CN111602648A - 一种免疫细胞无血清冻存液及冻存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种免疫细胞无血清冻存液，其特征在于，包括基础培养基和细胞冻存保护剂，所述细胞冻存保护剂由以下原料组成：聚乙二醇、壬基酚聚氧乙烯醚‑10、皂荚多糖、羧甲基纤维素钠、聚甘油脂肪酸酯、竹叶黄酮。本发明采用聚乙二醇、壬基酚聚氧乙烯醚‑10复配替代DMSO，改变细胞膜的通透性同时对细胞膜起到保护作用，使细胞内的自由水排除细胞外，减少在冻存过程中细胞内形成冰晶对细胞造成损害。添加皂荚多糖、羧甲基纤维素钠、聚甘油脂肪酸酯作为渗透压稳定剂，使细胞外环境保持稳定的渗透压。添加有竹叶黄酮，有助于细胞复苏后快速恢复活性。本发明还提供了一种免疫细胞的冻存方法，过程简便，满足科研、医疗等领域对免于细胞的需求。

Description

一种免疫细胞无血清冻存液及冻存方法

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种免疫细胞无血清冻存液及冻存方法。

背景技术

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色。免疫细胞包括吞噬细胞和淋巴细胞，淋巴细胞中的T细胞、B细胞是发挥特异性免疫的主要细胞群。从血液中分离出来的单个核细胞包括：T细胞、B细胞、NK细胞和DC细胞等，是免疫细胞治疗中的初始细胞来源，经各类细胞因子诱导扩增培养，得到一群具有高效杀伤活性的免疫细胞群。

细胞冻存技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已有深入广泛的应用。对供体的免疫细胞深低温保存可保持其活力和功能，无论对临床还是基础研究均具有重要意义。冷冻保存免疫细胞不仅可以解决现有免疫细胞诱导时间较长，需要多次诱导和患者多次采血的问题，还可以把人健康状态的免疫细胞保存下来，用于肿瘤治疗等。

细胞冻存主要是采取-196℃超低温条件下的保存方案，在超低温条件下，细胞的代谢功能停滞，但并未死亡。而细胞复苏则是冻存细胞在36-40℃快速解冻的过程，以恢复细胞的活性和功能。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻会导致冷冻损伤效应的发生，冷冻后细胞内外的水分会很快形成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。首先细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述因素而变性，引起细胞内部空间结构紊乱。细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质、酶的变性引起溶酶体膜的损伤使溶酶体释放，造成细胞内结构成分的破坏、线粒体肿胀、功能丧失并造成细胞能量代谢的障碍。细胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏，引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丧失。随着冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核内DNA的空间构型发生不可逆的损伤性变化，从而引起细胞的死亡。最终导致复苏后细胞存活率低、细胞增殖数量不足等问题。

细胞冻存经常采用渗透性保护剂，例如甘油和二甲基亚砜(DMSO)两种，而甘油作为冷冻保护剂冻存的免疫细胞存活率较低，DMSO可以迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶，成为免疫细胞冻存最理想的冷冻保护剂。但在冻存过程中，现有的冻存液仍不可避免的会对单个细胞产生损伤，甚至毒性，尤其是冻存过程中会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。因此，为提供足够量的免疫细胞，现有技术中冻存细胞复苏后的存活率仍需进一步提高，同时也应避免回输给患者时出现呕吐或过敏等不良反应，提高安全性。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种免疫细胞冻存液，不添加外源血清，减小冻存过程中对免疫细胞造成的损伤，提高免疫细胞的存活率。

本发明的目的之二在于提供一种免疫细胞的冻存方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种免疫细胞无血清冻存液，包括基础培养基和细胞冻存保护剂，所述细胞冻存保护剂由以下原料组成：聚乙二醇、壬基酚聚氧乙烯醚-10、皂荚多糖、羧甲基纤维素钠、聚甘油脂肪酸酯、竹叶黄酮。

进一步地，所述免疫细胞无血清冻存液中细胞冻存保护剂的体积分数为：5-10％，以冻存液的终体积计，所述细胞保护剂中各组分的含量为：聚乙二醇3.5-5.0mg/mL、壬基酚聚氧乙烯醚-10 1.5-3.0mg/mL、皂荚多糖8.5-10.0μg/mL、羧甲基纤维素钠9.0-12.0μg/mL、聚甘油脂肪酸酯15.0-18.0μg/mL、竹叶黄酮35.0-40.0μg/mL。

进一步地，所述免疫细胞无血清冻存液中细胞冻存保护剂的体积分数为：8％，以冻存液的终体积计，所述细胞保护剂中各组分的含量为：聚乙二醇4.0mg/mL、壬基酚聚氧乙烯醚-10 2.0mg/mL、皂荚多糖8.5μg/mL、羧甲基纤维素钠10.5μg/mL、聚甘油脂肪酸酯16.0μg/mL、竹叶黄酮38.0μg/mL。

进一步地，所述免疫细胞为NK细胞。

进一步地，所述基础培养基为无血清RPMI 1640培养基。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种免疫细胞的冻存方法，采用上述无血清冻存液冻存。

进一步地，包括以下步骤：取待冻存的免疫细胞和权利要求1至5任一项所述的冻存液混合得到细胞悬液，将细胞悬液置于无菌冻存管中程序降温至-80℃，冻存12-24h，然后放入液氮中冻存。

进一步地，所述细胞悬液中细胞的浓度为5×10⁶-1×10⁷个/mL。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供的免疫细胞无血清冻存液中采用聚乙二醇、壬基酚聚氧乙烯醚-10复配替代DMSO，改变细胞膜的通透性同时对细胞膜起到保护作用，使细胞内的自由水排除细胞外，减少在冻存过程中细胞内形成冰晶对细胞造成损害。

2、添加皂荚多糖、羧甲基纤维素钠、聚甘油脂肪酸酯作为渗透压稳定剂，使细胞外环境保持稳定的渗透压，避免细胞脱水后局部电解质浓度增高，引起细胞内部空间结构紊乱。

3、本发明的无血清冻存液中还添加有竹叶黄酮，有助于细胞复苏后快速恢复活性。

4、本发明的免疫细胞冻存液不添加外源血清和DMSO，细胞的安全性更高，并且通过聚乙二醇、壬基酚聚氧乙烯醚-10、皂荚多糖、羧甲基纤维素钠、聚甘油脂肪酸酯、竹叶黄酮协同作用，提高细胞冻存后的存活率，冻存后复苏的细胞仍具有较好的活性，保持较好的增殖能力。

5、本发明还提供了一种免疫细胞的冻存方法，过程简便，易于操作，便于批量化冻存免疫细胞，满足科研、医疗等领域对免疫细胞的需求。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1至3中的NK细胞的制备过程如下：

(1)取血液适量，平均分装于2支50ml离心管中，于室温下650g(升降速均降低至1)，离心15min；

(2)离心后去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS混匀，得到细胞悬液；

(3)小心加到Ficoll层上，使分层保持清晰，室温，离心；

(4)吸取外周血单个核细胞(PBMC)层，尽量吸尽两液面交接处的细胞层，加PBS吹打混匀，离心，相同方法再次洗涤细胞，得到外周血单核细胞(PBMC)；

(5)将上述PBMC细胞进行磁珠筛选得到NK细胞。

本发明对NK细胞的来源没有特殊限制，可以采用本领域技术人员熟知的方法制备得到或者采用市售商品。

实施例1

一种NK细胞无血清冻存液，包括无血清的RPMI 1640培养基和细胞冻存保护剂，所述免疫细胞无血清冻存液中细胞冻存保护剂的体积分数为：8％，以冻存液的终体积计，所述细胞保护剂中各组分的含量为：聚乙二醇4.0mg/mL、壬基酚聚氧乙烯醚-10 2.0mg/mL、皂荚多糖8.5μg/mL、羧甲基纤维素钠10.5μg/mL、聚甘油脂肪酸酯16.0μg/mL、竹叶黄酮38.0μg/mL。

一种NK细胞的冻存方法，取待冻存的NK细胞和上述无血清细胞冻存液混合得到细胞悬液，细胞悬液中细胞的浓度为5×10⁶个/mL，将上述细胞悬液置于无菌冻存管中程序降温至-80℃，冻存12h，然后放入液氮中冻存。

实施例2

一种NK细胞无血清冻存液，包括无血清的RPMI 1640培养基和细胞冻存保护剂，所述免疫细胞无血清冻存液中细胞冻存保护剂的体积分数为：5％，以冻存液的终体积计，所述细胞保护剂中各组分的含量为：聚乙二醇3.5mg/mL、壬基酚聚氧乙烯醚-10 1.5mg/mL、皂荚多糖8.5μg/mL、羧甲基纤维素钠9.0μg/mL、聚甘油脂肪酸酯15.0μg/mL、竹叶黄酮35.0μg/mL。

一种NK细胞的冻存方法，取待冻存的NK细胞和上述无血清细胞冻存液混合得到细胞悬液，细胞悬液中细胞的浓度为9×10⁶个/mL，将上述细胞悬液置于无菌冻存管中程序降温至-80℃，冻存20h，然后放入液氮中冻存。

实施例3

一种NK细胞无血清冻存液，包括无血清的RPMI 1640培养基和细胞冻存保护剂，所述免疫细胞无血清冻存液中细胞冻存保护剂的体积分数为：10％，以冻存液的终体积计，所述细胞保护剂中各组分的含量为：聚乙二醇5.0mg/mL、壬基酚聚氧乙烯醚-10 3.0mg/mL、皂荚多糖10.0μg/mL、羧甲基纤维素钠12.0μg/mL、聚甘油脂肪酸酯18.0μg/mL、竹叶黄酮40.0μg/mL。

一种NK细胞的冻存方法，取待冻存的NK细胞和上述无血清细胞冻存液混合得到细胞悬液，细胞悬液中细胞的浓度为1×10⁷个/mL，将上述细胞悬液置于无菌冻存管中程序降温至-80℃，冻存24h，然后放入液氮中冻存。

对比例1

对比例1提供一种NK细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去壬基酚聚氧乙烯醚-10，将聚乙二醇的用量调整为6.0mg/mL，其余均和实施例1相同。

对比例2

对比例2提供一种NK细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去聚乙二醇，将壬基酚聚氧乙烯醚-10的用量调整为6.0mg/mL，其余均和实施例1相同。

对比例3

对比例3提供一种NK细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去皂荚多糖，其余均和实施例1相同。

对比例4

对比例4提供一种NK细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去羧甲基纤维素钠，其余均和实施例1相同。

对比例5

对比例5提供一种NK细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去聚甘油脂肪酸酯，其余均和实施例1相同。

对比例6

对比例6提供一种NK细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去竹叶黄酮，其余均和实施例1相同。

对比例7

对比例7提供一种NK细胞冻存液，组成为：体积分数为8％DMSO、10％的胎牛血清、82％的RPMI 1640培养基。

细胞复苏：分别取实施例1至3，对比例1至7中在液氮中冻存1个月、3个月、6个月和12个月的NK细胞进行复苏，复苏过程如下：取冻存后的细胞在36℃水浴3min至细胞悬液完全融化，将复苏后的细胞进行台盼蓝染色统计细胞存活率(每次取三个冻存管计数，取平均值)，细胞存活率＝(细胞总数-着色细胞数)/细胞总数×100％，结果如表1所示。

表1

由表1可以看出，相同的冻存时间，实施例1至3中的NK细胞存活率更高，随着冻存时间的延长，实施例1至3中NK细胞复苏的存活率下降不明显。对比例1至2中分别省去了壬基酚聚氧乙烯醚-10和聚乙二醇中的一种，调整另一成分的用量后，冻存细胞的存活率不及实施例1至3，说明本发明的冻存液中通过加入壬基酚聚氧乙烯醚-10和聚乙二醇两种成分复配，改变细胞膜的通透性同时对细胞膜起到保护作用，使细胞内的自由水排除细胞外，减少在冻存过程中细胞内形成冰晶对细胞造成损害。

对比例3至6中省去了作为细胞外渗透压稳定剂的皂荚多糖、羧甲基纤维素钠、聚甘油脂肪酸酯中一种，冻存后的细胞存活率低于实施例1至3，说明本发明采用皂荚多糖、羧甲基纤维素钠、聚甘油脂肪酸酯三种成分协同作用，有助于保持细胞外环境渗透压的稳定，避免细胞脱水后局部电解质宁都升高，一起细胞内部空间结构的紊乱，从而造成细胞死亡。

对比例7的冻存液添加了DMSO和胎牛血清，虽然细胞的存活率高于对比例1至6，但是仍然低于本发明实施例1至3的存活率，并且本发明的冻存液不添加外源血清和DMSO，降低了动物病原污染的可能性，避免了DMSO可能带来的副作用，NK细胞的安全性更高。

分别取实施例1中冻存12个月后复苏的NK细胞，和新鲜制备未经冻存的NK细胞作为对照组在同样的培养条件下进行扩增，过程如下：将NK细胞加入NK细胞培养基中制成细胞悬浮液，细胞浓度为1×10⁵个/mL，将上述培养基转移至细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养，培养过程中每天对NK细胞进行计数，及时补充培养基使细胞浓度维持在1.0×10⁵个/mL，培养12天时，采用台盼兰染色，统计细胞数量，计算细胞的增殖倍数，结果如表2所示。

表2

样品	初始细胞数	总细胞数	增值倍数
				实施例1	1×10<sup>6</sup>	1.02×10<sup>8</sup>	102
对照组	1×10<sup>6</sup>	1.04×10<sup>8</sup>	104

由表2可以看出，实施例1中冻存后NK细胞的扩增倍数和未经冻存的NK细胞直接进行培养扩增倍数相差不大，说明本发明的冻存液在可以保持NK细胞的活性，复苏后细胞的增殖能力基本不受影响。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种免疫细胞无血清冻存液，其特征在于，包括基础培养基和细胞冻存保护剂，所述细胞冻存保护剂由以下原料组成：聚乙二醇、壬基酚聚氧乙烯醚-10、皂荚多糖、羧甲基纤维素钠、聚甘油脂肪酸酯、竹叶黄酮。

2.根据权利要求1所述免疫细胞无血清冻存液，其特征在于，所述免疫细胞无血清冻存液中细胞冻存保护剂的体积分数为：5-10％，以冻存液的终体积计，所述细胞保护剂中各组分的含量为：聚乙二醇3.5-5.0mg/mL、壬基酚聚氧乙烯醚-10 1.5-3.0mg/mL、皂荚多糖8.5-10.0μg/mL、羧甲基纤维素钠9.0-12.0μg/mL、聚甘油脂肪酸酯15.0-18.0μg/mL、竹叶黄酮35.0-40.0μg/mL。

3.根据权利要求2所述免疫细胞无血清冻存液，其特征在于，所述免疫细胞无血清冻存液中细胞冻存保护剂的体积分数为：8％，以冻存液的终体积计，所述细胞保护剂中各组分的含量为：聚乙二醇4.0mg/mL、壬基酚聚氧乙烯醚-102.0mg/mL、皂荚多糖8.5μg/mL、羧甲基纤维素钠10.5μg/mL、聚甘油脂肪酸酯16.0μg/mL、竹叶黄酮38.0μg/mL。

4.根据权利要求1所述免疫细胞无血清冻存液，其特征在于，所述免疫细胞为NK细胞。

5.根据权利要求4所述免疫细胞无血清冻存液，其特征在于，所述基础培养基为无血清RPMI 1640培养基。

6.一种免疫细胞的冻存方法，其特征在于，采用权利要求1至5任一项所述无血清冻存液冻存。

7.根据权利要求6所述免疫细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：取待冻存的免疫细胞和权利要求1至5任一项所述的冻存液混合得到细胞悬液，将细胞悬液置于无菌冻存管中程序降温至-80℃，冻存12-24h，然后放入液氮中冻存。

8.根据权利要求7所述免疫细胞的冻存方法，其特征在于，所述细胞悬液中细胞的浓度为5×10⁶-1×10⁷个/mL。