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CN111372599A - 细胞因子调节 - Google Patents

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CN111372599A
CN111372599A CN201880060106.7A CN201880060106A CN111372599A CN 111372599 A CN111372599 A CN 111372599A CN 201880060106 A CN201880060106 A CN 201880060106A CN 111372599 A CN111372599 A CN 111372599A
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CN
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cytokine
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CN201880060106.7A
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科林·理查德·格林
奥杜纳约·奥莫罗拉·博路瓦兰·莫吉肖
布拉德福德·杜夫特
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Auckland Uniservices Ltd
CoDa Therapeutics Inc
Original Assignee
Auckland Uniservices Ltd
CoDa Therapeutics Inc
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Publication date
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Abstract

本发明涉及半通道阻断剂用以调节受试者中的细胞因子含量，包括血管生成细胞因子、VEGF，和其产生、分泌和/或释放的用途，并且涉及使用半通道阻断剂用以降低或调整细胞因子活性，包括在总体或部分特征在于血管生成和/或血管渗漏的病况中的用途。

Description

细胞因子调节
相关申请
本申请案主张0217年7月19日提交的第62/534,595号美国临时申请案的优先权，其以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明大体上涉及连接蛋白半通道，包含连接蛋白43半通道，并且涉及细胞因子，包含VEGF、IL-6、IL-8、MCP-1和sICAM-1。
通过引用的方式并入
本文所提及的所有美国专利、美国专利申请公开案、外国专利、外国和PCT公开申请案、论文和其它文献、参考文献和公开案以及此处发布的任何一项或多项专利作为参考文献所列举得所有文件、参考文献和公开案，特此都以全文引用的方式并入本文中。所并入的信息作为本申请案的一部分，如同在本申请案中重复所有文本和其它内容一般，并且将被视为如所提交的本申请案的文本和内容的一部分。
背景技术
以下包含可能有助于理解本发明的信息。并不承认本文中特定地或隐含地提及的任何信息、公开案或文件是当前所描述或所要求的发明的现有技术或必不可少的。
血管生成细胞因子、血管内皮生长因子(VEGF)在人类生长和发育以及血管维持中起重要作用。然而，现在已明确血管生成还在多种病症的发病机理中起重要作用。据报导VEGF介导的血管生成对于肿瘤生长以及渗出性年龄相关的黄斑变性(AMD)、增生性糖尿病性视网膜病和早产儿视网膜病是必不可少的，例如所有这些都以异常新血管生成为特征。在实体肿瘤的情况下，新血管生成允许肿瘤细胞与正常细胞相比获得生长优势和增生自主性。在肿瘤切片中的微血管的密度与乳癌中的患者存活之间以及在若干其它肿瘤中已观察到相关性。韦德纳(Weidner)等人,浸润性乳癌中的肿瘤血管生成与转移-相关性(TumorAngiogenesis and Metastasis-Correlation in Invasive Breast Carcinoma).《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》324:1-6(1991)；赫拉克(Horak)等人,血管生成，通过血小板/内皮细胞粘附性分子抗体评估，乳癌淋巴结转移和存活期的指标(Angiogenesis,assessedby platelet/endothelial cell adhesion molecule antibodies,an indicator ofnode metastases and survival in breast cancer),柳叶刀(Lancet)340:1120-1124(1992)；和马基亚尼(Macchiarini)等人,新血管生成与非小细胞肺癌转移的关系(Relation of neovascularization to metastasis of non-small lung cell cancer),柳叶刀340:145-146(1992)。据报导，局部缺血和发炎引起VEGF介导的血液-视网膜屏障损坏，其导致视力下降的黄斑水肿。佛克曼(Folkman)等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》267:10931-10934(1992)；克拉斯布伦(Klagsbrun)等人，《生理学年鉴(Annu.Rev.Physiol.)》53:217-239(1991)；和加纳A(Garner A)，血管疾病(Vasculardiseases)，在眼部疾病病理学(Pathobiology of ocular disease)，动态方法(A dynamicapproach)中。加纳A(Garner A)、克林特沃斯G K编辑，纽约马塞尔德克尔第2版，第1625-1710页(1994)。为了对抗这些作用，已经研发抗VEGF药物(例如抗体、适体和酪氨酸激酶抑制剂)以用于全身性和局部(眼内)两者的用途。
关于视网膜病症，尽管抗VEGF药剂的总体临床成功，但一些AMD患者仍需要频繁注射来保持疾病处于控制之下。已陈述，对于此类情况需要更延长调配物或持续释放技术。参见费拉拉,N(Ferrara,N)和阿达氏AP(Adamis AP)，十年抗血管内皮生长因子疗法(Tenyears of anti-vascular endothelial growth factor therapy)。《自然综述：药物发现(Nature Reviews Drug Discovery)》15:385-403(2016)。另外，约40％患有新生血管性AMD的患者展示次优治疗反应，罗森费PJ(Rosenfeld,PJ)等人，用于新生血管性年龄相关性黄斑变性的雷珠单抗(Ranibizumab for neovascular age-related maculardegeneration)。新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)355:1419-1431(2006)，定义为小于20/40的视力。更高剂量不大可能有帮助，因为来自3期研究的数据表明当前批准的剂量处于或接近AMD和糖尿病黄斑水肿(DME)的剂量反应曲线的顶部。布斯贝克(Busbee),BG等人，0.5mg或2.0mg雷珠单抗在患有视网膜中央凹下新生血管年龄相关性黄斑变性的患者中的十二月功效和安全性。眼科学(Ophthalmology)120:1046-1056(2013)。关于癌症，VEGF抑制剂的影响尚未达到在用其它血管生成抑制剂进行的一些早期临床前研究中预期的显著功效。勃姆(Boehm),T等人,实验性癌症的抗血管生成疗法并不诱导获得性抗药性(Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drugresistance).自然(Nature)390:404-407(1997)。尽管如此，VEGF抑制剂展示对患有晚期和难以治疗恶性肿瘤的患者具有益处，并且现在是治疗若干转移性癌症的护理标准。然而，在临床反应中存在不均匀性。费拉拉，N.,VEGF非依赖性肿瘤血管生成的介导路径(Pathwaysmediating VEGF-independent tumor angiogenesis)。细胞因子生长因子综述(CytokineGrowth Factor Rev.)21:21-26(2010)。
白细胞介素-6(IL-6)为不仅在免疫系统中而且在多种生物过程中起关键作用的多功能细胞因子。已在各种自身免疫、慢性发炎性疾病和甚至癌症的发展中暗示产生失调的、持久性白细胞介素IL-6。其为急性和慢性发炎两者的主要调节因子。已例如在来源于顽固性/慢性葡萄膜炎患者的眼内液中发现IL-6显著升高，并且在用IL-6基因敲除小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎模型中表明IL-6是所需的以诱导发炎。
Figure BDA0002413147850000031
(托珠单抗(tocilizumab))、重组人类化抗IL-6受体抗体已经用于治疗若干种自身免疫疾病，包含葡萄膜炎。对于托珠单抗疗法的功效和安全性的概述，参见梅斯奎达(Mesquida)、M等人，在眼部发炎疾病中的白细胞介素-6阻断(Interleukin-6blockade in ocular inflammatorydiseases)。临床实验免疫学(Clin Exp Immunol)176:301-309(2-14)。抗IL-6受体抗体还针对自身免疫病症(包含卡斯特曼病(Castleman's disease))使用。
白细胞介素-8(IL-8)和/或其受体的表现增加已经在许多慢性发炎病状(包含COPD)以及许多癌症中表征，并且其上调通常与疾病活性相关。IL-8为在许多人类癌症中过度表现的促血管生成细胞因子。用于IL-8的受体在正常和各种肿瘤细胞上广泛表现，并且IL-8据报导为诱导许多病变中的促炎性、趋化性和基质、降解反应。通过卡济(Qazi)等人综述，基础病理学的最新进展为白细胞介素-8表现介导的发炎和血管生成提供线索，国际发炎杂志(International Journal of Inflammation)，卷2011(2011)，文章编号908468。表现希望发现间接减弱癌细胞中的IL-8信号传导的策略，但此希望是出于使癌细胞敏化到常规治疗性干预的目的。坎贝尔(Campbell),LM等人，靶向癌症中促炎白细胞介素-8(CXCL8)信号传导的基本原理和方式(Rationale and Means to Target Pro-InflammatoryInterleukin-8(CXCL8)Signaling in Cancer)。药物(Pharmaceutical)(巴塞尔(Basel))6:929-959(2013)。
单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1/CCL2)为调节单核细胞/巨噬细胞的迁移和浸润的关键趋化因子中的一种。MCP-1和其受体两者已经报导都诱导并且参与各种疾病和病状，包含多发性硬化症(MCP-1和轴突损伤之间的相关性)、次级多发性硬化症和伤害感受(通过神经元的MCP-1介导去极化)、肿瘤新血管生成(通过MCP-1影响巨噬细胞浸润)和胰岛素抵抗(MCP-1增加)。已注意到，影响MCP-1产生的药物的发现可以例如在经历慢性发炎的那些组织中靶向，但所提供的唯一可能是如使用RNAi技术使MCP-1基因沉默的技术。参见德什曼(Deshmane),SL等人，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1):概述,J干扰素细胞因子研究(JInterferon Cytokine Res.)29:313-326(2009)，其陈述若其在MCP-1表现的上游，那么阻断上调趋化因子受体的药物的发现可证实为有效的。同上在321处。
ICAM-1(免疫球蛋白超基因家族的成员)为在不同类型的细胞上在低水平组成性表现的单链细胞表面醣蛋白。血浆中可溶性ICAM-1(sICAM-1)的水平与冠心病和其它血管疾病相关。里德克PM(Ridker PM)等人，在表观健康男性中可溶性细胞间粘附分子1的血浆浓度和未来心肌梗塞的风险(Plasma concentration of soluble intercellularadhesion molecule 1and risks of future myocardial infarction in apparentlyhealthy men)柳叶刀351:88-92(1998)。据报导，sICAM-1的血浆浓度在患有急性心肌梗塞和不稳定心绞痛但不稳定心绞痛的患者中显著升高(佩莱格塔(Pellegatta),F.等人,J.心血管.药理学.30:455-460(1997)；Miwa,K.等人,心血管.研究36:37-44,1997；盖萨(Ghaisas),N.K.等人,Am.J.Cardiol.80:617-619(1997)；小川(Ogawa),H.等人,Am.J.Cardiol.83:38-42(1999)。还报导sICAM-1的血浆浓度的升高与癌症和多发性硬化症有关(金(Kim),J.S.,J.神经病学(Neurol).科学(Sci).137:69-78(1996)；拉斯科维茨(Laskowitz),D.T.等人,J.Stroke Cerebrovasc.Dis.7:234-241(1998).Gho等人，报导sICAM-1明显可促进血管生成并刺激肿瘤细胞生长。Gho YS等人，人类可溶性细胞间粘附分子-1的血管生成活性(Angiogenic activity of human soluble intercellularadhesion molecule-1)。癌症研究(Cancer Res)59:5128-32(1999)；Gho YS等人，通过人类可溶性细胞间粘附分子-1刺激肿瘤生长(Stimulation of tumor growth by humansoluble intercellular adhesion molecule-1)。癌症研究61:4253-7(2001)。在患有多种恶性疾病的患者中还报导了sICAM-1水平升高，并且认为与疾病进展和肿瘤转移相关。另一个论文报导发炎因子(VEGF、IL-6、MCP-1和sICAM-1)可以诱导血管渗透性增加并且破坏患有黄斑水肿的患者的血-房水屏障(blood-aqueous barrier)。诺马(Noma),H等人，发炎在未经治疗的视网膜分支静脉阻塞黄斑水肿中的作用，BMC眼科学(BMC Ophthalmol)14:67(2014)。
连接蛋白通道是普遍存在的，提供分子在细胞之间移动(间隙接合通道)和用于将分子效应子释放到细胞外环境(质膜间隙接合半通道)中的路径。间隙接合为专门的细胞间连接并且发现于大多数动物细胞类型之间。其实际上在身体的所有组织中表现，除了成熟骨骼肌和移动细胞类型，如精子和红细胞。间隙接合直接连接两个细胞的细胞质，其允许各种分子、离子和电脉冲直接穿过细胞之间的调节门。一个间隙接合由两个接合质(或半通道)构成，其跨越邻近细胞之间的细胞间间隔连接并且允许细胞内分子在那些细胞之间流动。间隙接合的每个接合质存在于邻近细胞膜中并且由6种个别连接蛋白(“Cx”)白质的共价寡聚形成。形成功能性间隙接合的前提条件是将连接蛋白蛋白质组装成半通道并且将其插入到膜中。对于来自一个细胞的细胞间通讯半通道必须对接到邻近细胞的相对膜上的其对应部分，以允许通过间隙接合将信号从一个细胞传输到另一个细胞。
间隙接合和半通道参与在分子量中传递高达约1kDa的多种小分子，如离子、小代谢物、cAMP、ATP、IP3、前列腺素等。伯拉S(Burra S)和江JX(Jiang JX)，通过连接蛋白半通道调节细胞功能(Regulation of cellular function by connexin hemichannels)Int JBiochem Mol Biol.2(2):119-128(2011)。在生理条件下，大部分在质膜中形成的连接蛋白为关闭的直到其在间隙接合形成期间对接以形成细胞-细胞通道为止。在一些例外下，连接蛋白半通道电流趋向于通过强去极化或低于0.5mM的细胞外基质钙的减少而活化。因此，内源性连接蛋白半通道的活性不大可能在正常生理条件下显著。然而，据报导，当表面暴露时，未对接的半通道可介导细胞溶质与细胞外空间之间的分子交换。因此，尽管半通道默认是关闭的，但已经描述诱导其开口的若干提示，例如细胞外Ca2+浓度下降(伊凡氏(Evans)等人,间隙接合细胞互连：连接蛋白半通道进入信号焦点。生物化学杂志(Biochem J)397(1):1-14(2006))或感染肠道病原体(普哈尔(Puhar)等人,志贺氏菌效应子通过产生脂质调节因子PtdIns5P调节上皮危险信号ATP的释放来抑制发炎(A Shigella Effector DampensInflammation by Regulating Epithelial Release of Danger Signal ATP throughProduction of the Lipid Mediator PtdIns5P)，免疫学(Immunity)39(6):1121-1131(2013)；Tran Van Nhieu等人，连接蛋白依赖性细胞间通讯增加志贺氏菌在上皮细胞中的侵袭和传播，Nat Cell Biol 5(8):720-726(2003))。参见普哈尔A和圣索内蒂PJ(Sansonetti PJ)，通过连接蛋白半通道的上染实验，Bio-protocol 4(17):e1221(2014年9月)。已针对各种治疗用途提议间隙接合、半通道和连接蛋白调节剂。
发明内容
本文中所描述和主张的发明具有许多属性和实施例，包含但不限于此发明内容中阐述或描述或提及的那些属性和实施例。并不希望为完全包括性的，且本文中所描述和主张的发明不限于此介绍中所识别的特征或实施例，所述特征或实施例仅仅出于说明的目的包含而非限制。
本专利描述使用半通道阻断剂以减弱细胞因子的产生和释放。细胞因子参与多种疾病、病症和病状。重要的是，半通道阻断剂将因此在当前治疗方法上游起作用，包含例如抗VEFG抗体、VEFG受体阻断剂和IL-6受体阻断剂以及其它调节剂和其它细胞因子和/或其受体的调节剂，包含IL-8、MCP-1和sICAM-1。
我们现在出人意料地发现鉴于具有约1kDa的分子大小通过限制的半通道的先前所描述特性，调节或阻断半通道可减少或阻止发炎性细胞因子的产生、分泌和/或释放，如通过在投与半通道阻断剂之后IL-6、IL-8、MCP-1和sICAM-1的减少以及血管生成细胞因子VEGF的存在或量的减少所证明。这些分子的大小在约11kDa(MCP-1和IL-8)到90kDa(sICAM-1)范围内。半通道仅允许水、小分子和离子(如Ca2+(40Da))和小信号传导分子(如ATP、cAMP、NAD+、IP3、前列腺素和谷氨酸(140-700Da)通过。
尽管不希望受任何理论束缚，但本文中的工作支持以下想法：在疾病过程中连接蛋白半通道通过扩增和维持连接蛋白半通道介导的细胞因子反馈环而发挥关键作用，形成用于本文中指出的病状和疾病的基础，以及至少部分地通过非所要水平的VEGF，例如和/或其它细胞因子(包含IL-6、IL-8、MCP-1和sICAM-1)来表征的其它基础。举例来说，促炎性细胞因子的全身性和局部释放涉及糖尿病和糖尿病性肾病的发展和进展。这些结果对疾病有意义，包含在本文中的背景和其它地方所提到的那些，以及例如心力衰竭(参见Butts,B等人.心力衰竭杂志(Journal of Cardiac Failure),21:586-593(2015))；肌肉萎缩症(muscular dystrophy)(参见Cea,LA等人.(2013)。失神经快肌型骨骼肌(denervated fastskeletal muscle)中的连接蛋白半通道的重新表现导致萎缩。美国国家科学院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciences),110:16229-16234(2013)；代谢疾病(metabolic diseases)(参见de Torre-Minguela,C.等人.免疫学前沿(Frontiers inImmunology),论文43(2017年1月27日))；如慢性阻塞性肺病的慢性呼吸道疾病或COPD(参见Hosseinian,N等人,呼吸道疾病的治疗进展(Therapeutic advances in respiratorydisease),9:188-197(2015))；糖尿病和糖尿病性肾病，以及导致胰岛素抗性、胰岛素分泌减弱和肾衰竭的器官功能障碍(参见和田J.(Wada,J.)和马基诺H.(Makino,H.)糖尿病和糖尿病性肾病的先天免疫(Innate immunity in diabetes and diabetic nephropathy).肾病学自然综述(Nature Reviews Nephrology),12:13-26(2016))；和脑肿瘤(参见周K.(Zhou,K.,)等人,免疫学研究杂志(Journal of Immunology Research),2016:9238290))。
在一个方面，本发明涉及例如使用半通道阻断剂调节受试者的细胞因子水平，包含血管生成细胞因子、VEGF和其产生、分泌和/或释放，并且涉及使用半通道阻断剂来降低或均衡细胞因子活性，包含在整体或部分特征在于血管生成和/或血管渗漏的病状中。
在一个方面，提供用于减少包含IL-6、IL-8、sICAM-1和MCP-1的细胞因子的产生、释放和/或分泌的方法。
在另一个方面，提供用于减少VEGF产生、释放和/或分泌的方法。在一个实施例中，VEGF为VEGF-A。
在另一个方面，提供用于调节受试者中不期望地扩增和维持连接蛋白半通道介导的细胞因子反馈环的方法，包含本文所描述或提及的疾病、病症和病状，包含在背景技术中。
在另一个方面，提供用于调节受试者中不希望地扩增和维持连接蛋白43半通道介导的自分泌反馈环的方法，包含本文所描述或提及的疾病、病症和病状，包含在背景技术中。
在另一个方面中，提供用于调节连接蛋白半通道介导(包含连接蛋白43半通道介导)的自分泌细胞因子反馈环，以减小至少部分地通过与新血管的血管生成形成有关的瘤形成或肿瘤生长来表征的疾病、病症和病状的细胞产生、分泌和/或释放的方法。
本专利部分地描述化合物的用途和调节连接蛋白半通道(包含连接蛋白43半通道)以阻断或调节细胞因子释放的方法。尤其，其描述可以用于破坏慢性疾病的介体循环的组合物和方法。
本发明的方法适用于通过向将受益于其的受试者投与连接蛋白半通道阻断剂来减弱受试者中的细胞因子的异常、升高、失调和/或以其它方式非所需的水平。细胞因子包含例如IL-6、IL-8、sICAM-1、MCP-1和VEGF(例如VEGF-A)。
本发明部分地涉及减少细胞因子和/或细胞因子活性的方法，其包括例如主要由以下组成或由以下组成：投与半通道阻断剂，例如拟肽物半通道阻断剂(如佩普塔贡(Peptagon)(肽5))，和/或小分子半通道阻断剂(如西弗拉姆(Xiflam)(托那博沙(tonabersat)))。这些方法适用于治疗例如与病理性或以其它方式非所需的血管生成相关的VEGF(例如VEGF-A)水平、与2型(非胰岛素依赖性)糖尿病相关的困难和例如实体肿瘤和癌症，以及本文所描述或提及的其它疾病、病症和病状，包含在背景技术中。
方法还适用于治疗例如非所需或病理性水平的白细胞介素-6(IL-6)、与各种人类发炎性疾病(如卡斯尔曼病)相关的病状和本文所描述或提及的其它疾病、病症和病状，包含在背景技术中。
方法适用于治疗例如非所需或病理性水平的白细胞介素-8(IL-8)、与各种疾病相关的病状(包括外周动脉阻塞性疾病(peripheral arterial occlusive disease；PAOD)、囊性纤维化(cystic fibrosis)、ANCA相关的血管炎(韦格纳氏肉牙肿病(Wegener'sgranulomatosis)))、血液科恶性疾病以及其它癌症，如肝细胞癌、软组织肉瘤和早期和转移性乳癌，以及本文所描述或提及的其它疾病、病症和病状，包含在背景技术中。
方法还适用于治疗例如非所需或病理性水平的sICAM-1、与各种急性和慢性发炎性疾病相关的病状，包含与狼疮肾炎(lupus nephritis)、视神经脊髓炎(neuromyelitisoptica；NMO)、全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus；SLE)以及与牙菌斑累积和发炎相关的牙龈承载细胞，包含在患有牙龈炎(gingivitis)、成人牙周炎和快速进展性牙周炎(rapidly progressive periodontitis)的患者中，以及在患有非小细胞肺癌(NSCLC)和本文所描述和提及的其它疾病、病症和病状的患者中的肿瘤细胞转移行为，包含在背景技术中。
方法还适用于治疗例如非所需或病理性水平的MCP-1、涉及多种疾病的病变的病状，包含自身免疫病症(例如多发性硬化症和继发性多发性硬化症)、肺病(例如慢性阻塞性肺病)、癌症以及胰岛素抗性、肿瘤新血管生成以及本文所描述或提及的其它疾病、病症和病状，包含在背景技术中。
在另一个方面，所述专利提供一种通过向所述受试者投与有效量的半通道阻断剂而有利地调节受试者的细胞因子(包含IL-6、IL-8、sICAM-1和MCP-1)的方法。在一个实施例中，本发明的方法是关于减少或调节VEGF(包含但不限于VEGF-A)。在另一个实施例中，本发明是关于减少或调节血管生成的方法。
在另一个方面，本发明是关于一种通过向受试者投与半通道阻断剂来减少或调节受试者的VEGF的方法。在一个实施例中，VEGF为VEGF-A。
此专利描述例如用于减少VEGF的产生、分泌和/或释放的组合物和方法以用于治疗至少部分地通过血管生成和/或通过VEGF(包含但不限于VEGF-A)表征或介导的疾病、病症和病状的用途。
因此，在一个方面，本发明涉及用于阻断或减少半通道开口以减少或调节VEGF(例如VEGF-A)的方法，并且涉及治疗其中VEGF和/或其它细胞因子的调节可能有益的病症的方法。
在另一个方面，本发明是关于一种通过向受试者投与半通道阻断剂来调节或减少患有乳癌、非小肺细胞癌或糖尿病的受试者的VEGF的方法。在一个实施例中，调节或降低的VEGF为VEGF-A。
半通道阻断剂组合物和方法可以单独使用或与一种或多种额外抗VEGF治疗剂组合使用，所述包含额外抗VEGF治疗剂抗VEGF抗体、变异抗VEGF抗体、VEGF捕捉(VEGF-trap)和其它抑制VEGF和/或VEGF受体(VEGFR)活性的药剂。在一个实施例中，VEGF治疗剂为VEGF-A拮抗剂或阻断剂或VEGF-A受体拮抗剂或阻断剂。
本发明的一个目标为提供用于调节半通道以减少有需要的受试者中细胞因子的产生、分泌和/或释放或分泌的的化合物、组合物、调配物、试剂盒和其使用和产生的方法，例如VEGF、IL-6、IL-8、sICAM-1和MCP-1和其异构体，包含VEGF-A。
本发明的另一个目标为提供用于通过向将受益于其的受试者投与连接蛋白半通道阻断剂来减弱受试者中的细胞因子的异常、升高、失调和/或以其它方式非所需水平的方法。
本发明的另一个目标为提供用于治疗将受益于调节细胞因子的疾病、病症和病状的化合物、组合物、调配物、试剂盒和方法。本发明的另一个目标为提供用于治疗将受益于细胞因子降低、细胞因子水平降低和/或细胞因子活性降低的疾病、病症和病状的化合物、组合物、调配物、试剂盒和方法。
在一些方面，将治疗方法施加到哺乳动物，例如人类。
在另一个方面，本发明提供一种间隙接合半通道阻断剂，例如小分子，如西弗拉姆和/或其类似物或前药，或拟肽物，如佩普塔贡和/或其类似物或前药，或其另一种半通道阻断剂或前药，用于治疗半通道调节可能有益的病症。在一些方面，半通道阻断剂每日、每周、每月、每两月或四月或以这些时间段的任何组合投与。举例来说，治疗可以每日投与一段时间，随后每周和/或每月等投与。
在另一个方面，本发明提供用于治疗一种或多种疾病、病症和病状的半通道阻断剂。在某些实施例中，所述一种或多种疾病、病症或病状选自包含以下各者、主要由以下各者组成或由以下各者组成的群组：例如韦格纳氏肉牙肿病；卡斯尔曼病；心绞痛，包含不稳定心绞痛；肾衰竭；多发性硬化症；肌肉萎缩症；继发性多发性硬化症；狼疮肾炎；肿瘤心血管生成；COPD；PAOD；糖尿病，包括2型(非胰岛素依赖性)糖尿病；胰岛素抗性；糖尿病性肾病；心力衰竭；实体肿瘤，包含脑肿瘤；癌症，包含乳癌、非小肺细胞癌、血液科恶性疾病；肝细胞癌、软组织肉瘤、早期乳癌和转移性乳癌。
适用于本发明的半通道阻断剂可以单独或与适用于治疗目标疾病、病症或病状的另一种治疗剂组合投与。在一些方面，式I化合物(例如西弗拉姆)和/或前述化合物的任一者的类似物或前药，或拟肽物(如佩普塔贡或其类似物或前药)或另一种半通道阻断剂可与用于治疗其中半通道的调节可能有益的病症的细胞因子拮抗剂一起使用。半通道阻断剂的投与可以与细胞因子拮抗剂的投与同时、之后或之前。
因此，半通道阻断剂可以例如与VEGF或其它细胞因子拮抗剂共投与。在包含以下、主要由以下组成或由以下组成的方法中：半通道阻断剂与细胞因子阻断剂或拮抗剂(例如VEGF拮抗剂)的共投与，例如抗VEGF抗体或VEGF受体阻断剂或IL-6受体阻断剂等；半通道阻断剂的共投与可与细胞因子阻断剂或拮抗剂的投与同时、之后或之前。VEGF-A和VEGF-A受体拮抗剂目前是优选的。
在其它方面，可以通过本发明的组合物和方法治疗各种细胞因子相关的病症，包含用单独或与细胞因子拮抗剂一起的半通道阻断剂治疗的方法。这些病症包含但不限于本文中所描述或提及的那些病症。
如所提到，本发明还提供一种治疗患者的方法，其中除投与小分子或肽或拟肽物半通道阻断剂以外，所述方法包含向患者投与抗VEGF药剂和/或抗细胞因子药剂作为治疗性治疗。在一个方面，VEGF拮抗剂或另一种抗细胞因子药剂与投与足以治疗患者的量的半通道阻断剂同时或在投与足以治疗患者的量的约1到5、10、30、45、60、75、90或100到180天内投与到患者。在本发明的方法的一个特定实施例中，VEGF拮抗剂与半通道阻断剂同时投与。在一些方面，举例来说，VEGF拮抗剂可以是抑制和/或阻断VEGF或抑制和/或阻断VEGF的上游促效剂的化合物。在一些方面，VEGF拮抗剂包含例如结合到VEGF和抑制VEGF的拮抗剂、抑制VEGF表现的化合物和/或包括VEGF抑制剂或编码蛋白质的病毒载体，或阻断或抑制VEGF的反义多核苷酸(antisense polynucleotides)。在一些方面，举例来说，抑制VEGF和/或VEGF上游促效剂的药剂可以是抗体或抗体片段、纳米抗体、肽或拟肽物、受体片段、重组融合蛋白、适体、小分子或单链可变片段(single chain variable fragment；scFv)。在一个实施例中，VEGF拮抗剂为VEGF-A拮抗剂。在另一个例示性实施例中，VEGF拮抗剂为核酸分子、适体、反义RNA分子、核酶(ribozyme)、RNAi分子、蛋白质、肽、环肽、抗体、抗体片段的结合片段、糖、聚合物或小分子。在一个实施例中，本发明的此方法涉及投与VEGF拮抗剂，其为适体，如EYE001适体。在另一个实施例中，本发明的此方法涉及投与VEGF拮抗剂，其为抗体或其结合片段，例如
Figure BDA0002413147850000101
(贝伐单抗(bevacizumab))或
Figure BDA0002413147850000102
(雷珠单抗(ranibizumab))。在另一个实施例中，本发明的此方法涉及投与IL-6受体拮抗剂，例如
Figure BDA0002413147850000103
(托珠单抗(tocilizumab))。
用于调节/降低细胞因子水平或活性(包含血管生成细胞因子、VEFG的水平或活性)的半通道阻断剂，包含本文所描述或提及或以引用的方式并入的半通道阻断剂化合物。
一些优选的半通道阻断剂包含小分子半通道阻断剂(例如，西弗拉姆(托那博沙))。在一些实施例中，半通道阻断剂为除了西弗拉姆的小分子，例如描述于以科林格林(Colin Green)等人的名义提交的，第20160177298号美国专利申请公开案中的式I或式II中的半通道阻断剂，其公开内容特此以如上所述的全文引用的方式并入。各种优选实施例包含使用阻断或改善或以其它方式拮抗或抑制半通道开口的小分子来治疗至少部分地由异常、升高、失调和/或以其它方式非所要、非所需或有害水平或活性的细胞因子(包含本文所描述或提及的那些)表征的疾病、病症和病状。在各种实施例中，阻断或改善或抑制半通道开口的小分子为西弗拉姆的前药或其类似物。
在其它实施例中，半通道阻断剂包含肽和拟肽物半通道阻断剂)例如佩普塔贡、VDCFLSRPTEKT、拟肽物)和其它包括胺基酸顺序SRPTEKT或主要由氨基酸序列SRPTEKT组成或由氨基酸序列SRPTEKT组成的拟肽物半通道阻断剂。在本发明的任一个方面中，半通道阻断剂为连接蛋白肽或拟肽物，包含肽或拟肽物，所述肽或拟肽物包括以下各者、主要由以下各者组成或由以下各者组成：连接蛋白胞外结构域、跨膜区域和连接蛋白羧基端肽。连接蛋白半通道阻断肽或拟肽物可以经修饰或不经修饰。以化学方式、以合成方式或以其它方式制造连接蛋白半通道阻断肽或拟肽物。在一些实施例中，连接蛋白半通道阻断肽或拟肽物是Cx43肽或拟肽物。在一些方面，治疗有效的经修饰或未经修饰的肽或拟肽物包括连接蛋白(如Cx43或Cx45)的细胞外或跨膜结构域的一部分，例如连接蛋白细胞外环2的一部分，包含Cx43细胞外环2的一部分和Cx45细胞外环2的一部分。
在另一个方面，本发明提供半通道阻断剂在制造用于治疗本文所描述或提及的一种或多种疾病、病症和病状的药物中的用途。药物包括半通道阻断剂、主要由半通道阻断剂组成或由半通道阻断剂组成。在一个实施例中，药物包括肽半通道阻断剂、主要由肽半通道阻断剂组成或由肽半通道阻断剂组成。在一个实施例中，药物包括拟肽物半通道阻断剂、主要由拟肽物半通道阻断剂组成或由拟肽物半通道阻断剂组成。在一个实施例中，药物包括小分子半通道阻断剂、主要由小分子半通道阻断剂组成或由小分子半通道阻断剂组成。在一个实施例中，药物包括根据第20160177298号美国专利申请公开案中的式I或式II的化合物、主要由其组成或由其组成。在一个实施例中，药物包括西弗拉姆(托那博沙)、主要由其组成或由其组成。与“包括(including)”、“含有(containing)”或“特征在于(characterized by)”同义的术语“包括(comprising)”为包含性的或开放式的并且并不排除来自药物(或在方法的情况下，步骤)的额外、未列出的要素或成分。短语“由...组成”排除药物(或在方法的情况下，步骤)中未指定的任何要素、步骤或成分。短语“主要由…组成”是指指定材料和不会实质上影响药物(或在方法的情况下，步骤)的基本和新颖特征的那些材料。本发明的基本和新颖特征在整个说明书中描述，并且包含本发明的药物和方法以阻断或调节连接蛋白间隙接合半通道并且减弱细胞因子(包含例如VEGF细胞因子)的产生、释放或活性的能力。本发明的基本和新颖特征(包括本文所描述的药物和方法)的物质变化包含半通道调节和/或细胞因子衰减的非所需或临床上非所要的、有害的、不利的或不良减弱。在一个实施例中，药物包括连接蛋白43半通道阻断剂(例如拟肽物或小分子连接蛋白43半通道阻断剂)、主要由其组成或由其组成：。
在另一个方面，本发明提供半通道阻断剂在制造用于调节半通道和/或治疗本文所描述或提及的疾病、病症和/或病状中的任一者的药物(或在有或无使用说明书的情况下，含有一种或多种药物和/或容器的套装或试剂盒)中的用途。在一个方面，举例来说，本发明提供连接蛋白半通道阻断剂(包含例如西弗拉姆和/或其类似物或佩普塔贡或其类似物)在制造用于治疗调节半通道可能有益的病症的药物或套装或试剂盒中的用途。在一个实施例中，药物包括连接蛋白43半通道阻断剂(例如拟肽物或小分子连接蛋白43半通道阻断剂)、主要由其组成或由其组成：。在一个实施例中，适用于本发明的半通道阻断剂组合物可包含药学上可接受的载剂，并且可以调配为例如丸剂、溶液、微球、纳米粒子、植入物、基质或水凝胶调配物，或可以冻干形式提供。
在一些方面，半通道阻断剂包含可与细胞因子拮抗剂(例如VEGF拮抗剂)共投与或一起用于制造用于治疗调节半通道和细胞因子具有益处的病症的药物中。
在一些方面，半通道阻断剂可与细胞因子拮抗剂(例如VEGF拮抗剂)一起用于制造用于治疗本文所提及的一种或多种疾病、病症和病状的单独药物或组合药物。
在各种实施例中，经调节的半通道包括以下中的一者或多者：连接蛋白23(Cx23)、连接蛋白25(Cx25)、连接蛋白26(Cx26)、连接蛋白30(Cx30)、连接蛋白30.2(Cx30.2)、连接蛋白30.3(Cx30.3)、连接蛋白31(Cx31)、连接蛋白31.1(Cx31.1)、连接蛋白31.9(Cx31.9)、连接蛋白32(Cx32)、连接蛋白36(Cx36)、连接蛋白37(Cx37)、连接蛋白40(Cx40)、连接蛋白40.1(Cx40.1)、连接蛋白43(Cs43)、连接蛋白45(Cx45)、连接蛋白46(Cx46)、连接蛋白47(Cx47)、连接蛋白50(Cx50)、连接蛋白57(Cx57)、连接蛋白59(Cx59)和连接蛋白62(Cx62)。在一个实施例中，经调节的半通道包括Cx26、Cx30、Cx32、Cx36、Cx37、Cx40、Cx45和/或Cx47蛋白质中的一者或多者。在一个特定实施例中，半通道和/或经调节的半通道包括Cx37、Cx40和Cx43中的一者或多者。在一个特定实施例中，半通道和/或经调节的半通道包括Cx30、Cx37、Cx40、Cx43和Cx45中的一者或多者。在一些实施例中，经调节的半通道可包含或不包含前述连接蛋白中的任一者。在一些方面，半通道阻断剂为Cx37半通道、Cx43半通道、Cx40半通道和/或Cx45半通道的阻断剂。在某些优选实施例中，半通道阻断剂为连接蛋白43半通道阻断剂。用于本文所述的任何用途的本发明的药物组合物还可包括可以抑制或阻断Cx26、Cx30、Cx31.1、Cx36、Cx37、Cx40、Cx45、Cx50或Cx57或任何其它连接蛋白或连接蛋白半通道的半通道阻断剂。在另一个实施例中，用于本发明方法和制造中的任何用途的药物组合物和本文所述的连接蛋白还可以包含一起或分开提供的至少一种细胞因子拮抗剂。在一些实施例中，阻断剂可包含或不包含前述连接蛋白中的任一者。在一个实施例中，半通道阻断剂阻断血管中的连接蛋白半通道。在其它实施例中，半通道阻断剂阻断血液微血管中的连接蛋白半通道。在其它实施例中，半通道阻断剂阻断毛细血管中的连接蛋白半通道。
在一个实施例中，本发明的任何投与、共投与、组合物、试剂盒或治疗方法中使用的半通道阻断剂为Cx43半通道阻断剂。其它实施例包含Cx45半通道阻断剂，和Cx26、Cx30、Cx31.1、Cx36、Cx37、Cx40、Cx50和/或Cx57半通道或包括上文和本文提到的任何其它连接蛋白的半通道、主要由其组成的半通道或由其组成的半通道的阻断剂。在一些实施例中，阻断剂可包含或不包含前述连接蛋白中的任一者，或在此专利中提到的其它连接蛋白。在一些实施例中，待阻断的连接蛋白半通道为异质半通道(即，含有混合不相同连接蛋白的半通道)。
本发明的此方面的另一个实施例提供一种药物包，其包含VEGF或其它细胞因子拮抗剂以及小分子或其它半通道阻断剂。在此方面的一个实施例中，药物包包含VEGF拮抗剂，其为VEGF-A拮抗剂。在另一个实施例中，药物包的半通道阻断剂和VEGF拮抗剂分开且以个别剂量调配。在又一个实施例中，药物包的半通道阻断剂和VEGF拮抗剂一起调配。在一个实施例中，半通道阻断剂为西弗拉姆。在另一个实施例中，半通道阻断剂为佩普塔贡。
在本发明的另一个方面中，使用细胞因子蛋白质分析评估或监测受试者中的半通道阻断剂治疗的作用。细胞因子蛋白质水平可以通过允许检测和定量来自受试者的样本中的蛋白质的任何常规方法(包含本文所描述的那些方法)定量。
本发明包含一种用于预测用半通道阻断剂治疗的受试者的临床结果并且引发半通道阻断剂治疗、中断半通道阻断剂治疗、改变半通道阻断剂治疗或进一步用半通道阻断剂和/或细胞因子拮抗剂治疗所述受试者的活体外方法。本文描述本发明的此特征的各种实施例。
可以使用某些生物分析评估半通道阻断剂的活性。可识别、评估或筛选已知或候选半通道阻断剂对分子动力的作用，以使用以下实例中所描述的方法，或用于确定化合物通过连接蛋白半通道的其它熟知或同等方法。已知所属领域中各种方法，包含染料转移实验，例如用可检测标记物标记的分子的转移，以及小荧光渗透性示踪剂的跨膜通道，其已广泛用于研究半通道的功能状态。本文描述本发明的此方面的各种实施例，包含用于识别或评估化合物阻断半通道的能力的方法，其包括：(a)将测试样本和测试系统放在一起，所述测试样本包括一种或多种测试化合物，并且所述测试系统包括用于评估半通道阻断的系统，所述系统特征在于其呈现例如染料或标记代谢物的高转移，例如回应于将缺氧或缺血引入到所述系统，发炎的介体或其它化合物或事件诱导半通道开口，如细胞外Ca2+下降；和(b)确定所述系统中染料或其他一种或多种标记代谢物的存在或增加量。还可以使用正和/或负控制。任选地，可以将预定量的半通道阻断剂((例如佩普塔贡或西弗拉姆)添加到测试系统。如本文中所指出，在一个实施例中，举例而言，半通道阻断剂(如佩普塔贡和西弗拉姆)在活体外分析中展现约小于约1到5nM、优选地小于约10nM并且更优选地小于约50pM的活性。在活体内分析中，这些化合物优选地展示浓度小于约10-100微摩尔(μM)并且更优选地浓度小于约50μM的半通道阻断。其它半通道阻断剂可在这些范围内，并且还在小于约200pM的范围内。
附图说明
图1展示在基础条件下并且响应于高葡萄糖(HG)条件、细胞因子和HG与细胞因子共同施加下IL-6、sICAM-1、MCP-1和IL-8的分泌。单独投与细胞因子而非单独投与HG诱导IL-6释放。单独的细胞因子或单独的HG都不诱导sICAM-1的分泌。然而，HG和细胞因子的共同施加产生与基础水平相比更高水平的IL-6和sICAM-1释放。细胞因子诱导MCP-1和IL-8释放。与HG的共投与产生更高水平的MCP-1和IL-8。结果表示为平均值±SD；使用具有图基氏多重比较测试(Tukey's multiple comparison's test)的单因子变异数分析(one-wayANOVA)进行统计分析；N＝3；t＝24小时；ns＝不显著；***p≤0.001；****p≤0.0001。
图2展示在用半通道阻断剂(佩普塔贡)和ATP添加治疗之后，在基础条件下，响应于HG、细胞因子和HG和细胞因子的共施加的VEGF分泌。HG和细胞因子的共投与诱导VEGF释放(p≤0.0001)，而佩普塔贡治疗使VEGF分泌恢复到基础水平。添加外源性ATP抵消针对半通道阻断介导的VEGF释放的保护。结果表示为平均值±SD；使用具有图基氏多重比较测试的单因子变异数分析进行统计分析；N＝3；t＝24小时；n.s.为不显著；**p≤0.01；****p≤0.0001。
图3展示在共同施加HG和细胞因子之后佩普塔贡介导IL-6、IL-8、sICAM-1和MCP-1的表现降低。HG和细胞因子的共同施加通过ARPE-19细胞诱导IL-6、IL-8、sICAM-1和MCP-1释放，并且用5μM、10μM、25μM和50μM的半通道阻断剂(佩普塔贡)处理，以浓度依赖性方式使IL-6、IL-8和MCP-1水平降低。结果表示为平均值±SD；使用具有邓内特氏多重比较测试(Dunnett's multiple comparisons test)的单因子变异数分析进行统计分析。所有处理都显著不同于高葡萄糖和细胞因子的共同施加(在所有情况下p<0.0001)。N＝3；t＝24小时。
图4展示半通道阻断剂(佩普塔贡)针对由HG和细胞因子诱导的ATP释放的保护作用。HG和细胞因子的共同施加引起相对于基础条件的ATP释放增加。肽5预防由HG+细胞因子介导的ATP释放。重要的是，经佩普塔贡处理的组与基础条件之间不存在统计学上显著的差异。使用具有图基氏多重比较测试的单因子变异数分析进行统计分析。N＝3；t＝24小时；n.s.＝不显著；*p≤0.05；***p≤0.001。
图5展示ATP逆转的半通道阻断剂介导的与佩普塔贡在IL-6、MCP-1和IL-8但非sICAM-1的表现中的降低。HG和细胞因子的共同施加通过ARPE19细胞诱导IL-6、IL-8、sICAM-1和MCP-1释放，但使用25μM连接蛋白拟肽物(佩普塔贡)处理的半通道阻断剂减少细胞因子的分泌。细胞外ATP(10nM)逆转的佩普塔贡介导的针对IL-6、MCP-1和IL-8而非sICAM-1释放的保护。结果表示为平均值±SD；使用具有图基氏多重比较测试的单因子变异数分析进行统计分析。N＝3；t＝24小时；ns＝不显著；*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001；****p<0.0001。
图6展示NLRP3复合物的免疫组织化学标记。惰性NLRP3通常分散于细胞质内，但一旦用高葡萄糖和发炎性细胞因子活化炎性体，使炎性体复合物中的多个NLRP3复制物寡聚浓缩，使得其能够显现为小点(箭头A)。连接蛋白拟肽物半通道阻断剂(佩普塔贡)的添加阻断了炎性体组装，仅看到几个复合物点(B)。具有此抗体的高核背景标记存在于所有条件下。外源性10nM ATP的添加使半通道阻断剂处理过度并且使炎性体复合物再次在细胞质(C)内形成。结果表示为平均值±SD；N＝3；t＝24小时；比例尺＝50μm。
具体实施方式
定义
在本文中，“小分子”定义为具有低于约600到900道尔顿的分子量，并且通常为有机化合物。小分子可以是半通道阻断剂前药的活性剂。在一个实施例中，小分子低于600道尔顿。在另一个实施例中，小分子低于900道尔顿。
如本文所使用，“治疗(treatment)”(和其语法变体，如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指改变所治疗的个体、组织或细胞的自然过程的临床干预，并且可以针对预防或在临床病理期间进行。治疗的所要作用包含但不限于预防疾病、病症或病状的发生或复发、缓解病征或症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病病状和缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的化合物、方法和组合物可用于延迟疾病、病症或病状的发展或减慢疾病、病症或病状的进展。术语未必暗示治疗受试者直到总体恢复。因此，“治疗”包含降低、缓解或改善特定疾病、病症或病状的症状或严重程度或预防或以其它方式降低产生特定疾病、病症或病状的风险。其还可包含维持或促进病状缓解的完整或部分状态。如本文所使用的“治疗”还包含在投与半通道阻断剂之后降低、缓解或改善受试者的细胞因子水平或活性，例如IL-6、IL-8、MCP-1和sICAM-1的水平和/或活性，以及降低血管生成细胞因子VEGF的存在或量。
术语“治疗细胞因子病症”等(包含疾病和病状)可以指预防、减缓、降低、减少、终止和/或逆转病症、疾病或病状和/或细胞因子的水平或活性，包含例如IL-6、IL-8、sICAM-1和MCP-1和/或VEGF。
术语“预防”意味着完全或部分地预防或改善或控制。
如本文所用，“有效量”是指在实现所要治疗或预防结果所必要的剂量和时间段下有效的量。举例来说，并且非限制性地，“有效量”可以指本文所公开的能够治疗涉及细胞因子的疾病、病症或病状的病征和/或症状的化合物或组合物的量，或指能够有利地调节细胞因子(包含例如IL-6、IL-8、sICAM-1和MCP-1和/或VEGF)的产生、分泌和/或释放的半通道化合物或组合物的量。
如本文所用，本发明的物质/分子、促效剂或拮抗剂的“治疗有效量”可以根据如个体的疾病病况、年龄、性别和体重等因素改变，并且可以改变物质/分子、促效剂或拮抗剂在个体中引发所需反应的能力。治疗有效量优选地也是其中物质/分子、促效剂或拮抗剂的任何毒性或有害作用可由治疗有益作用超过的量。半通道阻断剂的治疗有效量将降低或抑制受试者中细胞因子水平或活性的增加。半通道阻断剂的治疗有效量将调节受试者中的细胞因子水平或活性。
如本文所用，“预防有效量”是指在实现所要预防结果所必要的剂量和时间段下有效的量。通常但不一定，由于预防剂量在疾病、病症或病状之前或更早期用于受试者，因此预防有效量将小于治疗有效量。
术语“药物调配物”是指呈允许其中所含有的活性成分(例如半通道阻断剂)的生物活性有效并且不含有对将投与调配物的受试者不可接受地有毒的额外组分的此类形式的制剂。
如本文所用，“药学上可接受的载剂”是指药物调配物中的除活性成分以外的成分，其可以安全地投与受试者。药学上可接受的载剂包含但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂和防腐剂。
如本文所用，术语“受试者(subject)”等包含“个体(individual)”和“患者(patient)”,其所有在本文中可互换使用，是指任何哺乳动物，包含人类、家养动物和农畜，以及动物园动物、野生动物园、运动或宠物动物，如犬、马、猫、绵羊、猪、母牛等。优选的哺乳动物为人类，包含成人、儿童和老年人。优选的运动动物是马和犬。优选的宠物动物为犬和猫。受试者可以是例如水上公园动物，例如海豚、鲸、海豹或海象。在某些实施例中，受试者、个体或患者为人类。
如本文所用，术语“半通道”是间隙接合(两种半通道或接合质跨越邻近细胞之间的细胞间间隔连接以形成间隙接合)的一部分并且由多个连接蛋白蛋白质构成，通常同源或异源，即连接蛋白蛋白质的同源或异源六聚体，其形成两个邻近细胞的细胞质之间的间隙接合的孔。半通道是由在接合的一侧上的细胞供应，其中来自相对细胞的两个半通道通常一起形成完整的细胞间半通道。然而，在一些细胞中，并且在一些环境下的细胞中，半通道自身作为细胞质与胞外空间之间的管道具有活性，允许离子和小分子的转移。
式I化合物，例如西弗拉姆和/或前述化合物中的任一种的类似物或前药，可以调节半通道(优选包括任何类型的连接蛋白蛋白质的那些)的功能和/或活性。因此，除非上下文另外需要，否则提及“半通道”应广泛地理解为包含半通道，所述半通道包括多个不同连接蛋白蛋白质的任何一者或多者、主要由其组成或由其组成。然而，举例来说，半通道可包括连接蛋白23、25、26、30、30.2、30.3、31、31.1、31.9、32、36、37、40、40.1、43、45、46、47、50、59和62蛋白质中的一者或多者。在一个实施例中，半通道由前述连接蛋白中的一者组成。在一个实施例中，半通道包括连接蛋白26、30、32、36、37、40、45和47中的一者或多者。在一个实施例中，半通道由连接蛋白26、30、32、36、37、40、45或47中的一者组成。在一个实施例中，半通道由连接蛋白37、40或43中的一者组成。在一个实施例中，半通道为血管半通道。在一个实施例中，半通道为在血管内皮细胞中发现的连接蛋白半通道。在一个实施例中，半通道为在血管平滑肌细胞中发现的连接蛋白半通道。在一个特定实施例中，半通道包括连接蛋白30、37和连接蛋白43中的一者或多者。在一个特定实施例中，半通道由连接蛋白30组成。在一个特定实施例中，半通道由连接蛋白37组成。在一个特定实施例中，半通道由连接蛋白43组成。在一个特定实施例中，半通道由连接蛋白45或连接蛋白46或连接蛋白50中的一者组成。在一个实施例中，半通道包括不包含连接蛋白26的一种或多种连接蛋白。在一个实施例中，组合物可包含或不包含任何包含前述连接蛋白的半通道阻断剂。
半通道和半通道可存在于任何类型的细胞中。因此，除非上下文另外需要，否则提及“半通道”或“半通道”应认为包含提及存在于任何类型的细胞中半通道和半通道。在本发明的一个实施例中，半通道或半通道存在于器官中或存在于癌症或肿瘤中的细胞中。在一个实施例中，半通道为血管半通道。在一个实施例中，半通道为在血管内皮细胞和/或血管平滑肌细胞中发现的连接蛋白半通道。
如本文所用，“半通道调节”是半通道的一种或多种功能和/或活性的调节，典型地，分子在通过半通道的细胞之间的流动。此类功能和活性包含例如分子从胞外空间或环境流动通过半通道到细胞中，和/或分子从细胞的胞内空间或环境流动通过半通道到胞外空间或环境中。适用于调制半通道的化合物可被称为“半通道调节剂”。
半通道功能的调制可通过任何方式发生。然而，仅举例而言，调节可通过以下各者中的一者或多者发生：诱导或促进半通道封闭；预防、阻断、抑制或减小半通道开口；触发、诱导或促进半通道和/或间隙接合的细胞内化(cellular internalization)。词语的使用，如“阻断”、“抑制”、“预防”、“减少”和“拮抗”等可能不理解为暗示完全阻断、抑制、预防或拮抗，尽管这可能是优选的，并且应理解为包含部分阻断、抑制、预防或拮抗以至少降低半通道和/或半通道的功能或活性。类似地，“诱导”或“促进”不应理解为暗示半通道(或半通道群组)完全内化，并且应理解为包含部分内化以至少降低半通道的功能或活动。
如本文所用，术语“半通道阻断剂”是干扰分子穿过连接蛋白半通道的化合物。半通道阻断剂可以阻断或减小半通道开口、阻断或减少分子通过半通道释放到胞外空间，和/或阻断或减少分子通过半通道进入胞内空间中。半通道阻断剂包含完全或部分阻断半通道泄漏或分子到细胞外空间或从细胞外空间通过的化合物。半通道阻断剂还包含半降低通道开放概率的化合物。开放概率为通道保持开放与闭合的时间百分比的量度(在戈德伯格GS(Goldberg GS)等人,间隙接合通道的选择性渗透(Selective permeability of gapjunction channels)生物化学与生物物理学报(Biochimica et Biophysica Acta)1662(2004)96-101中回顾)。半通道阻断剂的实例包含肽、小分子、抗体和抗体片段。半通道阻断剂包含半通道调节剂。半通道阻断剂可直接或直接干扰分子穿过连接蛋白半通道。
如本文所用，术语“调节细胞因子”和“调节细胞因子活性”是指细胞因子(包含血管生成细胞因子、VEGF)的产生、分泌和/或释放的减少、降低、均衡或平滑化。如本文所用，术语“调节细胞因子”和“调节细胞因子活性”是指细胞因子活性(包含血管生成细胞因子、VEGF的活性)的减少、降低、均衡或平滑化。细胞因子调节是用半通道阻断剂实现，并且适用于治疗整体或部分特征在于病理性、异常或以其它方式非所需或非所要的细胞因子活性的疾病、病症和病状，包含整体或部分特征在于由血管生成和/或血管渗漏的疾病、病症或病状。适用于调节细胞因子的化合物可被称为“细胞因子调节剂”。本发明化合物可以用于调节细胞因子活性的治疗方法，其中调节细胞因子活性(例如细胞因子活性减少、降低、均衡或平滑化)，包含在整体或部分特征在于病理性、异常或另外非所要或非所需的细胞因子活性的疾病、病症或病状的治疗方法中。使细胞因子活性均衡或平滑化包含在细胞因子或细胞因子活性的存在或量下使物质平稳流出和/或抑制物质增加。
炎性体一些为包括半胱氨酸蛋白酶1、PYCARD、NALP和任选地半胱氨酸蛋白酶5(也称为半胱氨酸蛋白酶11或ICH-3)的多蛋白复合物。炎性体的准确组成取决于引发炎性体组装的活化剂。炎性体促进发炎性细胞因子白介素1β(IL-1β)和白介素18(IL-18)的成熟。根据本发明的半通道阻断剂可调节或调整炎性体活性和炎性体路径活化。半通道阻断剂的目标炎性体包含NLRP3炎性体。
术语“肽”、“拟肽物”和“模拟剂”包含可具有其模拟的蛋白质区域的大体上相同的结构和功能特征的合成或基因工程改造的化合物。在连接蛋白半通道的情况下，这些可模拟例如半通道连接蛋白的胞外环。
如本文所用，术语“肽类似物”是指具有类似于模板肽的特性的那些特性的化合物，并且可以是非肽药物。包含肽和基于肽的化合物的“拟肽物(Peptidomimetic)”(也称为拟肽物(peptide mimetic))还包含此类基于非肽的化合物，如肽类似物。结构上类似于治疗上适用的肽的拟肽物可用于产生同等或增强的治疗或预防作用。肽和拟肽物在一些方面可以经修饰或未经修饰。一般来说，拟肽物是对范式多肽(即，具有生物或药理学功能或活性的多肽)的结构或功能模拟(例如，相同或类似)，但还可具有一个或多个肽键，其任选地被选自由以下组成的群组的键置换：例如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-。模拟物可以完全由天然氨基酸、合成化合物、氨基酸非天然类似物构成，或为部分天然肽氨基酸和部分氨基酸非天然类似物的嵌合分子。模拟物还可包括任何量的天然氨基酸保守取代，只要此类取代也大体上不更改模拟物活性即可。在连接蛋白半通道的情况下，这些可模拟例如参与接合质-接合质对接和细胞-细胞通道形成的半通道胞外环。拟肽物涵盖本文所述的那些，以及所属领域中已知的那些，无论是现在已知的还是随后研发的。肽和拟肽物半通道阻断剂还可以经修改以增加稳定性、改良生物可用性和/或增加细胞膜渗透率。
本专利描述调节细胞因子的新方法，所述细胞因子包含IL-6、IL-8、sICAM-1和MCP-1以及血管生成细胞因子、VEGF。这些细胞因子中的一种或多种的存在或量在多种疾病、病症或病状中升高、异常、失调、无序或以其它方式非所要或非所需，所述疾病、病症或病状中的一些的特征在于非所要或病理性血管生成。
如本文所用，术语“拮抗剂”是指一种化合物，其存在引起蛋白质的生物活性量级降低。在某些实施例中，拮抗剂的存在阻断或减弱，即导致蛋白质的生物活性完全或部分抑制。在某些描述中，拮抗剂可被称为抑制剂或调节剂。因此，细胞因子“拮抗剂”是指完全或部分地抑制细胞因子活性或功能的一种或多种化合物，例如VEGF的活性或功能，优选地血管原活性。细胞因子“受体拮抗剂”意指完全或部分地抑制细胞因子受体(例如VEGF受体)的活化或功能的一种或多种化合物。
半通道开口的阻断剂(包含半通道阻断剂)包含小肽和小分子阻断剂。阻断剂可以单独或彼此组合和/或与其它治疗剂组合使用以治疗如本文所描述的疾病、病症或病状，包含特征在于血管生成和/或慢性发炎的疾病、病症或病状。
如本文所描述，在暴露于发炎的各种介体、促炎性细胞因子IL-1β和TNF-α以及IL-1β与具有高葡萄糖的TNF-α的组合的细胞系统中评估半通道阻断剂的用途，其协同地增加发炎性细胞因子释放。用于测量各种细胞因子释放的分析展示VEGF以及IL-6、IL-8、MCP-1、sICAM-1的分泌增加。图1展示仅在发炎存在下的细胞因子释放(IL-1β和TNF-α)，其中包含增加其的葡萄糖的组合。半通道阻断剂的施加减少细胞因子释放并且恢复正常间隙接合图案化。外源性ATP逆转半通道阻断剂保护，证实细胞因子作用是连接蛋白半通道介导的。
本发明涉及调节细胞因子产生、分泌和/或释放，包含调节VEGF水平或活性。如所提到，半通道阻断剂包含例如小拟肽物和小分子阻断剂。半通道阻断剂可以单独使用或与其它药剂(例如细胞因子拮抗剂)组合使用以治疗如本文所描述的疾病、病症或病状，包含急性和慢性发炎性疾病。
本发明提供用于治疗细胞因子病症(包含疾病和病况)并且至少部分地通过细胞因子包含VEGF、IL-6、IL-8、MCP-1、sICAM-1)的升高或非所要水平和/或活性来表征的方法，并且预防、减缓、降低、减少、终止和/或逆转包含VEGF以及IL-6、IL-8、MCP-1、sICA-1的细胞因子的产生、分泌和/或释放。患有细胞因子病症的受试者用治疗有效量的半通道阻断剂治疗。
本发明尤其提供通过投与半通道阻断剂(如佩普塔贡和/或其类似物；式I化合物例如西弗拉姆和/或前述化合物中的任一者的类似物或前药)来调节细胞因子产生、分泌和/或释放的方法，其用于治疗其中调节到更低细胞因子产生、分泌和/或释放可能有益的疾病、病症或病状。
在某些实施例中，本发明人涵盖本发明的方法，其用于治疗本文所描述或提及或其中使细胞银子产生、分泌和/或释放减弱具有益处的疾病、病症或病状。疾病、病症或病状包含例如韦格纳氏肉牙肿病；卡斯尔曼病；肾衰竭；心绞痛，包含不稳定心绞痛；多发性硬化症；肌肉萎缩症；继发性多发性硬化症；狼疮肾炎；肿瘤心血管生成；COPD；PAOD；糖尿病，包括2型(非胰岛素依赖性)糖尿病；胰岛素抗性；糖尿病性肾病；心力衰竭；实体肿瘤；脑肿瘤；癌症，包含乳癌、非小肺细胞癌、血液科恶性疾病；肝细胞癌、软组织肉瘤、早期乳癌和转移性乳癌。
在一些实施例中，本发明的特征在于使用式I化合物(例如西弗拉姆)和/或前述化合物中的任一者的类似物或前药直接并立即阻断Cx43半通道，并且引起细胞因子产生、分泌和/或释放的浓度和时间依赖性降低。
连接蛋白
在各种实施例中，经调节的半通道为连接蛋白23(Cx23)半通道、连接蛋白25(Cx25)半通道、连接蛋白26(Cx26)半通道、连接蛋白30(Cx30)半通道、连接蛋白30.2(Cx30.2)半通道、连接蛋白30.3(Cx30.3)半通道、连接蛋白31(Cx31)半通道、连接蛋白31.1(Cx31.1)半通道、连接蛋白31.9(Cx31.9)半通道、连接蛋白32(Cx32)半通道、连接蛋白36(Cx36)半通道、连接蛋白37(Cx37)半通道、连接蛋白40(Cx40)半通道、连接蛋白40.1(Cx40.1)半通道、连接蛋白43(Cx43)半通道、连接蛋白45(Cx45)半通道、连接蛋白46(Cx46)半通道、连接蛋白47(Cx47)半通道、连接蛋白50(Cx50)半通道、连接蛋白57(Cx57)半通道、连接蛋白59(Cx59)半通道和连接蛋白62(Cx62)半通道。在一个实施例中，经调节的半通道包括Cx26、Cx30、Cx32、Cx36、Cx37、Cx40、Cx43、Cx45和/或Cx47蛋白质中的一者或多者。在一个特定实施例中，经调节的半通道和/或半通道为Cx37和/或Cx40和/或Cx43半通道。在一个特定实施例中，经调节的半通道和/或半通道为Cx30和/或Cx43和/或Cx45半通道。在一些实施例中，经调节的半通道可包含或不包含前述连接蛋白蛋白质中的任一者。在一些方面，半通道阻断剂为Cx43半通道、Cx40半通道和/或Cx45半通道的阻断剂。在某些优选实施例中，半通道阻断剂为连接蛋白43阻断剂。用于本文所述的任何用途的本发明的药物组合物还可包括可以抑制或阻断Cx26、Cx30、Cx31.1、Cx36、Cx37、Cx40、Cx45、Cx50或Cx57半通道或任何其它连接蛋白半通道(包含同源和异源半通道)的半通道阻断剂。在另一个实施例中，用于本发明方法和制造中的任何用途的药物组合物和本文所述的连接蛋白还可以包含一起或分开提供的至少一种细胞因子拮抗剂。在一些实施例中，经调节的半通道可包含或不包含前述连接蛋白半通道中的任一者，或可为非均质半通道。
在一个实施例中，本发明的任何投与、共投与、组合物、试剂盒或治疗方法中使用的半通道阻断剂为Cx43半通道阻断剂。其它实施例包含Cx45半通道阻断剂、Cx30半通道阻断剂、Cx37半通道阻断剂、Cx40半通道阻断剂以及Cx26、Cx31.1、Cx36、Cx50和/或Cx57半通道或包括上文或本文中提到的任何其它连接蛋白、主要由其组成或由其组成的半通道的阻断剂。一些实施例可以包含或不包含任何前述连接蛋白或半通道，或在此专利中提到的其它连接蛋白或半通道。
半通道阻断剂
半通道阻断剂在本发明的方法中用于调节细胞因子，所述细胞因子包含例如VEGF以及IL-6、IL-8、MCP-1、sICAM-1。
小分子半通道阻断剂
半通道阻断剂的实例包含小分子半通道阻断剂(例如，西弗拉姆(托那博沙)。在一些实施例中，半通道阻断剂为除了西弗拉姆的小分子，例如描述于以科林格林等人的名义提交的，第20160177298号美国专利申请公开案中的式I中的半通道阻断剂，其公开内容特此以如上所述的全文引用的方式并入本文中。各种优选实施例包含使用阻断或改善或以其它方式拮抗或抑制半通道开口的小分子来治疗本文所描述或提及的疾病、病症和病状。在各种实施例中，阻断或改善或抑制半通道开口的小分子为西弗拉姆的前药或其类似物。
在一些实施例中，本发明的特征在于使用小分子半通道阻断剂，包含例如式I化合物(如西弗拉姆)和/或前述化合物中的任一者的类似物或前药阻断Cx43半通道，例如并且引起细胞因子产生、分泌和/或释放的浓度和时间依赖性降低。
举例来说，半通道阻断剂西弗拉姆可由国际理论化学和应用化学联合会(IUPAC)名称N-[(3S,4S)-6-乙酰基-3-羟基-2,2-二甲基-3,4-二氢苯并吡喃-4-基]-3-氯-4-氟苯甲酰胺或(3S-顺)-N-(6-乙酰基-3,4-二氢-3-羟基-2,2-(二甲基-d6)-2H-1-苯并吡喃-4-基)-3-氯-4-氟苯甲酰胺已知。
在一个实施例中，西弗拉姆和/或其类似物或前药选自具有式I的化合物的群组：
Figure BDA0002413147850000221
其中，
Y为C-R1；
R1为乙酰基；
R2为氢、C3-8环烷基、任选地间杂有氧或被羟基、C1-6烷氧基或经取代的氨基羰基取代的C1-6烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷基羰氧基、C1-6烷氧基、硝基、氰基、卤基、三氟甲基或CF3S；或为基团CF3-A-，其中A为-CF2-、-CO-、-CH2-、CH(OH)、SO2、SO、CH2-O-或CONH；或为基团CF2H-A′-，其中A′为氧、硫、SO、SO2、CF2或CFH；三氟甲氧基、C1-6烷基亚硫酰基、全氟C2-6烷基磺酰基、C1-6烷基磺酰基、C1-6烷氧基亚硫酰基、C1-6烷氧基磺酰基、芳基、杂芳基、芳基羰基、杂芳基羰基、膦酰基、芳基羰氧基、杂芳基羰氧基、芳基亚硫酰基、杂芳基亚硫酰基、芳基磺酰基或杂芳基磺酰基，其中任何芳香族部分任选地经取代；C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷氧基羰基氨基、C1-6烷基-硫羰基、C1-6烷氧基-硫羰基、C1-6烷基-硫羰氧基、1-氢硫基C2-7烷基、甲酰基或氨基亚硫酰基、氨基磺酰基或氨基羰基，其中任何氨基部分任选地经一个或两个C1-6烷基取代；或C1-6烷基亚硫酰氨基、C1-6烷基磺酰氨基、C1-6烷氧基亚硫酰氨基或C1-6烷氧基磺酰氨基，或末端经C1-6烷基羰基、硝基或氰基取代的乙烯基或-C(C1-6烷基)NOH或-C(C1-6)NNH2；或氨基，其任选地经一个或两个C1-6烷基或经C2-7烷酰基取代；R3和R4中的一者为氢或C1-4烷基并且另一个为C1-4烷基，CF3或CH2Xa为氟、氯、溴、碘、C1-4烷氧基、羟基、C1-4烷基羰氧基、-S-C1-4烷基、硝基、任选地经一个或两个C1-4烷基取代的氨基、氰基或C1-4烷氧基羰基；或R3和R4一起为任选地经C1-4烷基取代的C2-5聚亚甲基；
R5是C1-6烷基羰氧基、苯甲酰氧基、ONO2、苄氧基、苯氧基或C1-6烷氧基，并且R6和R9为氢或R5为羟基并且R6为氢或C1-2烷基并且R9为氢；
R7为杂芳基或苯基，其两者独立地任选地经选自以下的基团或原子取代一次或多次：氯、氟、溴、碘、硝基、任选地经C1-4烷基取代一次或两次的氨基、氰基、叠氮基、C1-4烷氧基、三氟甲氧基和三氟甲基；
R8为氢、C1-6烷基、OR11或NHCOR10，其中R11为氢、C1-6烷基、甲酰基、C1-6烷酰基、芳酰基或芳基-C1-6烷基，并且R10为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、单C1-6烷基氨基或二C1-6烷基氨基、氨基、氨基-C1-6烷基、羟基-C1-6烷基、卤基-C1-6烷基、C1-6酰氧基-C1-6烷基、C1-6烷氧羰基-C1-6烷基、芳基或杂芳基；R8-N-CO-R7与R5基团为顺式；并且X为氧或NR12，其中R12为氢或C1-6烷基。
对于上文阐述的马库西组(Markush group)中的任一者，所述基团可以包含或不包含针对所述基团列出的物质中的任一者。用于本发明的方法中的半通道阻断剂可包含或不包含这些化合物中的任一者。
在另一个实施例中，式I类似物为化合物卡拉博沙(carabersat)(N-[(3R,4S)-6-乙酰基-3-羟基-2,2-二甲基-3,4-二氢苯并吡喃-4-基]-4-氟苯甲酰胺)或反-(+)-6-乙酰基-4-(S)-(4-氟苯甲酰基氨基)-3,4-二氢-2,2-二甲基-2H-1-苯并[b]吡喃-3R-醇半水合物。
在某些实施例中，西弗拉姆和/或其类似物呈游离碱或药学上可接受的盐的形式。在其它实施例中，可使用西弗拉姆和/或其类似物的一种或多种多晶型物、一种或多种异构体和/或一种或多种溶剂合物。
已报导其它各种小分子适用于抑制半通道活性。参见格林等人，第20160177298号美国专利申请公开案，式II；萨沃里(Savory)等人，第20160318891号美国专利申请公开案；和萨沃里等人，第20160318892号美国专利申请公开案，其全部以如上文所述的全文引用的方式并入。用于本发明的方法中的半通道阻断剂可包含或不包含这些化合物中的任一者。
肽和拟肽物半通道阻断剂
在其它实施例中，本发明的特征在于使用肽半通道阻断剂(例如拟肽物化合物，如佩普塔贡)阻断连接蛋白半通道，并且引起细胞因子产生、分泌和/或释放的浓度和时间依赖性降低。半通道阻断剂可包含对应于胞外环E1和E2内的特定序列的肽，其涉及E1的保守性QPG和SHVR基序(Gap26肽)和E2中的SRPTEK基序(Gap27肽)以及细胞质环(Gap19肽)。用于本发明的方法中的半通道阻断剂可包含或不包含“Gap”化合物中的任一者。最强力拟肽物为佩普塔贡(VDCFRPTEKT)(SEQ ID NO:1)。优选的拟肽物化合物包含SRPTEKT，7-旁基序。
在一些实施例中，肽和/或拟肽物半通道阻断剂(例如佩普塔贡)包括连接蛋白胞外结构域、跨膜区域和连接蛋白羧基端肽。连接蛋白半通道阻断肽或拟肽物可以经修饰或不经修饰。以化学方式、以合成方式或以其它方式制造连接蛋白半通道阻断肽或拟肽物。在一些实施例中，连接蛋白半通道阻断肽或拟肽物是Cx43肽或拟肽物。在一些方面，治疗有效的经修饰或未经修饰的肽或拟肽物包括连接蛋白(如Cx43或Cx45)的细胞外或跨膜结构域的一部分，例如连接蛋白细胞外环2的一部分，包含Cx43细胞外环2的一部分和Cx45细胞外环2的一部分。在一些方面，肽或拟肽物包括以下各者的胞外或跨膜结构域的一部分：连接蛋白Cx26、Cx30、Cx31.1、Cx36、Cx37、Cx40、Cx50、Cx57或本文中所提及的另一种连接蛋白。目前优选的是对应于Cx43外细胞环2的一部分的拟肽物。
肽为可以剂量依赖性方式操作的半通道阻断剂，其中较低剂量阻断间隔接合半通道开口并且较高剂量断开细胞之间间隔接合联接。参见例如奥卡罗尔(O'Carroll)等人,2008。在持续低剂量施加的情况下，还存在间隙接合联接的逐渐缺失，视为对半通道对接的肽干扰(与在正常转换期间逐渐去除现有间隙接合并行)。佩普塔贡已证实在许多活体外、体外和活体内(动物)研究中有效(参见例如戴维森(Davidson)等人,2012；达内什-梅尔(Danesh-Meyer)等人,2012；奥卡罗尔等人,2013)。
在一些实施例中，半通道阻断剂(例如Cx43半通道阻断剂)可包括肽。半通道阻断剂肽序列可包括以下序列中的一个或多个、主要由以下序列中的一个或多个组成或由以下序列中的一个或多个组成：SRPTEKT“Mod3”(SEQ ID NO:2)、“肽1”ADCFLSRPTEKT(SEQ IDNO:3)、“肽2”VACFLSRPTEKT(SEQ ID NO:4)、“肽11”VDCFLSRPTAKT(SEQ ID NO:5)、“肽12”VDCFLSRPTEAT(SEQ ID NO:6)、“肽5”VDCFLSRPTEKT(SEQ ID NO:1)、“Mod1”CFLSRPTEKT(SEQID NO:7)、“Mod2”LSRPTEKT(SEQ ID NO:8)。在一些实施例中，羧基端可经修饰。在一些方面，羧基端修改可包括可任选地进一步连接到氢或其它部分的正烷基链。在一些实施例中，半通道阻断剂肽可以包含或不包含上文所列或本文所公开的任何肽。
在一个方面，本发明涉及药物组合物单独或在试剂盒、包装或其它制品内用于治疗本文所指出的疾病、病症或病况以及特征在于增加或无序或以其它方式非所要的细胞因子或血管生成，包含IL-6、IL-8、sICAM-1和MCP-1以及血管生成细胞因子、VEGF的那些疾病、病症或病况的方法中的用途。本文中的方法提供用足以减少IL-6、IL-8、sICAM-1和MCP-1和/或VEGF的产生、分泌和/或释放的量的半通道阻断剂治疗受试者。在一些方面，半通道阻断剂为连接蛋白43半通道阻断剂。如所指出，其它连接蛋白半通道的阻断剂在本发明内。
在一些实施例中，“前部分(promoiety)”是指充当掩蔽活性剂内的官能团，由此将活性剂转化成前药的保护基的物质。通常，前部分将经由通过活体内酶促或非酶促方式裂解的一个或多个键连接到药物，由此将前药物转换成其活性形式。在一些实施例中，前部分还可以是活性剂。在一些实施例中，前部分可以结合到半通道阻断剂。在一些实施例中，前部分可以例如结合到肽或拟肽物或小分子半通道阻断剂中的任一者。在一些实施例中，前部分可以结合到式I化合物。在一些实施例中，前药可以是另一种半通道化合物，例如，格林等人，第20160177298号美国专利申请公开案；萨沃里等人，第20160318891号美国专利申请公开案；或萨沃里等人，第20160318892号美国专利申请公开案中描述的化合物。
在一些方面，半通道阻断剂包含例如结合到连接蛋白半通道的抗体或抗体片段、纳米抗体、肽或拟肽物、重组融合蛋白、适体、小分子或单链可变片段(scFv)，和本文所提及的其它阻断剂。在一个当前优选实施例中，连接蛋白半通道为Cx43半通道。
在其它实施例中，半通道阻断剂为连接蛋白43肽或拟肽物，有时称为半通道阻断肽或拟肽物，并且包含经修饰或未经修饰的Cx肽或拟肽物，其括以下各者、主要由以下各者组成或由以下各者组成：连接蛋白胞外结构域、跨膜区域和连接蛋白羧基端肽。在一些方面，治疗有效的经修饰或未经修饰的肽或拟肽物包括连接蛋白43或连接蛋白45的胞外或跨膜结构域的一部分。下文展示连接蛋白43的蛋白质序列。
连接蛋白43(SEQ ID NO:9)
Figure BDA0002413147850000261
Figure BDA0002413147850000271
表1展示连接蛋白43和连接蛋白45的胞外环。在一些实施例中，治疗上有效的经修饰或未经修饰的肽或拟肽物包括连接蛋白(胞外环2)的E2胞外结构域的一部分，如连接蛋白43或连接蛋白45，优选连接蛋白43。在一些实施例中，治疗有效的经修饰或未经修饰的肽或拟肽物包括连接蛋白的C端结构域的一部分，如连接蛋白43或连接蛋白45，优选连接蛋白43。如果肽或拟肽物阻断剂包括连接蛋白的胞内结构域的一部分，那么在一些实施例中，肽可以共轭到细胞内化转运体，并且在一些情况下，可以阻断结合到连接蛋白43的闭锁小带蛋白(zona occluden)(ZO-1)。
表1.连接蛋白43和连接蛋白45的胞外环
Figure BDA0002413147850000272
不同连接蛋白同型的E2结构域的序列展示为具有与表2中以粗体展示的肽SEQ IDNO:14和肽SEQ ID NO:15同源的氨基酸。应注意，肽SEQ ID NO:15的最后4个氨基酸是第四膜结构域的一部分。
表2提供可以用于制备本文所描述的肽半通道阻断剂的连接蛋白家族成员的胞外结构域。在某些非限制性实施例中，肽和表2中所提供的肽和其片段用作肽半通道阻断剂。在其它非限制性实施例中，包括此表中约8个到约15个、或约11到约13个氨基邻接氨基酸的肽、主要由其组成或由其组成的半通道阻断剂肽为本发明的肽半通道阻断剂。在其它实施例中，对肽或其片段进行保守氨基酸变化。
表2.胞外结构域
Figure BDA0002413147850000281
其它肽半通道阻断剂来自连接蛋白43的细胞质环(氨基酸119-144)L2肽和连接蛋白43的L2肽的子部分。在一些实施例中，这些肽可以包含或不包含例如Gap 19的九个氨基酸序列，KQIEIKKFK(SEQ ID NO:19)；固有Gap19序列，DGVNVEMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK(SEQID NO:20)；Gap19的His144→Glu L2衍生物，如由什巴亚马(Shibayama)所报导(什巴亚马J.等人,生物物理(Biophys).J.91,405404063,2006)，DGVNVEMHLKQIEIKKFKYGIEEQGK(SEQID NO:21)；TAT-Gap19序列，YGRKKRRQRRRKQIEIKKFK(SEQ ID NO:22)；SH3结合结构域，CSSPTAPLSPMSPPGYK(SEQ ID NO:23)或其子部分，PTAPLSPMSPP(SEQ ID NO:24)；CT9或CT10肽的C端序列，具有或不具有TAT前导序列以增加细胞穿透，RPRDDEI(SEQ ID NO:25)、SRPRDDLEI(SEQ ID NO:26)、YGRKKRRQRRRSRPRDDEI(SEQ ID NO:27)或YGRKKRRQRRRRPRDDEI(SEQ ID NO:28)。本文所公开的用于方法、试剂盒或制品的组合物中可以包含或不包含的其它拟肽物序列为由戴因(Dhein)报告的那些序列(戴因S.,Naunyn-Schmiedeberg'sArch.Pharm.,350:174-184,1994))；AAP10肽，H2N-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro Tyr-CONH2(SEQID NO:29)和ZP123肽(罗普肽(rotigapeptide)),Ac-D-Tyr-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2(SEQ ID NO:310)，(戴因S.等人.细胞通讯、黏附(Cell Commun.Adhes).10,371-378,2013)。罗普肽由肽的D-形式构成，以增强肽的固有L-形式的功效。
可包含或不包含于本发明的某些实施例中的示例性连接蛋白43(Cx43)或Cx26、Cx30、Cx30.3、Cx31、Cx31.1、Cx32、Cx36、Cx37、Cx40.1、Cx43、Cx46、Cx46.6或Cx40肽阻断剂，提供于以下表3中(E2和T2是指肽在例如第二胞外结构域或第二跨膜结构域中的位置)。
表3
Figure BDA0002413147850000282
Figure BDA0002413147850000291
Figure BDA0002413147850000301
Figure BDA0002413147850000311
在一些实施例中，连接蛋白43阻断剂可包括例如肽或拟肽物，其包括例如SEQ IDNO:2(SRPTEKT)、主要其组成或由其组成。肽或拟肽物还可以包括例如SEQ ID NO:1(VDCFLSRPTEKT)。肽可以含有一种或多种经修饰的氨基酸、氨基酸类似物，或可以其它方式经修饰以改良生物可用性或增加跨越细胞膜的穿透。举例来说，可以修饰SEQ ID NO:1以获得SEQ ID NOS:20-25和27。在一些方面，包括例如SEQ ID NO:2(SRPTEKT)或SEQ ID NO:2(VDCFLSRPTEKT)、主要由其组成或由其组成的肽或拟肽物包括7到40个氨基酸或氨基酸类似物并且不包括C端肽。在一些实施例中，肽还可以用作前部分。
在一些方面，连接蛋白45阻断剂可为肽或拟肽物，其包括拮抗或抑制或阻断连接蛋白-连接蛋白相互作用的连接蛋白45蛋白质的部分、主要由其组成或由其组成。连接蛋白45肽和拟肽物阻断剂的示例性肽序列提供于表4中。
表4.样本连接蛋白45阻断剂肽或拟肽物的序列
Figure BDA0002413147850000312
Figure BDA0002413147850000321
在一些实施例中，连接蛋白45阻断剂可包括例如肽或拟肽物，其包括连接蛋白45的E2或C端结构域的一部分(例如，包括SEQ ID NO:150(SRPTEKT)、主要由其组成或由其组成)、主要由其组成或由其组成。肽或拟肽物还可以包括例如SEQ ID NO:149(DCFISRPTEKT)。在一些实施例中，肽的长度可仅为3个氨基酸，包含SRL、PCH、LCP、CHP、IYY、SKF、QPC、VCY、APL、HVR或更长。
在一些方面，连接蛋白40半通道阻断剂可以是包括连接蛋白40蛋白质的部分、主要由其组成或由其组成的肽或拟肽物。在一些实施例中，连接蛋白43阻断剂可包括例如SEQID NO:2(SRPTEKT)、SEQ ID NO:1(VDCFLSRPTEKT)或在N端处通过连接子共轭到两个十二烷基的SEQ ID NO:1、主要由其组成或由其组成。肽可以含有一种或多种经修饰的氨基酸、氨基酸类似物，或可以其它方式经修饰，例如共轭或结合到细胞内化转运体。
在另一个非限制性但优选实施例中，半通道阻断剂包括肽，所述肽包括对应于连接蛋白(如Cx43或Cx45、或Cx26、Cx31.1、Cx36、Cx37、Cx40、Cx50、Cx57)的跨膜区域的一部分的氨基酸序列、主要由其组成或由其组成。在特定非限制性实施例中，抗连接蛋白化合物为具有氨基酸序列的肽，其包括具有包括连接蛋白(例如连接蛋白43或45蛋白质序列)的约3个到约30个邻接氨基酸、连接蛋白蛋白质序列的约5到约20个邻接氨基酸的氨基酸序列的肽；具有包括连接蛋白蛋白质序列的约8个到约15个邻接氨基酸的氨基酸序列的肽；或具有包括连接蛋白蛋白质序列的约11个、12个或13个邻接氨基酸的氨基酸序列的肽。其它非限制性实施例包含抗连接蛋白化合物，其为具有包括连接蛋白蛋白质序列的至少约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个或30个邻接氨基酸的氨基酸序列的肽。在一些方面，半通道阻断剂可以包含或不包含前述中的任一者。
在其它抗连接蛋白化合物中，模拟肽是基于对应于在连接蛋白43蛋白质序列的位置37-76和178-208处的氨基酸的连接蛋白43的胞外结构域。因此，本文所描述的某些肽具有对应于在连接蛋白43蛋白质序列的位置37-76和178-208处的区域的氨基酸序列。肽不需要具有与连接蛋白43蛋白质序列的那些部分相同的氨基酸序列，并且可以进行保守氨基酸变化，使得肽在本文中描述并且在所属领域中另外已知的分析中保持结合活性或功能活性。在其它实施例中，模拟肽是基于除胞外结构域以外的连接蛋白蛋白质内的肽目标区域(例如，连接蛋白43蛋白质序列的不对应于位置37-76和178-208的部分)。
在一个非限制性但优选的实施例中，半通道阻断剂包括包括对应于连接蛋白45的跨膜区域或连接蛋白45的C端区域的一部分的氨基酸序列、主要由其组成或由其组成的肽、主要由其组成或由其组成。在特定非限制性实施例中，举例而言，抗连接蛋白化合物为具有包括已知连接蛋白45序列的约3个到约30个邻接氨基酸的氨基酸序列的肽；具有包括已知连接蛋白45序列的约5个到约20个邻接氨基酸氨基酸序列的肽；具有包括已知连接蛋白45序列的约8个到约15个邻接氨基酸的氨基酸序列的肽；或具有包括已知连接蛋白45序列的约11个、12个或13个邻接氨基酸的氨基酸序列的肽。其它非限制性实施例包含抗连接蛋白化合物，其为具有包括已知连接蛋白45序列的至少约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个或30个邻接氨基酸的氨基酸序列的肽。在本文所提供的某些抗连接蛋白化合物中，模拟肽是基于对应于已知连接蛋白45序列的位置46-75和199-228处的氨基酸的连接蛋白45的胞外结构域。因此，本文所描述的某些肽具有对应于已知连接蛋白45序列的位置46-75和199-228处的区域的氨基酸序列。肽不需要具有与已知连接蛋白45序列的那些部分相同的氨基酸序列。可以进行保守氨基酸变化，使得肽在本文中所描述的并且在所属领域中另外已知的分析中保持结合活性或功能活性。在其它实施例中，模拟肽是基于除胞外结构域以外的连接蛋白蛋白质内的肽目标区域(例如，连接蛋白45序列的不对应于位置46-75和199-228的部分)。公开各种连接蛋白序列的WO2006/134494以全文引用的方式并入。在一些方面，半通道阻断剂可以包含或不包含前述中的任一者。
其它连接蛋白半通道阻断剂
半通道阻断剂，例如，连接蛋白43或45阻断剂，包含肽、拟肽物、抗体、抗体片段等，也是适合的半通道阻断剂。示例性半通道阻断剂可包含但不限于多肽(例如抗体、其结合片段和合成构筑体)和其它间隙接合阻断剂和间隙接合蛋白质磷酸化药剂。在一些方面，半通道阻断剂为Cx26、Cx30、Cx31.1、Cx36、Cx37、Cx40、Cx43、Cx50、Cx57的阻断剂。半通道阻断剂，例如，连接蛋白43或45阻断剂包含例如单株抗体、多株抗体、抗体片段，包含例如Fab、F(ab')2和Fv片段；单链抗体；单链Fvs；和单链结合分子，如包括例如结合结构域、铰链、CH2和CH3结构域、重组抗体和能够结合抗原决定子(即，分子的通常被称作抗原决定基的部分)的抗体片段的那些分子、主要由其组成德那些分子或由其组成的那些分子，其与特定抗体或其它结合分子进行接触。包含抗体、抗体片段等的这些结合蛋白可以是嵌合或人类化的或以其它方式使其在待投与的受试者中较不具有免疫原性，并且可以合成、以重组方式产生或以表达库方式产生。设想所属领域中已知或稍后发现的任何结合分子，如本文中所提及和/或所属领域中更详细地描述的那些结合分子。举例来说，结合蛋白不仅包含抗体等，而且包含结合到目标(例如连接蛋白、半通道或相关分子)的配体、受体、拟肽物或其它结合片段或分子(例如由噬菌体展示(phage display)产生)。
结合分子将通常具有所需特异性，包含但不限于结合特异性和所需亲和力。亲和力，例如，可为大于或等于约104M-1、大于或等于约106M-1、大于或等于约107M-1、大于或等于约108M-1的Ka。甚至大于约108M-1的亲和力为适合的，如等于或大于约109M-1、约1010M-1、约1011M-1和约1012M-1的亲和力。根据本发明的结合蛋白的亲和力可以使用常规技术，例如史卡查(Scatchard)等人(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660所描述的那些技术容易地确定。
用于封闭间隙接合的示例性化合物(例如磷酸化连接蛋白43酪氨酸和/或丝氨酸残基)已在第7,153,822号美国专利和第7,250,397号美国专利中报告。示例性肽和拟肽物报告于格林等人,WO2006134494中。还参见WO2006069181和WO2003032964。用于封闭间隙接合的其它药剂的实例包含抗连接蛋白药剂，例如抗连接蛋白多核苷酸(例如，连接蛋白抑制剂，如α-l连接蛋白寡脱氧核苷酸)、抗连接蛋白肽(例如，抗体和抗体结合片段)和拟肽物(例如，α-l抗连接蛋白肽或拟肽物)、间隙接合封闭或阻断化合物、半通道封闭或阻断化合物和连接蛋白羧基端多肽，例如接合到ZO-1或ZO-1结合部位的多肽。
适用于本发明的其它半通道阻断剂还包含阻断连接蛋白半通道但维持连接蛋白间隙接合功能的化合物，或可与所述化合物组合。举例来说，表明线性肽RRNYRRNY、环状肽CyRP-71和拟肽物分子ZP2519靶向Cx43羧基端结构域并且在低pH条件下预防基于Cx43的间隙接合(维尔马V(Verma V)等人.预防酸化诱导心脏间隙接合封闭的第一拟肽物分子的设计和特性化(Design and characterization of the first peptidomimetic moleculethat prevents acidification-induced closure of cardiac gap junctions).心律(Heart Rhythm)7:1491-1498(2010)；维尔马V等人.基于Cx43接合肽的"RXP"系列的连接蛋白43的新颖药效团(Novel pharmacophores of connexin43 based on the"RXP"seriesof Cx43-binding peptides).Circ.Res.105:176-184(2009))。这些物质具有用于防止间隙接合封闭的潜在平移值(translational value)。此外，这些分子为潜在的半通道阻断剂，并且可因此具有针对预防间隙接合封闭以及抑制半通道开口的双侧作用。
抗连接蛋白药剂包含具有包括连接蛋白蛋白质(连接蛋白43(SEQ.ID.NO:19))的约5个到20个邻接氨基酸的氨基酸序列的肽；具有包括连接蛋白43的约8个到15个邻接氨基酸的氨基酸序列的肽；或具有包括连接蛋白43的约11个到13个邻接氨基酸的氨基酸序列的肽。其它抗连接蛋白药剂包含具有连接蛋白43的至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个邻接氨基酸的氨基酸序列的肽。其它抗连接蛋白43阻断剂包括连接蛋白43的胞外结构域，例如包括SRPTEKT或VDCFLSRPTEKT、主要由其组成或由其组成的肽或拟肽物。其它抗连接蛋白43阻断剂包括连接蛋白43的C端区域，参见WO2006/069181或其修改版本。
肽化学修饰
在某些实施例中，本发明的连接蛋白43阻断剂肽可以在氨基或羧基端处键连到细胞内化转运体。键连到本发明的连接蛋白43阻断剂肽的细胞内化转运体可以是所属领域中已知或新发现的任何内化序列或其保守变体。细胞内化转运体和序列的非限制性实例包含触角足序列(Antennapedia sequences)、TAT、HIV-Tat、穿膜肽、Antp-3A(Antp突变)、蟾蜍素II、转运素、MAP(模型两亲性肽)、K-FGF、Ku70、朊病毒、pVEC、Pep-1、SynB1、Pep-7、HN-1、BGSC(双-胍鎓-亚精胺-胆固醇)和BGTC(双胍鎓-乙基胺-胆固醇)。
示例性细胞内化肽的其它序列提供于以下表5中。
表5
Figure BDA0002413147850000361
在本发明的一个实施例中，连接蛋白43阻断剂肽的氨基酸序列可以选自由本文中所列的任何肽SEQ ID或其保守变体组成的群组。在本发明的另一个实施例中，连接蛋白43阻断剂肽可以包括SEQ ID NO:30-90的氨基酸序列、主要由其组成或由其构成。在本发明的另一个实施例中，连接蛋白43阻断剂肽进一步包括细胞内化转运体。在另一个实施例中，连接蛋白43半通道阻断剂肽可以在氨基端处键连到细胞内化转运体。
当本文中提及特定蛋白质时，涵盖衍生物、变体和片段。所属领域的技术人员很好地理解蛋白质衍生物和变体，并且可以涉及氨基酸序列修饰。举例来说，氨基酸序列修饰可以属于三个类别中的一个或多个：插入型、取代型或缺失型变体。插入体包含氨基和/或羧基端融合体以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入体。插入体可以是比氨基或羧基端融合体更小的插入体，例如约1个到4个残基。缺失的特征在于从一个或多个蛋白质序列去除一个或多个氨基酸残基。取代、缺失、插入或其任何组合可以组合以获得最终构筑体。取代型变体为其中已去除至少一个残基并且将不同残基插入其位置的那些。此类取代被称为保守取代。所属领域的技术人员已知用生物和/或化学类似的另一个氨基酸残基置换一个氨基酸残基作为保守取代。保守取代可以用一个疏水性残基置换另一个，或用一个极性残基置换另一个。每个明确公开的序列的经保守取代的变体包含于本文所提供的肽内。保守取代通常对所得多肽的生物活性几乎没有影响到没有影响。保守取代可以是肽中的大体上不影响肽的生物功能的氨基酸取代。肽可以可以包含一个或多个氨基酸取代、2-10个保守取代、2-5个保守取代或4-9个保守取代。
化学结构修饰
在某些实施例中，可以合成方式修饰半通道阻断剂肽或拟肽物的化学结构以增加活性或半衰期。举例而言，在一些实施例中，肽或拟肽物可通过使肽通过连接子部分共轭到疏水性化合物来修饰。疏水性化合物可以是例如一种或多种正烷基，其可以是例如C6-C14烷基。在一些实施例中，肽可在N端处共轭到一个或两个十二烷基(C12)，如陈YS(Chen,YS)等人,药物科学杂志(J.Pharm.Sci.),102:2322-2331(2013)，其以引用的方式并入本文中。在一个实施例中，肽序列CFLSRPTEKT或VD CFLSRPTEKT可以与两个十二烷基共轭以产生可以调节连接蛋白43，“C12-C12-Cxn43 MP.”(SEQ ID NO:171)的经修饰的肽。下文展示所得结构。
Figure BDA0002413147850000371
结构：C12-C12-Cxn43 MP(SEQ ID NO:171)的结构。R1和R2可为氢或烷基。在一些方面，R1＝R2＝正十二烷基链。
化学递送修饰
适用于减少或阻止本发明中的细胞因子产生、分泌和/或释放的半通道阻断剂还可以调配成微粒(微米球、Mps)或纳米粒子(纳米球、Nps)调配物或这两者。粒状药物递送系统包含纳米粒子(1到1,000nm)和微米粒子(1到1,000μm)，其进一步分类为纳米球和微米球和纳米胶囊和微米胶囊。在纳米胶囊和微米胶囊中，将药物粒子或小液滴包覆于聚合膜中。粒子系统具有通过注射递送的优点，并且其大小和聚合物组成显著影响其活体内生物行为。微米球可保持在玻璃体内比纳米球更长的时间周期，因此，微米粒子在注射之后像储集器一样起作用。纳米粒子快速扩散并且内化在组织和细胞中。
评估半通道阻断剂活化各种方法可以用于评估半通道阻断剂的活性或功效。在本发明的一个方面中，使用细胞因子蛋白质分析评估或监测受试者中的半通道阻断剂治疗的作用。细胞因子蛋白质水平可以通过允许检测和定量来自受试者的样本中的蛋白质的任何常规方法定量。借助于非限制性说明，细胞因子蛋白质水平可以例如通过使用具有细胞因子结合能力的抗体(或其含有抗原决定子的片段)和所形成的复合物的后续定量来定量。在这些分析中使用的抗体可以标记或可以不标记。可以使用的标记物的说明性实例包含放射性同位素、酶、荧光团、化学发光试剂、酶底物或辅因子、酶抑制剂、粒子、染料等。广泛范围的已知分析可用于本发明中，其使用未标记抗体(初级抗体)和标记抗体(二级抗体)。这些技术包含威斯登-印迹(Western-blot)或威斯登转移(Western transfer)、酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)、放射免疫法(radioimmunoassay；RIA)、竞争性酶免疫法(competitive enzyme immunoassay；竞争性EIA)、双抗体夹心ELISA(double antibody sandwich ELISA；DAS-ELISA)、免疫细胞化学和免疫组织化学技术、基于使用蛋白质微阵列或包含特异性抗体的生物芯片的技术或基于胶体沉淀的分析，以如油尺(dipstick)形式。检测和定量细胞因子的其它方式包含亲和色谱技术、配体结合分析等。当使用免疫方法时，已知以高亲和力结合到细胞因子蛋白质的任何抗体或试剂可以用于检测其量。尽管如此，优选使用抗体，例如多株血清、融合瘤或单株抗体的上清液、抗体片段、Fv、Fab、Fab'和F(ab')2、scFv、人类化双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、纳米抗体、α抗体、订书肽(stapled peptide)、环肽和抗体。市场上存在市售抗细胞因子蛋白质抗体，其可以在由许多商业公司提供的本发明的上下文中使用。
本发明包含一种用于预测用半通道阻断剂治疗的受试者的临床结果并且引发半通道阻断剂治疗、中断半通道阻断剂治疗、改变半通道阻断剂治疗或进一步用半通道阻断剂和/或细胞因子拮抗剂治疗所述受试者的活体外方法。在一实施例中，方法包括在所述受试者的样本中检测一种或多种细胞因子，例如VEGF-A，其中一种或多种细胞因子水平或轮廓或活性的升高指示临床结果不佳或不充分；和引发使用治疗有效量的半通道阻断剂治疗受试者，即旨在预防和/或治疗非所要或非所需的细胞因子水平和/或活性的疗法，所述半通道阻断剂选自由以下组成的群组：小分子半通道阻断剂、拟肽物半通道阻断剂和充当能够避开和/或预防所述受试者中疾病或疾病进展的半通道阻断剂的其它化合物。在另一个实施例中，半通道阻断剂治疗中断或持续预定时段后中断。在另一个实施例中，例如通过改变剂量或给药频率或通过单独投与另一种治疗剂，例如细胞因子拮抗剂(例如，抗VEGF抗体或VEGFR阻断剂)来修改半通道阻断剂治疗。在另一个实施例中，半通道阻断剂治疗持续或持续预定时段。当前优选的小分子半通道阻断剂包含西弗拉姆。当前优选的拟肽物半通道阻断剂包含佩普塔贡。
还可使用某些生物分析评估半通道阻断剂的活性。可识别、评估或筛选已知或候选半通道阻断剂对分子动力的作用，以使用以下实例中所描述的方法，或用于确定化合物通过连接蛋白半通道的其它熟知或同等方法。已知所属领域中各种方法，包含染料转移实验，例如用可检测标记物标记的分子的转移，以及小荧光渗透性示踪剂的跨膜通道，其已广泛用于研究半通道的功能状态。参见例如施拉珀,KA(Schlaper,KA)等人当前使用的用于识别和表征半通道的方法(Currently Used Methods for Identification andCharacterization of Hemichannels).细胞通讯和粘附(Cell Communication andAdhesion)15:207-218(2008)。还可以使用活体内方法。参见例如达内什-梅尔,HV等人的方法。连接蛋白43模拟肽减少视网膜缺血后的血管渗漏和视网膜神经节细胞死亡(Connexin43mimetic peptide reduces vascular leak and retinal ganglion celldeath following retinal ischaemia).大脑(Brain),135:506-520(2012)；戴维森,JO等人.(2012).连接蛋白半通道阻断改良胎儿局部缺血模型中的结果(Connexin hemichannelblockade improves outcomes in a model of fetal ischemia).神经学年报(Annals ofNeurology)71:121-132(2012)。
一种用于识别或评估化合物阻断半通道的能力的方法，其包括：(a)将测试样本和测试系统放在一起，所述测试样本包括一种或多种测试化合物，并且所述测试系统包括用于评估半通道阻断的系统，所述系统特征在于其呈现例如染料或标记代谢物的高转移，例如回应于将缺氧或缺血引入到所述系统，发炎的介体或其它化合物事件诱导半通道开口，如细胞外Ca2+下降；和(b)确定所述系统中染料1或其他一种或多种标记代谢物的存在或增加量。还可以使用正和/或负控制。任选地，可以将预定量的半通道阻断剂((例如佩普塔贡或西弗拉姆)添加到测试系统。
优选地，举例而言，半通道阻断剂(如佩普塔贡和西弗拉姆)在活体外分析中展现约小于约1到5nM、优选地小于约10nM并且更优选地小于约50pM的活性。在活体内分析中，这些化合物优选地展示浓度小于约10-100微摩尔(μM)并且更优选地浓度小于约50μM的半通道阻断。其它半通道阻断剂可在这些范围内，并且在小于约200pM的范围内。
共投与
还提供呈组合制剂形式的药物组合物用于共投与，例如作为两种或更多种半通道阻断剂(其可以经修饰或未经修饰)、或一种或多种半通道阻断剂和一种或多种细胞因子拮抗剂的掺合物。
术语“组合制剂”包含意义如上文所定义的组合搭配物的“组分的试剂盒”或“制品”，其可独立地给药或通过使用具有区分量的组合搭配物(a)和(b)的不同固定组合，即同时、单独或依序给药，无论是呈药物形式还是敷料/基质形式或这两者。然后，组分的试剂盒可以例如同时或按时间顺序交错投与，也就是说，在不同时间点并且对于组分试剂盒的任何部分以相等或不同时间间隔投与。
在一个实施例中，投与组合制剂，其中向受试者投与两种或更多种单独阻断剂组合物，其中第一组合物包括治疗有效量的阻断剂，如半通道阻断剂，例如抗连接蛋白43肽、拟肽物或小分子半通道封闭化合物，并且第二组合物包括治疗有效量的第二阻断剂，如抗细胞因子药剂，例如抗VEGF抗体。
用于单一、组合、同时、分开、依序或持续投与的药物组合物可以用于本文所描述的方法和试剂盒中。在一个实施例中，以用于一次或多次投与的一种或多种所需剂量投与或提供包括一种或多种半通道阻断剂、主要由其组成或由其组成的组合物。在另一个实施例中，包括一种或多种半通道阻断剂、主要其组成或由其组成的组合物与一种或多种细胞因子拮抗剂大约同时投与。当在不同时间投与组合物时，其可在例如30分钟、1小时、1天、1周、1个月或相隔1季度或所叙述时间段中的任何两者之间的任何时间间隔内投与。
在一个实施例中，在一或多种细胞因子拮抗剂的至少约三十到六十分钟内投与包括一种或多种半通道阻断剂、主要由其组成或由其组成的组合物。半通道阻断剂单独地或与细胞因子拮抗剂剂量一起(在组合或单独的调配物中)可QD、BID、TID、QID，或以周剂量投与，例如QIW、BIW QW。其还可以PRN(即，按需要)和HS(临睡时，即上床时)投与。
剂型和调配物和投与
除非另外明确陈述，否则关于给药的所有描述适用于本发明的半通道阻断剂。
半通道阻断剂可以如本文所描述给药、投与或调配。
半通道阻断剂可以向需要治疗的受试者投与。因此，根据本发明，提供调配物，可通过调节连接蛋白半通道(例如连接蛋白43半通道或连接蛋白45半通道)以按暂时且定点的方式降低其开放概率。
半通道阻断剂可以大体上分离的形式存在于调配物中。应理解，产品可与不干扰产品的预期目的的载剂或稀释剂混合并且仍被视为大体上分离的。本发明的产品还可以呈大体上纯化形式，在此情况下其将一般包括约80％、85％或90％，例如至少约88％、至少约90％、95％或98％，或至少约99％的拟肽物或小分子半通道阻断剂，例如，或制剂的干质量。
向受试者投与半通道阻断剂可通过能够将药剂递送到受试者体内的目标部位的任何方式发生。举例来说，半通道阻断剂和/或细胞因子拮抗剂可通过以下途径中的一者投与：经口、局部、全身性(例如静脉内、动脉内、腹膜内、经皮、鼻内或通过栓剂)、不经肠(例如肌肉内、皮下或静脉内或动脉内注射)、通过植入和通过例如渗透泵的此类装置输注、经皮贴片等。示例性投与途径还概述于：冰河(Binghe),W.和B.王(Wang)(2005).药物递送：原理和应用(Drug delivery:principles and applications),王冰河,特鲁纳·西亚汉(Teruna Siahaan),理查德·索尔特罗(Richard Soltero),霍博肯(Hoboken),新泽西州威立-国际科学(N.J.Wiley-Interscience),c2005。在一个实施例中，全身性投与半通道阻断剂。在另一个实施例中，经口投与半通道阻断剂。在另一个实施例中，例如，将半通道阻断剂局部或直接投与到所关注的器官、癌症或肿瘤。
在一些方面，半通道阻断剂可提供作为植入物或与植入物结合。在一些方面，可能提供持续传递。在一些实施例中，微针、针、离子导入装置(iontophoresis device)或植入物可用于投与半通道阻断剂。植入物可以是例如可溶磁盘材料，如描述于S.普夫卢格费尔德(S.Pflugfelder)等人,美国化学学会·纳米(ACS Nano),9(2),第1749-1758页(2015)。在一些方面，半通道阻断剂，例如本发明的连接蛋白43半通道阻断剂，可以经由心室内、和/或鞘内、和/或硬膜外(extradural)、和/或硬膜下(subdural)和/或硬膜上(epidural)途径投与。
半通道阻断剂可以投与一次、或多于一次、或周期性投与。其还可PRN(按需要)或按预定时间表或这两者来投与。在一些方面，半通道阻断剂每日、每周、每月、每两月或四月或以这些时间段的任何组合投与。举例来说，治疗可以每日投与一段时间，随后每周和/或每月等投与。本文中展示投与阻断剂的其它方法。在一个方面，在第1天到第5天、第10天、第30天、第45天、第60天、第75天、第90天或第100天到第180天或在第1天到5天、10天、30天、45天、60天、75天、90天或100天到180天之间的时间向患者以足以治疗患者德量投与半通道阻断剂。
半通道阻断剂(如肽，例如和/或其类似物或前药)、式I化合物(例如西弗拉姆)和前述化合物中的任一者的类似物或前药可以单独投与或与一种或多种额外成分组合投与，并且可以调配成包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载剂的药物组合物。
“药学上可接受的稀释剂、载剂和/或赋形剂”旨在包含适用于制备药物组合物的物质，可以与式I化合物(例如西弗拉姆)和前述化合物中的任一种的类似物共投与，同时允许其执行其预期功能，并且通常是安全的、无毒的并且既不是生物的也不是不期望的。药学上可接受的稀释剂、载剂和/或赋形剂包含适用于兽用(veterinary use)以及人类药物用途的那些稀释剂、载剂和/或赋形剂。考虑到式I化合物(例如西弗拉姆)和前述化合物中的任一者的类似物的性质，所属领域的一般技术人员将容易了解适合的载剂和/或赋形剂。然而，举例来说，稀释剂、载剂和/或赋形剂包含溶液、溶剂、分散介质、延迟剂、聚合和脂质剂、乳液等。借助于进一步实例，适合的液体载剂，尤其用于可注射溶液，包含水、盐水水溶液、右旋糖水溶液等，其中等张溶液优选用于静脉内、脊柱内和脑池内投与，并且如脂质体的媒剂，也是尤其适合投与的药剂。
组合物可呈任何标准已知剂型的形式，包含片剂、丸剂、胶囊、半固体、粉末、持续释放调配物、溶液、悬浮液、酏剂、气雾剂、用于注射的液体、凝胶、乳膏、经皮传递装置(例如经皮贴片)、插入物(如器官插入物，例如眼睛)或任何其它适当的组合物。本发明所涉及的所属领域的一般技术人员将易于了解考虑到待治疗的病状和待在无任何不当实验的情况下使用的活性剂的性质的最适当剂型。应了解，半通道阻断剂(如佩普塔贡和/或其类似物)、式I化合物(例如西弗拉姆)和前述化合物中的任一者的类似物和/或细胞因子拮抗剂中的一者或多者可以调配成单一组合物。在某些实施例中，优选的剂型包含可注射溶液和口服调配物。
考虑到剂型和投与模式，适用于本发明的组合物可含有任何适当水平的半通道阻断剂，如佩普塔贡，例如和/或其类似物；式I化合物，例如西弗拉姆；和前述化合物中的任一者的类似物；和/或细胞因子拮抗剂。然而，举例来说，本发明中使用的组合物可含有约0.1重量％到约99重量％，优选约1重量％到约60重量％的半通道阻断剂，视投与方法而定。
除标准稀释剂、载剂和/或赋形剂之外，举例而言，根据本发明的组合物可调配有一种或多种额外组分，或以此方式调配，以便增强半通道阻断剂(如佩普塔贡和/或其类似物)、式I化合物(例如西弗拉姆)和前述化合物中的任一者的类似物，和/或细胞因子拮抗剂的活性或生物可用性，帮助保护其完整性或增加其半衰期或存放期，使得一旦投与受试者能够减缓释放或提供其它合乎需要益处。举例来说，减缓释放媒剂包含大分子单体、聚(乙二醇)、玻尿酸、聚(乙烯吡咯烷酮)或水凝胶。借助于进一步实例，组合物还可以包含防腐剂、增溶剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、包衣剂、缓冲剂等。本发明所涉及的所属领域的技术人员可识别可能合乎特定目的其它添加剂。
半通道阻断剂可以通过持续释放系统投与。持续释放组合物的合适实例包含呈成型制品例如膜或微胶囊形式的半渗透聚合物基质。持续释放基质包含聚丙交酯(第3,773,919号美国专利；欧洲专利58,481)、L-谷氨酸与γ-乙基-谷氨酸的共聚物、聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、乙烯乙酸乙烯酯或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利133,988)。持续释放组合物还包含经脂质体包覆的化合物。含有半通道阻断剂的脂质体可以通过已知方法制备，包含例如在以下各者中描述的那些：DE 3,218,121；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP143,949；EP 142,641；日本专利申请案83-118008；第4,485,045号和第4,544,545号美国专利；和EP 102,324。通常，脂质体为较小(从或约200到800埃)单层类型，其中脂质水平大于约30摩尔％胆固醇，所选择的比例经调节用于最有效的疗法。举例而言，还可使用使用PGLA纳米或微米粒子或原位离子活化胶凝系统的缓慢释放递送。
另外，预期根据本发明使用的半通道阻断剂药物组合物可以调配有额外活性成分或药剂，所述额外活性成分或药剂在特定情况下可以对受试者具有治疗性或其它益处。考虑到本文中的本发明的描述和待治疗的病症的性质，本发明所涉及领域的一般技术人员将了解合适的额外活性成分。
组合物可根据标准技术调配，举例而言，如可在此类标准参考文献中发现的，例如根纳罗AR(Gennaro AR):雷明顿：药物科学和实践(Remington:The Science and Practiceof Pharmacy),第20版,利平科特(Lippincott),威廉姆斯&威尔金斯(Williams&Wilkins),2000。然而，作为进一步实例，可使用US2013/0281524或US5948811中所提供的信息。
在某些实施例中，本发明提供一种组合产品，其包括以下、主要由以下组成或由以下组成：(a)半通道阻断剂和(b)一种或多种额外活性剂，如细胞因子拮抗剂，其中组分(a)和(b)适于同时或依序投与。
在本发明的一个特定实施例中，根据本发明的组合产品以使得投与所述组分中的至少一者，而另一组分仍对所治疗的受试者具有作用的方式使用。
适用于储存和/或投与药物组合物的任何容器可用于在本发明的方法中使用的半通道阻断剂产品。
在一些方面，一种或多种半通道阻断剂(例如，一种或多种连接蛋白43半通道阻断剂)可以经调配以向投与部位提供受控和/或分区释放。在本发明的一些方面，调配物可以是立即、或延长或持续释放剂型。在一些方面，剂型可包括立即释放剂型，与延长和/或持续释放剂型的组合两者。在一些方面，举例而言，可以通过将呈立即释放形式的经修饰或未经修饰的肽或拟肽物或一种或多种其它半通道阻断剂组合来获得一种或多种半通道阻断剂的立即和持续和/或延长释放两者。在本发明的一些方面，半通道阻断剂为例如连接蛋白43阻断剂或本公开的其它半通道阻断剂。在本发明的一些方面，剂型可以是植入物，例如可生物降解或不可生物降解的植入物。
在本发明的一些方面，半通道阻断剂(例如，连接蛋白43半通道阻断剂)可经调配以用于阻断剂的分区释放，例如，通过调节粒子的大小或包衣。举例而言，，在一些方面，可投与半通道阻断剂(例如，连接蛋白43阻断剂)的粒子调配物以供本发明的方法使用。在一些方面，包括粒子的药物递送系统可包括平均直径小于1,000nm，例如1-1000nm的纳米粒子和/或平均直径在1到1,000μm之间的微米粒子。纳米粒子或微米粒子可为例如纳米球或微米球，或经包封的纳米胶囊和微米胶囊，其中半通道阻断剂包封于聚合包衣中。粒子调配物还可包括脂质体。在一些方面，半通道阻断剂可包含或不包含连接蛋白45、Cx26、Cx30、Cx31.1、Cx36、Cx37、Cx40、Cx50或Cx57半通道或血管中的任何其它连接蛋白半通道的阻断剂。
本发明包括用于调节用于治疗各种病症的半通道的功能的方法。本发明的方法包括按需要单独或与一种或多种其它药剂(包含例如活性细胞因子拮抗剂)或疗法组合投与半通道阻断剂。
在另一个实施例中，半通道阻断剂，例如式I化合物，例如西弗拉姆，或肽或拟肽物半通道阻断剂，可以全身性投与，如通过静脉内、动脉内或腹膜内投与，使得最终循环浓度为约0.001到约150微摩尔，或更高达200、300、400、500、600、700、800、900或1000微摩尔。最终循环浓度可为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2.、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、100、110、120、130、140或150微摩尔，或任何两个所列数字之间的任何浓度或任何高于上文所描述的浓度和上述范围内的任何浓度。如本文所提及，本发明还包括还向受试者投与一种或多种额外活性剂的组合疗法。考虑到药剂的性质和本文中先前所论述的原理，所属领域的技术人员将了解一种或多种活性剂的所需剂量。
半通道阻断剂和任选地一种或多种其它活性剂的投与可在病症进展期间的任何时间发生，或在病症或病症的一种或多种症状发展之前或之后发生。在一个实施例中，对于延长时段周期性地投与半通道阻断剂以帮助症状的持续治疗。在另一个实施例中，延长时段或终身周期性地投与半通道阻断剂以预防或延迟病症的发展。
在一些实施例中，半通道阻断剂(例如，连接蛋白43半通道阻断剂)可以作为包括一种或多种粒子的药物组合物投与。在一些方面，药物组合物可以是例如立即释放调配物或控制释放调配物，例如延迟释放粒子。在其它方面，半通道阻断剂可在粒状调配物中调配一种或多种粒子以选择性递送到待治疗的区域。在一些实施例中，粒子可为例如纳米粒子、纳米球、纳米胶囊、脂质体、聚合胶束或树枝状聚合物(dendrimer)。在一些实施例中，粒子可为微米粒子。纳米粒子或微米粒子可包括可生物降解聚合物。在其它实施例中，半通道阻断剂作为植入物或基质制备或投与，或调配以向投与部位提供分区释放。
在一些实施例中，经调配的半通道阻断剂为连接蛋白43或连接蛋白45半通道阻断剂，优选为连接蛋白43半通道阻断剂。如本文所用，“基质”包含例如，如聚合基质、可生物降解或不可生物降解基质，和可用于制备用于递送半通道阻断剂的植入物或所应用的结构的其它载剂的基质。植入物包含储集器植入物和可生物降解的基质植入物。
在一些实施例中，举例而言，向受试者投与半通道阻断剂(例如，连接蛋白43和半通道阻断剂)，使用微针、微针阵列、针或可以用于投与一种或多种半通道阻断剂的植入物提供治疗有效量的连接蛋白43半通道阻断剂。在一些实施例中，微针可用于投与半通道阻断剂。在一些实施例中，可将微针的穿透控制到组织或器官或器官隔室内的所要深度。在一些实施例中，微针还可单独或与其它药剂一起包覆有半通道阻断剂。在一些方面，通过微针投与的半通道阻断剂和/或药剂的体积为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、295或300μl，或任何两个所列数字之间的体积的任何范围，或任何两个所列数字之间的任何体积。本发明的任何适合的调配物可通过微针注射投与，包含例如纳米粒子或微米粒子调配物，或可通过微针注射的其它调配物。
连接蛋白半通道阻断剂与细胞因子抑制剂或其它药剂的组合
在一些方面，用于本发明的VEGF拮抗剂为抑制和/或阻断VEGF或抑制和/或阻断VEGF或其受体的上游促效剂的化合物或组合物。在一些方面，VEGF拮抗剂包含例如结合到VEGF和抑制VEGF的拮抗剂、抑制VEGF表现的化合物和/或包括VEGF抑制剂或编码蛋白质的病毒载体，或阻断或抑制VEGF或VEGFR的反义多核苷酸。在一些方面，VEGF拮抗剂为例如抗体或抗体片段、纳米抗体、肽或拟肽物、受体片段、重组融合蛋白、适体、小分子或单链可变片段(scFv)。在一些方面，VEGF拮抗剂抗体为例如LucentisTM(雷珠单抗)和/或AvastinTM(贝伐单抗)。
在一些方面，与结合并且因此抑制VEGF的VEGF物质的上游促效剂反义的VEGF拮抗剂可以是RTP801抑制剂或REDD1阻断剂。在一些方面，RTP801抑制剂或REDD1阻断剂可以是PF-655(由夸克(Quark Pharmaceuticals)和辉瑞(Pfizer))，也被称为REDD14NP或RTP801i。在一些方面，REDD1阻断剂可以具有mRNA序列5'-AGCUGCAUCAGGUUGGCAC-3'(SEQID NO:172)。
在本发明的一些方面，VEGF拮抗剂为例如肽或拟肽物，例如哌加他尼钠(pegaptanib sodium)(MacugenTM)和AGN-150998。MacugenTM为经修饰的RNA序列、((2'-脱氧-2'-氟基)C-Gm-Gm-A-A-(2'-脱氧-2'-氟基)U-(2'-脱氧-2'-氟基)C-Am-Gm-(2'-脱氧-2'-氟基)U-Gm-Am-Am-(2'-脱氧-2'-氟基)U-Gm-(2'-脱氧-2'-氟基)C-(2'-脱氧-2'-氟基)U-(2'-脱氧-2'-氟基)U-Am-(2'-脱氧-2'-氟基)U-Am-(2'-脱氧-2'-氟基)C-Am-(2'-脱氧-2'-氟基)U-(2'-脱氧-2'-氟基)C-(2'-脱氧-2'-氟基)C-Gm-(3'→3')-dT)、具有α,α'-[4,12-二氧代-6-[[[5-(膦酰氧基)戊基]氨基]羰基]-3,13-二氧杂-5,11-二氮-1,15-十五烷二基]双[ω-甲氧基聚(氧基-1,2-乙烷二基)]的5'-酯、钠盐(SEQ ID NO:173)。AGN-150998/MP0112为抗VEGF DARPin，结合到VEGF的较小蛋白质。
在本发明的一些方面，VEGF拮抗剂为例如重组融合蛋白，如阿柏西普(aflibercept)(EyeleaTM)或康柏西普(conbercept)。阿柏西普为由融合到人类IgG1的Fc部分的人类VEGF受体1和2胞外结构域的部分组成的重组融合蛋白。康柏西普为由VEGFR1的第二Ig结构域和VEGFR2的第三和第四Ig结构域组成的重组融合蛋白到人类IgG1的恒定区(Fc)。
在一些方面，scFv VEGF拮抗剂为例如ESBA1008。ESBA1008为靶向VEGFA的人类化单株单链FV(scFv)抗体片段。
在一些方面，病毒载体VEGF拮抗剂可以是AAV-sFLT01(也称为“AVA-101”)。AAV2-sFlt01为携带用于分泌结合到VEGF的嵌合蛋白-sFLT01-的基因构筑体的腺相关病毒载体。sFLT01为由键连到人类免疫球蛋白G1重链Fc片段(sFlt01)的Flt-1的结构域2组成的VEGF结合蛋白，与腺相关病毒(AAV)组合以产生AAV2-sFlt01。
在本发明的一些方面，VEGF拮抗剂为小分子，例如凡塔蓝尼(Vatalanib)、西地尼布(Cediranib)、AL39324、帕唑帕尼(Pazopanib)、TG100572或TG100801。凡塔蓝尼(N-(4-氯苯基)-4-(吡啶-4-基甲基)酞嗪-1-胺)也称为PTK787、PTK/ZK或CGP 79787。西地尼布也称为AZD 2171、RecentinTM、ZD 2171或CAS号288383-20-0也称为4-[(4-氟基-2-甲基-1H-吲哚-5-基)氧基]-6-甲氧基-7-[3-(1-吡咯啶基)丙氧基]-喹唑啉。AL39324也称为利尼伐尼(Linifanib)、CAS编号796967-16-3、1145655-58-8(作为HCl盐)或796967-17-4(作为三氟乙酸盐)，也称为1-[4-(3-氨基-1H-吲唑-4-基)苯基]-3-(2-氟-5-甲基苯基)脲。帕唑帕尼也称为VotrientTM、ArmalaTM或PatormaTM，也称为5-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲氨基]-2-嘧啶基]氨基]-2-甲基苯磺酰胺单盐酸盐。TG100801是TG100572的前药版本，并且还称为4-氯-3-(5-甲基-3-((4-(2-(吡咯啶-1-基)乙氧基)苯基)-氨基)苯并[e][1,2,4]三嗪-7-基)p；4-氯-3-[5-甲基-3-[[4-[2-(1-吡咯啶基)乙氧基]苯基]氨基]-1,2,4-苯并三嗪-7-基]苯酚1-苯甲酸盐。
在一些实施例中，可以共调配半通道阻断剂和抗细胞因子治疗剂以用于共投与。在一些方面，半通道阻断剂和抗细胞因子治疗剂的调配物可以是丸剂、溶液、凝胶、预填充注射器、片剂、滴眼剂或作为基于粒子的调配物的一部分。
在半通道阻断剂(例如具有相对较短的肽和拟肽物)的情况下，本发明的方法还设想起始高/快速开始给药(快速释放)，随后持续低维持给药。对于单独或共同投与，可以制备调配物以提供快速或缓慢释放；立即、延迟、定时或持续释放；或其组合。调配物可以呈以下形式：液体、溶液、悬浮液、乳液、酏剂、糖浆、舐剂(electuary)、滴剂(包含但不限于滴眼剂)、片剂、颗粒、粉末、口含片、(pastille)、胶囊、凝胶、软膏、乳膏、洗剂、油、泡沫、喷雾剂、雾剂(mist)或气雾剂。
与细胞因子抑制剂或其它药剂的连接蛋白半通道阻断剂的组合的制品/试剂盒
在本发明的另一个实施例中，提供一种制品或“试剂盒”，其含有适用于治疗上文所描述的疾病和病症的物质。试剂盒包括容器，所述容器包括抑制剂抑制剂和连接蛋白半通道阻断剂、主要由细胞因子抑制剂和连接蛋白半通道阻断剂组成或由其组成。试剂盒还可进一步包括在容器上或与容器相关联的标签或药品说明书。术语“药品说明书”用以指通常包含于治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于与此类治疗产品的使用的适应症、用途、剂量、投与、禁忌和/或警告有关的信息。合适的容器包含例如瓶子、小瓶、注射器、泡壳包装等。容器可以由多种材料形成，如玻璃或塑料。容器可以盛放半通道阻断剂和/或细胞因子拮抗剂或其调配物(对于治疗病状有效)，并且可以具有无菌接入端口(例如容器可以是静脉内溶液包或具有可由皮下注射针穿刺的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为半通道阻断剂。标签或药品说明书指示组合物用于治疗所选病状，如本文中所描述或提及的疾病、病症和/或病状中的任一者。标签或药品说明书还可指示组合物可用于治疗其它病症。替代地或另外，制品还可以包括第二容器，其包括药物学上可接受的缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)和右旋糖溶液。从商业和用户观点来看，其可以进一步包含其它合乎需要的物质，包含其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
试剂盒可以进一步包括投与半通道阻断剂的指导，并且如果存在，那么细胞因子抑制剂或其它药剂作用于与半通道调节分离的机制以治疗如本文所描述的受试者。举例而言，如果试剂盒包括第一组合物(包括连接蛋白半通道阻断剂、主要由连接蛋白半通道阻断剂组成由其组成)和第二药物调配物，那么所述试剂盒可进一步包括向有需要的患者同时、依序或分开投与第一和第二药物组合物的指导。
在一个方面，试剂盒可进一步包括第三容器，所述第三容器包括药学上可接受的缓冲剂(如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液)，主要由药药学上可接受的缓冲剂(如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液)组成或由其组成。从商业和用户观点来看，其可以进一步包含其它合乎需要的物质，包含其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
在一些方面，试剂盒的第一和第二(和任选地，第三)组合物可组合投与、可同时投与、可分开投与、可依序投与或可以持续方式投与。
因此，单独或以调节剂中的任一者的组合形式的一或多种连接蛋白半通道阻断剂肽或拟肽物和/或其它抗连接蛋白试剂(如小分子半通道阻断剂)也可以用于制造药物，或用于试剂盒中。举例而言，合适的半通道阻断剂为Cx31.1、Cx36、Cx37、Cx40、Cx43、Cx45、Cx50、Cx57或本文中提到的任何其它连接蛋白的阻断剂。如所提到，试剂盒可在单独容器或分区容器中包括一种或多种药物组合物，以及包装和使用说明书。试剂盒还可包括药学上可接受的载剂。在一些实施例中，试剂盒还可以包含用于投与药物组合物的组件，例如注射器、针、微针、可装载植入物或离子导入装置。如本文所描述的连接蛋白半通道阻断剂和治疗搭配物可以独立地给药或通过使用具有区分量的组合搭配物(a)和(b)的不同固定组合，即，同时、单独或依序给药，无论是呈药物形式还是呈敷料/基质形式或这两者。然后，组分的试剂盒可以例如同时或按时间顺序交错投与，也就是说，在不同时间点并且对于组分试剂盒的任何部分以相等或不同时间间隔投与。
还提供包括含有半通道阻断剂化合物、组合物或调配物的容器和用于治疗受试者的说明书、主要由含有半通道阻断剂化合物、组合物或调配物的容器和用于治疗受试者的说明书组成或由其组成的制品。举例而言，在另一个方面，本发明包含一种制品，其包括含有单独或以抗细胞因子药剂中的任一种的组合形式的治疗有效量的一种或多种连接蛋白半通道阻断剂肽或拟肽物和/或其它半通道阻断剂的容器，以及使用说明书(包含用于治疗)、主要由其组成或由其组成。
在一些方面，制品可包括基质，所述基质包括一种或多种连接蛋白半通道阻断剂肽或拟肽物或另一种半通道阻断剂，如单独或以组合形式的小分子半通道阻断剂。举例而言，合适的连接蛋白半通道阻断剂可以是例如抗连接蛋白43或45半通道阻断剂。
剂量、量和浓度
如将了解，所投与的半通道阻断剂的剂量、投与时段和一般投与方案可能在受试者之间不同，取决于此类变量：待递送的目标部位、待治疗的受试者的任何症状的严重程度、待治疗的病症的类型、单位剂量的大小、所选择的投与模式和受试者的年龄、性别和/或一般健康状况和所属领域的一般技术人员已知的其它因素。
描述可以用于治疗本文中所提及的疾病、病症或病状的有效剂量的实例。在一些方面，半通道阻断剂(例如连接蛋白43半通道阻断剂)的治疗有效量为约0.001到约1.0微克/ml、或约0.001到约0.01mg/ml、或约0.1mg/mL到约100mg/mL、或更多，或所列举的剂量中的任何两者之间的任何范围或任何两个所列数字之间的任何剂量的浓度。剂量可以为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2.、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100mg/ml，所列举的剂量中的任何两者之间的任何范围或任何两个所列数字之间的任何剂量。在一些实施例中，半通道阻断剂的治疗有效量以约0.5到约50mg/mL范围内的浓度存在。在一些实施例中，半通道阻断剂以约0.3到约30mg/mL范围内的浓度存在。在一些实施例中，半通道阻断剂以约0.1或1.0到约10mg/mL范围内的浓度存在。在一些实施例中，半通道阻断剂以约0.1或1.0到约0.3或3.0mg/mL范围内的浓度存在。在一些实施例中，半通道阻断剂以约3.0mg/mL的浓度存在。
在一些方面，可以约0.001到约100mg/kg之间、约0.001到约0.01mg/kg之间、约0.01到约0.1mg/kg之间、0.1到约1mg/kg之间、约1到约10mg/kg之间、或约10到约100mg/kg之间、或任何两个所列的剂量之间的任何范围或任何两个所列剂量之间的任何剂量的治疗有效剂量投与半通道阻断剂。在一些方面，剂量可以为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2.、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100mg/ml，所列举的剂量中的任何两者之间的任何范围或任何两个所列数字之间的任何剂量。
应了解，投与可以包含单一日剂量、投与多个离散分次剂量或按适当的需要连续投与。举例来说，单位剂量可以每天投与一次或多于一次，例如一天1次、2次、3次、4次、5次或6次以获得所需总日剂量。举例来说，半通道阻断剂的单位剂量可以单一日剂量或多个离散剂量或连续投与以获得约0.1到10mg、10到100mg、100到1000mg、1000到2000mg或2000mg到5000mg、0.1到约2000mg、约0.1到约1000mg、约1到约500mg、约1到约200mg、约1到约100mg、约1到约50mg或约1到约25mg，或任何两种所列举剂量之间的任何范围或任何两种所列举剂量之间的任何剂量的日剂量。
借助于其它实例，半通道阻断剂的单位剂量可以一天投与一次或多于一次(例如一天1次、2次、3次、4次、5次或6次，通常1次到4次)，使得总日剂量在约1到约1000mg，例如约1到约500mg，或500mg到1000mg、1000到2000mg或2000mg到5000mg，或任何两种所列举剂量之间的任何范围活任何两种所列举剂量之间的任何剂量(对于70kg)。举例而言，可以约0.01到约15mg/kg/天，例如约0.1到约6mg/kg/天、例如约1到约6mg/kg/天、例如6mg/kg/天到100mg/kg/天或任何两种所列举剂量之间的任何范围或任何两种所列举剂量之间的任何剂量向受试者投与半通道阻断剂(如佩普塔贡和/或其类似物)、式I化合物(例如西弗拉姆)和前述化合物中的任一者的类似物。在一个实施例中，西弗拉姆可以约2mg到约40mg的剂量一天经口投与一次。
在一个实施例中，半通道阻断剂的剂量在作用部位处为约0.001微摩尔到0.1微摩尔、0.1微摩尔并且至多约200微摩尔，或更高，在循环内获得作用部位处的那些浓度。举例来说,剂量可以(但不限于)为约0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2.、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500微摩尔，或任何两种所列举浓度之间的任何范围或任何两种所列数字之间的任何浓度的最终循环浓度。预期阻断半信道但不断开间隙接合联接的剂量的其它实例描述于奥卡罗尔等人,2008中，以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，西弗拉姆可以更低剂量，例如0.001到20微摩尔使用。低剂量可以为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2.、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20微摩尔。
在一个实施例中，半通道阻断剂(如佩普塔贡和/或其类似物)的剂量在作用部位处为约0.001微摩尔并且至多约200微摩尔，或200到2000或5000微摩尔，或在循环内更高，以在作用部位处为获得的那些浓度。举例来说，剂量可以是(但不限于)约1、5、10、20、50、100、200、250、500、1000、2000、3000、4000或5000微摩尔，或任何两种所列举剂量之间的任何范围或任何两种所列举剂量之间的任何剂量的最终循环浓度。有效阻断半通道但不断开间隙接合联接的佩普塔贡的剂量在论述于奥卡罗尔等人,2008。
在一些实施例中，西弗拉姆可以更低剂量使用，例如1到20微摩尔、1到50微摩尔、20到30、30到40或40到50微摩尔。低剂量可以为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2.、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20微摩尔。
在一些实施例中，其半通道阻断剂的合适的治疗有效剂量可以是至少约1.0mg/mL的半通道阻断剂。在一些实施例中，半通道阻断剂的治疗有效剂量可为约0.001mg/mL到0.01mg/mL、约0.01mg/mL到约0.1mg/mL或约0.1mg/mL到约100mg/mL。在一些实施例中，半通道阻断剂的合适的治疗有效剂量可为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、24.0、25.0、26.0、27.0、28.0、29.0、30.0、31.0、32.0、33.0、34.0、35.0、36.0、37.0、38.0、39.0、40.0、41.0、42.0、43.0、44.0、45.0、46.0、47.0、48.0、49.0、50.0、52.5、55.0、57.5、60.0、62.5、65.0、67.5、70.0、72.5、75.0、77.5、80.0、82.5、85.0、87.5、90.0、92.5、95.0、97.5或约100.0μg/mL，或所列举剂量的任何两者之间的任何范围或子范围，或属于约0.1到约100μg/mL的范围内的任何剂量。在一些实施例中，半通道阻断剂的合适的治疗有效剂量可为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、24.0、25.0、26.0、27.0、28.0、29.0、30.0、31.0、32.0、33.0、34.0、35.0、36.0、37.0、38.0、39.0、40.0、41.0、42.0、43.0、44.0、45.0、46.0、47.0、48.0、49.0、50.0、52.5、55.0、57.5、60.0、62.5、65.0、67.5、70.0、72.5、75.0、77.5、80.0、82.5、85.0、87.5、90.0、92.5、95.0、97.5或约100.0mg/mL，或所列举剂量的任何两者之间的任何范围或子范围，或属于约0.1到约100mg/mL的范围内的任何剂量。在一些实施例中，半通道阻断剂以约0.5到约50mg/mL范围内的浓度存在。在其它实施例中，半通道阻断剂以约0.3到约30mg/mL范围内的浓度存在。在其它实施例中，半通道阻断剂以约0.1或1.0到约10mg/mL范围内的浓度存在。在其它实施例中，半通道阻断剂以约0.1或1.0到约0.3或3.0mg/mL范围内的浓度存在。在其它实施例中，半通道阻断剂，如连接蛋白43半通道阻断剂和/或连接蛋白45半通道阻断剂以约3.0mg/mL的浓度存在。在这些方面中的任一个中，半通道阻断剂可以是连接蛋白43或连接蛋白45半通道阻断剂。当半通道阻断剂为经修饰或未经修饰的肽或拟肽物时，剂量可以降低1-10、25-50、100-200或1000倍。
在某些实施例中，半通道阻断剂，例如，连接蛋白43半通道阻断剂，可以在治疗部位和/或邻近治疗部位处约0.001微摩尔(μM)或0.05μM到约200μM、或至多300μM、或至多1000μM、或至多2000μM或至多3200μM，例如至多约10mM、20mM或30mM最终浓度和在这些剂量数字内任何剂量和剂量范围投与。在一个实施例中，半通道阻断剂组合物以大于约1000μM施加。优选地，以约1000μM到约10mM最终浓度施加半通道阻断剂组合物，更优选地，以约3mM到约10mM最终浓度施加抗连接蛋白药剂组合物，并且更优选地，以约1-3mM到约5-10mM最终浓度施加半通道阻断剂组合物。半通道阻断剂浓度可以为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2.、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100微摩尔；或0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2.、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100毫摩尔，或所列举剂量的任何两者之间的任何范围或任何两个所列数字之间的任何剂量。
另外，半通道阻断剂，例如，连接蛋白43半通道阻断剂可以约1μM到约50μM最终浓度存在于调配物中，并且可替代地，例如，连接蛋白43半通道阻断剂以约5μM到约20μM最终浓度，或以约10到约15μM的最终浓度存在。在某些其它实施例中，半通道阻断剂以约10μM最终浓度存在。在又一个实施例中，半通道阻断剂以约1-15μM的最终浓度存在。在其它实施例中，半通道阻断剂以约20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、10-200μM、200-300μM、300-400μM、400-500μM、500-600μM、600-700μM、700-800μM、800-900μM、900-1000或1000-1500μM、或1500μM-2000μM、2000μM-3000μM、3000μM-4000μM、4000μM-5000μM、5000μM-6000μM、6000μM-7000μM、7000μM-8000μM、8000μM-9000μM、9000μM-10,000μM、10,000μM-11,000μM、11,000μM-12,000μM、12,000μM-13,000μM、13,000μM-14,000μM、14,000μM-15,000μM、15,000μM-20,000μM、20,000μM-30,000μM、30,000μM-50,000μM或更大，或所列举剂量的任何两者之间的任何范围或子范围或属于约20μM到约50,000μM范围内的任何剂量存在。
本文还描述半通道阻断剂中的每一者的约1纳克(mg)/kg与约1mg/kg体重/天之间的其它剂量水平。在某些实施例中，主题化合物中的每一者的剂量通常在约1ng到约1微克/kg体重、约1ng到约0.1微克/kg体重、约1ng到约10ng/kg体重、约10ng到约0.1微克/kg体重、约0.1微克到约1微克/kg体重、约20ng到约100ng/kg体重、约0.001mg到约0.01mg/kg体重、约0.01mg到约0.1mg/kg体重或约0.1mg到约1mg/kg体重的范围内。在某些实施例中，主题化合物中的每一者的剂量通常在约0.001mg到约0.01mg/kg体重、约0.01mg到约0.1mg/kg体重、约0.1mg到约1mg/kg体重的范围内。如果使用超过一种半通道阻断剂，那么每种半通道阻断剂的剂量不必在与其它半通道阻断剂在相同的范围内。举例而言，一种连接蛋白半通道阻断剂的剂量可以在约0.01mg到约10mg/kg体重之间，并且另一种连接蛋白半通道阻断剂的剂量可以在0.1mg到约1mg/kg体重、0.1到约10、0.1到约20、0.1到约30、0.1到约40之间，或在约0.1到约50mg/kg体重之间。剂量还可为约0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2.、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100mg/kg体重，或所列举剂量的任何两者之间的任何范围或子范围，或属于约0.001到约100mg/kg体重范围内的任何剂量。
如上所述，半通道阻断剂(例如，连接蛋白43或45半通道阻断剂)的剂量可以单次投与或分次施加。可以投与剂量一次，或可以重复施加。通常，按需要每周、每两周或每3周、每一个月或每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或每24个月或更久重复施加以预防、减缓或治疗本文所描述的任何疾病、病症或病状。可以重复剂量和/或增加剂量，或如果细胞因子水平或一种或多种活性增加到非所要或非所需的水平，则减小剂量。还可每隔12小时到7天或更久施加剂量。举例而言，可以间隔12小时、或1、2、3、4、5、6或7天、或在这些时间中的任何者之间、或12小时与7天之间的任何时间间隔施加剂量。举例而言，连接蛋白43半通道阻断剂可以投与至多四、六、八、十、十二、十四、十六、十八、二十、二十二、二十四或二十六周。对于一些适应症，可采用更频繁的给药。
组合产品
在一些方面，半通道阻断剂可与细胞因子拮抗剂一起用于制造用于治疗本文所提及的一种或多种疾病、病症和病状的单独药物或组合药物。
适用于本发明的半通道阻断剂可以单独或与适用于治疗目标疾病、病症或病状的另一种治疗剂组合投与。在一些方面，式I化合物(例如西弗拉姆)和/或前述化合物的任一者的类似物或前药，或拟肽物(如佩普塔贡或其类似物或前药)或另一种半通道阻断剂可与用于治疗其中半通道的调节可能有益的病症的细胞因子拮抗剂一起使用。半通道阻断剂的投与可以与细胞因子拮抗剂的投与同时、之后或之前。
在某些实施例中，本发明提供一种组合产品，其包括以下、主要由以下组成或由以下组成：(a)半通道阻断剂和(b)一种或多种额外活性剂，如细胞因子拮抗剂，其中组分(a)和(b)被调适成同时或依序投与。适用于储存和/或投与药物组合物的任何容器可以用于本发明的半通道阻断剂组合产品，其中半通道阻断剂和额外活性剂在相同或单独容器中。
在本发明的一个特定实施例中，根据本发明的组合产品以使得投与所述组分中的至少一者，而另一组分仍对所治疗的受试者具有作用的方式使用。
制造和纯度
合成抗体和结合片段以及肽和多肽(包含拟肽物和肽类似物)的方法可以使用适合的方法进行。参见例如杨立虎(Lihu Yang)等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),1；95(18):10836-10841(1998年9月1日)；哈洛(Harlow)和莱恩(Lane)(1988)“抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manuel)”冷泉港出版物(Cold Spring Harbor Publications,纽约；哈洛和莱恩(1999)“抗体使用(UsingAntibodies)”实验室手册,冷泉港出版物,纽约。
在一些实施例中，本发明的调配物大体上是纯的。大体上纯意指调配物包括小于约10％、5％或1％，并且优选小于约0.1％的任何杂质。在一些实施例中，总杂质(包含连接蛋白43调节剂的代谢物)将不超过1-15％。在一些实施例中，总杂质(包含连接蛋白43调节剂的代谢物)将不超过2-12％。在一些实施例中，总杂质(包含连接蛋白43调节剂的代谢物)将不超过3-11％。在其它实施例中，总杂质(包含连接蛋白43调节剂的代谢物)将不超过4-10％。
实例
进行这些实例中所描述的工作以使用永生化人类视网膜着色上皮细胞株评估高葡萄糖和发炎对细胞因子释放和连接蛋白43表现和定位的作用(ARPE-19)。通过使细胞暴露于IL-1β和TNF-α、有效促炎性细胞因子的组合来诱导发炎。周,J.等人.玻璃体内发炎性细胞因子和血管生成因子在增生性糖尿病性视网膜病变中的作用(Role of intravitrealinflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabeticretinopathy).现代眼科研究杂志(Current Eye Research),37:416-420(2012)。研究的包含IL-6(促炎性细胞因子)、IL-8(嗜中性白细胞趋化因子)、MCP-1(单核细胞化学引诱剂)和sICAM-1(白细胞-内皮细胞黏附因子)、已经在文献(参见唐,J(Tang,J)和科恩,TS(Kern,TS).糖尿病性视网膜病变中的发炎(Inflammation in diabetic retinopathy).视网膜与眼睛研究进展(Progress in Retinal and Eye Research),30(5),343-358(2011))中充分研究的细胞因子、以及VEGF(血小管生成的刺激剂)的细胞因子释放，所有都发现在糖尿病性视网膜病变病人的玻璃体内升高(周等人前述；阿布埃尔阿斯拉(Abu El Asrar),A.M.等人.(1992).患有增生性糖尿病性视网膜病变病人的玻璃体内细胞因子(Cytokines in theVitreous of Patients With Proliferative Diabetic Retinopathy).美国眼科学杂志(American Journal of Ophthalmology),114:731-736(1972))随后使用连接蛋白43半通道阻断剂以抑制半通道开口来评估疾病过程中的连接蛋白半通道的作用。
实例1
方法
细胞培养-将人类成人视网膜着色上皮细胞(ARPE-19；美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)，马纳萨斯，VA)在营养物混合F-12介质的经杜尔贝科氏改良的伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12medium)(DMEM-F12；美国赛默飞世尔科学公司(Thermofisher Scientific Inc.))中，补充有10％胎牛血清(FBS；英杰生命技术有限公司(Invitrogen)))和1倍抗生素和抗真菌剂混合物(AA，100被储备液)，在37℃下，在潮湿的5％CO2培育箱中培养。细胞在T75烧瓶中生长，并且培养基每周更换两次直到汇合并且准备好实验为止。
葡萄糖和/或细胞因子攻击-在通道6-12处，在8孔腔式载玻片中以2.5×105个细胞/mL接种细胞以用于免疫组织化学研究或24孔板用于ATP释放分析和流式细胞微球阵列分析(cytometric bead array analysis)。一旦汇合，培养基就更换成在含有1倍AA的无血清DMEM-F12中的处理。用15mM葡萄糖(高葡萄糖(高葡萄糖)组)、促炎性细胞因子10ng/mLTNF-α(派普泰克(Peprotech)，美国)和10ng/mL IL-1β(派普泰克，美国)(细胞因子组)的组合或高葡萄糖、10ng/mL TNF-α和10ng/mL IL-1β(高葡萄糖+细胞因子组)的组合攻击一些培养物。未处理组接受不具有额外处理的培养基变化(基础组)。所有评估都在处理后24小时进行。
半通道阻断剂处理-将肽5(H-Val-As-Cys-Phe-Leu-Ser-Arg-Pro-Thr-Glu-Lys-Thr-OH；中国肽公司，中国)投与到用高葡萄糖和促炎性细胞因子攻击的细胞。在24小时之后，以5、10、25和50μM的佩普塔贡研究浓度依赖性作用。这些浓度已展示阻断连接蛋白43半通道，而对于细胞-细胞联接的间隙接合具有极小作用。奥卡罗尔,SJ等人.连接蛋白43模拟肽减少脊髓损伤后肿胀、星形胶质细胞增生和神经元细胞死亡(Connexin43mimeticpeptides reduce swelling,astrogliosis,and neuronal cell death after spinalcord injury).细胞通讯和粘附,15:27-42(2008)。
使用流式细胞微球阵列的细胞因子和趋化因子测量结果-使用基于复合微球的免疫分析、流式细胞微球阵列(CBA，BD Biosciences，美国)同时测量ARPE-19培育基中的可溶细胞因子和趋化因子。在24小时之后，从24孔板中的重复培养物取出50μL体积的三个测试并且将其转移到96孔板中待用于CBA分析。所述分析包含每组六个测试。根据制造商说明书进行分析。简单来说，使用提供于每个试剂盒中的细胞因子标准物对于每一细胞因子得十点标准曲线在0到5000pg/mL范围内。所测量的细胞因子为人类可溶CD54(sICAM-1，目录号560269，BD Biosciences，美国)、IL-6(目录号558276)、IL-8(目录号558227)和MCP-1(目录号558287)。将样本和细胞因子标准物在捕获微球混合物中培育1小时，并且将针对每个细胞因子的藻红蛋白(Phycoerythrin；PE)共轭的抗体添加到样本微球混合物中，在室温下培育2小时。所使用的所有缓冲液来自CBA人类可溶蛋白主缓冲液试剂盒(human solubleprotein master buffer kit)(目录号558265，BD Biosciences，美国)。洗涤微球并使用Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences，美国)分析。使用如先前所描述(奥卡罗尔等人,2015)的FCAP ArrayTM软件(BD版本3.1)，基于十点标准曲线，将每个微球簇的平均荧光强度转换成细胞因子浓度。
ATP释放分析-在处理介质中培育24小时之后，使用50μL取自24孔板的重复孔的培养基以一式三份的形式测量ATP释放。样本大小为每组六个，在单独实验中重复三次。根据制造商说明书使用ATPlite发光ATP检测分析系统(ATPlite Luminescence ATP DetectionAssay System)(珀金埃尔默(PerkinElmer)，美国)，测量释放到培养基中的ATP。使用下式计算相对于用高葡萄糖和细胞因子(损伤组)处理的细胞的经肽5处理的培养物(处理组)中的ATP释放(％)：(处理组OD490-损伤组OD490)/(损伤组OD490)×100％。
免疫组织化学-在处理介质中培育24小时之后，用4％多聚甲醛固定细胞10分钟并且用0.1％Triton X-100在磷酸缓冲盐水(PBS)中渗透10分钟。然后在4℃下将细胞与小鼠抗NLRP3(1:100；阿布凯姆(Abcam)，美国)一起培育整夜，随后在PBS中洗涤三次，持续15分钟。将山羊抗小鼠Cy3(1:500；美国，杰克逊免疫研究(Jackson Immuno Research))二级抗体施加到载玻片上并且在室温下培育3小时。二级抗体仅控制揭露无特定标记。细胞核用DAPI(1:1000；美国西格玛奥德里奇)染色。洗涤细胞并且使用CitifluorTM抗褪色试剂固定细胞并且用指甲油密封盖玻片。在单独实验中重复标记三次。
图像分析-所有图像都是用奥林巴斯FV1000共焦激光扫描显微镜(日本，东京，奥林巴斯(Olympus))拍摄并且使用FV-10ASW 3.0查看器和ImageJ软件版本1.46r(美国，美国国家卫生研究院)处理。
NLRP3免疫标记的定量-对于NLRP3免疫组织化学分析，每孔分析四个图像，并且重复整个实验三次。
使用ImageJ，将每个图像拆分成其RGB通道，其中NLRP3在红通道中并且DAPI在蓝通道中。将每个NLRP3图像转换成二进制图像，并且将相等阈值施加于所有图像以减少背景。锐化滤镜(sharpen filter)仅用以突出显示NLRP3复合物，并且设定更低大小阈值和更高大小阈值以允许独立于噪声半点和更大核来计数炎性体。对每个图像计数NLPR3点的数目。
统计分析-数据呈现为算术平均值±标准差。使用单因子变异数分析进行组之间的统计比较。当将每个数据点与所述系列中的每个其它数据点比较时，使用事后图基氏多重比较测试。当将每个数据点仅与一个数据点进行比较时，使用事后邓内特氏多重比较测试。用于每个数据组的特定统计方法呈现在图例中。p<0.05视为统计学上显著的。使用GraphPad Prism6进行所有统计分析。
实例2
高葡萄糖+细胞因子共同施加增加IL-6、sICAM-1MCP-1、IL-8和VEGF分泌。
评估高葡萄糖和促炎性细胞因子的个别或组合施加对发炎路径细胞因子分泌的影响。高葡萄糖相对于基础水平并不刺激IL-6或sICAM-1、MCP-1或IL-8的释放(图1)。单独的细胞因子不诱导sICAM-1水平的显著变化，但与基础条件相比诱导较高IL-6水平(p≤0.0001)、MCP-1(p＝0.0002)和IL-8(p≤0.0001)。然而，相对于基础、仅高葡萄糖和仅细胞激素(对于所有p≤0.0001)，高葡萄糖和细胞因子两者的共同施加产生更高的IL-6、sICAM-1、MCP-1和IL-8释放(图1)。此增加比单独的发炎性细胞因子高两倍到三倍。
还评估VEGF的分泌。当单独地添加时，与基础水平相比，发炎性细胞因子或高葡萄糖对VEGF释放均不具有显著影响(图2)。然而，发炎性细胞因子和高葡萄糖的组合显著增加VEGF释放(p<0.0001)，其中VEGF浓度大于其基线水平的两倍。
实例3
在高葡萄糖和细胞因子的共同施加之后，连接蛋白半通道阻断减少IL-6、IL-8、sICAM-1、MCP-1和VEGF的表现
为了评估连接蛋白43半通道在高葡萄糖和细胞因子介导的病变中的作用，将细胞暴露于佩普塔贡，即连接蛋白半通道的公认阻断剂。结果展示佩普塔贡显著降低IL-6、IL-8、sICAM-1和MCP-1的分泌(图3，对于所有p<0.0001)。用佩普塔贡处理，IL-6、IL-8和MCP-1分泌有轻微的浓度依赖性降低趋势，但对于sICAM-1，所有肽浓度具有相同影响。此外，在添加连接蛋白半通道阻断剂的情况下，VEGF释放也完全停滞，并且胞外浓度几乎降低回到基线水平，基线与高葡萄糖+细胞因子+肽5处理组之间无统计显著性(p＝0.98)(图2)。
实例4
连接蛋白半通道阻断阻止高葡萄糖+细胞因子诱导的ATP释放
细胞因子太大而不能通过连接蛋白半通道，并且我们的实验室中的先前研究已经表明，开放连接蛋白43半通道释放ATP。增加的ATP释放引起炎性体活化和细胞因子释放，并且在高葡萄糖和细胞因子损伤之后并且响应于额外的肽5处理来评估ATP释放。结果展示在24小时，高葡萄糖和细胞因子的共同施加产生高水平ATP释放(图4)，通过ARPE-19细胞使所释放基础水平加倍(p＝0.0003)。与高葡萄糖和细胞激素(p＝0.0171)相比，用佩普塔贡的半通道阻断剂处理显著降低ATP释放，使得经佩普塔贡处理的组与基础条件之间不存在统计学上显著的差异(p＝0.1119)。
实例5
外源性胞外ATP并不诱导IL-6、sICAM-1、MCP-1、IL-8或VEGF释放，但相反地，连接蛋白半通道阻断保护针对IL-6、IL-8和VEGF释放。
在共同施加高葡萄糖和细胞因子之后评估释放的ATP以确定单独ATP是否足以诱导细胞因子释放。如表A中所示，结果显示将ARPE-19细胞暴露于10nM的外源性ATP不引起IL-6、sICAM-1、IL-8或VEGF分泌的变化，但与基础条件(p≤0.0001)相比，确实引起MCP-1释放的降低。
表A：响应于胞外ATP的IL-6、sICAM-1、MCP-1和IL-8的分泌(n.s.＝不显著；****p≤0.0001)
Figure BDA0002413147850000611
在单独10nM下的外源性ATP不足以诱导细胞因子释放的条件下，进行额外实验以确定在细胞暴露于高葡萄糖、细胞因子和佩普塔贡时，添加相同浓度的ATP到胞外环境中是否可覆盖发炎性细胞因子分泌的佩普塔贡介导的阻断。关于IL-6、MCP-1和IL-8释放结果是肯定的，其中外源性ATP的存在导致细胞因子分泌回到损伤水平(图5)。尽管在存在外源性ATP的情况下，存在对sICAM-1释放增加的趋势，但其并未达到统计显著性。然而，外源性胞外ATP的添加完全覆盖佩普塔贡半通道阻断对VEGF释放的作用，并且VEGF水平再次显著增加(图2)。
这些结果是通过调节炎性体复合物组装的事实是使用NLRP3炎性体复合物的免疫组织化学标记展示。惰性NLRP3通常分散于细胞质内，但一旦炎性体活化，炎性体复合物内的多个NLRP3复制物寡聚浓缩，使得其能够用免疫组织化学标记显现。一旦添加高葡萄糖和发炎性细胞因子，将多个复合物标记于ARPE-19细胞内(图6A中的小点)。添加佩普塔贡半通道阻断剂继而阻断炎性体组装(图6B)并且在细胞细胞质中发现极少标记(注意：此抗体在所有条件下都产生高核背景)，但添加外源性ATP使处理过度，并且再次发现在细胞质内形成炎性体复合物(在图6C中定量)。
论述
这些实例展示半通道阻断的新颖作用的出人意料的发现，其涉及对通过半通道调节的细胞因子产生和释放或分泌的直接和立即作用。已出人意料地发现在连接蛋白半通道介导细胞因子释放并且在细胞因子释放中发挥关键作用，发现在治疗整体或部分由细胞因子活性表征的各种疾病、病症和病状并且，重要的是，在经由VEGF的血管生成细胞因子活性方面具有重要含义。
此外，还出人意料地发现半通道阻断剂可减少发炎性介体IL-6、sICAM-1、MCP-1和IL-8的释放。IL-6和sICAM-1的释放指示细胞应激和发炎水平的变化。IL-6(促炎性细胞因子)为“死亡”信号，并且其表达在细胞暴露于发炎性应激时增加(普朗克(Planck)等人,1992)。在另一方面，sICAM-1从细胞表面裂解并且可以充当调节分子以控制白细胞对细胞表面的粘附(宫本(Miyamoto)等人,2000)。MCP-1和IL-8参与白细胞募集，加重发炎反应。综合起来，这些实例和此描述中的发现支持以下想法：使用浓度低到5μM的半通道阻断剂导致发炎性介体的分泌统计学上显著降低。然而，通过连接蛋白半通道调节的细胞因子释放并不直接，因为这些分子太大而不能移动通过大小限制约1kDa的间隙接合半通道。
最后，重要的是，半通道阻断剂的一次使用将VEGF释放降低到基线水平。因此，其提供预防第一实例中过量VEGF(和其它发炎性细胞因子)释放从而形成用于治疗例如慢性发炎性疾病的基础的新颖上游方法。
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***
本文中所描述和主张的发明具有许多属性和实施例，包含但不限于此详细公开中阐述或描述或参考的那些属性和实施例。并不希望为完全包含性的，并且本文中所描述和主张的发明不限于此详细公开中所识别的特征或实施例，所包含的特征或实施例仅仅出于说明的目的而非限制。然而，所属领域的一般技术人员将易于认识到，许多组分和参数可以在不脱离本发明的范围的情况下在一定程度上加以改变或修改或取代成已知同等着。应了解，此类修改和同等者如同单独阐述般并入本文中。本发明还包含本说明书中个别或共同地提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物以及所述步骤或特征中的任何两者或更多者的任何和所有组合。
本文引用或提及的所有专利、公开案、科学文章、网站和其它文献和材料指示本发明涉及的领域的技术人员的技术水平，并且每个此类参考文献和材料特此以引用的方式并入，并入程度如同其单独地已经以全文引用的方式并入本文中或通过在本文中阐述其全部。申请人保留将来自任何此类专利、公开案、科学文章、网站、电子可用信息和其它参考材料或文献的任何和所有材料和信息实际并入本说明书的权利。对本说明书中的任何申请、专利和公开案的参考不是并且不应视为其在世界上任何国家中构成有效现有技术或形成公共常识的一部分的承认或任何形式的建议。
本文所述的具体方法和组合物是优选实施例的代表，并且是示例性的，并不旨在限制本发明的范围。所属领域的技术人员在考虑本说明书后将想到其它目标、方面和实施例，并且所述其它目标、方面和实施例涵盖在由权利要求的范围限定的本发明的精神内。对于所属领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文所公开的本发明进行各种替换和修改。本文例示性描述的本发明可适当地在不存在本文未具体公开为必要的任何一个或多个要素，或一个或多个限定的情况下实施。因此，举例而言，在本文中的每个实例中，并且在本发明的实施例或实例中，术语“包括”、“主要由…组成”和“由…组成”中的任一者可与本说明书中的其它两者中的任一者替换。本文例示性地描述的方法和过程可以适当地以不同的步骤顺序实施，并且它们不必限于本文或权利要求中指出的步骤的顺序。另外，如本文中和所附权利要求书中所使用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“a”、“an”和“the”包含复数个参考。在任何情况下，本专利都不能解释为限于本文具体公开的具体实例或实施例或方法。在任何情况下，本专利都不能解释为受任何审查员或专利和商标局的任何其它官员或雇员作出的任何陈述的限制，除非此类陈述明确且无任何限定或保留地在申请人的回应书中明确采用。此外，提供标题、小标题等以增强读者对本文件的理解，并且不应被解读为限制本发明的范围。本文所提及的本发明的方面、实施例或组分的任何实例视为非限制性的。
已经使用的术语和表达被用作描述性术语而非限制性术语，并且在使用这些术语和表达时无意排除所示出和描述的特征或其部分的任何同等者，但是应当认识到，在所主张保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应理解，尽管本发明已经通过优选实施例和任选特征特定地公开，但所属领域的技术人员可以对本文中所公开的概念进行修改和变更，并且此类修改和变更被视为属于在如所附权利要求书限定的本发明的范围内。
本发明已在本文中广泛并且一般地加以描述。属于通用公开内容的较狭义物质和子类组中的每一个也形成本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述，附带条件或负面限制为从所述属中去除任何主题，无论所去除的材料是否在本文中具体列举。
其它实施例在以下权利要求书内。此外，在本发明的特征或方面以马库西组的方式进行描述的情况下，所属领域的技术人员将认识到本发明也因此以马库西组的任何个别成员或成员子组的形式进行描述。

Claims (26)

1.一种用于调节受试者的细胞因子活性的方法，其包括向所述受试者投与有效量的半通道阻断剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞因子的存在或量减少。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞因子的存在或量的增加被抑制。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞因子选自由以下组成的群组：白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、单核细胞趋化蛋白-1MCP-1和可溶性细胞内粘附分子-1(sICAM-1)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞因子为血管内皮生长因子。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述血管内皮生长因子为血管内皮生长因子-A。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述半通道阻断剂为连接蛋白43半通道阻断剂。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述半通道阻断剂为小分子半通道阻断剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述小分子半通道阻断剂为N-[(3S,4S)-6-乙酰基-3-羟基-2,2-二甲基-3,4-二氢苯并吡喃-4-基]-3-氯-4-氟苯甲酰胺(西弗拉姆)。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述半通道阻断剂为连接蛋白拟肽物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述半通道阻断剂为VDCFLSRPTEKT(SEQ IDNO:1)。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述半通道阻断剂主要由SRPTEKT(SEQ IDNO:2)组成。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述半通道阻断剂选自由主要由ADCFLSRPTEKT(SEQ ID NO:3)、VACFLSRPTEKT(SEQ ID NO:4)、VDCFLSRPTAKT(SEQ ID NO:5)、VDCFLSRPTEAT(SEQ ID NO:6)、CFLSRPTEKT(SEQ ID NO:7)和LSRPTEKT(SEQ ID NO:8)组成的肽组成的群组。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括投与VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述VEGF为VEGF-A。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括投与IL-6拮抗剂或IL-6受体拮抗剂。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括投与IL-8拮抗剂、MCP-1拮抗剂或sICAM-1拮抗剂中的一种或多种。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述半通道阻断剂为连接蛋白43半通道阻断剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中血管生成减少或减弱。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述半通道阻断剂通过注射投与。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述半通道阻断剂经口投与。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述半通道阻断剂以PRN或以预定时间表或以这两者投与。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者为人。
24.根据权利要求10所述的方法，其中所述半通道阻断剂为经修饰的拟肽物。
25.根据权利要求25所述的方法，其中所述修饰包括C12-C12-VDCFLSRPTEKT(SEQIDNO:171)。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者具有病理性、异常、非所需或非所要量的细胞因子活性。
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