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CN111454993B - 一种决明子发酵物及其应用 - Google Patents

一种决明子发酵物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种决明子发酵物及其应用，涉及微生物发酵技术领域。包括以下步骤：(1)将20‑60份决明子、10‑30份豆粕和10‑30份麦麸粉碎，混匀后灭菌，得到混合物A，备用；(2)将混合物A接种于菌液中进行发酵处理，得到发酵产物；(3)将发酵产物用50％乙醇溶液搅拌提取，过滤、浓缩，得发酵物提取浓缩液，然后将浓缩液喷雾干燥得到发酵物提取粉；在实施过程中控制决明子和豆粕的重量份数之比可以有效提高发酵原料与菌种之间的相互作用，提高发酵过程中产孢量，从而提高了发酵效果；控制微生物以及助剂种类以及添加量，能够有效提高微生物之间的相互作用，可以有效提高药物有效成分的释放量。

Description

一种决明子发酵物及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种决明子发酵物及其应用。
背景技术
发酵法是中药炮制的传统方法，其具有节约药料、减毒增效的作用。虽然中药经发酵炮制，改变了以往的煎煮、蒸浸、炼制等常用工序，但药物疗效明显增强。如中药淡豆豉，是由桑叶或麻黄等发酵后制得，而采取不同的培养基，经过相同的微生物处理之后，药物的药性会发生明显变化，所以利用这一特性，可制得不同适应证的中药。现代中药发酵技术是在传统发酵技术上进一步创新发展，将中药发酵与生物工程学、微生态学等现代生物技术结合，对药材进行处理，前景广泛。
发酵在中药炮制中具有多种作用，(1)可以增强药物疗效：中药发酵炮制通过微生物与中药共同发酵，在此过程中微生物经发酵产生的次级代谢产物和药物成分相互协同、增强药效，其原因为次级代谢产物与药物发生作用的同时拓宽了代谢途径，甚至会产生明显不同的有效成分；(2)提高有效成分的提取率：中草药的有效成分大多包裹在其细胞壁内，致密坚硬的细胞壁是阻碍药物有效成分从细胞内溶出、妨碍体内吸收的屏障。因此，微生物对有效成分的提取发挥了一定作用，它能针对不同成分构成的壁结构，分泌各种胞外酶，使构成紧密的结构分解，使细胞与细胞间的空隙变大，不仅为细胞内外的物质扩散提供通道，还能提高有效成分的提取率、吸收利用率；(3)降低药物毒性：中药不是完全无害的，有些药物因其自身所含化学成分的种类多样，具有一定程度的毒性和刺激性，所以人们在使用时会出现一些副作用。有些药材经发酵处理后，其毒性或刺激性明显减弱，这是由于在微生物的作用下，毒性成分的结构发生改变，变成低毒甚至无毒的物质。
中药是我国的宝贵财富，但随着工业化的日益发展及不合理的开发利用，药用植物资源逐渐匮乏，野生中药材濒危，因此提高药用资源利用率是开发利用中药的有效途径之一。而作为中药炮制领域研究热点之一的发酵法，具有改变药物性质、提高疗效、减少毒副作用等优点，为我国丰富药用资源的进一步研究、开发，乃至中医药事业的发展拓宽了研究范围。
决明子为豆科植物决明或小决明的干燥成熟种子，具有清热明目，润肠通便的作用。药理实验证明决明子不仅具有较好的降血脂、抗动脉粥样硬化等作用，还具有降压、增强机体免疫力和抗衰老等多方面的作用。决明子中含有蒽醌类、萘骈吡喃酮类、多糖类等多种化学成分，其中蒽醌类化合物主要包括大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等，具有抗炎抑菌、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、神经保护、保肝护目、通便利尿、杀幼虫活性、抑制乙酰胆碱酯酶和β-分泌酶的作用；萘骈吡喃酮类化合物主要包括红镰霉素、去甲红镰霉素、决明子内酯、异决明种内酯、决明蒽酮、大黄酸-9-蒽酮等，具有抗糖尿病、抗菌、抗雌激素的作用；多糖类化合物主要包括果胶多糖、半纤维素、阿拉伯葡聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄糖醛酸木聚糖、中性半乳甘露聚糖等，具有抗氧化、免疫和抗肿瘤、治疗糖尿病及并发症、降血压血脂、调节胃肠道、保肝护目的作用，决明子是我国卫生部首批公布的药食同源药物之一。
中国专利申请201811439573.9中公开了一种具有辅助降血脂功效的决明子组合物，由决明子、山楂、大豆和大米经两次混合发酵制成，其制备过程是：首先将决明子、山楂、大豆按照配方比例接种纳豆菌进行发酵，制得的发酵物添加大米和红曲霉进行二次发酵，得到的决明子组合物中各活性组分具有明显的协同作用，在减少内源性脂质合成、促进脂质的转运和排泄、调节脂质代谢等多方面起到积极降血脂的作用，安全无毒无害。
中国专利申请201410692371.0中公开了一种以决明子乳酸菌发酵物为有效成分的便秘改善、治疗或预防用组合物及其制备方法，该发明的决明子乳酸菌发酵物长期使用安全性高，作为生药的副作用发生可能性小，能够用于便秘治疗或预防用药物组合物或者便秘改善或预防用保健功能食品。
根据以上现有技术的记载其主要目的是为了组合物中药物成分的协同作用，但是对于如何提高中药成分中有效成分的释放率并没有记载，本发明在实施过程中通过采用多种微生物发酵法得到的决明子发酵物中多种有效成分的含量明显提高。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明旨在提供一种决明子发酵物及其应用，本发明在实施过程中，采用多种微生物混合发酵得到的发酵物中药物有效成分的含量明显提高，使药物有效成分得到的充分释放，提高了决明子中药物成分的利用率。
一方面，本发明提供了一种决明子发酵物，包括以下步骤：
(1)将发酵原料进行粉碎，混匀后灭菌，得到混合物A，备用；
(2)将步骤(1)中得到的混合物A接种于菌液中进行发酵处理，得到发酵产物；
(3)将步骤(2)中得到的发酵产物用50％乙醇溶液搅拌提取，过滤、浓缩，得发酵物提取浓缩液，然后将浓缩液喷雾干燥得到发酵物提取粉。
上述步骤(1)中所述的发酵原料为决明子、豆粕和麦麸中的一种或几种；
优选地，上述步骤(1)中所述的发酵原料为决明子、豆粕和麦麸；
上述步骤(1)中所述的发酵原料，按重量份数计，包括：决明子20-60份、豆粕10-30份和麦麸10-30份。
优选地，上述步骤(1)中所述的发酵原料，按重量份数计，包括：决明子30-50份、豆粕15-25份和麦麸15-25份。
再优选地，上述步骤(1)中所述的发酵原料，按重量份数计，包括：决明子40-50份、豆粕18-22份和麦麸20-25份。
在一些具体实施方式，所述的决明子和豆粕的重量份数之比为1-6：1；优选地，所述的决明子和豆粕的重量份数之比为2-5:1；再优选地，所述的决明子和豆粕的重量份数之比为4-5:1。
上述步骤(2)中所述的菌液中菌种选自黑曲霉、白地霉、烟曲霉、乳酸如球菌、青霉、罗伊氏乳杆菌、格氏乳杆菌、唾液乳杆菌、青春双歧杆菌、粉状毕赤酵母和马克斯克鲁维酵母中的一种或几种；
优选地，所述的菌种选自黑曲霉、乳酸如球菌、唾液乳杆菌、粉状毕赤酵母和马克斯克鲁维酵母中的一种或几种；
再优选地，所述的菌种选自黑曲霉、唾液乳杆菌和马克斯克鲁维酵母。
进一步优选地，所述的唾液乳杆菌、马克斯克鲁维酵母和黑曲霉的添加量之比为5-10：3-5：1；优选为8-10：4-5：1；再优选为9-10：5：1；进一步优选为10：5：1。
所述的菌种的加入量为发酵原料的5-10％，优选地，所述的菌种的加入量为发酵原料的5％、6％、7％、8％、9％或10％。
在一些优选实施例中，所述的菌液中还含有助剂，所述的助剂为质量比2-3：1的蔗糖和脱脂奶。
所述的助剂的加入量为发酵原料的2-5％；优选地，所述的助剂的加入量为发酵原料的2％、3％、4％或5％。
发酵时间为36-48小时。
在实施过程中意外地发现在发酵过程中，在菌液中加入一定含量的助剂可以有效提高菌种的存活率，从而有助于提高微生物的发酵效果，进而提高药物有效成分的释放率。
另一方面，本发明还提供了一种以上述决明子发酵物为有效成分在制备抗炎抑菌、抗肿瘤、降血脂、保肝护目药物组合物中的应用。
所述的药物组合物可以为粉末、颗粒、片状、胶囊或糖浆等的制剂。
所述的药物组合物还包括保健食品上可接受的矫味剂、填充剂或乳化剂。
本发明提供了一种决明子发酵物，具体包括以下步骤：
(1)将20-60份决明子、10-30份豆粕和10-30份麦麸进行粉碎，混匀后灭菌，得到混合物A，备用；
(2)将步骤(1)中得到的混合物A接种于添加量之比5-10：3-5：1的唾液乳杆菌、马克斯克鲁维酵母和黑曲霉的混合菌种的菌液中进行发酵处理，得到发酵产物；
(3)将步骤(2)中得到的发酵产物用50％乙醇溶液搅拌提取，过滤、浓缩，得发酵物提取浓缩液，然后将浓缩液喷雾干燥得到发酵物提取粉。
所述的黑曲霉、唾液乳杆菌和马克斯克鲁维酵母的活菌数1×104-1×106CFU/mL。
所述的菌种的加入量为发酵原料的5-10％，优选地，所述的菌种的加入量为发酵原料的5％、6％、7％、8％、9％或10％。
在一些优选实施例中，所述的菌液中还含有助剂，所述的助剂为质量比2-3：1的蔗糖和脱脂奶；优选地，所述的助剂为质量比2：1或3：1的蔗糖和脱脂奶。
另一方面，本发明还提供了一种以上述决明子发酵物为有效成分在制备抗炎抑菌、抗肿瘤、降血脂、保肝护目药物组合物中的应用。
所述的药物组合物可以为粉末、颗粒、片状、胶囊或糖浆等的制剂。
所述的药物组合物还包括保健食品上可接受的矫味剂、填充剂或乳化剂。
与现有技术相比本发明的有益效果在于：
(1)本发明在实施过程中控制发酵原料中决明子和豆粕的重量份数之比为1-6:1，可以有效提高发酵原料与菌种之间的相互作用，提高发酵过程中产孢量，从而提高了发酵效果；
(2)本发明使用混合菌种进行发酵，在实施过程中控制微生物唾液乳杆菌、马克斯克鲁维酵母和黑曲霉的添加量之比为5-10：3-5：1，采用混合菌种发酵能够有效提高微生物之间的相互作用，提高发酵效率，缩短发酵时间；
(3)本发明为了使发酵效果更好，微生物存活时间更长，在菌液中添加了一定量的助剂，即质量比为质量比2-3：1的蔗糖和脱脂奶，可以明显提高为微生物的存活时间，提高发酵效果，促进药物有效成分的充分释放。
具体实施方式
下面通过具体的实施方式叙述本发明，除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
其中，唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，编号：CICCNo.23174，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；
马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)，编号：CICCNo.1276，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；
黑曲霉(Aspergillus niger)，编号CICCNo.2108，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
另外，本发明所使用的原料即试剂均有市售，本发明所采用的单位可以是：份、百分数、克或千克，根据需要加以选择。
实施例1一种决明子发酵物
具体包括以下步骤：
(1)将20份决明子、10份豆粕和10份麦麸进行粉碎，混匀后灭菌，得到混合物A，备用；
(2)将步骤(1)中得到的混合物A接种于添加量比5：3：1的唾液乳杆菌、马克斯克鲁维酵母和黑曲霉且含助剂的菌液中，加入量为3.6份，进行发酵处理，得到发酵产物；
(3)将步骤(2)中得到的发酵产物用50％乙醇溶液搅拌提取1小时，得提取液过滤、滤液浓缩，得发酵物提取浓缩液，然后将浓缩液喷雾干燥得到发酵物提取粉。
所述的菌液中的助剂为1.2份质量比2：1的蔗糖和脱脂奶。
实施例2一种决明子发酵物
具体包括以下步骤：
(1)将60份决明子、30份豆粕和30份麦麸进行粉碎，混匀后灭菌，得到混合物A，备用；
(2)将步骤(1)中得到的混合物A接种于添加量比5：5：1的唾液乳杆菌、马克斯克鲁维酵母和黑曲霉且助剂的菌液中，加入量为10.56份，进行发酵处理，得到发酵产物；
(3)将步骤(2)中得到的发酵产物用50％乙醇溶液搅拌提取2小时，得提取液过滤、滤液浓缩，得发酵物提取浓缩液，然后将浓缩液喷雾干燥得到发酵物提取粉。
所述的菌液中的助剂为2.4份质量比3：1的蔗糖和脱脂奶。
实施例3一种决明子发酵物
具体包括以下步骤：
(1)将60份决明子、10份豆粕和15麦麸进行粉碎，混匀后灭菌，得到混合物A，备用；
(2)将步骤(1)中得到的混合物A接种于添加量比10：3：1的唾液乳杆菌、马克斯克鲁维酵母和黑曲霉并含助剂的菌液中，加入量为8.33份，进行发酵处理，得到发酵产物；
(3)将步骤(2)中得到的发酵产物用50％乙醇溶液搅拌提取1.5小时，得提取液过滤、滤液浓缩，得发酵物提取浓缩液，然后将浓缩液喷雾干燥得到发酵物提取粉。
所述的菌液中的助剂为3.4份质量比3：1的蔗糖和脱脂奶。
实施例4一种决明子发酵物
具体包括以下步骤：
(1)将50份决明子、10份豆粕和25份麦麸进行粉碎，混匀后灭菌，得到混合物A，备用；
(2)将步骤(1)中得到的混合物A接种于添加量比10：5：1的唾液乳杆菌、马克斯克鲁维酵母和黑曲霉并含助剂的菌液中，加入量为6.8份，进行发酵处理，得到发酵产物；
(3)将步骤(2)中得到的发酵产物用50％乙醇溶液搅拌提取2小时，得提取液过滤、滤液浓缩，得发酵物提取浓缩液，然后将浓缩液喷雾干燥得到发酵物提取粉。
所述的菌液中的助剂为4.25份质量比3：1的蔗糖和脱脂奶。
对比例1-6一种决明子发酵物
与实施例4的区别在于：具体数据见下表1，(单位为：份)
表1
Figure BDA0002451393730000071
对比例1-6的制备方法，除各组分含量不同外，其他操作与步骤与实施例4相同。
对比例7
与实施例4的区别在于：唾液乳杆菌、马克斯克鲁维酵母和黑曲霉的添加量比为2：5：3，即唾液乳杆菌1.36份、马克斯克鲁维酵母3.4份和黑曲霉2.04份，其他操作与步骤与实施例4相同。
对比例8
与实施例4的区别在于：助剂中蔗糖和脱脂奶的质量比0.7：1，即蔗糖1.75份，脱脂奶2.5份，其他操作与步骤与实施例4相同。
对比例9
与实施例4的区别在于：助剂中仅有蔗糖，即蔗糖4.25份，其他操作与步骤与实施例4相同。
对比例10
与实施例4的区别在于：决明子与豆粕的重量份数之比为0.5：1，即决明子20份、豆粕40份，其他操作与步骤与实施例4相同。
对比例11
与实施例4的区别在于：决明子和豆粕的重量份数之比为9：1，即决明子54份、豆粕6份，其他操作与步骤与实施例4相同。
试验例1活菌数检测
分别在发酵0小时、6小时、12小时、24小时、48小时的时间节点取相同体积的发酵产物，测量发酵产物中活菌数量，具体检测结果见下表2。
表2 活菌数检测
Figure BDA0002451393730000081
根据上表2的检测数据可以看出，本发明实施例中发酵48小时后活菌数明显增加，通过控制组分之间的质量比能够有效提高发酵原料与菌种之间的相互作用，提高发酵过程中产孢量，从而提高了发酵效果，而对比例改变组分质量比不在本发明公开的保护范围内，或者减少一种组分会明显影响发酵过程中的活菌数，从而影响发酵效果。
试验例2药物有效成分的检测
检测方法：取决明子发酵前样品、实施例1-4以及对比例1-11得到的发酵产物，以甲醇为提取溶剂，料液比为1:10,室温超声提取30分钟，提取液滤膜滤过，滤过液待测备用；
色谱柱：C18-ODS反相柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇(A)-0.1％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(A的体积分数为0-33min为63％，33-40min63-75％，40-60min为75-95％)；流速：1mL·min-1；柱温：25℃；检测波长：280nm。各峰的分离度均＞1.5，理论塔板数按大黄酚峰计算应该≥3000，检测结果见下表3和表4。
变化率％＝(发酵后的提取率-发酵前的提取率)/发酵前的提取率×100％
表3 发酵前决明子和实施例1-4及对比例1-6发酵后决明子中蒽醌类成分含量测定结果(mg·g-1)
Figure BDA0002451393730000091
根据上表3的检测数据，可以看出发酵后蒽醌含量总体呈上升趋势，但是实施例1-4芦荟大黄素、大黄酸和大黄素增加幅度比较小，仅为增加10％左右，而大黄酚增加120％左右，大黄素甲醚增加40％左右，说明本发明提供的发酵方法有利于有效成分蒽醌的释放，但是根据发酵结果看，发酵后游离型蒽醌含量呈上升趋势，说明决明子通过发酵有利于活性成分蒽醌苷元的增加；根据对比例1-6的检测数据可以看出减少组分中某一种成分会明显影响决明子中有效成分的释放决明子中有效成分的提取率较实施例明显降低。
表4 对比例7-11发酵后决明子中蒽醌类成分含量测定结果(mg·g-1)
Figure BDA0002451393730000101
根据上表4的检测数据可以看出，改变发酵组分中某两种或几种成分的质量比不在本发明的保护范围内时，得到的发酵物中有效成分的含量较发酵前虽有所增加，但是其增加量较实施例4所有降低，由此可知发酵过程中只有使用本发明公开的组分及含量时，发酵效果才最好，得到的产物有效成分含量释放率高，进而提取率高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种决明子发酵物，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
（1）将发酵原料进行粉碎，混匀后灭菌，得到混合物A，备用；
（2）将发酵菌种接种于步骤（1）中得到的混合物A中进行发酵处理，得到发酵产物；
（3）将步骤（2）中得到的发酵产物用50%乙醇溶液搅拌提取，过滤、浓缩，得发酵物提取浓缩液，然后将浓缩液喷雾干燥得到发酵物提取粉；
步骤（1）中所述的发酵原料，按重量份数计，包括：决明子20-60份、豆粕10-30份和麦麸10-30份；
所述的决明子和豆粕的重量份数之比为1-6：1；
所述的菌种为唾液乳杆菌、马克斯克鲁维酵母和黑曲霉；
所述的唾液乳杆菌、马克斯克鲁维酵母和黑曲霉的添加量之比为5-10：3-5：1；
步骤（2）中所述的菌液中还含有助剂，所述的助剂为质量比2-3：1的蔗糖和脱脂奶。
2.根据权利要求1所述的决明子发酵物，其特征在于：步骤（1）中所述的发酵原料，按重量份数计包括：决明子30-50份、豆粕15-25份和麦麸15-25份。
3.根据权利要求1所述的决明子发酵物，其特征在于：所述的菌种的加入量为发酵原料的5-10%。
4.根据权利要求1所述的决明子发酵物，其特征在于：所述的助剂的加入量为发酵原料的2-5%。
5.一种如权利要求1所述的决明子发酵物在制备抗炎抑菌、抗肿瘤、降血脂、保肝护目药物组合物中的应用。
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