CN111411066B - 一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法，属于遗传工程领域。本发明通过将N‑乙酰神经氨酸合酶和N‑乙酰神经氨酸醛缩酶同时整合到基因组上表达，并选取3个不同强度启动子对NeuB和NanA基因进行表达量优化，最终产量在摇瓶中达到了8.3g/L，为进一步提高枯草芽孢杆菌N‑乙酰神经氨酸产量奠定了基础。

Description

一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法

技术领域

本发明涉及一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法，属于遗传工程领域。

背景技术

N-乙酰神经氨酸是一种功能性单糖，广泛存在于微生物以及哺乳动物体内。在人体中，N-乙酰神经氨酸参与细胞识别、信号转导等多个生理过程。因此，N-乙酰神经氨酸被广泛应用于增强婴儿免疫力，促进婴儿大脑发育。目前，N-乙酰神经氨酸主要采取天然产物提取法(鸡蛋、燕窝等)，存在其他产物难以分离，且成本较高；另外可以通过全细胞转化的方法获得，但是需要成本较高的底物乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸为底物，由于底物转化率较低，导致神经氨酸生产成本较高。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此以枯草芽孢杆菌为宿主，通过代谢工程改造，以葡萄糖等廉价碳源为底物，高效从头合成神经氨酸是一种有效的策略。

目前在枯草中构建的N-乙酰神经氨酸代谢途径主要通过N-乙酰氨基葡萄糖为前体的NeuB关键酶合成途径，由于枯草芽孢杆菌胞内磷酸烯醇式丙酮酸(NeuB合成神经氨酸的前体物质)浓度较低，限制了神经氨酸的合成效率。这个问题的存在严重限制了神经氨酸产量的提高，进一步限制了其市场应用。

发明内容

为解决上述问题，本申请在强化NeuB为特征酶的途径基础上，进一步引入N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA)，其以丙酮酸为前体物质，并选取3个不同强度启动子优化NeuB和NanA表达水平，以获得N-乙酰神经氨酸产量提高的菌株。

本发明的第一个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，通过不同强度的启动子整合表达了N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)和N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA)，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～5任一所示。

在一种实施方式中，N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在一种实施方式中，P1启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在一种实施方式中，P2启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

在一种实施方式中，P3启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌还过表达氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)和N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)。

在一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以P1启动子表达氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶，并以P2启动子表达N-乙酰氨基葡萄糖异构酶。

在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以P1启动子表达氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶，并以P2启动子表达N-乙酰氨基葡萄糖异构酶，并以P1启动子表达N-乙酰神经氨酸合酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌BSGN6-comK；所述枯草芽孢杆菌BSGN6-comK的构建方法公开于论文《Modular pathway engineering of keycarbon-precursor supply-pathways for improved N-acetylneuraminic acidproduction in Bacillus subtilis》中。

本发明的第二个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，是分别构建氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶基因、N-乙酰氨基葡萄糖异构酶基因、N-乙酰神经氨酸合酶基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因的重组整合片段，再将一个或多个重组整合片段转化至枯草芽孢杆菌基因组上；所述重组整合片段是由基因左臂、启动子片段、基因片段和基因右臂按顺序融合连接而成。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子片段的核苷酸序列选自SEQ ID NO.9～11。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌BSGN6-comK为宿主。

本发明的第三个目是提供一种提高枯草芽孢杆菌神经氨酸产量的方法，是通过强启动子强化N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)和N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA)的表达。

在一种实施方式中，所述方法还强化氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶和N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的表达。

在一种实施方式中，所述强启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示。

本发明的第四个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌在生产神经氨酸及其衍生产品方面的应用。

在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌接种在LB培养基中，培养12～18h获得OD为6～10的种子液，再以1～10％的接种量转接至发酵培养基中进行发酵。

在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的培养条件为在30～37℃培养16～72h。

有益效果：

(1)本发明通过以3个不同强度启动子(P1、P2和P3)优化N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)和N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA)在基因组上的表达水平，降低了关键酶对细胞造成的蛋白合成压力，并进一步将优化表达水平的N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)和N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA)整合到同一株重组枯草芽孢杆菌中，使枯草芽孢杆菌N-乙酰神经氨酸产量由2.75g/L提高至9.5g/L以上；

(2)本发明提供多途径构建策略，构建方法简单，便于使用，具有很好的代谢工程应用前景。

具体实施方式

Neisseria meningitidis来源的N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)酶氨基酸列如SEQID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)氨基酸列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA)氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQID NO.8所示；

P1启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；P2启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；P3启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

大肠杆菌来源NeuB酶氨基酸列如SEQ ID NO.12所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

Moritella viscosa来源NeuB酶氨基酸列如SEQ ID NO.14所示，核苷酸序列如SEQID NO.15所示。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，胰蛋白胨6，酵母粉12，硫酸铵6，磷酸氢二钾12.5，磷酸二氢钾2.5，硫酸镁3。

N-乙酰神经氨酸检测方法：Agilent液相色谱：色谱柱为Aminex HPX-87H column(300×7.8mm)，紫外210nm检测吸收峰，流动相为10mM硫酸，流速为0.5mL/min。N-乙酰神经氨酸出峰时间约为9.8分钟。

实施例1构建基因组重组整合Gna1片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物Gna1-L-F:5’-CGTGATATCGTCATTCAGTCTCTTGAACGCCA-3’和Gna1-L-R:5’-CGCAATAACGCAGGCGTTCTGTGACATTAACTTATTTCATGTTCTTTTTAGTTAGACGATTTTAATACAAGCCTCGCCA-3’，扩增重组整合Gna1左臂基因片段；

合成如SEQ ID NO.9～11所示的启动子P1、P2和P3的片段；

合成如SEQ ID NO.4所示的编码Gna1的基因片段；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物Gna1-R-L：5’-ATAACTTGTCAGACTGCCGGGAAATCCCGGCAGTCTTTTTTCCATTAAAACACGGCCCAGTCATAAAATAGTTTTCCTAATAAGACCTGG-3’和Gna1-R-R：5’-cctacttaagctgctaccacttgtga-3’，扩增重组整合Gna1右臂基因片段。

将Gna1左臂基因片段、启动子片段(分别为P1、P2或P3)、Gna1的基因片段和Gna1右臂基因片段通过融合PCR获得重组整合Gna1基因片段，根据启动子的不同分别将其命名为Gna1-1、Gna1-2、Gna1-3(分别对应启动子P1、P2和P3)。

实施例2构建基因组重组整合Age片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物Age-L-F:5’-CGTGATATCGTCATTCAGTCTCTTGAACGCCA-3’和Age-L-R:5’-CGCAATAACGCAGGCGTTCTGTGACATTAACTTATTTCATGTTCTTTTTAGTTAGACGATTTTAATACAAGCCTCGCCA-3’，扩增重组整合Age左臂基因片段；

合成如SEQ ID NO.9～11所示的启动子P1、P2和P3的片段；

合成如SEQ ID NO.6所示的编码Age的基因片段；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物Age-R-L：5’-ATAACTTGTCAGACTGCCGGGAAATCCCGGCAGTCTTTTTTCCATTAAAACACGGCCCAGTCATAAAATAGTTTTCCTAATAAGACCTGG-3’和Age-R-R：5’-ATAACCAACGCAGCAAGTGGCAACCT-3’，扩增重组整合Age右臂基因片段。

将Age片段左臂基因序列、启动子片段(分别为P1、P2或P3)、Age基因片段和Age片段右臂基因序列通过融合PCR获得重组整合Age基因片段，根据启动子的不同分别将其命名为Age-1、Age-2、Age-3(分别对应启动子P1、P2和P3)。

实施例3构建基因组重组整合NeuB片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物NeuB-L-F:5’-CGGTGTCTGTATATCACAAAAATAGTGAGCAGGGTAACGA-3’和NeuB-L-R:5’-CGCAATAACGCAGGCGTTCTGTGACATTAACTTATTTCCACCTATTTTGTTACAGCGTGTGCCACTTTTATGCA-3’，扩增重组整合NeuB左臂基因片段；

合成如SEQ ID NO.9～11所示的启动子P1、P2和P3的片段；

合成如SEQ ID NO.2所示的编码NeuB的基因片段；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物NeuB-R-L：5’-TAACTTGTCAGACTGCCGGGAAATCCCGGCAGTCTTTTTTCCATTAAAACACGGCGCTTGAACAGCTTTTTTTGAATACCTTGTCCAGCT-3’和Age-R-R：5’-GCGTCATCGCAGTTTTTGCACCTGACT-3’，扩增重组整合NeuB右臂基因片段。

将扩增得到的NeuB左臂基因片段、启动子片段(P1、P2或P3)、NeuB基因片段和NeuB右臂片段通过融合PCR技术，构建成重组整合NeuB基因片段，根据启动子的不同分别将其命名为NeuB-1、NeuB-2和NeuB-3(分别对应启动子P1、P2和P3)。

实施例4构建基因组重组整合NanA片段

以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物NanA-L-F:5’-GATGTTGCAGTCACAGTTAGTTGATTAGAGTTAGCAGCA-3’和NanA-L-R:5’-CGCAATAACGCAGGCGTTCTGTGACATTAACTTATTTCTTTTTACGGCCCTGTGCCACAACTTACT-3’，扩增重组整合NanA左臂基因片段；

合成如SEQ ID NO.9～11所示的启动子P1、P2和P3的片段；

合成如SEQ ID NO.8所示的NanA片段；

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物NanA-R-L：5’-GAATAACTTGTCAGACTGCCGGGAAATCCCGGCAGTCTTTTTTCCATTAAAACACGGCGAATAAGTCCAAGACGGAAAGCCTGCGGA-3’和NanA-R-R：5’-GGATATTAACATGTACGCAATACTGCTGCTGT-3’，扩增重组整合NanA右臂基因片段。

分别将NanA左臂基因片段、启动子片段(P1、P2或P3)、NanA的基因片段和NanA片段右臂基因序列通过融合PCR，构建成重组整合NanA基因片段，根据不同启动子分别命名为NanA-1、NanA-2和NanA-3(分别对应启动子P1、P2和P3)。

实施例5基因组重组整合Gna1基因的重组枯草芽孢杆菌的构建

将实施例1构建的重组整合Gna1-1基因片段转化至枯草芽孢杆菌BSGN6-comK(构建方法公开于论文《Modular pathway engineering of key carbon-precursor supply-pathways for improved N-acetylneuraminic acid production in Bacillussubtilis》)基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌命名为BS-Gna1。

实施例6基因组重组整合Age基因的重组枯草芽孢杆菌的构建

将实施例2构建的重组整合Age-2的基因片段转化至实施例5构建的重组枯草芽孢杆菌BS-Gna1的基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌命名为BSG-Age-2。

实施例7基因组重组整合NeuB基因的重组枯草芽孢杆菌的构建

分别将实施例3构建的重组整合NeuB-1、NeuB-2和NeuB-3的基因片段转化至实施例6构建的重组枯草芽孢杆菌BSG-Age-2的基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌分别命名为BSGA-NeuB-1、BSGA-NeuB-2和BSGA-NeuB-3。

分别将重组枯草芽孢杆菌BSGA-NeuB-1、BSGA-NeuB-2和BSGA-NeuB-3接种于LB培养基中培养12～18小时，获得OD约为6的种子液，再分别将种子液按体积计，以1％的接种量接种于发酵培养基中，于37℃、200rpm下培养72h，测得发酵液中NeuAc产量分别为：7.6g/L、1.9g/L和1.7g/L。

实施例8基因组重组整合NanA基因枯草芽孢杆菌的构建

分别将实施例4构建的重组整合NanA-1、NanA-2和NanA-3的基因片段转化至实施例7构建的重组枯草芽孢杆菌BSGA-NeuB-1基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌分别命名为BSGAN-NanA-1、BSGAN-NanA-2和BSGAN-NanA-3。

分别将重组枯草芽孢杆菌BSGAN-NanA-1、BSGAN-NanA-2和BSGAN-NanA-3接种于LB培养基中培养12～18小时，获得OD约为6的种子液，再分别将种子液按1％接种量接种于发酵培养基中，于37℃、200rpm下，在发酵培养基中培养72h。最终测定发酵液中检测到NeuAc产量分别为：9.5g/L、8.1g/L和7.7g/L，成功获得能够提高NeuAc产量的工程菌株，并且BSGAN-NanA-1工程菌产量最高，达到9.5g/L。

对比例1：仅通过Age-NeuB途径合成NeuAc

按照实施例6～7相同的策略，不通过启动子调控，仅强化Age-NeuB途径合成NeuAc，构建的重组菌在37℃、200rpm下，在发酵培养基中培养72h，NeuAc产量最高只能达到2.75g/L。

对比例2：不同来源N-乙酰神经氨酸合酶对表达效果的影响

分别以实施例5相同的策略，将E.coli K1和Moritella viscosa来源的NeuB基因在枯草芽孢杆菌BSGN6-comK中表达，并分别通过不同的启动子调控基因的表达。构建的重组枯草芽孢杆菌在实施例10相同的培养条件下，发酵72h后的神经氨酸产量如表1所示，最高仅4.5g/L。

表1表达不同来源NeuB的重组枯草芽孢杆菌神经氨酸产量

对比例3：不同启动子调控不同酶对表达效果的影响

按照实施例6相同的策略，分别将实施例2构建的重组整合Age-1、Age-3转化至实施例5构建的重组枯草芽孢杆菌BS-Gna1基因组上，获得的菌株神经氨酸产量分别为0.5g/L和3.1g/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 349

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gln Asn Asn Asn Glu Phe Lys Ile Gly Asn Arg Ser Val Gly Tyr

1 5 10 15

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Asp Glu Ala Lys Gln Val Ile Pro Gly Asn Ala Asp Val Ser Ile Tyr

65 70 75 80

Glu Ile Met Glu Arg Cys Ala Leu Asn Glu Glu Asp Glu Ile Lys Leu

85 90 95

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Ser Arg Ala Ala Ala Leu Arg Leu Gln Arg Met Asp Ile Pro Ala Tyr

115 120 125

Lys Ile Gly Ser Gly Glu Cys Asn Asn Tyr Pro Leu Ile Lys Leu Val

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Ala Ser Phe Gly Lys Pro Ile Ile Leu Ser Thr Gly Met Asn Ser Ile

145 150 155 160

Glu Ser Ile Lys Lys Ser Val Glu Ile Ile Arg Glu Ala Gly Val Pro

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Tyr Ala Leu Leu His Cys Thr Asn Ile Tyr Pro Thr Pro Tyr Glu Asp

180 185 190

Val Arg Leu Gly Gly Met Asn Asp Leu Ser Glu Ala Phe Pro Asp Ala

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Ile Ile Gly Leu Ser Asp His Thr Leu Asp Asn Tyr Ala Cys Leu Gly

210 215 220

Ala Val Ala Leu Gly Gly Ser Ile Leu Glu Arg His Phe Thr Asp Arg

225 230 235 240

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245 250 255

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Gly Lys Lys Asp Thr Ile Ile Ala Gly Glu Lys Pro Thr Lys Asp Phe

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Ala Phe Ala Ser Val Val Ala Asp Lys Asp Ile Lys Lys Gly Glu Leu

290 295 300

Leu Ser Gly Asp Asn Leu Trp Val Lys Arg Pro Gly Asn Gly Asp Phe

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Ser Val Asn Glu Tyr Glu Thr Leu Phe Gly Lys Val Ala Ala Cys Asn

325 330 335

Ile Arg Lys Gly Ala Gln Ile Lys Lys Thr Asp Ile Glu

340 345

<210> 2

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcaaaaca acaacgaatt taaaatcggc aacagatcag tcggatataa tcatgaaccg 60

cttattatct gcgaaattgg catcaaccat gaaggaagct taaaaacagc ctttgaaatg 120

gtcgatgcag cgtataatgc cggagcagaa gttgtgaaac atcaaacaca tatcgttgaa 180

gatgaaatgt ctgatgaagc caaacaggtg atcccgggca acgcagatgt ctcaatctac 240

gaaatcatgg aaagatgtgc gctgaacgaa gaagatgaaa tcaaactgaa agaatacgtt 300

gaaagcaaag gaatgatctt tatctctaca ccgttttcac gcgctgccgc acttagatta 360

cagcgcatgg atattccggc ctataaaatc ggctctggag aatgcaacaa ctacccgctg 420

atcaaactgg tggcaagctt tggcaaaccg atcatcctgt ctacaggaat gaactcaatc 480

gaaagcatca aaaaatcagt tgaaatcatc agagaagcgg gcgtgccgta tgctctgctt 540

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<210> 3

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

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Ser Lys Gly Tyr Val Asp Leu Leu Ser Gln Leu Thr Ser Val Gly Asn

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Leu Asp Gln Glu Ala Phe Glu Lys Arg Phe Glu Ala Met Arg Thr Ser

50 55 60

Val Pro Asn Tyr His Ile Val Val Ile Glu Asp Ser Asn Ser Gln Lys

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Val Val Ala Ser Ala Ser Leu Val Val Glu Met Lys Phe Ile His Gly

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165

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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tcacaattga cgtcagttgg aaaccttgac caagaagcat ttgagaaacg atttgaggcg 180

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gtggtggcgt ctgctagttt ggttgttgaa atgaaattca ttcatggggc cggatcaagg 300

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<210> 5

<211> 388

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Gly Lys Asn Leu Gln Ala Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Asn Ala Leu

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Leu Asn Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Asn His Ser Leu Asp Ser Glu

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gcgatggcct tttctcagta tgcattagcg tcaggagaag aatgggcaaa agatgttgct 420

atgcaagcct ataataacgt gctgagacgc aaagataacc cgaaaggcaa atacacaaaa 480

acatatccgg gaacaagacc gatgaaagct ttagccgttc cgatgattct ggcgaacctg 540

acacttgaaa tggaatggtt actgccgcaa gaaacactgg aaaatgtgct tgctgccaca 600

gtccaggaag ttatgggcga ttttcttgat caagaacagg gattaatgta tgaaaacgtc 660

gctccggatg gctcacatat cgattgcttt gaaggacgcc tgattaatcc gggccatgga 720

atcgaagcga tgtggtttat tatggatatc gctagacgca aaaacgatag caaaacaatc 780

aaccaggcgg ttgatgttgt gttaaatatc ctgaactttg cttgggataa cgaatacggc 840

ggactttact actttatgga tgcagcgggc catccgccgc aacagctgga atgggatcaa 900

aaactttggt gggtgcatct tgaaagctta gtcgcactgg cgatgggcta tagattaaca 960

ggacgcgatg catgttgggc gtggtatcaa aaaatgcatg attattcttg gcagcatttt 1020

gcagatccgg aatatggcga atggtttgga tatcttaaca gacgcggcga agtgcttctg 1080

aacctgaaag gcggaaaatg gaaaggatgc tttcatgtcc cgagagccat gtatctgtgt 1140

tggcaacagt ttgaagcact ttcataa 1167

<210> 7

<211> 297

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Ala Thr Asn Leu Arg Gly Val Met Ala Ala Leu Leu Thr Pro Phe

1 5 10 15

Asp Gln Gln Gln Ala Leu Asp Lys Ala Ser Leu Arg Arg Leu Val Gln

20 25 30

Phe Asn Ile Gln Gln Gly Ile Asp Gly Leu Tyr Val Gly Gly Ser Thr

35 40 45

Gly Glu Ala Phe Val Gln Ser Leu Ser Glu Arg Glu Gln Val Leu Glu

50 55 60

Ile Val Ala Glu Glu Ala Lys Gly Lys Ile Lys Leu Ile Ala His Val

65 70 75 80

Gly Cys Val Ser Thr Ala Glu Ser Gln Gln Leu Ala Ala Ser Ala Lys

85 90 95

Arg Tyr Gly Phe Asp Ala Val Ser Ala Val Thr Pro Phe Tyr Tyr Pro

100 105 110

Phe Ser Phe Glu Glu His Cys Asp His Tyr Arg Ala Ile Ile Asp Ser

115 120 125

Ala Asp Gly Leu Pro Met Val Val Tyr Asn Ile Pro Ala Leu Ser Gly

130 135 140

Val Lys Leu Thr Leu Asp Gln Ile Asn Thr Leu Val Thr Leu Pro Gly

145 150 155 160

Val Gly Ala Leu Lys Gln Thr Ser Gly Asp Leu Tyr Gln Met Glu Gln

165 170 175

Ile Arg Arg Glu His Pro Asp Leu Val Leu Tyr Asn Gly Tyr Asp Glu

180 185 190

Ile Phe Ala Ser Gly Leu Leu Ala Gly Ala Asp Gly Gly Ile Gly Ser

195 200 205

Thr Tyr Asn Ile Met Gly Trp Arg Tyr Gln Gly Ile Val Lys Ala Leu

210 215 220

Lys Glu Gly Asp Ile Gln Thr Ala Gln Lys Leu Gln Thr Glu Cys Asn

225 230 235 240

Lys Val Ile Asp Leu Leu Ile Lys Thr Gly Val Phe Arg Gly Leu Lys

245 250 255

Thr Val Leu His Tyr Met Asp Val Val Ser Val Pro Leu Cys Arg Lys

260 265 270

Pro Phe Gly Pro Val Asp Glu Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Lys Ala Leu

275 280 285

Ala Gln Gln Leu Met Gln Glu Arg Gly

290 295

<210> 8

<211> 894

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggcaacga atttacgtgg cgtaatggct gcactcctga ctccttttga ccaacaacaa 60

gcactggata aagcgagtct gcgtcgcctg gttcagttca atattcagca gggcatcgac 120

ggtttatacg tgggtggttc gaccggcgag gcctttgtac aaagcctttc cgagcgtgaa 180

caggtactgg aaatcgtcgc cgaagaggcg aaaggtaaga ttaaactcat cgcccacgtc 240

ggttgcgtca gcaccgccga aagccaacaa cttgcggcat cggctaaacg ttatggcttc 300

gatgccgtct ccgccgtcac gccgttctac tatcctttca gctttgaaga acactgcgat 360

cactatcggg caattattga ttcggcggat ggtttgccga tggtggtgta caacattcca 420

gccctgagtg gggtaaaact gaccctggat cagatcaaca cacttgttac attgcctggc 480

gtaggtgcgc tgaaacagac ctctggcgat ctctatcaga tggagcagat ccgtcgtgaa 540

catcctgatc ttgtgctcta taacggttac gacgaaatct tcgcctctgg tctgctggcg 600

ggcgctgatg gtggtatcgg cagtacctac aacatcatgg gctggcgcta tcaggggatc 660

gttaaggcgc tgaaagaagg cgatatccag accgcgcaga aactgcaaac tgaatgcaat 720

aaagtcattg atttactgat caaaacgggc gtattccgcg gcctgaaaac tgtcctccat 780

tatatggatg tcgtttctgt gccgctgtgc cgcaaaccgt ttggaccggt agatgaaaaa 840

tatctgccag aactgaaggc gctggcccag cagttgatgc aagagcgcgg gtga 894

<210> 9

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcatagacct gaaaaggtct ttttttgtac tcttaataat aaaaagaaga tgaaacttgt 60

ttaaggattg aacgtagtag ataataatat taaaactgag aaaggaggtg ataaaa 116

<210> 10

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttgaggaatc atagaatttt gacttaaaaa tttcagttgc ttaatcctac aattcttgat 60

ataatattct catagtttga aaaaggaggt gataaaa 97

<210> 11

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

attttgtcaa aataatttta ttgacaacgt cttattaacg ttgatataat ttaaatttta 60

tttgacaaaa atgggctcgt gttgtacaat aaatgtagtg aaaggaggtg ataaaa 116

<210> 12

<211> 346

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Met Ser Asn Ile Tyr Ile Val Ala Glu Ile Gly Cys Asn His Asn Gly

1 5 10 15

Ser Val Asp Ile Ala Arg Glu Met Ile Leu Lys Ala Lys Glu Ala Gly

20 25 30

Val Asn Ala Val Lys Phe Gln Thr Phe Lys Ala Asp Lys Leu Ile Ser

35 40 45

Ala Ile Ala Pro Lys Ala Glu Tyr Gln Ile Lys Asn Thr Gly Glu Leu

50 55 60

Glu Ser Gln Leu Glu Met Thr Lys Lys Leu Glu Met Lys Tyr Asp Asp

65 70 75 80

Tyr Leu His Leu Met Glu Tyr Ala Val Ser Leu Asn Leu Asp Val Phe

85 90 95

Ser Thr Pro Phe Asp Glu Asp Ser Ile Asp Phe Leu Ala Ser Leu Lys

100 105 110

Gln Lys Ile Trp Lys Ile Pro Ser Gly Glu Leu Leu Asn Leu Pro Tyr

115 120 125

Leu Glu Lys Ile Ala Lys Leu Pro Ile Pro Asp Lys Lys Ile Ile Ile

130 135 140

Ser Thr Gly Met Ala Thr Ile Asp Glu Ile Lys Gln Ser Val Ser Ile

145 150 155 160

Phe Ile Asn Asn Lys Val Pro Val Gly Asn Ile Thr Ile Leu His Cys

165 170 175

Asn Thr Glu Tyr Pro Thr Pro Phe Glu Asp Val Asn Leu Asn Ala Ile

180 185 190

Asn Asp Leu Lys Lys His Phe Pro Lys Asn Asn Ile Gly Phe Ser Asp

195 200 205

His Ser Ser Gly Phe Tyr Ala Ala Ile Ala Ala Val Pro Tyr Gly Ile

210 215 220

Thr Phe Ile Glu Lys His Phe Thr Leu Asp Lys Ser Met Ser Gly Pro

225 230 235 240

Asp His Leu Ala Ser Ile Glu Pro Asp Glu Leu Lys His Leu Cys Ile

245 250 255

Gly Val Arg Cys Val Glu Lys Ser Leu Gly Ser Asn Ser Lys Val Val

260 265 270

Thr Ala Ser Glu Arg Lys Asn Lys Ile Val Ala Arg Lys Ser Ile Ile

275 280 285

Ala Lys Thr Glu Ile Lys Lys Gly Glu Val Phe Ser Glu Lys Asn Ile

290 295 300

Thr Thr Lys Arg Pro Gly Asn Gly Ile Ser Pro Met Glu Trp Tyr Asn

305 310 315 320

Leu Leu Gly Lys Ile Ala Glu Gln Asp Phe Ile Pro Asp Glu Leu Ile

325 330 335

Ile His Ser Glu Phe Lys Asn Gln Gly Glu

340 345

<210> 13

<211> 1041

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atgtctaaca tctacatcgt ggcagaaatc ggctgcaatc ataacggatc agtcgatatc 60

gcgagagaaa tgattttaaa agctaaagaa gccggcgtga acgctgtcaa atttcaaaca 120

tttaaagccg ataaactgat cagcgcaatt gcgccgaaag cagaatacca aatcaaaaac 180

acaggagaat tagaatctca gctggaaatg acgaaaaaac tggaaatgaa atacgatgat 240

taccttcatc tgatggaata cgcagtcagc ctgaatcttg atgtttttag cacaccgttt 300

gatgaagatt ctattgattt tctggcgtca ctgaaacaaa aaatctggaa aattccgtca 360

ggcgaactgc ttaaccttcc gtacctggaa aaaatcgcta aacttccgat cccggataag 420

aaaattatca ttagcacagg catggccaca atcgatgaaa tcaaacagtc tgtctcaatc 480

tttatcaata acaaagtccc ggttggaaac atcacaatcc tgcattgtaa cacagaatat 540

ccgacaccgt ttgaagatgt taaccttaac gctatcaacg atctgaaaaa acattttccg 600

aaaaacaaca tcggcttttc tgatcattca agcggatttt atgcagcgat tgctgccgtt 660

ccgtatggca tcacatttat cgaaaaacat tttacactgg ataaaagcat gtctggaccg 720

gatcatcttg cttcaatcga accggatgaa ctgaaacatc tttgcattgg cgttagatgt 780

gtggaaaaat cactgggatc aaatagcaaa gttgtgacag ccagcgaaag aaaaaacaaa 840

atcgttgcac gcaaatctat catcgcgaaa acagaaatca aaaaaggaga agtgttttca 900

gagaaaaata tcacaacaaa aagaccgggc aacggaatta gcccgatgga atggtataat 960

ttactgggca aaatcgcgga acaagatttt atcccggatg aacttatcat ccatagcgaa 1020

tttaaaaacc agggagaata a 1041

<210> 14

<211> 347

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Met Thr Asn Pro Val Phe Glu Ile Ser Gly Arg Lys Val Gly Leu Asp

1 5 10 15

Tyr Ala Pro Leu Val Ile Ala Glu Ile Gly Ile Asn His Glu Gly Ser

20 25 30

Leu Lys Thr Ala Phe Glu Met Val Asp Ala Ala Ile Glu Gly Gly Ala

35 40 45

Glu Ile Ile Lys His Gln Thr His Val Ile Glu Asp Glu Met Ser Ser

50 55 60

Glu Ala Lys Lys Val Ile Pro Gly Asn Ala Asp Val Ser Ile Tyr Glu

65 70 75 80

Ile Met Asp Arg Cys Ser Leu Asn Glu Glu Asp Glu Ile Lys Leu Lys

85 90 95

Lys Tyr Ile Glu Ser Lys Gly Ala Ile Phe Ile Ser Thr Pro Phe Ser

100 105 110

Arg Ala Ala Ala Leu Arg Leu Glu Arg Met Gly Val Ser Ala Tyr Lys

115 120 125

Ile Gly Ser Gly Glu Cys Asn Asn Tyr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Ala

130 135 140

Ser Tyr Gly Lys Pro Val Ile Leu Ser Thr Gly Met Asn Asp Ile Pro

145 150 155 160

Ser Ile Arg Lys Ser Val Glu Ile Phe Arg Lys Tyr Lys Thr Pro Leu

165 170 175

Cys Leu Leu His Thr Thr Asn Leu Tyr Pro Thr Pro Asp His Leu Ile

180 185 190

Arg Ile Gly Ala Met Glu Glu Met Gln Arg Glu Phe Ser Asp Val Val

195 200 205

Val Gly Leu Ser Asp His Ser Ile Asp Asn Leu Ala Cys Leu Gly Ala

210 215 220

Val Ala Ala Gly Ala Ser Val Leu Glu Arg His Phe Thr Asp Asn Lys

225 230 235 240

Ala Arg Ser Gly Pro Asp Ile Cys Cys Ser Met Asp Gly Ala Glu Cys

245 250 255

Ala Glu Leu Ile Ser Gln Ser Lys Arg Met Ala Gln Met Arg Gly Gly

260 265 270

Ser Lys Gly Ala Val Lys Glu Glu Gln Val Thr Ile Asp Phe Ala Tyr

275 280 285

Ala Ser Val Val Thr Ile Lys Glu Ile Lys Ala Gly Glu Ala Phe Thr

290 295 300

Lys Asp Asn Leu Trp Val Lys Arg Pro Gly Thr Gly Asp Phe Leu Ala

305 310 315 320

Asp Asp Tyr Glu Met Leu Leu Gly Lys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp

325 330 335

Phe Asp Val Gln Leu Lys Lys Glu Phe Ile Lys

340 345

<210> 15

<211> 1044

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgacaaatc cggtctttga aatttctggc agaaaagttg gacttgatta tgccccgtta 60

gtgatcgcag aaattggcat caaccatgaa ggatcactga aaacagcctt tgaaatggtg 120

gatgcagcga ttgaaggcgg agcagaaatc atcaaacatc aaacacatgt cattgaagat 180

gaaatgtcaa gcgaagcaaa gaaagttatc ccgggcaatg ctgatgtgag catctacgaa 240

atcatggata gatgctctct gaacgaagaa gatgaaatca aactgaaaaa atacatcgaa 300

tcaaaaggcg ctatctttat ctcaacaccg tttagccgcg ctgccgcact gagacttgaa 360

cgcatgggag ttagcgccta taaaattggc tctggagaat gcaataacta tccgctgctt 420

gatcttattg cgtcttatgg caaaccggtc atcttatcaa caggaatgaa tgatattccg 480

tctatcagaa aatcagttga aatctttcgc aaatacaaaa caccgctttg tttactgcat 540

acaacaaacc tgtatccgac accggatcat cttattagaa tcggcgcaat ggaagaaatg 600

caacgcgaat ttagcgatgt tgtggtcgga ctgagcgatc attctatcga taacctggct 660

tgtctgggag ctgtggctgc tggagcttct gtcctggaaa gacattttac agataacaaa 720

gctcgctcag gcccggatat ttgctgtagc atggatggag cggaatgtgc tgaacttatc 780

tctcaatcaa aaagaatggc ccagatgcgc ggcggatcaa aaggcgcagt caaagaagaa 840

caggttacaa ttgattttgc ctatgcaagc gttgtgacaa ttaaagaaat caaagccgga 900

gaagcattta caaaagataa tctgtgggtt aaacgcccgg gcacaggaga ttttcttgcg 960

gatgattatg aaatgctttt aggcaagaaa gcaagccaaa acattgattt tgatgtgcag 1020

ctgaagaaag aatttatcaa ataa 1044

Claims (6)

1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以SEQ ID NO.9所示的启动子调控氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶和N-乙酰神经氨酸合酶的表达，并以SEQ ID NO.10所示的启动子表达N-乙酰氨基葡萄糖异构酶，并通过不同强度的启动子整合N-乙酰神经氨酸醛缩酶，所述不同强度的启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO.9~11；所述N-乙酰神经氨酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌中氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶、N-乙酰神经氨酸合酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶分别通过SEQ ID NO.9所示的启动子调控表达，N-乙酰氨基葡萄糖异构酶通过SEQ ID NO.10所示的启动子调控表达。

3.一种构建权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，分别构建氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶基因、N-乙酰氨基葡萄糖异构酶基因、N-乙酰神经氨酸合酶基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因的重组整合片段，再将重组整合片段转化至枯草芽孢杆菌基因组上；所述重组整合片段是由基因左臂、启动子片段、基因片段和基因右臂按顺序融合连接而成；所述重组枯草芽孢杆菌以SEQ ID NO.9所示的启动子调控氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶和N-乙酰神经氨酸合酶的表达，并以SEQ ID NO.10所示的启动子表达N-乙酰氨基葡萄糖异构酶，并通过不同强度的启动子整合N-乙酰神经氨酸醛缩酶，所述不同强度的启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO.9~11。

4.一种提高枯草芽孢杆菌神经氨酸产量的方法，其特征在于，以SEQ ID NO.9所示的启动子调控氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶和N-乙酰神经氨酸合酶的表达，并以SEQ IDNO.10所示的启动子表达N-乙酰氨基葡萄糖异构酶，并通过不同强度的启动子整合N-乙酰神经氨酸醛缩酶，所述不同强度的启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO.9~11；所述N-乙酰神经氨酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.权利要求1或2所述重组枯草芽孢杆菌在生产N-乙酰神经氨酸及N-乙酰神经氨酸衍生产品方面的应用。

6.一种生产神经氨酸的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌接种在LB培养基中，培养12~18 h获得种子液，再以1~10%的接种量转接至发酵培养基中进行发酵；所述发酵是在30~37 ^oC发酵16~72 h。