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CN111527202B - So3色谱在病毒纯化方法中的应用 - Google Patents

So3色谱在病毒纯化方法中的应用 Download PDF

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CN111527202B CN201880084877.XA CN201880084877A CN111527202B CN 111527202 B CN111527202 B CN 111527202B CN 201880084877 A CN201880084877 A CN 201880084877A CN 111527202 B CN111527202 B CN 111527202B
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Abstract

本发明涉及从细胞培养物中纯化病毒颗粒的工艺，其包括步骤为：将细胞培养物离心，以获得含有病毒颗粒的上清液部分，用核酸酶孵育所述部分，用低电导率缓冲液稀释所述部分，将所述被稀释的部分进行SO3色谱步骤，用低电导率缓冲液执行洗涤步骤，以及洗脱流感病毒颗粒。

Description

SO3色谱在病毒纯化方法中的应用
技术领域
本发明涉及从细胞培养物中纯化病毒颗粒，特别地涉及纯化流感病毒颗粒的工艺，该工艺包括的步骤为：将细胞培养物离心，以获得含有病毒颗粒的上清液部分，用核酸酶孵育所述部分，用低电导率缓冲液稀释所述部分，将所述被稀释的部分进行SO3色谱步骤，用低电导率缓冲液执行洗涤步骤，以及洗脱流感病毒颗粒。
背景技术
通过在细胞系(例如Vero细胞)上培养获得的病毒获取物，不仅包含所需的病毒，而且还包含源自培养细胞的蛋白质和DNA。但是，当计划将病毒用于某些用途(例如疫苗生产)时，它们的尽可能纯净是至关重要的。
流感是一种传染性的病毒性疾病，每年约6亿人感染，导致500,000人死亡。该病的病原体来自正粘病毒科的包膜病毒，正粘病毒科分为三个属，A型流感病毒、B型流感病毒和C型流感病毒。对疫苗需求和流行病威胁的增加，以及传统的蛋源性疫苗(egg basedvaccine)的其他一些弊端，刺激了新生产策略的开发和引入。通常地，来自尿囊液的流感病毒的下游工艺由通过离心的澄清、通过超滤的浓缩和通过超离心的纯化组成。在1960年代和1970年代，报道了在磷酸钙和琼脂糖凝胶柱上进行流感病毒小规模色谱纯化的早期尝试。随着基于细胞培养工艺的引入，目前正在评估使用现代色谱支持物的纯化方法。Nayak等人使用深度过滤、灭活、超滤和凝胶过滤的组合来纯化源自MDCK细胞的流感病毒(NayakDP.et al.,J.Chromatogr.B Analyt Technol Biomed Life Sci,2005；823:75-81)。尺寸排阻色谱也与阴离子交换色谱结合使用，用于纯化A型流感病毒(Kalbfuss B.et al.,Biotech Bioeng.2007；96:932-44)。具有传质增强的色谱支持物(例如膜吸附器和整体柱)已被证明更为有效，并且用于纯化不同的病毒(Kramberger P.et al.,J.Chromatogr.A2007；1144:143-9；Vicente T.et al.,J.Memb.Sci.,2008；311:270-83)。Kalbfuss等人比较了强的和弱的阴离子交换膜吸附器用于纯化A型流感病毒，并实现了高达80％的高病毒回收率(Kalbfuss B.et al.,J.Memb:Sci.2007；299:251-60)。还研究了基于膜吸附器和整体柱的亲和色谱和伪亲和色谱纯化流感病毒(Opitz L.et al.,Vaccine 2007；25:939-47；Kalashnikova N.et al.,Anal Chem 2008；80:2188-98；Opitz L.et al.,BiotechnolBioeng 2009；103:1144-54)。所有描述的方法都用于纯化灭活的流感病毒，而研究者并未专注于保留病毒的传染性。
Ye GJ等人报告了将benzonase处理、澄清和柱色谱用于清除单纯疱疹病毒的应用(2015,URL:https:jjwww.agtc.comjuploadsjdocumentsJAGTC_Doc_5414_ASGCT_2015_Viral clearance_2015-04-2I.pdf)。
Zaveckas M等人报道了使用SO3整体柱色谱纯化猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组病毒样颗粒，其纯度约为40％。病毒回收率约为15％(J.Chromatogr.B:BiomedicalSciences&Applications,Elsevier,Amsterdam.vol.991,2015,pages 21-28)。
Strauss D等人描述了将阴离子交换色谱用于去除病毒的应用(Biotechnol.Bioengineering,vol.102,no.I,2009,pages 168-175)。
Banjac M等人使用离子交换甲基丙烯酸酯整体柱，用来纯化复制缺陷型流感病毒(Vaccine 2014；32:2487-2492)，但是对B型流感病毒的特异性吸附很低。
因此，对于病毒纯化系统，特别是对于高产量和高纯度的流感病毒的纯化系统，有很高、但尚未得到满足的需求。
因此，仍然需要快速、可扩展、有效和廉价的下游工艺来纯化流感病毒，用于疫苗或任何其他需要纯净的、免疫原性的和/或传染性的病毒的应用。
发明内容
本发明的目的是提供用于病毒纯化，特别地用于流感病毒纯化的改进的纯化方法。另一个目的是开发一种用于有用量的任何流感病毒或其衍生物的纯化的工艺，特别地用于疫苗或作为病毒载体使用，以满足实验室或工业规模的需要，其中该病毒是免疫原性的和/或具有保留的传染性。
可通过本发明的主题来实现该目的。
这里描述的方法，允许在水性介质中以高浓度回收纯化的传染性病毒颗粒，特别是传染性流感病毒颗粒。该方法适合于实验室或工业化量的任何流感病毒颗粒，特别是活病毒颗粒的制备。
本发明的工艺是有利的，因为由于温和的条件，可以基本上保持流感病毒的效力，例如免疫原性和/或传染性。
根据本发明，提供了一种从细胞培养物中纯化病毒颗粒，特别地是流感病毒颗粒的工艺，其包括所示顺序的步骤：
a)将细胞培养物离心，以获得含有病毒颗粒的上清液部分，
b)用核酸酶孵育所述部分，
c)用低电导率缓冲液稀释所述部分，
d)将所述稀释的部分进行SO3色谱步骤，
e)用低电导率缓冲液执行洗涤步骤，以及
f)洗脱病毒颗粒。
特别地，该病毒是流感病毒，特别地选自由A型流感病毒、B型流感病毒和C型流感病毒组成的组。更特别地，流感病毒选自由流感病毒野生型和包含修饰(包括取代突变、插入和/或缺失)的流感病毒组成的组。
特别地，洗脱后将病毒颗粒稀释。
根据本发明的一个具体实施例，在洗脱后执行超滤和/或无菌过滤。
在一个具体实施例中，SO3色谱是柱色谱，特别地，是甲基丙烯酸酯整体柱色谱。
特别地，稀释缓冲液的电导率为2mS/cm或更小。
特别地，洗涤缓冲液的电导率为约12mS/cm或更小。
根据一个具体实施例，缓冲液选自由Hepes、Tris、Tris碱、磷酸钾、磷酸钠、Mops、Bis-Tris丙烷甘氨酸(Bis-Tris propane Bicine)、Mes和Bis-Tris组成的组。
根据一个具体实施例，洗涤缓冲液进一步地包含一种或多种添加剂，例如EDTA。
在一个具体实施例中，缓冲液还包含渗透稳定剂，特别地选自蔗糖、山梨糖醇和甘露糖醇。特别地，缓冲液可包含100至250mM，特别地150至200mM，更特别地约200mM的蔗糖。
特别地，以分步或线性梯度，特别地以盐度梯度，更特别地，以氯化钠梯度，来洗脱病毒。
在一个具体实施例中，以至少2,000g，特别地至少3,000g，特别地至少4,000g，特别地至少4,100g的速度执行离心。根据一个实施例，离心速度在约2,000g和4,500g的范围内。
根据本发明的一个实施例，细胞的培养是用宿主细胞执行的，特别地用哺乳动物细胞，更特别地用Vero细胞和MDCK细胞。
在一个特别的实施例中，至少50％，特别地至少60％，特别地至少70％，特别地至少80％，特别地至少85％，特别地至少90％，特别地至少95％，更特别地至少99％的宿主细胞蛋白被去除。
在一个特别的实施例中，至少50％，特别地至少60％，特别地至少70％，特别地至少80％，特别地至少85％，特别地至少90％，特别地至少95％，更特别地至少99％的宿主细胞DNA被去除。
附图说明
图1：示例3的色谱图。OD260和电导率分别由实线和虚线表示。显示了流通部分(FT1至FT4)、洗涤部分(WASH)和病毒洗脱液部分(E1)。A)概述和B)病毒洗脱液部分的详细信息。
图2：示例6的色谱图。OD260和电导率分别由实线和虚线表示。显示了流通部分(FT1至FT12)、洗涤部分(W)和病毒洗脱部分(E3)。A)概述和B)病毒洗脱液部分的详细信息。
具体实施方式
根据本发明，术语“约”涵盖明确列举的值，以及这些值的微小偏差。相应地，术语“约”涵盖的与所述值的偏差为10％，优选地5％，优选地1％。
流感病毒或其衍生物的任何已知的上游生产工艺，均可用于生产本发明的纯化工艺的原料。
支持流感病毒复制的任何真核细胞都是病毒颗粒或其衍生物的适合的来源。优选的宿主细胞是哺乳动物宿主细胞系，该细胞系支持流感病毒的感染和复制。
流感病毒可以通过本领域已知的任何方法繁殖和制备。可以根据文献中解释的已知程序，在鸡蛋或细胞培养物中培养病毒。优选地，从病毒感染的细胞，例如Vero细胞或MDCK细胞中获取流感病毒。为了优化产率，可以在高感染复数(multiplicity ofinfection)下感染细胞。可以使用适合于从感染细胞中回收病毒的任何方法。
本文应涵盖所有适合根据本发明方法纯化的病毒。病毒可以是包膜病毒，特别地它们是RNA病毒。适用于根据本发明纯化的RNA病毒，可以是但不限于正粘病毒、黄病毒、披膜病毒、冠状病毒、肝炎病毒、副粘病毒、弹状病毒、布尼亚病毒和丝状病毒。
流感病毒可以选自由人类流感病毒、禽流感病毒、马流感病毒、猪流感病毒、猫流感病毒组成的组。流感病毒更特别地选自毒株A、B和C，优选地选自毒株A和B。流感毒株可以源自流行病爆发间(年度或季节性的)的流感毒株。或者，流感病毒颗粒可能来自导致流行病爆发的病毒毒株；即，与当前流行的毒株中的血凝素相比，具有新血凝素的流感毒株，或在禽类受试者中具有致病性并在人类人群中具有水平传播潜力的流感毒株，或对人类致病的流感毒株。根据特定的季节和疫苗中所含抗原的性质，流感抗原可以衍生自以下的一种或多种血凝素亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。优选地，流感病毒或其抗原来自H1、H2、H3、H5、H7或H9亚型。在一个实施例中，流感病毒来自H2、H5、H6、H7或H9亚型。在另一个实施例中，流感病毒来自H1、H3或B亚型。
根据一个具体的实施例，流感病毒是减毒的流感病毒。特别地，流感病毒在抑制宿主细胞的先天免疫应答的致病因子内包含缺失或修饰。该减毒可以示例性地源自冷适应病毒毒株，或由于NS1基因(ΔNS1病毒)内的缺失或修饰，如WO99/64571和WO99/64068中所述，其整体通过引用并入本文。
特别地，流感病毒可以是病毒载体，所述病毒载体包含截短的NS1蛋白，所述截短的NS1蛋白的NS1蛋白N末端包括最多122个氨基酸，优选地最多121个氨基酸，优选地最多120个氨基酸，优选地最多119个氨基酸，优选地最多118个氨基酸，优选地最多117个氨基酸，优选地最多116个氨基酸，优选地最多115个氨基酸，优选地最多114个氨基酸，优选地最多113个氨基酸，优选地最多112个氨基酸，优选地最多111个氨基酸，优选地最多110个氨基酸，优选地最多109个氨基酸，优选地最多108个氨基酸，优选地最多107个氨基酸，优选地最多106个氨基酸，优选地最多105个氨基酸，优选地最多104个氨基酸，优选地最多103个氨基酸，优选地最多102个氨基酸，优选地最多101个氨基酸，优选地最多100个氨基酸，优选地最多99个氨基酸，优选地最多98个氨基酸，优选地最多97个氨基酸，优选地最多96个氨基氨基酸，优选地最多95个氨基酸，优选地最多94个氨基酸，优选地最多93个氨基酸，优选地最多92个氨基酸，优选地最多91个氨基酸，优选地最多90个氨基酸，优选地最多89个氨基酸，优选地最多88个氨基酸，优选地最多87个氨基酸，优选地最多86个氨基酸，优选地最多85个氨基酸，优选地最多84个氨基酸，优选地最多83个氨基酸，优选地最多82个氨基酸，优选地最多81个氨基酸，优选地最多80个氨基酸，优选地最多79个氨基酸，优选地最多78个氨基酸，优选地最多77个氨基酸，优选地最多76个氨基酸，优选地最多75个氨基酸，优选地最多74个氨基酸，优选地最多73个氨基酸。
已经显示，由于干扰素感受态细胞(interferon competent cell)或生物体(复制缺陷表型)中缺乏复制，NS1蛋白的缺失导致流感病毒的显著减弱。缺乏NS1蛋白的病毒不能拮抗被感染细胞的细胞因子的产生，因此会诱导自我辅助和免疫调节作用。用DeINS1病毒免疫后的免疫应答的标志触发Th1型免疫应答，所述Th1型免疫应答与主要的IgG2A抗体同型应答相关(Ferko B.et al.,J.Virol.,2004,78(23):13037-45)。
“修饰”是指与野生型NS1序列相比，一个或多个核酸的取代或缺失。NS基因内的修饰，可导致病毒颗粒在干扰素感受态细胞中缺乏增长。缺乏增长是指这些病毒在动物的呼吸道中经历流产性复制(abortive replication)时缺乏复制。或者，病毒可包含PB1-F2基因的缺失或修饰。
根据本发明的方法可以特别地用于生产包含NS1蛋白功能性缺失的流感病毒。
根据本发明，还包括流感病毒的衍生物，所述流感病毒的衍生物特别地为遗传修饰的流感病毒、或病毒样颗粒或递送异物的流感病毒颗粒(病毒载体)，所述异物为例如具有生物学上或药学上活性的物质(例如生物聚合物，还有小分子)。生物聚合物尤其是蛋白质(例如抗体和受体酶)、核酸(反义核酸)、脂质或多糖。
可以产生流感病毒样颗粒，例如从真核细胞中表达的流感病毒蛋白，或通过体外操作流感病毒和/或包含流感病毒的分子。流感病毒基因组的遗传操作，可包括流感病毒基因组的突变、缺失、插入或任何其他操作。特别地，流感病毒颗粒包含至少一种修饰和/或缺失的NS1基因。
用于疫苗的流感病毒毒株随季节变化而变化。三价疫苗是典型的，但是在本发明中还考虑了更高的价，例如四价。本发明可以使用来自流行病毒株(即，针对于无免疫的疫苗接受者和普通人群的毒株)的HA，并且用于流行病毒株的流感疫苗可以是单价的，或者可以基于由流行病毒株补充的正常三价疫苗。
包含根据本发明的方法产生的病毒颗粒的组合物，可包括来自一种或多种流感病毒毒株的抗原，所述流感病毒毒株包括A型流感病毒和/或B型流感病毒。特别地，本发明考虑了三价疫苗，所述三价疫苗包括来自两种A型流感病毒毒株和一种B型流感病毒毒株的抗原。或者，四价疫苗也在本发明的范围内，所述四价疫苗包括来自两个A型流感病毒毒株和两个B型流感病毒毒株的抗原。
根据本发明生产的组合物不限于单价组合物，即仅包括一种毒株类型，即仅季节性毒株或仅流行病毒株。本发明还包括多价组合物，所述多价组合物包含季节性毒株和/或流行病毒株的结合。
一旦针对特定毒株纯化了流感病毒，就可以将其与其他毒株的病毒和/或与本领域已知的辅助剂结合。
通过本文描述的方法获得的病毒颗粒，可以用于制备用于个体治疗的组合物，特别地用于预防治疗(例如通过疫苗接种)的组合物。
如本领域公知的，含有病毒颗粒的细胞培养基可以通过离心澄清。特别地，在约4000g下进行离心，例如在2000g至4500g的范围内，特别地在3500g至4500g的范围内。特别地，以约2000g、2100g、2200g、2300g、2400g、2500g、2600g、2700g、2800g、2900g、3000g、3100g、3200g、3300g、3400g、3500g、3600g、3700g、3800g、3900g、4000g、4100g、4200g、4300g、4400g、4500g或更高进行离心。
根据本发明，任何核酸酶或核酸内切酶，均可用于孵育含有病毒颗粒的上清液部分。例如，CyanaseTM或是众所周知的工业上可应用的核酸酶。CyanaseTM是一种克隆的高活性的、基于非沙雷氏菌的非特异性核酸内切酶，其可降解单链和双链DNA和RNA。如本文中所使用的或超核酸酶是核酸酶，特别地是来自粘质沙雷氏菌的核酸内切酶。该蛋白质是具有两个关键的二硫键的30kDa亚基的二聚体。这种核酸内切酶攻击并降解所有形式的DNA和RNA(单链、双链、线性和环状的)，并在广泛的操作条件下是有效的。发现酶活性的最佳pH为8.0-9.2。它完全地将核酸消化为长度为3至5个碱基的5'-单磷酸终止的寡核苷酸。
单位定义如下：在37C、pH值为8.0下(反应体积为2.625ml)，一个单位在30min内，将超声处理的鲑鱼精子DNA消化为酸溶性寡核苷酸(相当于△A260为1.0)。
本文所用的核酸酶添加到含病毒的宿主细胞上清液中的最终浓度可以是在10和50U/ml的范围内，特别地在15和40U/ml，特别地在大约20U/ml。
根据一个具体的实施例，用缓冲液以9:1至1:5的比例稀释经核酸酶处理的获取物。
在低电导率条件下进行纯化工艺对于本发明是关键的。因此，在本发明的纯化方法中执行用低电导率缓冲液稀释病毒颗粒部分，并在低电导率条件下执行洗涤步骤。尽管通过稀释所述部分可以进一步获得低电导率，但是过度稀释会导致压力增加以及病毒颗粒活力降低。更优选地使用低电导率缓冲液。
根据一个具体的实施例，将低电导率缓冲液与减少对病毒颗粒的渗透压力的化合物组合。所述化合物可以，但不限于蔗糖、山梨糖醇和甘露糖醇，或葡萄糖。
“电导率值”是指电解质溶液导电的能力。电解质溶液的电导率，可以通过，例如，确定相隔一固定距离的两个电极之间的溶液电阻来测量。电导率值表示为毫西门子每厘米(mS/cm)。
可以使用电导率仪(例如各种型号的Orion电导率仪)来测量电导率。由于电解电导率是溶液中离子承载电流的能力，因此可以通过改变溶液中离子的浓度来改变溶液的电导率。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如氯化钠、乙酸钠或氯化钾)的浓度，以便获得所需的电导率。优选地，改变缓冲液的盐浓度以获得所需的电导率。
术语“低电导率缓冲液”是指电导率值低的水溶液。
相对于用于稀释的缓冲液(低电导率稀释缓冲液)，电导率值可以约为5mS/cm或更小。在本文描述的任何方法的一些实施例中，稀释缓冲液的电导率在约0.5至5mS/cm的范围内，特别地在约0.5至5mS/cm的范围内，特别地约为0.1mS/cm、0.2mS/cm、0.3mS/cm、0.4mS/cm、0.5mS/cm、0.6mS/cm、0.7mS/cm、0.8mS/cm、0.9mS/cm、1.0mS/cm、1.5mS/cm、2.0mS/cm、3.0mS/cm、4.0mS/cm、5mS/cm。
洗涤缓冲液(低电导率洗涤缓冲液)的电导率值可以更高，特别地在0.5和12mS/cm之间，特别地在1和10mS/cm之间。在本文描述的任何方法的一些实施例中，洗涤缓冲液的电导率约为0.5mS/cm、1.0mS/cm、1.2mS/cm、1.5mS/cm、2.0mS/cm、2.5mS/cm、3.0mS/cm、3.5mS/cm、4.0mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm、10.5mS/cm、11.0mS/cm、11.5mS/cm或12.0mS/cm。
在一个具体的实施例中，洗涤缓冲液进一步地包含一种或多种添加剂，例如但不限于EDTA。特别地，EDTA的浓度在0.1至50mM，特别地浓度为10至30mM，特别地浓度约为20mM。
根据一个具体的实施例，进行色谱法的整个病毒部分的电导率值具有12mS/cm的最大电导率，更特别地，所述部分在约0.5至12mS/cm的范围内，特别地在约1.5至10mS/cm，更特别地为2至8，更特别地为4至7，更特别地为2至4mS/cm。
关于A型流感病毒的纯化，根据一个具体的实施例，稀释缓冲液的电导率在0.5至8mS/cm的范围内，进行色谱法的病毒颗粒部分的电导率，即病毒负载，特别地在0.5至12mS/cm的范围内，特别地在1至9.5mS/cm的范围内，特别地在1至8mS/cm的范围内。
关于B型流感病毒的纯化，根据一个具体的实施例，稀释缓冲液的电导率在0.5至2mS/cm的范围内，进行色谱法的病毒颗粒部分的电导率，即病毒负载，特别地在约0.5至12mS/cm的范围内，特别地在约1至7mS/cm的范围内。
适用于本文所述工艺的各个电导率，应允许病毒颗粒与色谱材料有效结合。各自的电导率可以由技术人员评估，例如通过使用TCID50或荧光聚焦测试(fluorescent focusassay，FFA)来确定病毒流通和SO3病毒洗脱。
根据本发明确定，如果在色谱的流通部分中发现10％或更多，特别地3％或更多，特别地2％或更多，特别地1％或更多，则根据本发明的方法，对于有效病毒结合而言，电导率被认为太高。
在用于纯化A型流感病毒的具体的实施例中，在低电导率稀释缓冲液(病毒负载)存在下，进行色谱法分离的病毒颗粒部分的电导率范围为5至9.5mS/cm，特别地5至9mS/cm，洗涤缓冲液的电导率范围约为0.5至9mS/cm。
在用于纯化B型流感病毒的具体的实施例中，在低电导率稀释缓冲液(病毒负载)存在下，进行色谱法分离的病毒颗粒部分(病毒负载)的电导率范围为5至9mS/cm，并且洗涤缓冲液的电导率范围在约0.5-8mS/cm，特别地在约0.5-7mS/cm。
在用于纯化病毒，特别地流感病毒的具体的实施例中，将乙二胺四乙酸(EDTA)添加到SO3洗涤缓冲液中，例如但不限于，以0.5-20mM的浓度。
“低电导率的水溶液”可以包括，例如，含有200mM蔗糖的10至100mM的Hepes缓冲液。
SO3(磺酸盐)是强阳离子交换基团，在pH 2-13之间是满电荷。它在pH 2-13的工作范围内，选择性地结合具有主要正电荷的分子。对于本发明方法中使用的色谱材料，SO3(磺酰基)官能团连接到任何合适的树脂上。
优选地，在本发明的方法的SO3阳离子交换色谱法步骤中，使用基于具有磺酸盐官能团的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙烯酯)基质的整体化支持物(例如SO3整体化柱)。如本文所述，整体化SO3色谱，特别地用于基于其正电荷结合至离子交换剂的病毒的纯化和浓缩。
优选地，色谱材料用本文所述的低电导率缓冲液平衡。特别地，用于平衡的所述低电导率缓冲液的电导率范围在0.5mS/cm至2mS/cm。
病毒颗粒部分的洗脱可以逐步或分步进行。根据本发明，可以将含有任何盐的缓冲液用于洗脱病毒。特别地，本文使用NaCl。特别地，盐的浓度可以高达2M，特别地高达1.5M、1M、0.9M、0.8M、0.7M、0.6M、0.5M、0.4M、0.3M、0.2M。为了保持病毒的传染性，应限制在高盐浓度下的孵育时间。
与Banjac等人(2014)相比，降低A型H1N1流感病毒获取物的电导率，显著地提高了SO3整体柱的动态结合容量，从每ml的SO3柱体积约9log10的传染性病毒颗粒，增加到每ml的SO3柱体积约10.5log10的传染性病毒颗粒(即30倍)。对于B型流感病毒，降低获取物的电导率还导致每ml的SO3柱体积的动态结合容量为10.5log10的传染性病毒颗粒。由于Banjac等人在将B型流感病毒获取物负载至SO3柱之前，没有降低B型流感病毒获取物的电导率，因此在流通物中发现了大量病毒(37.1％)。因此，Banjac等人并未确定对B型流感病毒的动态结合容量。
作为附加步骤，可以执行无菌过滤或超滤，以进一步地消除生物负荷。因此，洗脱液可通过0.22μm的过滤器过滤。过滤器可以由多种材料构成，其可以包括但不限于聚丙烯、纤维素、纤维素酯、尼龙、聚醚砜，或与低非特异性流感病毒结合一致的任何其他材料。该过滤器可以具有单层膜或一层以上，或者可以包含相同或不同材料的预过滤器。
过滤后的流感病毒可以冷冻保存，或保持在约4℃下以便随后处理。
本发明包括以下项目：
1.一种从细胞培养物中纯化病毒颗粒的工艺，其包括所示顺序的步骤：
a)将细胞培养物离心，以获得含有病毒颗粒的上清液部分，
b)用核酸酶孵育所述部分，
c)用低电导率稀释缓冲液稀释所述部分，
d)在允许有效病毒结合的条件下，对所述被稀释部分进行SO3色谱步骤，
e)用低电导率的洗涤缓冲液执行清洗步骤，以及
f)洗脱病毒颗粒。
2.根据第1项所述的工艺，其中所述病毒是流感病毒。
3.根据第1或2项所述的工艺，其中病毒颗粒在洗脱后被稀释。
4.根据第1至3项中任一项所述的工艺，其中在洗脱之后，执行超滤和/或无菌过滤。
5.根据第1至4项中任一项所述的工艺，其中所述SO3色谱是柱色谱，特别地是甲基丙烯酸酯整体柱。
6.根据第1至5项中任一项所述的工艺，其中所述稀释缓冲液的电导率为5mS/cm或更小，特别地为1mS或更小。
7.根据第1至6项中任一项所述的工艺，其中所述洗涤缓冲液的电导率为12mS/cm或更小，特别地为7mS或更小。
8.根据第1至7项中任一项所述的工艺，其中所述洗涤缓冲液进一步地包含一种或多种添加剂，特别地EDTA。
9.根据第1至8项中任一项所述的工艺，其中所述缓冲液选自由Hepes、Tris、Tris碱、磷酸钾、磷酸钠、Mops、Bis-Tris丙烷甘氨酸、Mes和Bis-Tris组成的组。
10.根据第1至9项中任一项所述的工艺，其中所述缓冲液进一步地包括蔗糖、山梨糖醇和/或甘露糖醇。
11.根据第1至10项中任一项所述的工艺，其中以分步或线性梯度，特别地以氯化钠梯度，来洗脱病毒。
12.根据第1至11项中任一项所述的工艺，其中所述病毒是流感病毒，特别地选自由A型流感病毒、B型流感病毒和C型流感病毒组成的组。
13.根据第1至12项中任一项所述的工艺，其中所述流感病毒选自由流感病毒野生型和包含修饰(包括取代突变，插入和/或缺失)的流感病毒组成的组。
14.根据第1至13项中任一项所述的工艺，其中离心速度为至少2,000g，特别地为至少3,000g，特别地为至少4,000g，特别地为至少4,100g。
15.根据第1至14项中任一项所述的工艺，其中细胞的培养是用宿主细胞执行的。
16.根据第1至15项中任一项所述的工艺，其中至少50％，特别地至少60％，特别地至少70％，特别地至少80％，特别地至少85％，特别地至少90％，特别地至少95％，更特别地至少99％的宿主细胞蛋白被去除。
17.根据第1至16项中任一项所述的工艺，其中至少50％，特别地至少60％，特别地至少70％，特别地至少80％，特别地至少85％，特别地至少90％，特别地至少95％，更特别地至少99％的宿主细胞DNA被去除。
18.根据第1至17项中任一项所述的工艺，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞，特别地是Vero细胞。
通过以下示例进一步地说明本发明，但不限于此。
示例
A型流感病毒的纯化：
示例1：未稀释的H1N1病毒
A型H1N1 NS106-E6E7流感病毒在接种于细胞工厂的Vero细胞中生长。A型H1N1NS106-E6E7流感病毒是IVR-116的衍生物，其缺乏NS1开放阅读框C端的124个氨基酸，因此仅表达NS1的N端106个氨基酸。人类乳头瘤病毒16(HPV16)的E6和E7蛋白，通过2A序列与NS106蛋白的C末端框内融合。通过在4.100g和22℃下，离心30min来澄清病毒获取物。在2mM的Mg2+的存在下，澄清的获取物在室温下用Benzonase(20U/ml)处理2h。
将97ml的电导率为13mS/cm的经Benzonase处理的获取物(Benzonase-treatedharvest，HCB)负载至预先用50mM的HEPES、200mM的蔗糖、pH为7.5的缓冲液平衡的1ml的整体化CIM SO3柱上。用50mM的HEPES、200mM的蔗糖，在pH为7.5下洗涤后，在50mM的Hepes、pH为7.5、400mM的NaCl、200mM的蔗糖(逐步梯度)中洗脱病毒。
在HCB、SO3洗涤液、SO3流通物以及SO3洗脱液中的传染性滴度(infectioustiter)，通过TCID50测试确定。然而在洗脱液部分中发现了65％的传染性病毒，在流通物中检测到8％的病毒，这表明HCB的电导率过高，无法有效地将病毒与SO3柱结合。
示例2：1:1稀释病毒
A型H1N1 NS106-E6E7流感病毒在接种于细胞工厂的Vero细胞中生长。通过在4.100g和22℃下，离心30min来澄清病毒获取物。在2mM的Mg2+的存在下，澄清的获取物在室温下用Benzonase(20U/ml)处理2h。
50ml的HCB(电导率为13mS/cm)用50ml的50mM的Hepes、200mM的蔗糖，pH为7.0(电导率为700μS/cm)稀释，得到的电导率为7.05mS/cm，并负载至预先用50mM的HEPES缓冲液、200mM的蔗糖、pH为7.5的缓冲液平衡的1ml的整体化CIM SO3柱上。用50mM的HEPES、200mM的蔗糖、pH为7.5(电导率为1.2mS/cm)洗涤后，用线性NaCl梯度(最高2M NaCl)在50mM的Hepes、pH为7.5、200mM的蔗糖中洗脱病毒。在HCB、被稀释的HCB(SO3负载)、SO3洗涤液、SO3流通物以及SO3洗脱液中的传染性滴度通过TCID50测试确定。与先前的实验相反，在流通物中未检测到病毒，而在洗脱液部分中发现67％的病毒，这表明负载中的电导率足够低，以有效地将病毒与SO3柱结合。
示例3：2:1稀释病毒
A型H1N1 NS106-E6E7流感病毒在接种于细胞工厂的Vero细胞中生长。通过在4,100g和22℃下离心30min来澄清病毒获取物。在2mM的Mg2+的存在下，澄清的获取物在室温下用Benzonase(20U/ml)处理2h。
100ml的HCB(电导率为13mS/cm)用50ml的50mM的Hepes、200mM的蔗糖，pH为7.0(电导率为700μS/cm)稀释，得到的电导率为9.2mS/cm，并负载至预先用50mM的HEPES、200mM的蔗糖、pH为7.0的缓冲液平衡的0.1ml的整体化CIM SO3柱上。用50mM的HEPES、200mM的蔗糖、pH为7.5(电导率为1.2mS/cm)洗涤后，用线性NaCl梯度(最高2M NaCl)在50mM的Hepes、pH为7.5、200mM的蔗糖中洗脱病毒(图1)。在HCB、被稀释的HCB(SO3负载)、SO3洗涤液、SO3流通物以及SO3洗脱液中的传染性滴度通过FFA(荧光聚焦测试)确定。在流通物中仅发现1.5％的传染性病毒，而洗脱液中回收73％的传染性病毒。
动态结合容量经计算为10.5log10的FFU/ml的SO3柱体积。所述结合容量高于1.5log 10，因此比Bajac等人(2014)描述的高30倍。
B型流感病毒的纯化：
示例4
B型流感病毒NS106-E6E7病毒在接种于细胞工厂的Vero细胞中生长。B型流感NS106-E6E7病毒是B/Thueringen/02/06的衍生物，B型流感NS106-E6E7病毒缺少NS1开放阅读框的C端的175个氨基酸，因此仅表达NS1的N端106个氨基酸。将人类乳头瘤病毒16(HPV16)的E6和E7蛋白，通过2A序列框内融合到NS106蛋白的C末端。通过在4,100g和22℃下离心30min来澄清病毒获取物。在2mM的Mg2+的存在下，将澄清的获取物在室温下用Benzonase(20U/ml)处理2h。
将48ml的HCB(电导率为13.4mS/cm)负载至预先用50mM的HEPES、200mM的蔗糖、pH为7.0(电导率为700μS/cm)的缓冲液平衡的1ml的整体化CIM SO3柱上。用50mM的HEPES、200mM的蔗糖，pH为7.5(电导率为1.2mS/cm)洗涤后，用线性NaCl梯度(最高2M NaCl)在50mM的Hepes、pH为7.5、200mM的蔗糖中洗脱病毒。
在HCB、SO3洗涤液、SO3流通物以及SO3洗脱液中的传染性滴度通过TCID50测试确定。在流通物中发现了60％的传染性病毒，而洗脱液部分中仅回收了34％的传染性病毒，这表明HCB的电导率过高，无法有效地将病毒与SO3柱结合。
示例5
B型流感病毒NS106-E6E7病毒在接种于细胞工厂的Vero细胞中生长。通过在4,100g和22℃下离心30min来澄清病毒获取物。在2mM的Mg2+的存在下，澄清的获取物在室温下用Benzonase(20U/ml)处理2h。
将50ml的HCB(电导率13.4mS/cm)用50ml的50mM的Hepes、200mM的蔗糖，pH为7.0(电导率为700μS/cm)稀释，得到的电导率为7.04mS/cm，并负载至预先用50mM的HEPES、200mM的蔗糖、pH为7.0的缓冲液平衡的1ml的整体式CIM SO3柱上。用50mM的HEPES、200mM的蔗糖，pH为7.5(电导率1.2mS/cm)洗涤后，用线性NaCl梯度溶液(最高2M NaCl)在50mM的Hepes、pH为7.5、200mM的蔗糖中洗脱病毒。
在HCB、被稀释的HCB(SO3负载)、SO3洗涤液、SO3流通物以及SO3洗脱液中的传染性滴度通过TCID50测试确定。在流通物中发现少于0.1％的传染性病毒，而洗脱液部分中回收到84.5％的传染性病毒，这表明负载的电导率足够低，以有效地将病毒与SO3柱结合。
示例6
B型流感病毒NS106-E6E7病毒在接种于细胞工厂的Vero细胞中生长。通过在4.100g和22℃下，离心30min来澄清病毒获取物。在2mM的Mg2+的存在下，澄清的获取物在室温下用Benzonase(20U/ml)处理2h。
将300ml的HCB(电导率为13.4mS/cm)用300ml的50mM的Hepes、200mM的蔗糖，pH为7.0(电导率为700μS/cm)稀释，得到的电导率为7.6mS/cm，并负载至预先用50mM的HEPES缓冲液、200mM的蔗糖、pH为7.0平衡的1ml的整体化CIM SO3柱上。用50mM的HEPES、200mM蔗糖，pH为7.5(电导率为1.2mS/cm)洗涤后，用线性NaCl梯度(最高2M NaCl)在50mM的Hepes、pH为7.5、200mM的蔗糖中洗脱病毒(图2)。
在HCB、被稀释的HCB(SO3负载)、SO3洗涤液、SO3流通物以及SO3洗脱液中的传染性滴度通过FFA测试确定。在流通物中发现了仅有0.12％的传染性病毒，而洗脱液部分中仅回收了80.6％的传染性病毒，这证实了负载的电导率足够低，以有效地将病毒与SO3柱结合。
动态结合容量经计算为10.5log10FFU/ml的SO3柱体积。
示例7
确定有效病毒与SO3柱结合的最大电导率。
A型流感病毒或B型流感病毒在接种于细胞工厂的Vero细胞中生长。通过在4,100g和22℃下离心30min来澄清病毒获取物。在2mM的Mg2+的存在下，澄清的获取物在室温下用Benzonase(20U/ml)处理2h。HCB的电导率通常在14mS/cm的范围内。
含有最多9log10TCID50的10ml的HCB，用1.7ml的50mM的Hepes、pH为7.0、200mM的蔗糖(所得电导率约为12mS/cm)稀释，然后负载至预先用50mM的HEPES缓冲液、200mM的蔗糖、pH为7.0平衡的1ml的整体化CIM SO3柱上。用50mM HEPES、200mM蔗糖，pH为7.5(电导率为1.2mS/cm)洗涤后，用线性NaCl梯度在50mM Hepes、pH为7.5、200mM蔗糖中洗脱病毒。
在被稀释的HCB(＝SO3负载)、SO3洗涤液、SO3流通物以及SO3洗脱液中的传染性滴度通过TCID50或FFA测试确定。如果在流通物中发现多于1％的传染性病毒，则认为电导率对于有效的病毒结合而言过高。因此，必须逐渐降低SO3负载的电导率，直到在流通物中发现少于1％的病毒为止。
示例8
B型流感病毒NS106-E6E7病毒在接种于细胞工厂的Vero细胞中生长。通过在4.100g和22℃下离心30min来澄清病毒获取物。在2mM的Mg2+的存在下，澄清的获取物在室温下用(20U/ml)处理2h。
14.500ml的HCB(电导率为13.7mS/cm)用14.500ml的50mM的Hepes、200mM的蔗糖，pH为7.0(电导率为630μS/cm)稀释，得到的电导率为7.2mS/cm，并负载至预先用50mM的HEPES、200mM的蔗糖、pH为7.0(+2M NaCl)进行调节，并用50mM的HEPES、200mM的蔗糖，pH为7.0进行平衡的80ml的整体化CIM SO3柱上。用50mM的HEPES、200mM的蔗糖、50mM的NaCl，pH为7.5(电导率为5.0mS/cm)负载和洗涤后，用线性NaCl梯度(最高2M NaCl)在50mM的Hepes、200mM的蔗糖，pH为7.5中洗脱病毒。通过FFA测试确定传染性滴度。Vero宿主细胞蛋白含量和残留Vero细胞DNA，分别通过ELISA和qPCR分析。
传染性病毒回收率为83.4％。宿主细胞蛋白质消耗了99.7％，宿主细胞DNA消耗了99.99％以上。动态结合容量经计算为10.8 log10 FFU/ml的SO3柱体积。
示例9
B型流感病毒NS106-E6E7病毒在接种于细胞工厂的Vero细胞中生长。通过在4.100g和22℃下离心30min来澄清病毒获取物。在2mM的Mg2+的存在下，澄清的获取物在室温下用(20U/ml)处理2h。
95ml的HCB(电导率为14.5mS/cm)用95ml的50mM的Hepes、200mM的蔗糖，pH为7.0(电导率为700μS/cm)稀释，得到7.6mS/cm的电导率，并负载至预先用50mM的HEPES、200mM的蔗糖，pH为7.0(+2M NaCl)进行调节，并用50mM的HEPES、200mM的蔗糖，pH为7.0平衡的1ml的整体化CIM SO3柱上。负载后，用50mM的HEPES、200mM的蔗糖、50mM的NaCl，pH为7.5(电导率为6.3mS/cm)洗涤该柱。在50mM的Hepes、200mM的蔗糖，pH为7.5中，用线性NaCl梯度(最高2MNaCl)洗脱病毒。通过FFA测试确定传染性滴度。通过ELISA分析的含量。
洗脱液部分的病毒回收率为78％。99.48％的在洗脱液水平上被消耗。这对应于每10log10传染性病毒7.7ng的Benzonase。
示例10
B型流感病毒NS106-E6E7病毒在接种于细胞工厂的Vero细胞中生长。通过在4.100g和22℃下，离心30min来澄清病毒获取物。在2mM的Mg2+的存在下，澄清的获取物在室温下用Benzonase(20U/ml)处理2h。
95ml的HCB(电导率为14.5mS/cm)用95ml的50mM的Hepes、200mM的蔗糖，pH为7.0(电导率为700μS/cm)稀释，得到7.7mS/cm的电导率，并负载至预先用50mM的HEPES、200mM的蔗糖，pH为7.0(+2M NaCl)进行调节，并用50mM的HEPES、200mM的蔗糖，pH为7.0进行平衡的1ml整体化CIM SO3柱上。负载后，用50mM的HEPES、200mM的蔗糖、20mM的EDTA，pH为7.5(电导率为5.1mS/cm)和50mM的HEPES、200mM的蔗糖，pH为7.5洗涤该柱。在50mM的Hepes、200mM的蔗糖，pH为7.5中，用线性NaCl梯度(最高2M NaCl)洗脱病毒。通过FFA测定确定传染性滴度。通过ELISA分析的含量。
洗脱液部分的病毒回收率为90％。99,99％的在洗脱液水平上被消耗。每10log10的传染性病毒相当于0.3ng的与示例9相比，病毒洗脱液中的含量降低了96％。
示例11
10mL的OptiPro中的15000单位用5mL的50mM的HEPES、200mM的蔗糖，pH为7.0稀释，并负载至预先调节和平衡的0.1ml的整体化SO3柱上。负载后，用50mM的HEPES、200mM的蔗糖、75mM的NaCl，pH为7.5，或50mM的HEPES、200mM的蔗糖、20mM的EDTA，pH为7.5进行洗涤该柱，然后用50mM的HEPES、200mM的蔗糖，pH为7.5进行洗涤。在50mM的Hepes、200mM的蔗糖，pH为7.5中，使用线性NaCl梯度(最高2M NaCl)进行洗脱。通过SDS PAGE和银染分析了负载、洗涤和洗脱部分的含量。当用75mM的NaCl执行柱洗涤时，洗脱液中仍可检测到相反地，在用20mM的EDTA洗涤后，在洗脱液中未发现这证实了示例10的结果。

Claims (18)

1.一种从细胞培养物中纯化流感病毒颗粒的方法，其包括所示顺序的步骤：
a) 将细胞培养物在2000 g至4500 g的范围内进行离心，以获得含有病毒颗粒的上清液部分，
b) 用核酸酶孵育所述部分，
c) 用低电导率稀释缓冲液稀释所述部分，被稀释的部分的电导率在5 mS/cm至9.2mS/cm的范围内，
d) 将所述被稀释的部分进行SO3色谱步骤，
e) 用低电导率洗涤缓冲液执行洗涤步骤，所述洗涤缓冲液的电导率在1.2 mS/cm至5.1 mS/cm的范围内，以及
f) 洗脱病毒颗粒；
其中，所述稀释缓冲液和所述洗涤缓冲液各自选自由Hepes、Tris、Tris碱、磷酸钾、磷酸钠、Mops、Bis-Tris丙烷甘氨酸、Mes和Bis-Tris组成的组；
所述稀释缓冲液和所述洗涤缓冲液各自还包含渗透稳定剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中病毒颗粒在洗脱后还被稀释。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在洗脱之后，执行超滤和/或无菌过滤。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述SO3色谱是柱色谱。
5.据权利要求4所述的方法，其中所述SO3色谱是甲基丙烯酸酯整体柱。
6. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述被稀释的部分的电导率在7 mS/cm至8mS/cm的范围内。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述洗涤缓冲液还包含一种或多种添加剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述添加剂包含EDTA。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述渗透稳定剂包含蔗糖、山梨糖醇和/或甘露糖醇。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中以分步或线性梯度来洗脱病毒。
11.根据权利要求10所述的方法，其中以氯化钠梯度来洗脱病毒。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述流感病毒选自由A型流感病毒、B型流感病毒和C型流感病毒组成的组。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述流感病毒选自由流感病毒野生型和包含修饰的流感病毒组成的组，所述修饰包括取代突变、插入和/或缺失。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中细胞的培养是用宿主细胞执行的。
15.根据权利要求14所述的方法，其中细胞的培养是用Vero细胞执行的。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其中至少50%的宿主细胞蛋白被去除。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中至少95%的宿主细胞DNA被去除。
18.根据权利要求17所述的方法，其中至少99%的宿主细胞DNA被去除。
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