生期望的治疗效果的预定量的针对骨硬化蛋白的适体以及所需的药物载体。本文所描述的针对骨硬化蛋白的适体的剂量单位形式的说明决定于并直接依赖于特定针对骨硬化蛋白的适体的唯一的特性和所要实现的特定的治疗效果和配制此类用于治疗个体的活性剂的技术的固有限制。

包含至少一种针对骨硬化蛋白的适体的药物组合物可以包括一或多种药物赋形剂。这样的赋形剂的实施例包括但不限于，结合剂、填充剂、润滑剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、防腐剂、缓冲剂、润湿剂、崩解剂、泡腾剂和其它赋形剂。这样的赋形剂在本领域中是已知的。示例性赋形剂包括：(1)结合剂，包括各种纤维素和交联聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素(如Avicel PH101和Avicel PH102)、硅化微晶纤维素(ProSolv SMCC^TM)、黄蓍胶和明胶；(2)填充剂，例如各种淀粉、乳糖，乳糖单水合物、无水乳糖；(3)崩解剂如藻酸、Primogel、玉米淀粉、轻度交联的聚乙烯基吡咯烷、马铃薯淀粉、玉米淀粉和修饰的淀粉、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、乙醇酸淀粉钠及它们的混合物；(4)润滑剂，包括作用于所要压缩的粉末的流动性的试剂，包括硬脂酸镁、胶状二氧化硅(如Aerosil 200、滑石)、硬脂酸、硬脂酸钙和硅胶；(5)助流剂，如胶状二氧化硅；(6)防腐剂，如山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸及其盐、其他对羟基苯甲酸的酯(如对羟基苯甲酸丁酯)、醇(如乙醇或苯甲醇)、酚类化合物(如苯酚)或季铵化合物(如氯化苯甲烃胺)；(7)稀释剂，如药学上可接受的惰性填料，如微晶纤维素、乳糖、磷酸氢钙、糖类和/或任何以上的混合物；稀释剂的实施例包括微晶纤维素，如AvicelPH101和AvicelPH102；乳糖如乳糖单水合物、无水乳糖和Pharmatose DCL21；磷酸氢钙如Emcompress甘露醇、淀粉、山梨醇、蔗糖和葡萄糖；(8)甜味剂，包括任何天然或人造的甜味剂，如蔗糖、糖精蔗糖、木糖醇、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜和安赛蜜；(9)调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯、橙调味剂、Magnasweet(商标MAFCO)、泡泡糖香料、水果香料等；和(10)泡腾剂，包括泡腾剂对，如有机酸和碳酸盐或重碳酸盐。

实施例

下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。

实施例1、通过SELEX富集和筛选针对骨硬化蛋白的高亲和力适体

ssDNA文库中的序列由两端18nt保守区域和一个中央随机区域组成。使用了两个不同长度随机序列的ssDNA文库。长ssDNA文库中的序列包含40nt随机区(5’-CGTACGGTCGACGCTAGC-(N)₄₀-CACGTGGAGCTCGGATCC-3’)，短ssDNA文库中的序列含有25nt随机区(5’-CGTACGGTCGACGCTAGC-(N)₂₅-CACGTGGAGCTCGGATCC-3’)。合成正向引物(FP：5’-CGTACGGTCGACGCTAGC-3’)和生物素化反向引物(Bio-RP：5’-生物素-GGATCCGAGCTCCACGTG-3’)用于在选择期间扩增ssDNA。所有寡核苷酸在合成后通过HPLC纯化。

进行蛋白SELEX方法以鉴定高亲和力适体(Ellington and Szostak,1990；Tuerkand Gold,1990)。100-30皮摩尔的His₆标记的骨硬化蛋白在4℃下1小时固定在NTA磁珠上(Murphy,Fuller et al.,2003)。1纳摩尔ssDNA文库在95℃变性5分钟并迅速冷却至4℃，随后与固定化的骨硬化蛋白在室温孵育0.5-1小时。用洗涤缓冲液除去未结合的序列。洗涤后，收集结合的DNA-蛋白质-NTA，用H₂O/吐温20重悬，并应用于PCR扩增。用未修饰的正向引物和生物素化的反向引物进行PCR扩增(步骤1：95℃初始变性1分钟；步骤2：95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，重复12个循环；和步骤3：72℃最后延伸5分钟)。通过生物素-链霉亲和素结合将PCR产物应用于链霉亲和素磁珠。通过用0.2M NaOH处理再生单链序列。针对固定在NTA磁珠上的其他His₆标记的不相关蛋白进行负选择。每种选择共进行20轮SELEX。来自最后一轮的DNA池进行高通量二代序列(NGS)。

图1示出第10轮和第20轮选择之后DNA池对骨硬化蛋白的亲和力增加，表明通过SELEX富集了高亲和力骨硬化蛋白适体。

实施例2、候选骨硬化蛋白适体的特异性鉴定

根据NGS结果，合成具有高出现频率的代表性适体进行特异性测定。这些适体候选物的详细序列列于表1中。

为了确定适体候选物对骨硬化蛋白的特异性，使用N-末端生物素化修饰合成代表性适体候选物和随机序列(RS)(阴性对照)。每种适体/RS使用1μM通过酶联寡核苷酸测定法(ELONA)测定对骨硬化蛋白的特异性。将160ng纯化的重组人骨硬化蛋白通过在100μl PBS中4℃温育过夜而包被96孔微量滴定板。然后将板用封闭缓冲液(PBS，0.1％吐温20和1％BSA)在室温封闭1小时，并用SELEX B&W缓冲液(PBS，1mM MgCl₂，0.1％吐温20和0.1％BSA)洗涤4次。适体候选物在95℃变性10分钟，在使用前在冰上快速冷却10分钟。每孔加入1μM生物素标记的适体，然后加入SELEX B&W缓冲液至100μl，室温孵育45min，连续温和摇动。结合后，将板用SELEX B&W缓冲液洗涤4次以除去非特异性和非常弱的结合，然后用PBST+0.1％BSA洗涤4次。向每个孔中加入100μl链霉亲和素-HRP/山羊抗人IgG Fc-HRP(1:10000稀释到PBST+0.1％BSA中)并孵育30/60分钟，并用PBST+0.1％BSA洗涤4次。向每个孔中加入50μlTMB并温育20分钟。加入50μl 2M H₂SO₄终止反应。用酶标仪测量450nm处的吸光度(Stoltenburg,Krafcikova et al.,2016)。为了确定适体候选物与肝细胞/PBMC的结合能力，表征步骤与ELONA类似。将300,000个细胞与每种适体候选物一起温育，通过离心进行洗涤和分离。

结果表明，从长和短ssDNA文库中鉴定的适体候选物在与肝细胞和PBMC的结合比较时显示对人骨硬化蛋白的高选择性(图2)。从长ssDNA文库鉴定的适体候选物aptscl 6、9、15、27、34、36、46、51、56、132和140，以及从短ssDNA文库鉴定的aptscl 1、2、3、5、8、12、16、22、29和32，显示出对骨硬化蛋白的高结合特异性，因此被选择用于以下亲和力表征。

实施例3、候选骨硬化蛋白适体的亲和力鉴定

进行酶联寡核苷酸测定(ELONA)以确定适体候选物与骨硬化蛋白的结合亲和力(Drolet,Moon-McDermott et al.,1996)。类似地，进行酶联免疫吸附测定(ELISA)以确定抗骨硬化蛋白抗体(Romosozumab，针对骨硬化蛋白的人源化治疗性抗体，购自CreativeBiolabs)对人骨硬化蛋白的结合亲和力(Engvall and Perlmann,1971)。将160ng纯化的重组人硬化蛋白通过在100μl PBS中4℃温育过夜而包被96孔微量滴定板。然后将板用封闭缓冲液(PBS，0.1％吐温20和1％BSA)在室温封闭1小时，并用SELEX B&W缓冲液(PBS，1mMMgCl₂，0.1％吐温20和0.1％BSA)洗涤4次。适体候选物在95℃变性10分钟，在使用前在冰上快速冷却10分钟。将适当浓度的生物素化的适体/抗体加入到每个孔中，然后加入SELEX B&W缓冲液至100μl中，并在室温下温育45分钟，连续温和摇动。结合后，将板用SELEX B&W缓冲液洗涤4次以除去非特异性和非常弱的结合，然后用PBST+0.1％BSA洗涤4次。向每个孔中加入100μl链霉亲和素-HRP/山羊抗人IgG Fc-HRP(1:10000稀释到PBST+0.1％BSA中)并孵育30/60分钟，并用PBST+0.1％BSA洗涤4次。向每个孔中加入50μl TMB并温育20分钟。加入50μl 2M H₂SO₄终止反应。用酶标仪测量450nm处的吸光度(Stoltenburg,Krafcikova et al.,2016)。用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)分析数据。使用非线性曲线拟合模型Hyperbl绘制结合曲线Hyperbl模型的方程是y＝P1*x/(P2+x)，P2是Kd值。

对于从含有40nt随机区的ssDNA文库鉴定的适体候选物，aptscl 6、9、15、46、56和132对骨硬化蛋白具有高亲和力，具有纳摩尔水平的解离常数(Kd)值(Kd值分别为4.2、3.4、45.6、43.1和42.2nM)(图3)。而aptscl 36、140、136和随机序列(RS)未能拟合。对于从含有25nt随机区的ssDNA文库中鉴定的适体候选物，aptscl 32、29、22、16、3、2和1对骨硬化蛋白的结合亲和力更高，Kd值分别为0.18、0.28、0.76、0.02、0.04、0.006和0.02nM(图4)。随机序列显示对骨硬化蛋白的低结合能力并无法拟合。相比之下，抗骨硬化蛋白抗体对骨硬化蛋白的Kd值是3.55nM。

实施例4、体外评估候选骨硬化蛋白适体对骨硬化蛋白活性的抑制能力

在成骨细胞MC3T3-E1细胞中使用TOP-Wnt诱导的萤光素酶报告基因测定法(vanBezooijen,Svensson et al.,2007；Shum,Chan et al.,2011)，研究适体候选物抑制骨硬化蛋白对Wnt信号传导的拮抗作用的能力。

将MC3T3-E1细胞接种于24孔板，在第2天使用FuGENE HD转染试剂(Promega)，转染相应的报告基因质粒(100ng)、Wnt3a质粒(800ng)和骨硬化蛋白质粒(800ng)。转染10小时后，将培养基更换为新鲜培养基，并用适体/抗体处理细胞。处理24小时后，每个孔的细胞用100μl被动裂解缓冲液裂解，并取20μl用于分析。根据制造商的方案(Promega)，通过SpectraMax i3x Multi-Mode Detection Platform(Molecular Device)自动制备萤光素酶测定试剂II和Stop&Glo试剂，并且相应地分析数据(Grentzmann,Ingram et al.,1998；McNabb,Reed et al.,2005)。

结果如图5所示，aptscl 56、aptscl 6、aptscl 3和抗骨硬化蛋白抗体可有效抑制骨硬化蛋白对Wnt信号传导的拮抗作用，并释放Wnt诱导的荧光素酶活性。对于骨硬化蛋白的抑制作用具有剂量依赖性，当aptscl 56、aptscl 6的浓度分别达到25μg/ml和47.4μg/ml时，响应稳定。当用抗体处理时，浓度增加到20mg/ml响应仍不稳定。此外，用非线性曲线拟合分析了aptscl 56、aptscl 6和aptscl 3的抑制能力。Aptscl 56、aptscl 6和aptscl 3的EC50分别为19.7μg/ml、36.8μg/ml和18.2μg/ml。

表1、骨硬化蛋白适体候选物的序列

实施例5、aptscl3的截短和表征

显示对硬化蛋白具有高亲和力和抑制效力的aptscl3被截短(表2)。使用与前述的研究中相同的方案进行结合亲和力和体外抑制效力检测。aptscl3-1、aptscl3-2，aptscl3-3、aptscl3-4和aptscl3-5保持对硬化蛋白的高结合亲和力，Kd值分别为0.86、0.52、0.2和0.22nM。aptscl3-6在该浓度范围内无法拟合结合曲线，表明对硬化蛋白的结合能力低(图6a)。此外，aptscl3-5保留了对硬化蛋白对Wnt信号传导的拮抗作用的高抑制效力(EC50＝28.4μg/ml(图6b))。

表2.适体候选物aptscl3的序列截短

实施例6、化学修饰的适体候选物的血清稳定性评估

本发明人已经选择出针对骨硬化蛋白的DNA适体，并最终开发两种截短的适体，称为aptscl56和aptscl3-5，其特异性地与骨硬化蛋白紧密结合，具有低纳摩尔范围内的解离常数。核酸适体的2'-O-甲基(2'-OMe)修饰先前已被用作选择后修饰，因为它们具有增强的核酸酶抗性和升高的双链体解链温度，如临床实验中所示(Fine,Martin et al.2005；Gupta,Hirota et al.2014)。反向dT的3'末端封端也是正在进行或已完成的临床试验中用于疾病治疗的适体的常用策略(Padilla,Sousa et al.1999；Ruckman,Green etal.1998)。因此，本实施例评估aptscl56和aptscl3-5的血清稳定性是否可以通过2'-OMe和3'-末端反向dT(3'-idT)修饰来改善。

实验设计：

在合成过程中引入修饰的核苷酸。在新鲜制备的小鼠血清中评估修饰的和未修饰的适体的血清代谢稳定性。将所有适体样品与10％和100％小鼠血清在37℃下分别孵育0、2、4、8、12、24、36、48和72小时。在指定的时间，将适体样品在干冰浴中快速冷冻，然后储存在-80℃直至收获所有样品用于评估。所有适体样品的稳定性表示为孵育后剩余的完整适体的条带密度，其可通过琼脂糖凝胶电泳确定。

DNA合成方案：

使用市售的5'-O-DMT-2'-脱氧核苷(ABz、CAc、GiBu和T)亚磷酰胺单体、5'-O-DMT-2'-O-甲基核苷(ABz、CAc、GiBu和T)亚磷酰胺单体和/或5'-O-DMT-2'-F-核苷(ABz、CAc、GiBu和T)亚磷酰胺单体在K&A H8标准DNA/RNA合成仪上以1μmole规模合成修饰的和未修饰的DNA序列(Beaucage和Caruthers 2001)。修饰的aptscl56序列为CGGGG TGTGG GTTCGTCGTT AGCTT GATTT GGCAG CTGCCC-idT，下划线核苷酸用2'-OMe修饰。aptscl3-5的修饰序列是GCTAG CTGTT GTACA TCGCC TTACG CACGT G-idT，下划线核苷酸是2'-OMe修饰的。

评估方案：

通过分子成像仪(Bio-Rad)测定所有适体样品的条带密度(Klussmann,Nolte etal.1996,Siller-Matula,Merhi et al.2012)。使用与前述研究中相同的方案进行结合亲和力和体外抑制效力测定。

结果：

对于aptscl56，未修饰的适体在10％血清中48小时后完全降解，并且在100％血清中仅保持8小时。2'-OMe和3'-idT修饰的aptscl56在10％小鼠血清中保持72小时，并在100％小鼠血清中12小时后才降解。在72小时，仍然保留少量修饰的适体(图7)。

对于aptscl3-5，未修饰的适体在10％小鼠血清中孵育后24小时降解。2'-OMe和3'-idT修饰的aptscl3-5可在10％小鼠血清中保持48小时。在100％血清中，未修饰的aptscl3-5在8小时后迅速和完全降解，而修饰的aptscl3-5在72小时后可保持完整性(图8)。

化学修饰的aptscl56和aptscl3-5显示出对骨硬化蛋白的高结合亲和力，Kd值分别为6.55和0.54nM。此外，化学修饰的aptscl56和aptscl3-5可有效解除骨硬化蛋白对细胞中Wnt信号的抑制作用，其效力分别为14和11μg/ml(图9)。

结论：

用2'-OMe和3'-idT修饰可以进一步促进将aptscl56和aptscl3-5开发成治疗性核酸酶抗性适体。

实施例7、PEG修饰的适体

本发明确定在大鼠皮下给药后，针对骨硬化蛋白的进行PEG修饰和不进行PEG修饰的适体(PEG40K-aptscl56和aptscl56)的血浆药代动力学。其中aptscl56序列为CGGGGTGTGG GTTCG TCGTT AGCTT GATTT GGCAG CTGCCC-idT，起始CGGG和末端GCCC各核苷酸用2'-OMe修饰。PEG40K-aptscl56在此基础上进一步在5'-末端连接PEG40K(分子量40000的PEG)。

实验设计：

适体aptscl56和PEG40K-aptscl56的药代动力学研究在6个月大的雌性原始Sprague-Dawley大鼠中进行，该大鼠随意喂食标准实验室饮食并在受控条件下饲养(12小时光周期，20℃)。通过单次皮下注射分别用6.1mg/kg aptscl56和25mg/kg PEG40K-aptscl56处理大鼠。将aptscl56和PEG40K-aptscl56分别以1.6mg/ml和6.2mg/ml的浓度溶解在盐水中(Judith M.Healy，Ryan M.Boomer等人，2004)。在不同时间点(aptscl56：5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h；PEG40K-aptscl56：30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、30h、36h、48h、54h、62h、70h、76h、84h、96h、107h)分别从各组的重复大鼠(n＝6)收集血样，分离血浆。在用蛋白酶K处理后，通过HPLC定量血浆中剩余的aptscl56和PEG40K-aptscl56。

评估方案：

样品制备：从每只大鼠通过眼眶静脉采集大约800μl血液，并收集到含有钠-肝素作为抗凝血剂的管中(1.8ml真空容器，BD Biosciences)，然后立即置于湿冰上(Healy,Lewis et al.2004,Perschbacher,Smestad et al.2015)。通过在收集后1小时内在4℃下以6000g离心10分钟来分离血浆，并在-80℃下储存直至分析(Healy,Lewis et al.2004,Siller-Matula,Merhi et al.2012,Gao,Shen et al.2016)。在分析之前，25μl消化缓冲液(60mM Tris-HCl，pH 8.0,100mM EDTA和0.5％SDS)和75μl蛋白酶溶液(在10mM Tris HCl中1mg/mL蛋白酶K，pH 7.5，20mM CaCl₂，10％甘油v/v)加入50μl血浆样品中。然后将样品在55℃下振荡培养过夜。温育后，将样品离心(14000rpm；4℃；15分钟)并取出100μl上清液并转移至HPLC注射小瓶(Siller-Matula，Merhi等人，2012)。

HPLC定量：HPLC系统配备有C4柱以定量在不同时间点收集的血浆样品中的PEG40K-aptscl56，而C18柱用于定量aptscl56。该方法均使用由A相(TEAA[pH 7.0])和B相(乙腈)制成的流动相洗脱梯度。当柱温箱温度设定在50℃时，流速均为1.0mL/min。测定注射体积为20uL。在含有不同浓度的aptscl56和PEG40K-aptscl56的钠-肝素的空白大鼠血浆中制备标准品(Gao，Shen等人，2016)。所有报告的aptscl56和PEG40K-aptscl56的浓度均基于aptscl56的质量。根据标准曲线计算血浆样品中的适体浓度。

药代动力学分析：绘制Aptscl56和PEG40K-aptscl56浓度对时间曲线，并通过软件DAS 3.0(BioGuider Co.，Shanghai，China)分析每只大鼠。将得到的药代动力学参数取平均值。根据适体消除一半最大血浆浓度所需的时间计算适体的半衰期(t1/2)(Grieken和Bruin 1994)。根据药代动力学曲线获得最大血浆浓度(C max)和最大血浆浓度时间(Tmax)。从药物施用开始计算曲线下面积(AUC)，并且当血浆中的浓度可忽略不计时结束(Rowland,Benet et al.1973,Toutain and Bousquet-Melou 2004,Siller-Matula,Merhiet al.2012)。随后，根据下式计算多剂量PEG40K-aptscl56的给药间隔：D＝1/1-e^-Ke·t(Ke：消除常数，Ke＝ln2/T1/2；t：给药间隔；D：给药比＝负荷剂量/维持剂量)(Birkett 1996,Jambhekar 2012)。

结果：

aptscl56的HPLC定量下限为10ul/mL，线性浓度范围为10μg/mL至360ug/mL。皮下给药后Sprague-Dawley大鼠中aptscl56适体的消除半衰期(Elim.T1/2)的平均值为1.8小时。C max的平均值为265.5μg/ml，T max为0.5小时(图10，表3)。

PEG40K-aptscl56的HPLC定量的下限为7.5μg/mL，线性浓度范围为7.5μg/mL至240μg/mL。皮下给药后Sprague-Dawley大鼠中PEG40K-aptscl56的消除半衰期(Elim.T1/2)的平均值为66.9小时。C max的平均值为152.8μg/ml，T max为72小时(图11，表4)。

表3.皮下施用的aptscl56的药代动力学参数

表4.皮下施用的PEG40K-aptscl56的药代动力学参数

讨论：

本实施例研究了在S.D.大鼠皮下施用的PEG40K-aptscl56和aptscl56的药代动力学特征。与aptscl56的1.8小时消除半衰期相比，PEG40K-aptscl56的半衰期显著延长了65.1小时。这表明PEG对延长aptscl56的体内停留时间具有显著作用。然而，血浆中PEG40K-aptscl56的浓度整体低于aptscl56的浓度(图12)。许多研究表明PEG化的大小增加导致血液吸收的系统性降低(Caliceti 2003,Kaminskas,Kota et al.2009)。聚乙二醇化可能阻碍aptscl56对血液的吸收。

在PEG40K-aptscl56的药代动力学研究中，吸收需要60小时，但消除需要35小时。然而，消除大多数适体-PEG所需的时间总是比吸收长得多(Christopher E.Tucker 1999,Siller-Matula,Merhi et al.2012)。一些研究表明PEG化的大小增强通过被动增强的渗透和保留机制促进了渗透组织的积累(Caliceti 2003)。将PEG40K-aptscl56累积到可渗透组织中可能是药代动力学曲线消除阶段快速下降的原因之一。进一步研究PEG40K-aptscl56的这种药代动力学现象将作出清楚的解释。

多剂适体的给药间隔可以基于其消除半衰期和负荷剂量与维持剂量的剂量比来定义(Birkett 1996,Jambhekar 2012)。PEG40K-aptscl56的消除半衰期为66.9小时。如果剂量比为2，则给药间隔等于消除半衰期(T1/2)。如果剂量比小于2，则给药间隔应长于T1/2。在PEG40K-aptscl56的药效学研究中，建议的剂量比为1(加载剂量等于维持剂量)。因此，PEG40K-aptscl56给药间隔应长于66.9h。

实施例8、评估聚乙二醇化适体候选物在通过卵巢切除术诱导的骨质疏松大鼠中的骨合成代谢功效

PEG40K缀合的适体在骨质疏松大鼠中的治疗方案。为了评估化学修饰的aptscl56/aptscl3与PEG40K组合在卵巢切除诱导的骨质疏松大鼠中的骨合成代谢功效，将70只3月龄雌性Sprague Dawley大鼠进行切除卵巢(OVX，n＝50)或假手术(SHAM，n＝20)，并且不处理2个月。在治疗前将10只OVX大鼠和10只SHAM操作的大鼠安乐死作为基线(OVX-BS和SHAM-BS)。其余的SHAM或OVX大鼠每周一次皮下注射载体(Veh)、PEG40K-aptscl56/aptscl3(25mg/kg)或PEG40K-随机序列(RS，25mg/kg)，进行6周(n＝每组10个)。在第一次注射后6周对所有动物实施安乐死。在安乐死之前，所有动物分别在第13天和第3天腹膜内注射钙黄绿素(20mg/kg)。安乐死后，收集右股骨，通过显微CT检查骨微结构。收集左股骨用于未脱钙切片和进一步的组织形态学分析。所有实验均按照相关指南和法规进行，所有实验程序均经香港浸会大学动物伦理委员会和实验安全委员会批准。

Micro-CT分析。使用micro-CT(版本6.5，vivaCT40，SCANCO Medical AG，Bassersdorf，Switzerland)进行右股骨远端干骺端、右胫骨近端干骺端、第五腰椎和右股骨中轴的分析。椎骨和股骨的图像分别以12.5和17.5μm的各向同性体素尺寸(70kVp，114μA，200ms积分时间，260阈值，1200mg HA/cm³)重建和校准。每次测量都使用相同的过滤和分段值。使用Scanco评估软件，为皮质和小梁参数定义感兴趣区域(ROI)。对于右侧远端股骨干骺端和右侧胫骨近端干骺端，整个股骨或胫骨将重新定向，中间骨干平行于z轴，骨长度测量为最近端和远端横向板之间含有股骨的距离。从生长板的最近端开始，选择在离生长板1.4mm的距离处的100个连续切片上的小梁区域。通过手动轮廓排除皮质骨来分析小梁。对于第五腰椎，选择相当于椎体高度的70％并且从远端生长板的近端到末端朝向椎体延伸的中心区域。在100个连续切片上徒手绘制了小梁ROI，以确保它在骨内包膜内。对于右股骨中轴，使用自动阈值算法在准确的中心和远端50％的股骨长度处测量100个切片。从ROI手动移除与皮质骨接触的小梁。计算骨小梁参数，包括每总体积的小梁体积(Tb.BV/TV)，小梁体积矿物质密度(Tb.vBMD)，小梁厚度(Tb.Th)，小梁数(Tb.N)，小梁间距(Tb.Sp)，小梁结构模型指数(Tb.SMI)，小梁连接密度(Tb.conn.D)。

统计分析。使用GraphPad Prism(版本8；GraphPad Software，Inc)进行统计分析。所有数值数据均表示为平均值±标准偏差。单因素ANOVA和Tukey的事后检验用于所有参数。P<0.05被认为具有统计学意义。

结果：

对于骨小梁，微型计算机断层扫描(micro-CT)分析显示，相比于卵巢切除(OVX)基线(OVX-BS)大鼠，SHAM基线(SHAM-BS)大鼠的股骨远端、胫骨近端和第五腰椎的小梁骨质量明显较高，骨小梁结构性能较好(图13)。将PEG40K-aptscl56/aptscl3，随机序列或载体的六次定期注射分别以每周一次的间隔对OVX大鼠进行处理(分别命名为OVX+aptscl56，OVX+aptscl3，OVX+RS和OVX+Veh)。SHAM大鼠每周一次用载体治疗6周(SHAM+Veh)(图13a)。股骨远端，胫骨近端和第五腰椎的小梁区域的数量分析显示，与SHAM+Veh对照相比，OVX+Veh的骨量显著减少(图13b、c和d)。这些数据表明OVX大鼠成功诱导了骨质疏松症。

股骨远端干骺端区域的显微CT分析显示BMD和BV/TV显著较高，表明与OVX-BS相比，OVX+aptscl56大鼠的骨小梁骨质量明显增加(P<0.005)。与OVX-BS相比，OVX+aptscl56的小梁结构也得到了显著改善(图13b)。然而，与OVX+Veh和OVX+RS组相同，与OVX-BS相比，OVX+aptscl3组未显示显著增加的骨量和改善的结构。

对于第五腰椎，与OVX-BS相比，OVX大鼠中PEG40K-aptscl56治疗6周完全恢复了骨量和骨结构(图13d)。而与OVX-BS相比，像OVX+RS和OVX+Veh那样，OVX+aptscl3没有改变骨量和骨骼结构。

综上，micro-CT数据表明，PEG40K-aptscl56可促进OVX诱导的骨质疏松大鼠骨形成，改善骨微结构，增加骨量。

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Whitfield,J.F.(2001)."The bone growth-stimulating PTH andosteosarcoma."Medscape Womens Health 6(5):7.

序列表

<110> 翼高生物科技有限公司

<120> 针对骨硬化蛋白的适体及其用途

<130> P20182420

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl56

<400> 1

cggggtgtgg gttcgtcgtt agcttgattt ggcagctgcc 40

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl132

<400> 2

cccagacgag acacctcatg cttttccccg ggggaggggt at 42

<210> 3

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl6

<400> 3

cgtacggtcg acgctagctg gaagggtggg ggcggggggt cctcgcctcg aacgtacgca 60

cgtggagctc ggatcc 76

<210> 4

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl9

<400> 4

cgtacggtcg acgctagctg ggggtagggg gaccctggct agttagtcac cgtttcgaca 60

cgtggagctc ggatcc 76

<210> 5

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl15

<400> 5

cgtacggtcg acgctagcga gggggccaac tatgcttagt gggggggttg accgtatcca 60

cgtggagctc ggatcc 76

<210> 6

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl46

<400> 6

cgtacggtcg acgctagcgg gtggattaag ggggccccgt ctgtaggcga ttggcgaaca 60

cgtggagctc ggatcc 76

<210> 7

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl51

<400> 7

cgtacggtcg acgctagctg ggggtagggg gtccttggct acggtgattc ggatgtgaca 60

cgtggagctc ggatcc 76

<210> 8

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl1

<400> 8

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<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl2

<400> 9

cgtacggtcg acgctagcca gccaaagaca gagatgcacg tggagctcgg atcc 54

<210> 10

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl3

<400> 10

cgtacggtcg acgctagctg ttgtacatcg ccttacgcac gtggagctcg gatcc 55

<210> 11

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl5

<400> 11

cgtacggtcg acgctagctg ttgttcatcg acttgacgca cgtggagctc ggatcc 56

<210> 12

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl8

<400> 12

cgtacggtcg acgctagccg gcgaaattgc taccacgtgg agctcggatc c 51

<210> 13

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl12

<400> 13

cgtacggtcg acgctagccg ttgactcgtt gctacacgtg gagctcggat cc 52

<210> 14

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl16

<400> 14

cgtacggtcg acgctagctg gtttcatcga tcgtatccac gtggagctcg gatcc 55

<210> 15

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl22

<400> 15

cgtacggtcg acgctagctg ggtttatcga ctagttccac gtggagctcg gatcc 55

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl29

<400> 16

cgtacggtcg acgctagccg gagacctgag gttcacgtgg agctcggatc c 51

<210> 17

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl32

<400> 17

cgtacggtcg acgctagctg tgttaatcgc cgtacctcca cgtggagctc ggatcc 56

<210> 18

<211> 190

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Gln Gly Trp Gln Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu

1 5 10 15

Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr

20 25 30

Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro Phe Glu

35 40 45

Thr Lys Asp Val Ser Glu Tyr Ser Cys Arg Glu Leu His Phe Thr Arg

50 55 60

Tyr Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu

65 70 75 80

Val Cys Ser Gly Gln Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile

85 90 95

Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile

100 105 110

Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gln Arg Val Gln Leu Leu Cys Pro Gly Gly

115 120 125

Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Val Arg Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys

130 135 140

Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gln Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly

145 150 155 160

Thr Glu Ala Ala Arg Pro Gln Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala

165 170 175

Arg Ser Ala Lys Ala Asn Gln Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr

180 185 190

<210> 19

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl3-1

<400> 19

gtcgacgcta gctgttgtac atcgccttac gcacgtggag ctcggatcc 49

<210> 20

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl3-2

<400> 20

cgtacggtcg acgctagctg ttgtacatcg ccttacgcac gtggagctc 49

<210> 21

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl3-3

<400> 21

gctagctgtt gtacatcgcc ttacgcacgt ggagctc 37

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl3-4

<400> 22

gtcgacgcta gctgttgtac atcgccttac gcacgtg 37

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl3-5

<400> 23

gctagctgtt gtacatcgcc ttacgcacgt g 31

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aptscl3-6

<400> 24

tgttgtacat cgccttacgc acgtg 25

Claims (13)

1. 一种针对骨硬化蛋白的适体，所述适体包含SEQ ID NO:1-17或19-23中的任一序列，其中所述适体特异性结合骨硬化蛋白。

2. 权利要求1的适体，其中所述适体对骨硬化蛋白具有小于100 nM的K_d。

3. 权利要求1的适体，其中所述适体包含SEQ ID NO:1、3、10或23的序列且以小于50μg/ml的EC50值抑制骨硬化蛋白对Wnt信号通路的拮抗作用。

4.权利要求1的适体，其中所述适体还包含一或多种赋予所述适体增强的核酸酶抗性和/或增强所述适体的体内半衰期的修饰。

5.权利要求4的适体，其中所述修饰包括3’反向脱氧胸苷修饰。

6.权利要求4的适体，其中所述修饰包括用经修饰的核苷酸取代一或多个天然存在的核苷酸，所述经修饰的核苷酸选自2’-氟、2’-甲氧乙基、2’-甲氧基和/或2’丙烯氧基修饰的核苷酸。

7.权利要求4的适体，其中所述修饰包括核苷酸间的修饰。

8.权利要求4的适体，其中所述修饰包括PEG修饰。

9. 权利要求8的适体，其中所述PEG的分子量为1 kDa至100 kDa。

10.权利要求4的适体，其中所述适体包含2’-甲氧基修饰、3’反向脱氧胸苷修饰和/或PEG修饰。

11.一种药物组合物，其包含至少一种权利要求1-10中任一项的针对骨硬化蛋白的适体，和药学上可接受的载体或赋形剂。

12.权利要求1-10中任一项的针对骨硬化蛋白的适体或权利要求11的药物组合物在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗骨硬化蛋白相关疾病。

13.权利要求12的用途，其中所述骨硬化蛋白相关疾病选自骨质疏松症、骨质减少、骨软化、成骨不全、缺血性骨坏死、类风湿关节炎、骨折、骨关节炎和骨髓瘤。