CN111411065B

CN111411065B - 一种基于人工双碳源的产n-乙酰神经氨酸的重组菌

Info

Publication number: CN111411065B
Application number: CN202010237111.XA
Authority: CN
Inventors: 刘延峰; 刘龙; 张晓龙; 堵国成; 李江华; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2040-03-30
Also published as: CN111411065A

Abstract

本发明公开了一种基于人工双碳源的产N‑乙酰神经氨酸的重组菌，属于遗传工程领域。本发明通过在枯草芽孢杆菌中以启动子P6过表达甘油激酶，并强化氨基葡萄糖‑6‑磷酸‑N‑乙酰基转移酶和N‑乙酰氨基葡萄糖异构酶，使重组枯草芽孢杆菌可以葡萄糖和甘油双碳源生长、合成，并提高N‑乙酰神经氨酸的产量，使摇瓶水平下的产量提高至8.7g/L。

Description

一种基于人工双碳源的产N-乙酰神经氨酸的重组菌

技术领域

本发明涉及一种基于人工双碳源的产N-乙酰神经氨酸的重组菌，属于遗传工程领域。

背景技术

N-乙酰神经氨酸是一种功能性单糖，广泛存在于微生物以及哺乳动物体内。在人体中，N-乙酰神经氨酸参与细胞识别、信号转导等多个生理过程。因此，N-乙酰神经氨酸被广泛应用于增强婴儿免疫力，促进婴儿大脑发育。目前，N-乙酰神经氨酸主要采取天然产物提取法(鸡蛋、燕窝等)，存在其他产物难以分离，且成本较高；另外可以通过全细胞转化的方法获得，但是需要成本较高的底物乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸为底物，由于底物转化率较低，导致神经氨酸生产成本较高。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此以枯草芽孢杆菌为宿主，通过代谢工程改造，以葡萄糖等廉价碳源为底物，高效从头合成神经氨酸是一种有效的策略。

目前在枯草中构建的N-乙酰神经氨酸代谢途径主要通过N-乙酰氨基葡萄糖为前体的NeuB关键酶合成途径，由于胞内磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)浓度较低，限制了神经氨酸的合成效率。这个问题的存在严重限制了神经氨酸产量的提高，进一步限制了其市场应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种可利用双碳源的枯草芽孢杆菌，可解除葡萄糖存在时的碳源代谢分解阻遏效应，高效供给胞内PEP浓度。

本发明的第一个目的是提供一种可以利用人工双碳源葡萄糖和甘油双碳源生长、合成的枯草芽孢杆菌，以SEQ ID NO.11所示的组成型启动子过表达甘油激酶；所述甘油激酶含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌还过表达氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)和N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)。

在一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌还过表达脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)来源的N-乙酰神经氨酸合酶。

在一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，并通过SEQ ID NO.9所示的P1启动子调控表达。

在一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶通过SEQ ID NO.9所示的P1启动子调控表达。

在一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶通过SEQ ID NO.10所示的P10启动子调控表达。

本发明的第二个目的是提供一种N-乙酰神经氨酸的合成方法，是以葡萄糖和甘油为碳源，应用上述任一所述的枯草芽孢杆菌进行发酵。

在一种实施方式中，所述葡萄糖的含量为40～80g/L，所述甘油的含量为10～20g/L。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌的培养基还含有：胰蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和硫酸镁。

在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌接种在LB培养基中，培养12～18h获得种子液，再以1～10％的接种量转接至发酵培养基中进行发酵。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌在30～37℃发酵16～72h。

本发明还要求保护所述重组枯草芽孢杆菌在制备含N-乙酰神经氨酸或其衍生产品中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是用于制备药物或保健品。

在一种实施方式中，所述衍生产品包括但不限于抗病毒药物扎那米韦(Zanamivir)或奥司他韦(Oseltamivir)。

有益效果：

(1)本发明通过以组成型启动子P6过表达甘油激酶，使枯草芽孢杆菌能够利用人工双碳源葡萄糖和甘油双碳源，克服了葡萄糖存在时的碳源代谢分解阻遏效应，提高了胞内磷酸烯醇式丙酮酸的供应；

(2)本发明通过启动子合理调控甘油激酶基因的整合表达，使重组枯草芽孢杆菌的N-乙酰神经氨酸产量提高至8.7g/L。

具体实施方式

甘油激酶(glpK)的氨基酸列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)的氨基酸列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)的酶氨基酸列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQID NO.8所示；

P1启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；P2启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；P3启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；P6启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；P10启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

N-乙酰神经氨酸枯草芽孢杆菌培养条件：

发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨6，酵母粉12，硫酸铵6，磷酸氢二钾12.5，磷酸二氢钾2.5，硫酸镁3，葡萄糖60g/L，甘油20g/L。

培养条件：37℃、200rpm，条件下培养72h。

N-乙酰神经氨酸检测方法：

Agilent液相色谱：色谱柱为Aminex HPX-87H column(300×7.8mm)，紫外210nm检测吸收峰，流动相为10mM硫酸，流速为0.5mL/min。N-乙酰神经氨酸出峰时间约为9.8分钟。实施例1构建基因组重组整合Gna1片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物Gna1-L-F:5’-CGTGATATCGTCATTCAGTCTCTTGAACGCCA-3’和Gna1-L-R:5’-CGCAATAACGCAGGCGTTCTGTGACATTAACTTATTTCATGTTCTTTTTAGTTAGACGATT TTAATACAAGCCTCGCCA-3’，扩增重组整合Gna1左臂基因片段；

合成如SEQ ID NO.9所示的P1启动子片段；

合成如SEQ ID NO.4所示的编码Gna1的基因片段；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物Gna1-R-L：5’-ATAACTTGTCAGACTGCCGGGAAATCCCGGCAGTCTTTTTTCCATTAAAACACGGCCCAGTCATAAAATAGTTTTCCTAATAAGACCTGG-3’和Gna1-R-R：5’-CCTACTTAAGCTGCTACCACTTGTGA-3’，扩增重组整合Gna1右臂基因片段。

将Gna1左臂基因片段、启动子片段(SEQ ID NO.9所示)、Gna1的基因片段和Gna1右臂基因片段通过融合PCR获得重组整合，通过融合PCR技术，构建成重组整合Gna1基因片段，将重组整合Gna1基因的片段命名为Gna1-1。

实施例2构建基因组重组整合Age片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物Age-L-F:5’-CGTGATATCGTCATTCAGTCTCTTGAACGCCA-3’和Age-L-R:5’-CGCAATAACGCAGGCGTTCTGTGACATTAACTTATTTCATGTTCTTTTTAGTTAGACGATTTTAATACAAGCCTCGCCA-3’，扩增重组整合Age片段左臂基因序列；

合成如SEQ ID NO.12所示的P2启动子片段；合成如SEQ ID NO.6所示的编码Age的基因片段；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物Age-R-L：5’-ATAACTTGTCAGACTGCCGGGAAATCCCGGCAGTCTTTTTTCCATTAAAACACGGCCCAGTCATAAAATAGTTTTCCTAATAAGACCTGG-3’和Age-R-R：5’-ATAACCAACGCAGCAAGTGGCAACCT-3’，扩增重组整合Age右臂基因片段。

将Age片段左臂基因序列、启动子片段(SEQ ID NO.10所示)、Age基因片段和Age片段右臂基因序列通过融合PCR技术构建成重组整合Age基因片段，并将其命名为Age-2。

实施例3构建基因组重组整合NemNeuB片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物NemNeuB-L-F:5’-CGGTGTCTGTATATCACAAAAATAGTGAGCAGGGTAACGA-3’和NemNeuB-L-R:5’-CGCAATAACGCAGGCGTTCTGTGACATTAACTTATTTCCACCTATTTTGTTACAGCGTGTGCCACTTTTATGCA-3’，扩增重组整合NemNeuB左臂基因片段；

合成如SEQ ID NO.9所示的P1启动子片段；合成如SEQ ID NO.8所示的编码NemNeuB的基因片段；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物NemNeuB-R-L：5’-TAACTTGTCAGACTGCCGGGAAATCCCGGCAGTCTTTTTTCCATTAAAACACGGCGCTTGAACAGCTTTTTTTGAATACCTTGTCCAGCT-3’和NemNeuB-R-R：5’-GCGTCATCGCAGTTTTTGCACCTGACT-3’，扩增重组整合NemNeuB右臂基因片段。

将NemNeuB左臂基因片段、启动子片段(SEQ ID NO.9所示)、NemNeuB基因片段和NemNeuB右臂基因片段通过融合PCR技术，构建成重组整合NemNeuB基因片段，将其命名为NemNeuB-1。

实施例4构建基因组重组整合P6-glpk片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物glpK-L-F:5’-GTCGTACTGCCATCTGTTTCTGTATACATTCTCCCAAT-3’和glpK-L-R:5’-CGCAATAACGCAGGCGTTCTGTGACATTAACTTATTTCTTTTTACCTTGTGATAAACAGGCACATGACGGCA-3’，扩增重组整合glpK左臂基因片段；

合成如SEQ ID NO.11所示的P6启动子片段；合成如SEQ ID NO.2所示的编码glpK的基因片段；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物glpK-R-L：5’-GAATAACTTGTCAGACTGCCGGGAAATCCCGGCAGTCTTTTTTCCATTAAAACACGGCCCGCTGTCCTTGTTTTTTTCAGTCAATATTGC-3’和glpK-R-R：5’-GACATTTGCAGCGCCGGTTATCGCTCA-3’，扩增重组整合glpK右臂基因片段。

分别将glpk左臂基因片段、P6启动子片段(SEQ ID NO.11所示)、glpk基因片段和glpk右臂基因片段通过融合PCR技术，构建成重组整合glpK基因片段，将其命名为glpK-6。

实施例5重组整合Gna1基因的枯草芽孢杆菌的构建

将实施例1构建的重组整合Gna1-1的基因片段转化至枯草芽孢杆菌BSGN6-comK(构建方法公开于论文《Modular pathway engineering of key carbon-precursorsupply-pathways for improved N-acetylneuraminic acid production in Bacillussubtilis》)基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌工程菌命名为BS-Gna1。

实施例6重组整合Age基因的枯草芽孢杆菌的构建

将实施例2构建的重组整合Age-2的基因片段转化至实施例5构建的重组枯草芽孢杆菌BS-Gna1基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌工程菌命名为BSG-Age-2。

实施例7重组整合NemNeuB基因的枯草芽孢杆菌的构建

将实施例3构建的重组整合NemNeuB-1的基因片段转化至实施例6构建的重组枯草芽孢杆菌BSG-Age-2基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌工程菌命名为BSGA-NemNeuB-1。

实施例8重组整合P6-glpK的枯草芽孢杆菌的构建

将实施例4构建的重组整合glpk-6的基因片段转化至实施例7构建的重组枯草芽孢杆菌BSGA-NemNeuB-1基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌命名为BSGAN-glpk-6。

将重组枯草芽孢杆菌BSGAN-glpk-6接种于LB培养基中培养12～18小时，获得OD约为6的种子液，再将种子液按体积计，以1％的接种量接种于发酵培养基中，于37℃、200rpm下培养72h，测定发酵液中的NeuAc产量为8.7g/L。

对比例1：未整合P6-glpK的重组枯草芽孢杆菌生产NeuAc

将按照实施例7的方法制备的重组枯草芽孢杆菌BSGA-NemNeuB-1接种于LB培养基中培养12～18小时，获得OD约为6的种子液，再将种子液按体积计，以1％的接种量接种于发酵培养基中，于37℃、200rpm下培养72h，测定发酵液中的NeuAc产量为7.6g/L。

对比例2：

按照实施例4相同的策略，区别在于，将启动子分别替换为SEQ ID NO.9的P1启动子、SEQ ID NO.12的P2启动子，以及SEQ ID NO.13的P3启动子，构建重组整合glpk片段，并按照实施例8的方式将重组整合glpk片段转化至枯草芽孢杆菌BSGA-NemNeuB-1基因组上，在相同条件下发酵。结果显示，发酵相同时间后的N-乙酰神经氨酸产量分别为7.4g/L、7.2g/L和7.5g/L，低于本发明产量的8.7g/L。

表1不同启动子强化glpk对N-乙酰神经氨酸产量的影响

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种基于人工双碳源的产N-乙酰神经氨酸的重组菌

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 496

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Glu Thr Tyr Ile Leu Ser Leu Asp Gln Gly Thr Thr Ser Ser Arg

1 5 10 15

Ala Ile Leu Phe Asn Lys Glu Gly Lys Ile Val His Ser Ala Gln Lys

20 25 30

Glu Phe Thr Gln Tyr Phe Pro His Pro Gly Trp Val Glu His Asn Ala

35 40 45

Asn Glu Ile Trp Gly Ser Val Leu Ala Val Ile Ala Ser Val Ile Ser

50 55 60

Glu Ser Gly Ile Ser Ala Ser Gln Ile Ala Gly Ile Gly Ile Thr Asn

65 70 75 80

Gln Arg Glu Thr Thr Val Val Trp Asp Lys Asp Thr Gly Ser Pro Val

85 90 95

Tyr Asn Ala Ile Val Trp Gln Ser Arg Gln Thr Ser Gly Ile Cys Glu

100 105 110

Glu Leu Arg Glu Lys Gly Tyr Asn Asp Lys Phe Arg Glu Lys Thr Gly

115 120 125

Leu Leu Ile Asp Pro Tyr Phe Ser Gly Thr Lys Val Lys Trp Ile Leu

130 135 140

Asp Asn Val Glu Gly Ala Arg Glu Lys Ala Glu Lys Gly Glu Leu Leu

145 150 155 160

Phe Gly Thr Ile Asp Thr Trp Leu Ile Trp Lys Met Ser Gly Gly Lys

165 170 175

Ala His Val Thr Asp Tyr Ser Asn Ala Ser Arg Thr Leu Met Phe Asn

180 185 190

Ile Tyr Asp Leu Lys Trp Asp Asp Glu Leu Leu Asp Ile Leu Gly Val

195 200 205

Pro Lys Ser Met Leu Pro Glu Val Lys Pro Ser Ser His Val Tyr Ala

210 215 220

Glu Thr Val Asp Tyr Arg Phe Phe Gly Lys Asn Ile Pro Ile Ala Gly

225 230 235 240

Ala Ala Gly Asp Gln Gln Ser Ala Leu Phe Gly Gln Ala Cys Phe Glu

245 250 255

Glu Gly Met Gly Lys Asn Thr Tyr Gly Thr Gly Cys Phe Met Leu Met

260 265 270

Asn Thr Gly Glu Lys Ala Ile Lys Ser Glu His Gly Leu Leu Thr Thr

275 280 285

Ile Ala Trp Gly Ile Asp Gly Lys Val Asn Tyr Ala Leu Glu Gly Ser

290 295 300

Ile Phe Val Ala Gly Ser Ala Ile Gln Trp Leu Arg Asp Gly Leu Arg

305 310 315 320

Met Phe Gln Asp Ser Ser Leu Ser Glu Ser Tyr Ala Glu Lys Val Asp

325 330 335

Ser Thr Asp Gly Val Tyr Val Val Pro Ala Phe Val Gly Leu Gly Thr

340 345 350

Pro Tyr Trp Asp Ser Asp Val Arg Gly Ser Val Phe Gly Leu Thr Arg

355 360 365

Gly Thr Thr Lys Glu His Phe Ile Arg Ala Thr Leu Glu Ser Leu Ala

370 375 380

Tyr Gln Thr Lys Asp Val Leu Asp Ala Met Glu Ala Asp Ser Asn Ile

385 390 395 400

Ser Leu Lys Thr Leu Arg Val Asp Gly Gly Ala Val Lys Asn Asn Phe

405 410 415

Leu Met Gln Phe Gln Gly Asp Leu Leu Asn Val Pro Val Glu Arg Pro

420 425 430

Glu Ile Asn Glu Thr Thr Ala Leu Gly Ala Ala Tyr Leu Ala Gly Ile

435 440 445

Ala Val Gly Phe Trp Lys Asp Arg Ser Glu Ile Ala Asn Gln Trp Asn

450 455 460

Leu Asp Lys Arg Phe Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Lys Arg Asn Glu

465 470 475 480

Leu Tyr Lys Gly Trp Gln Lys Ala Val Lys Ala Ala Met Ala Phe Lys

485 490 495

<210> 2

<211> 1491

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggaaacgt acattttatc cttagatcag gggacgacaa gttcaagagc gattctgttt 60

aataaagaag gcaaaattgt ccactctgct caaaaggaat ttacacaata cttcccgcat 120

cctggctggg ttgagcataa tgccaatgaa atttggggct ctgtcctcgc ggttatcgcc 180

tcagtcatct ctgaatcagg aatcagcgct tctcaaattg ccggcatcgg catcacgaac 240

cagcgcgaga cgacggttgt gtgggataaa gatacaggaa gtcctgtcta taatgcaatc 300

gtttggcagt ccagacagac gtccggcatt tgtgaggaac ttcgtgaaaa aggatataat 360

gataaattca gagaaaaaac agggctttta atcgatcctt acttctccgg cacgaaggtg 420

aagtggattt tagacaatgt ggaaggcgca agagaaaaag cggaaaaagg cgagctgctg 480

tttggaacga ttgatacgtg gctcatttgg aaaatgtcag gcggaaaagc gcatgtgacc 540

gattactcca atgcctcaag aacactgatg tttaatattt acgatttaaa atgggacgat 600

gaactgctcg acattctagg cgtaccgaaa tccatgctcc ctgaagtgaa gccgtcctct 660

catgtgtatg cggagactgt tgattatagg ttcttcggaa aaaatatccc gattgctgga 720

gcggcaggcg accagcagtc cgcattgttc ggccaggcat gctttgaaga aggcatgggg 780

aaaaacactt acggcacagg atgtttcatg ctgatgaata ccggggaaaa agcaattaag 840

tccgaacatg ggcttttgac aacaatcgct tggggcattg acggaaaagt gaactatgcg 900

ttagaaggga gcatttttgt cgcaggctct gccatccagt ggcttagaga cggtttgaga 960

atgttccagg attcatcgct aagcgaatct tatgcagaaa aagtggattc aactgacggc 1020

gtgtatgttg ttccagcatt tgtcggactg ggaacgcctt actgggacag cgatgtgcgc 1080

ggttcggttt tcggcctgac aagagggaca acaaaagagc actttatccg tgcgacactg 1140

gagtcattgg cttatcagac caaagatgtg cttgacgcaa tggaagcaga ttcaaacatt 1200

tcattaaaga cgctccgtgt agacggagga gctgtaaaaa acaatttcct aatgcagttc 1260

caaggagacc tgttgaatgt tcctgtggag cgcccggaaa ttaatgaaac gactgcactt 1320

ggcgcggctt atttggcggg tatcgctgtg ggattctgga aggaccgttc tgaaatcgcg 1380

aaccagtgga atctggataa acggtttgag cctgaattgg aagaagaaaa acgaaatgag 1440

ctgtataaag gctggcaaaa agccgtgaaa gcagctatgg cttttaaata a 1491

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

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Ser Lys Gly Tyr Val Asp Leu Leu Ser Gln Leu Thr Ser Val Gly Asn

35 40 45

Leu Asp Gln Glu Ala Phe Glu Lys Arg Phe Glu Ala Met Arg Thr Ser

50 55 60

Val Pro Asn Tyr His Ile Val Val Ile Glu Asp Ser Asn Ser Gln Lys

65 70 75 80

Val Val Ala Ser Ala Ser Leu Val Val Glu Met Lys Phe Ile His Gly

85 90 95

Ala Gly Ser Arg Gly Arg Val Glu Asp Val Val Val Asp Thr Glu Met

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Arg Arg Gln Lys Leu Gly Ala Val Leu Leu Lys Thr Leu Val Ser Leu

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Gly Lys Ser Leu Gly Val Tyr Lys Ile Ser Leu Glu Cys Val Pro Glu

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Leu Leu Pro Phe Tyr Ser Gln Phe Gly Phe Gln Asp Asp Cys Asn Phe

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Met Thr Gln Arg Phe

165

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atgagaacaa gcgtaccgaa ttatcacatc gtagtaattg aggattccaa cagccagaaa 240

gtggtggcgt ctgctagttt ggttgttgaa atgaaattca ttcatggggc cggatcaagg 300

ggtcgtgttg aagatgttgt cgtcgataca gaaatgcgcc ggcaaaaatt aggtgccgtg 360

cttttaaaaa ctttggtgtc acttggcaaa tctttaggcg tctacaaaat aagcctcgaa 420

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Leu Asn Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Asn His Ser Leu Asp Ser Glu

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165 170 175

Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Gln Glu Thr

180 185 190

Leu Glu Asn Val Leu Ala Ala Thr Val Gln Glu Val Met Gly Asp Phe

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acatatccgg gaacaagacc gatgaaagct ttagccgttc cgatgattct ggcgaacctg 540

acacttgaaa tggaatggtt actgccgcaa gaaacactgg aaaatgtgct tgctgccaca 600

gtccaggaag ttatgggcga ttttcttgat caagaacagg gattaatgta tgaaaacgtc 660

gctccggatg gctcacatat cgattgcttt gaaggacgcc tgattaatcc gggccatgga 720

atcgaagcga tgtggtttat tatggatatc gctagacgca aaaacgatag caaaacaatc 780

aaccaggcgg ttgatgttgt gttaaatatc ctgaactttg cttgggataa cgaatacggc 840

ggactttact actttatgga tgcagcgggc catccgccgc aacagctgga atgggatcaa 900

aaactttggt gggtgcatct tgaaagctta gtcgcactgg cgatgggcta tagattaaca 960

ggacgcgatg catgttgggc gtggtatcaa aaaatgcatg attattcttg gcagcatttt 1020

gcagatccgg aatatggcga atggtttgga tatcttaaca gacgcggcga agtgcttctg 1080

aacctgaaag gcggaaaatg gaaaggatgc tttcatgtcc cgagagccat gtatctgtgt 1140

tggcaacagt ttgaagcact ttcataa 1167

<210> 7

<211> 349

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Gln Asn Asn Asn Glu Phe Lys Ile Gly Asn Arg Ser Val Gly Tyr

1 5 10 15

Asn His Glu Pro Leu Ile Ile Cys Glu Ile Gly Ile Asn His Glu Gly

20 25 30

Ser Leu Lys Thr Ala Phe Glu Met Val Asp Ala Ala Tyr Asn Ala Gly

35 40 45

Ala Glu Val Val Lys His Gln Thr His Ile Val Glu Asp Glu Met Ser

50 55 60

Asp Glu Ala Lys Gln Val Ile Pro Gly Asn Ala Asp Val Ser Ile Tyr

65 70 75 80

Glu Ile Met Glu Arg Cys Ala Leu Asn Glu Glu Asp Glu Ile Lys Leu

85 90 95

Lys Glu Tyr Val Glu Ser Lys Gly Met Ile Phe Ile Ser Thr Pro Phe

100 105 110

Ser Arg Ala Ala Ala Leu Arg Leu Gln Arg Met Asp Ile Pro Ala Tyr

115 120 125

Lys Ile Gly Ser Gly Glu Cys Asn Asn Tyr Pro Leu Ile Lys Leu Val

130 135 140

Ala Ser Phe Gly Lys Pro Ile Ile Leu Ser Thr Gly Met Asn Ser Ile

145 150 155 160

Glu Ser Ile Lys Lys Ser Val Glu Ile Ile Arg Glu Ala Gly Val Pro

165 170 175

Tyr Ala Leu Leu His Cys Thr Asn Ile Tyr Pro Thr Pro Tyr Glu Asp

180 185 190

Val Arg Leu Gly Gly Met Asn Asp Leu Ser Glu Ala Phe Pro Asp Ala

195 200 205

Ile Ile Gly Leu Ser Asp His Thr Leu Asp Asn Tyr Ala Cys Leu Gly

210 215 220

Ala Val Ala Leu Gly Gly Ser Ile Leu Glu Arg His Phe Thr Asp Arg

225 230 235 240

Met Asp Arg Pro Gly Pro Asp Ile Val Cys Ser Met Asn Pro Asp Thr

245 250 255

Phe Lys Glu Leu Lys Gln Gly Ala His Ala Leu Lys Leu Ala Arg Gly

260 265 270

Gly Lys Lys Asp Thr Ile Ile Ala Gly Glu Lys Pro Thr Lys Asp Phe

275 280 285

Ala Phe Ala Ser Val Val Ala Asp Lys Asp Ile Lys Lys Gly Glu Leu

290 295 300

Leu Ser Gly Asp Asn Leu Trp Val Lys Arg Pro Gly Asn Gly Asp Phe

305 310 315 320

Ser Val Asn Glu Tyr Glu Thr Leu Phe Gly Lys Val Ala Ala Cys Asn

325 330 335

Ile Arg Lys Gly Ala Gln Ile Lys Lys Thr Asp Ile Glu

340 345

<210> 8

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgcaaaaca acaacgaatt taaaatcggc aacagatcag tcggatataa tcatgaaccg 60

cttattatct gcgaaattgg catcaaccat gaaggaagct taaaaacagc ctttgaaatg 120

gtcgatgcag cgtataatgc cggagcagaa gttgtgaaac atcaaacaca tatcgttgaa 180

gatgaaatgt ctgatgaagc caaacaggtg atcccgggca acgcagatgt ctcaatctac 240

gaaatcatgg aaagatgtgc gctgaacgaa gaagatgaaa tcaaactgaa agaatacgtt 300

gaaagcaaag gaatgatctt tatctctaca ccgttttcac gcgctgccgc acttagatta 360

cagcgcatgg atattccggc ctataaaatc ggctctggag aatgcaacaa ctacccgctg 420

atcaaactgg tggcaagctt tggcaaaccg atcatcctgt ctacaggaat gaactcaatc 480

gaaagcatca aaaaatcagt tgaaatcatc agagaagcgg gcgtgccgta tgctctgctt 540

cattgtacaa acatttatcc gacaccgtat gaagatgttc gcctgggcgg aatgaatgat 600

ctttcagaag cctttccgga tgcaattatc ggccttagcg atcatacatt agataactat 660

gcatgcctgg gagcggtggc tcttggcgga tctatcctgg aaagacattt tacagataga 720

atggatcgcc cgggcccgga tatcgtctgt tcaatgaatc cggatacatt taaagaactg 780

aaacaaggag cccatgcact gaaacttgcg agaggcggca agaaagatac aattatcgct 840

ggcgaaaaac cgacaaaaga ttttgcgttt gctagcgtcg ttgcggataa agatattaag 900

aaaggcgaac tgctgtctgg agataacctg tgggtcaaaa gaccgggcaa cggagatttt 960

agcgttaacg aatacgaaac actttttggc aaagtggcgg cttgcaatat ccgcaaagga 1020

gctcagatta agaaaacaga tatcgaataa 1050

<210> 9

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcatagacct gaaaaggtct ttttttgtac tcttaataat aaaaagaaga tgaaacttgt 60

ttaaggattg aacgtagtag ataataatat taaaactgag aaaggaggtg ataaaa 116

<210> 10

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaaaaacggc ctctcgaaat agagggttga cactcttttg agaatatgtt atattatcag 60

aaaggaggtg ataaaa 76

<210> 11

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttttcgaatg attaaatttt ttgtttttta taaaggtttt ttactatttt gtgaacaatc 60

aaggtagaat caaattgcaa acagtggtaa aatatcgttg aaaggaggtg ataaaa 116

<210> 12

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

attattctta acttttacga aactttgata taataacaaa cgtatatatt agtaatttac 60

ggcttatttt ccttgtgagc gtaaaaataa atgtgactat aaaggaggtg ataaaa 116

<210> 13

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aaacaatgaa actttttttt ataaaaaacg actattttag gatttcattc ttgtattaaa 60

tagagttgta tttattggaa atttaactca taatgaaagt aatttaaagg aggtgataaa 120

a 121

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis ) ，其特征在于，具有利用双碳源生长并合成N-乙酰神经氨酸的能力；所述双碳源为葡萄糖和甘油；所述枯草芽孢杆菌过表达氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶和N-乙酰氨基葡萄糖异构酶和脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）来源的N-乙酰神经氨酸合酶，并以SEQ ID NO.11所示的组成型启动子过表达甘油激酶；

所述甘油激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述N-乙酰神经氨酸合酶通过SEQID NO.9所示的启动子调控表达；所述氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶通过SEQ IDNO.9所示的启动子调控表达；所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶通过SEQ ID NO.10所示的启动子调控表达。

2.一种生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，以葡萄糖和甘油为碳源，应用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌进行发酵。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵原料中的葡萄糖含量为40~80 g/L，甘油的含量为10～20 g/L。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌接种至含葡萄糖、甘油、氮源和无机盐的环境中，于30~37 ^oC发酵16~72 h。

5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备含神经氨酸的产品中的应用。