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CN111343970A - 微针贴片局部诱导脂肪组织褐变治疗肥胖症 - Google Patents

微针贴片局部诱导脂肪组织褐变治疗肥胖症 Download PDF

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CN111343970A
CN111343970A CN201880073636.5A CN201880073636A CN111343970A CN 111343970 A CN111343970 A CN 111343970A CN 201880073636 A CN201880073636 A CN 201880073636A CN 111343970 A CN111343970 A CN 111343970A
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CN
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microneedles
particle
subject
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顾臻
张雨琪
羌丽
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North Carolina State University
Columbia University in the City of New York
Original Assignee
North Carolina State University
Columbia University in the City of New York
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Abstract

本文公开了用于递送脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的组合物和方法。

Description

微针贴片局部诱导脂肪组织褐变治疗肥胖症
该申请要求于2017年9月13日提交的No.62/558,348美国临时申请的权益，该临时申请通过引用其全部内容并入本文。
关于联邦政府赞助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的No.1UL1TR001111、No.R00DK97455和No.P30DK063608政府拨款的支持下完成。政府对本发明享有某些权利。
背景技术
随着全球社会经济的快速发展，肥胖症已于2013年被美国医学会列为一种疾病，同时也是公认的21世纪最严重的公共卫生问题之一。肥胖症相关障碍，诸如2型糖尿病、心血管疾病和癌症，已经成为对人类健康的全球性威胁。特别是在美国，超过三分之一的成年人口都是肥胖者，而且在未来几十年里，肥胖率将大幅上升。目前治疗肥胖症的方法包括通过饮食计划限制热量摄入，通过体育锻炼、药物治疗以及减肥手术和抽脂来促进能量消耗。然而，大多数治疗方法对人体器官诸如胃肠、肝和肾都会产生不良的副作用，而且手术风险很高。因此，迫切需要开发有效的治疗肥胖症的方法。本文公开的组合物和方法满足了这些及其他需求。
发明内容
本文公开的颗粒包含：脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂。在一个方面，该脂肪组织褐变剂可包含罗格列酮(Rosi)、CL 316243或其任意组合。
在一个方面，任何前述方面的颗粒可进一步包含pH-改变剂(诸如例如，降低pH值的试剂)、过氧化物代谢酶(诸如例如，过氧化氢酶)和/或pH-响应性基质。在一个方面，该pH-改变剂可包含葡萄糖响应性酶(诸如例如，葡萄糖氧化酶(GOx))。
本文还公开了任何前述方面的颗粒，其中，与生理pH相比，该pH响应性基质可在相对酸性pH下降解。在一个方面，该pH响应性基质可包含聚合物，诸如右旋糖酐单体聚合物(例如间葡聚糖单体聚合物)。
在一个方面，本文所公开的是任何前述方面的颗粒，进一步包含包封该pH响应性基质的包封材料(诸如例如，表面活性剂或其他聚合物)。在一个方面，该包封材料可包含海藻酸钠、多糖(例如壳聚糖)和/或包含聚乙烯吡咯烷的聚合物。
在一个方面，本文公开了用于穿过受试者生物屏障的材料运输装置，该装置包含任何前述方面的纳米粒。在一个方面，本文公开了用于穿过受试者生物屏障的材料运输装置，该装置包含多个微针，该多个微针各自具有基部端和尖端；基底，该微针的基部端附接或整合至该基底；以及包含脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的多个颗粒。
本文还公开了任何前述方面的装置，其中多个颗粒附接至多个微针。
在一个方面，本文公开了任何前述方面的装置，其中该多个微针包含生物相容性聚合物(诸如例如，甲基丙烯酸酯化的透明质酸(m-HA))。在一个方面，可交联生物相容性聚合物。本文还公开了任何前述方面的装置，其中多个微针具有约200μm至约800μm的中心到中心间隔和/或其中多个微针具有约600μm至1.8m的高度。
在本文公开的一个方面，是局部递送脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂(fatmodulating agent)(本文也称为脂肪调节剂(fat modulator))的方法，其包含提供一种用于穿过受试者生物屏障的材料运输装置，该装置包含：多个微针，该多个微针各自具有基部端和尖端；基底，该微针的基部端附接或整合至该基底；以及包含脂肪组织褐变和/或脂肪调节剂的多个颗粒；以及向需要脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的受试者施用该装置。在一个方面，将该褐变剂递送至白色脂肪组织可将真皮下白色脂肪组织的至少一部分转化为褐色脂肪组织。在一个方面，该脂肪调节剂的递送可以诱导细胞凋亡、脂质摄取、脂类分解或杀死脂肪细胞。
在一个方面，本文公开了局部递送任何前述方面的脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的方法，其中该装置施用到受试者身体的位置，该位置包含真皮下白色脂肪组织。还公开了局部递送任何前述方面的脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的方法和/或脂肪调节剂，其中施用步骤b)包含将多个微针插入生物屏障。
在一个方面，本文公开了局部递送任何前述方面的脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的方法，其中该多个颗粒进一步包含pH改变剂和pH-响应性基质。在一个方面，该pH改变剂可降低纳米粒内的pH，其中pH的降低降解该pH-响应性基质并释放脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂。在一个方面，本文公开了局部递送任何前述方面的脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的方法，其中该装置在高血糖条件下释放脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂。
本文还公开了治疗有此需要的受试者的疾病(诸如例如，肥胖症或糖尿病)的方法，包含提供一种用于穿过受试者生物屏障的材料运输装置，包含：多个微针，该多个微针各自具有基部端和尖端；基底，该微针的基部端附接或整合至该基底；以及包含脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的多个颗粒；以及向需要治疗疾病的受试者施用该装置。在一个方面，治疗疾病(诸如例如，肥胖症或糖尿病)的方法可以减少受试者的真皮下白色脂肪组织。
在本文公开的一个方面，是治疗任何前述方面的疾病的方法，其中施用步骤b)包含将多个微针插入生物屏障。本文还公开了任何前述方面的治疗方法，其中该多个颗粒进一步包含pH改变剂和pH-响应性基质。在一个方面，该pH改变剂降低纳米粒内的pH，其中pH的降低降解该pH-响应性基质并释放脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂。
本文还公开了治疗任何前述方面的疾病的方法，其中施用步骤b)调节(例如，增加)一个或多个褐色脂肪细胞基因(诸如例如，Ucp1、Dio2、Elovl3、Cidea、Pgc-1α、Cox7al或Cox8b)、脂联素和/或PPARγ靶点aP2的表达。
在一个方面，本文公开了任何前述方面的治疗方法，其中该方法降低一个或多个白色脂肪细胞基因的表达。本文还公开了任何前述方面的治疗方法，其中该方法增加受试者的能量消耗和脂肪酸氧化，增加胰岛素敏感性和/或避免显著的皮肤损伤。
附图说明
包含在本说明书中并构成其一部分的附图示出了下文所述的几个方面。
图1显示了描绘褐变剂加载经皮MN贴片的示意图。用pH敏感的缩醛改性右旋糖酐制备了包封罗格列酮(Rosi)、葡萄糖氧化酶(Gox)和过氧化氢酶(CAT)的纳米粒(NP)，并用海藻酸钠包被。将NP进一步加载至由交联透明质酸(HA)基质制成的微针阵列贴片，用于白色脂肪的褐色重塑。
图2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2I、2J、2K和2L显示了一组描绘褐变剂微针的制造和表征的图表和显微照片。图2A显示了由DLS确定的Rosi NP的平均水动力尺寸。图2B显示了在含有100mg/dL葡萄糖的PBS缓冲液中，含或不含GOx的右旋糖酐NP的相关pH变化。(N＝3)图2C显示了在37℃下，在含有100mg/dL葡萄糖的PBS缓冲液中，酸降解右旋糖酐NP(具有或不具有Gox)的体外累积Rosi释放。(n＝3)(2d)NP悬浮液的UV吸收率A400nm。(n＝3)(2e)第0天和第4天，在37℃下，用100mg/dL葡萄糖在PBS缓冲液中培养的Rosi NP的SEM图像(比例尺：2μm)，插入图片显示NP悬浮液的透明度变化。图2F显示了由aP2和围脂滴蛋白基因表达评估的经Rosi NP化合物处理的PgKO-MEF和经Rosi化合物处理的PgKO-MEF之间的可比脂肪生成。(n＝4)。图2G显示了成熟3T3-L1白色脂肪细胞中由Rosi NP或Rosi化合物诱导的相同程度的褐变。(n＝4)。(2i)MN阵列的SEM图像(比例尺：200μm)。图2J显示了MN尖端SEM成像的高倍放大率，证实了MN被加载了NP(比例尺：10μm)。图2K显示了施用后3天MN的SEM图像。图2L显示了用MN贴片施用的小鼠皮肤的台盼蓝染色图像(比例尺：1mm)。误差条表示标准差(SD)，双尾学生氏t检验，*P<0.05，**P<0.01。
图3A和3B显示了一组显微照片和条形图，描绘了瘦型小鼠体内MN贴片诱导的褐变。图3A显示了用HA空MN贴片(左)、加载Rosi NP的MN贴片(中)和加载CL 316243 NP的MN贴片(右)处理的小鼠腹股沟脂肪组织的苏木精和伊红(H&E)染色切片(比例尺：25μm)。图3B显示了Q-PCR分析腹股沟WAT中的基因表达，该WAT是用加载HA空载体(EV)、Rosi或CL 316243(Cl)的MN贴片处理的。加载NP的MN贴片。误差条表示平均数(SEM)的标准误差，双尾学生氏t检验，与EV(n＝6)相比，*P<0.05，**P<0.01。
图4A、4B、4C、4D、4E、4F和4G显示了一组条形图和折线图，描绘了用HA空MN贴片(EV)、加载Rosi NP的MN贴片(Rosi)或加载CL316243的MN贴片(CL)处理的健康小鼠的间接量热分析。图4A显示了6天治疗后的体重变化。图4B显示了正常的腹股沟脂肪垫大小。图4C显示了正常的附睾脂肪垫大小。图4D显示了治疗期间的平均食物摄入量。图4E显示了一个24-h暗/光周期内的自主活动。右边的面板是曲线下面积(AUC)。图4F显示了耗氧量和AUC。图4G显示了一个暗/光周期内的呼吸交换比(RER)和AUC。误差条表示SEM，双尾学生氏t检验，与EV(n＝6)相比，*P<0.05，**P<0.01。
图5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I和5J显示了一组照片、折线图、显微照片和条形图，描绘了在HFD-诱导的肥胖小鼠模型中MN贴片的体内抗肥胖症和抗糖尿病作用。图5A显示了一张图片，说明在腹股沟一侧(红色)使用褐变剂贴片和在另一侧(蓝色)使用空载体贴片处理的小鼠。图5B显示了未经治疗或经褐变剂贴片治疗的小鼠的正常体重。图5C显示了治疗2周后小鼠的IPGTT试验。图5D显示了禁食16小时后经褐变剂贴片或空白贴片处理的小鼠血糖水平。图5E显示了经不同治疗的小鼠的正常附睾脂肪垫大小。图5F显示了经不同治疗的小鼠的肩胛间脂肪垫大小的正常重量。图5G显示了治疗后腹股沟脂肪垫大小与未治疗侧的比率。图5H显示了治疗4周后肥胖小鼠腹股沟脂肪组织两侧的照片。图5I显示了腹股沟脂肪组织的H&E染色(比例尺：50μm)。图5J显示了腹股沟组织脂肪细胞基因表达的Q-PCR分析。b-g，误差条表示SD，双尾学生氏t检验，与EV(n＝5)相比，*P<0.05，**P<0.01；j，误差条表示SEM，双尾学生氏t检验，与EV(n＝5)相比，*P<0.05，**P<0.01。
图6显示了描绘间葡聚糖的合成和解离路线的示意图。
图7显示了描绘一个加载NP的MN的机械行为的图表。
图8显示了经微针贴片治疗异硫氰酸荧光素(FITC)包封的NP后腹股沟脂肪组织切片的荧光显微镜图像(比例尺：200μm)。
图9显示了在不同时间点用Cy5.5-标记的加载NP的MN治疗的小鼠的体内荧光图像。将Cy5.5-标记的不含葡萄糖特异性酶(Gox)的非可降解NP加载至交联HA-MN中。
图10显示了在不同时间点用MN治疗的小鼠的体内荧光图像。荧光信号显示加载游离Cy5.5的MN贴片(上板)或包埋Cy5.5的NP(下板)。
图11显示了在治疗一个月后，与周围组织一起施用了空MN、加载Rosi NP的MN和加载CL 316243 NP的MN(从左到右)的H&E-染色的皮肤切片的显微照片(比例尺：100μm)。
具体实施方式
本文公开了一种新的控释纳米粒组合物，其在施用部位局部提供生理上相关的治疗、预防水平。
现将更详细地参考本发明的实施例，在附图和实例中说明所述优选实施例的实例。然而，本公开可以多种不同的形式体现，并且不应将本发明理解为受限于本文所述的实施例。
术语
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科技术语都与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。提供以下定义是为了充分理解本说明书中使用的术语。
如本说明书和权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。例如，术语“药剂”包括多种药剂，其中包括它们的混合物。
如本文所用，术语“可”、“任选地”和“可任选地”可互换使用，并且意指包括发生疾病的情况以及不发生疾病的情况。因此，例如，制剂“可包含赋形剂”的陈述意在包括其中制剂包含赋形剂的情况以及制剂不包含赋形剂的情况。
如本领域的普通技术人员所理解的，术语“约”和“大约”被定义为“接近”。在一个非限制性实施例中，术语被定义为在所提供的相关值的10％以内。在另一个非限制性实施例中，术语被定义为在5％以内。在另一个非限制性实施例中，术语被定义为在1％以内。
向受试者“给药/施用”包括向受试者引入或递送药剂的任何途径。可通过任何合适的途径进行给药/施用，包括口服、局部、静脉、皮下、经皮、穿皮、肌肉内、关节内、肠外、小动脉内、皮内、脑室内、颅内、腹腔内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入、通过植入的存贮器、肠外(例如，皮下、静脉、肌肉、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、腹腔内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术)等。如本文所用，“并行给药/施用”、“联合给药/施用”、“同时给药/施用(“simultaneous administration”或“administered simultaneously”)”意指化合物在同一时间点给药/施用或基本上紧接着给药/施用。在后一种情况下，该两种化合物的给药/施用时间足够接近，以至于观察到的结果与在同一时间点给予化合物时获得的结果不可区分。“全身给药/施用”是指通过将药剂引入或递送到受试者身体的广泛区域(例如，超过身体的50％)的途径，例如通过进入循环或淋巴系统，将药剂引入或递送给受试者。相比之下，“局部给药/施用”是指通过一条途径向受试者引入或递送药剂，该途径将该药剂引入或递送到紧邻给药点的一个或多个区域，并且在治疗上不系统地大量引入该药剂。例如，局部给药/施用的药剂在给药点/施用点的局部附近很容易被检测到，但在受试者身体的远侧部分不可检测到或检测到的量可以忽略不计。给药/施用包括自我给药/施用和他人给药/施用。
“生物相容性”通常是指材料及其任何代谢物或降解产物通常对受试者无毒并且不对受试者造成显著的副作用。
“包含”意指组合物、方法等包括所提到的元素，但不排除其他元素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...组成”应指包括所提到的元素，但不包括对组合具有任何重要意义的其他元素。因此，基本上由本文所定义的元素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载体，诸如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。“由...组成”应指排除多于其他成分的痕量元素和用于给予本发明的组合物的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每个所定义的实施例都在本发明的范围内。
如本文所用，“调节”是指在基因表达量、蛋白质表达、症状数量、疾病、组合物、病症或活动方面实现变化(增加或减少)。
“增加”可以指导致较大的基因表达、蛋白质表达、症状数量、疾病、组合物、病症或活动的任何变化。减少可以是统计学上显著的量的病症、症状、活动、组合物中的任何个体、中位数或平均增加。因此，只要增加非常显著，增加可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。
“减少”可以指导致较小的基因表达、蛋白质表达、症状数量、疾病、组合物、病症或活动的任何变化。当含有该物质的基因产物的遗传产量与不含该物质的基因产物的遗传产量相比较小时，物质也被理解为减少基因的遗传产量。此外，举例来说，减少可以是一种障碍症状的改变，使得症状比以前观察到的要少。减少可以是统计学上显著的量的病症、症状、活动、组合物中的任何个体、中位数或平均减少。因此，只要减少非常显著，减少可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。
“对照”是在实验中用于比较目的的替代受试者或样本。对照可为“阳性对照”或“阴性对照”。
“控释”或“缓释”是指为了在体内达到所需的药代动力学曲线，以可控的方式从给定剂型释放药剂。“控释”药剂递送的一个方面是操纵制剂和/或剂型以建立所需的药剂释放动力学的能力。
药剂的“有效量”是指药剂提供所需的效果的足够数量。“有效的”药剂的量将在不同受试者之间变化，取决于受试者的年龄和一般情况、特定的一种或多种药剂等许多因素。因此，并不总是能够指定量化的“有效量”。然而，任何受试者病例中的适当的“有效量”可由本领域的普通技术人员使用常规实验方法确定。此外，如本文所用，并且除非另外特别说明，否则药剂的“有效量”也可以指涵盖治疗有效量和预防有效量的量。实现治疗效应所需的药剂的“有效量”可根据诸如受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。可调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可每天给予若干分开的剂量，或者可按照治疗情况的紧急程度按比例减少剂量。
“肽”、“蛋白质”和“多肽”可互换使用地指代包含这样的两个或更多个氨基酸的天然或合成分子，所述两个或更多个氨基酸通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的α氨基连接。
“药学上可接受的”组分可指并非生物学上或以其他方式不可取的组分，即该组分可掺入本发明的药物制剂中并给予如本文所述的受试者，而不引起显著的不良生物效应或以有害的方式与包含该组分的制剂的任何其他组分相互作用。当用于提及对人体的给药/施用时，该术语通常意味着该组分已达到毒理学和制造试验的要求标准，或者它包括在美国食品药品监督管理局所制定的非活性成分指南中。
“药学上可接受的载体”(有时称为“载体”)意指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括兽医和/或人类药用或治疗用的药物可接受的载体。术语“载体”或“药学上可接受的载体”可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水或水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用，术语“载体”包括但不限于任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、脂质或本领域中熟知的用于药物制剂的其他材料，并且如本文中进一步描述。
“药理活性”(或仅“活性”)，正如在“药理活性”衍生物或类似物中所用的那样，可指具有与母体化合物相同类型的药理活性并且程度大致相等的衍生物或类似物(例如，盐、酯、酰胺、缀合物、代谢物、异构体、片段等)。
“引物”或“DNA引物”是一种通常具有游离的3'-0H基团的短多核苷酸，该短多核苷酸通过与感兴趣的样本中可能存在的靶点或“模板”杂交而与所述靶点结合，然后促进与该靶点互补的多核苷酸的聚合。“聚合酶链式反应(PCR)”是这样的反应，在所述反应中使用由“上游”引物和“下游”引物组成的“一对引物”或“一组引物”以及聚合催化剂(诸如DNA聚合酶，通常是热稳定的聚合酶)制备靶多核苷酸的复制拷贝。用于PCR的方法是本领域中众所周知的，并且例如在“PCR:A PRACTICAL APPROACH”(M.MacPherson等人,IRL Press atOxford University Press(1991))中教导的。产生多核苷酸的复制拷贝的所有过程，诸如PCR或基因克隆，在本文中统称为“复制”。引物也可以用作杂交反应(诸如Southern或Northern印迹分析)中的探针。Sambrook等人，出处同上。
“聚合物”是指相对高分子量的天然或合成有机化合物，其结构可由重复的小单元、单体表示。聚合物的非限制性实例包括聚乙烯、橡胶、纤维素。合成聚合物通常由单体的加成或缩聚形成。术语“共聚物”是指由两种或更多种不同的重复单元(单体残基)形成的聚合物。以举例的方式并且非限制性地，共聚物可为交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。还可设想，在某些方面，嵌段共聚物的各种嵌段链段本身可包含共聚物。术语“聚合物”包括所有形式的聚合物，包括但不限于天然聚合物、合成聚合物、均聚物、杂聚物或共聚物、加成聚合物等。
“治疗剂”是指任何具有有益生物效应的组合物。有益的生物效应包括治疗效应和预防效应两者，其中治疗效应为例如治疗疾病或其他不希望的生理症状，预防效应为例如预防疾病或其他不希望的生理症状(例如，1型糖尿病)。该术语还涵盖本文中具体提及的有益剂在药学上可接受的药理活性衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前体药剂、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“治疗剂”时，或者当明确标识特定的药剂时，应当理解，该术语包括药剂本身以及在药学上可接受的药理活性盐、酯、酰胺、前体药剂、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。
组合物(例如，包含药剂的组合物)的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指有效地达到所需的治疗结果的量。在一些实施例中，所需的治疗结果是控制I型糖尿病。在一些实施例中，所需的治疗结果是控制肥胖。给定治疗剂的治疗有效量通常将根据诸如所治疗的障碍或疾病的类型和严重程度以及受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。术语还可指有效促进所需的治疗效应(如疼痛缓解)的治疗剂的量或治疗剂的递送速率(例如，随时间推移的量)。精确所需的治疗效应将根据待治疗的病症、受试者的耐受性、待给予的药剂和/或药剂制剂(例如，治疗剂的效力、制剂中的药剂浓度等)，以及本领域中的普通技术人员所理解的各种其他因素而变化。在一些情况下，在向受试者连续几天、几周或几年给予多种剂量的该组合物后，可获得所需的生物或医学反应。
范围可在本文中被表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表达此类范围时，另一个实施例包括从一个特定值和/或至另一个特定值。相似地，在利用前词“约”将值表示为近似值时，应当理解，该特定值形成另一个实施例。还应当理解，每个范围的端点在相对于另一个端点和独立于另一个端点方面都是显著的。还应当理解，本文公开了许多值，并且每个值在本文中除值本身之外还被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。
本文所引用的出版物据此全文或至少引用的所述出版物所针对的材料以引用方式并入。
最近的研究揭示了褐色脂肪组织(BAT)(一种主要的发热器官)在哺乳动物能量消耗中的重要作用。白色脂肪组织(WAT)以甘油三酯的形式储存超出的能量，导致超重；而BAT则通过非颤抖性产热来散热，这可能有助于抑制肥胖症。将WAT转化为BAT为治疗肥胖症及相关代谢紊乱提供了另一种途径。调控脂肪细胞发育的多种基因和途径已经被证实。然而，由于广泛的靶向性，许多能促进WAT“褐变”的褐变剂(例如，噻唑烷二酮类，诸如例如，罗格列酮和/或吡格列酮)在临床应用中面临挑战，因为它们对其他器官产生了不良的副作用。本文公开的组合物实现了这一目标。因此，在本文公开的一个方面，是减少脂肪组织调节剂和/或褐变剂的副作用的方法，该脂肪组织调节剂和/或褐变剂包括但不限于噻唑烷二酮类(诸如例如，罗格列酮和/或吡格列酮)、西布曲明、氯卡色林、和/或奥利司他或本文所公开的任何其他脂肪组织调节剂或褐变剂，该方法包含提供一种用于穿过受试者生物屏障的材料运输装置，其包含：多个微针，该多个微针各自具有基部端和尖端；基底，该微针的基部端附接或整合至该基底；以及包含脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的多个颗粒。
在一个方面，本文公开了包含脂肪组织褐变剂的颗粒。如本文所用，褐变剂是指诱导WAT转化为BAT的试剂。脂肪组织褐变剂的实例包括但不限于β-肾上腺素能激动剂、瘦素、TLQP-21、脑源性神经营养因子、前列腺素、心脏利钠肽、PPARy配体、PPARa配体、维甲酸、甲状腺激素、AMPK活化剂、虹膜素、成纤维细胞生长因子21和骨形态发生蛋白(M.L.Bonet等人,Biochimica et Biophysica Acta 1831,969-985(2013))。优选的褐变剂包括PPARy活化剂(例如，罗格列酮，(RS)-5-[4-(2-[甲基(吡啶-2-基)氨基]乙氧基)苄基]噻唑烷-2,4-二酮、吡格列酮、(RS)-5-(4-[2-(5-乙基吡啶-2-基)乙氧基]苄基)噻唑烷-2,4-二酮、曲格列酮、(RS)-5-(4-[(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-基)甲氧基]苄基)噻唑烷-2,4-二酮等)、前列腺素E2类似物(PGE2、(5Z,1la,13E,15S)-7-[3-羟基-2-(3-羟基辛-l-烯基)-5-氧代环戊基]庚-5-烯酸等)、β3肾上腺素受体激动剂(CL 316243、5-[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-氯苯基)-2-羟乙基]氨基]丙基]-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-2,2-二羧酸水合物二钠等)、成纤维细胞生长因子21(FGF-21)、和/或虹膜素。
在一个方面，本文公开了包含脂肪调节剂的微粒。如本文所用，脂肪调节剂(fatmodulating agent)(也称为脂肪调节剂(fat modulator)或脂肪组织调节剂)可包含任何可诱导脂质摄取、脂类分解和/或细胞凋亡以简单地局部杀死脂肪细胞的化学物质、RNA、DNA、蛋白质。脂质调节剂的实例包括但不限于
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奥利司他、西布曲明、二乙胺苯丙酮、芬他命、氯卡色林、纳曲酮、利拉鲁肽、烟酸受体激动剂(包括但不限于烟酸、阿昔莫司、阿昔呋喃、(D)-羟基丁酸、1-烷基-苯并三唑-5-羧酸和黄嘌呤衍生物)、激素敏感脂肪酶抑制剂(诸如例如，-苯基-5-烷氧基-1,3,4-恶二唑-2-酮和5-(2H)-异恶唑基)脲)、
-肾上腺素能受体(诸如例如，雷法贝隆(AJ-9677)和L-796568)、A1受体激动剂、磷脂酰胆碱和脱氧胆酸衍生物、匹伐他汀、苯扎贝特、吉非贝齐、皮质类固醇(诸如例如，地塞米松)、环AMP(cAMP)活化剂(诸如例如，异丁基甲基黄嘌呤)和他汀类。
在一个方面，该颗粒可进一步包含pH-改变剂(诸如例如，降低pH的试剂)、过氧化物代谢酶(诸如例如，过氧化氢酶)和/或pH-响应性基质。在一个方面，该pH-改变剂可包含葡萄糖响应性酶(诸如例如，葡萄糖氧化酶(GOx))。
应理解并在此设想，颗粒可具有预期用途所需的任何尺寸。例如，颗粒的直径可以在10nm到1000nm之间。该颗粒的直径可以在10nm到900nm之间、10nm到800nm之间、10nm到700nm之间、10nm到600nm之间、10nm到500nm之间、20nm到500nm之间、30nm到500nm之间、40nm到500nm之间、50nm到500nm之间、50nm到400nm之间、100nm到400nm之间、150nm到400nm之间、或175nm到400nm之间。在优选实施例中，该颗粒的直径可小于约200nm至约300nm，更优选约225至约275。例如，在一个方面，该颗粒的直径可以小于275nm，诸如约250nm。
本文还公开了包含脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的颗粒，其中与生理pH(大约在7.35-7.45之间)相比，胶束在相对酸性pH下可降解。例如，可以将该pH降低为7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、或4.0。在一个方面，该pH响应性基质可包含聚合物，诸如右旋糖酐单体聚合物(例如间葡聚糖单体聚合物)。
在一个方面，本文所公开的是颗粒，进一步包含包封该pH响应性基质的包封材料(诸如例如，表面活性剂或其他聚合物)。在一个方面，该包封材料可包含海藻酸钠、多糖(例如壳聚糖)和/或包含聚乙烯吡咯烷的聚合物。在一个方面，本文公开了用于穿过受试者生物屏障的材料运输装置，该装置包含本文所公开的纳米粒。
因此，在一个方面，本文公开了用于穿过受试者生物屏障的材料运输装置，该装置包含多个微针，该多个微针各自具有基部端和尖端；基底，该微针的基部端附接或整合至该基底；以及包含脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的多个颗粒。
应理解并在此设想，该脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂、pH-改变剂(诸如例如，降低pH的试剂)、过氧化物代谢酶(诸如例如，过氧化氢酶)、表面活性剂，和/或所公开颗粒的pH-响应性基质可单独或组合地提供对与该颗粒接触的受试者的组织有毒。因此，应理解并在此设想，随时间的控制释放和向施用附近(即非全身性)的有限释放可降低颗粒的毒性效应。因此，在一个方面，该多个颗粒附接至该多个微针。
应理解并在此设想，多个微针可以包含生物相容性聚合物(诸如例如，甲基丙烯酸酯化的透明质酸(m-HA))。在一个方面，可交联生物相容性聚合物。此类聚合物还可用于将脂肪褐变剂和/或脂肪调节剂缓慢释放到组织中。如本文所使用的，生物相容性聚合物包括但不限于多糖；亲水性多肽；聚(氨基酸)诸如聚-L-谷氨酸(PGS)、γ-聚谷氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚-L-丝氨酸或聚-L-赖氨酸；聚亚烷基二醇和聚环氧烷诸如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)和聚(环氧乙烷)(PEO)；聚(氧乙烯化多元醇)；聚(烯烃醇)；聚乙烯吡咯烷酮；聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)；聚(羟烷基甲基丙烯酸)；聚(糖)；聚(羟基酸)；聚(乙烯醇)、多羟基酸诸如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)和聚(乳酸-乙醇酸)；聚羟基脂肪酸酯诸如聚3-羟基丁酸或聚4-羟基丁酸；聚己内酯；聚(正酯)；聚酸酐；聚(磷腈)；聚(丙交酯-己内酯)；聚碳酸酯诸如酪氨酸聚碳酸酯；聚酰胺(包括合成和天然聚酰胺)、多肽和聚(氨基酸)；聚酯酰胺；聚酯；聚(二氧环己酮)；聚(烷基烯)；疏水性聚醚；聚氨酯；聚醚酯；聚缩醛；聚氰基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；聚甲基丙烯酸甲酯；聚硅氧烷；聚(氧乙烯)/聚(氧丙烯)共聚物；聚缩酮；聚磷酸盐；聚羟基戊酸盐；聚亚烷基草酸酯；聚亚烷基琥珀酸盐；聚(马来酸)及其共聚物。生物相容性聚合物还可包括聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚亚烷基二醇、聚亚烷基氧化物、聚烷基对苯二甲酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯基酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、三醋酸纤维素、硫酸纤维素钠盐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯基酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(乙烯醇)、聚(醋酸乙烯酯、聚氯乙烯聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物、线性和支链共聚物及其嵌段共聚物，以及其共混物。示例性可生物降解聚合物包括聚酯、聚(邻位酯)、聚(乙烯胺)、聚(己内酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚(羟基戊酸酯)、聚酸酐、聚(丙烯酸)、聚乙二醇、聚(氨基甲酸乙酯)、聚碳酸酯、聚磷酸酯、聚磷腈及其衍生物、线性和支链共聚物及其嵌段共聚物，以及其共混物。
在一些实施例中，该颗粒包含生物相容性和/或可生物降解聚酯或聚酸酐，诸如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)和聚(乳酸-乙醇酸)。该颗粒可包含以下聚酯中的一种或多种：包括乙醇酸单元(本文称为“PGA”)的均聚物和乳酸单元(诸如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D,L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯、和聚-D,L-丙交酯5，本文统称为“PLA”)和己内酯单元(诸如聚(己内酯)，在本文中统称为“PCL”)；和包括乳酸和乙醇酸单元的共聚物(诸如以乳酸与乙醇酸之比为特征的各种形式的聚(乳酸-乙醇酸)和聚(丙交酯-乙交酯)，在本文中统称为“PLGA”)；和聚丙烯酸酯，以及其衍生物。示例性聚合物还包括聚乙二醇(PEG)和上述聚酯的共聚物，诸如各种形式的PLGA-PEG或PLA-PEG共聚物，在此统称为“PEG化聚合物”。在某些实施例中，该PEG区域可与聚合物共价缔合以通过可裂解的接头产生“PEG化聚合物”。在一个方面中，该聚合物包含至少60、65、70、75、80、85、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的缩醛侧基。
在一个方面中，所公开的装置可包括多个微针，其中该多个微针具有约200μm至约800μm的中心到中心间隔，例如约200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775或800m的中心到中心间隔。
还应理解并在此设想，当针的长度足够长以到达皮肤层下面的所需组织时，所公开装置中所公开的多个微针是有效的。因此，在一个方面中，本文公开了其中多个微针具有约600nm到1.8m的高度的设备。例如，该多个微针可以具有约600、650、700、750、800、850、900、950nm、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8m的高度。
在本文公开的一个方面，是将药物(诸如，脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂)局部递送至脂肪组织的方法，包括提供一种用于穿过受试者生物屏障的材料运输装置，该装置包含：多个微针，该多个微针各自具有基部端和尖端；基底，该微针的基部端附接或整合至该基底；以及包含脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的多个颗粒；以及向需要脂肪组织褐变和/或脂肪调节剂的受试者施用该装置。在一个方面，将该褐变剂递送至白色脂肪组织可将真皮下白色脂肪组织的至少一部分转化为褐色脂肪组织。在另一方面中，该脂肪调节剂可诱导脂类分解、脂质摄取或细胞凋亡。
在一个方面，本文公开了将药物(诸如例如，脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂)局部递送至脂肪组织的方法，其中该装置施用到受试者身体的位置，该位置包含真皮下白色脂肪组织。还公开了局部递送脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的方法，其中施用步骤b)包含将多个微针插入生物屏障。
在一个方面，本文公开了将药物(诸如例如，脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂)局部递送到脂肪组织的方法，其中多个颗粒进一步包含pH改变剂和pH-响应性基质。在一个方面，该pH改变剂可降低纳米粒内的pH，其中pH的降低降解该pH-响应性基质并释放脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂。在一个方面，本文公开了局部递送脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的方法，其中该装置在高血糖条件下释放脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂。
本文还公开了治疗有此需要的受试者的疾病(诸如例如，肥胖症或糖尿病)的方法，包含提供一种用于穿过受试者生物屏障的材料运输装置，包含：多个微针，该多个微针各自具有基部端和尖端；基底，该微针的基部端附接或整合至该基底；以及包含脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的多个颗粒；以及向需要治疗疾病的受试者施用该装置。在一个方面，治疗疾病(诸如例如，肥胖症或糖尿病)的方法可以减少受试者的真皮下白色脂肪组织。
在一些实施例中，“肥胖症”是指体重指数(BMI)为30kg/m2或更高(国家卫生研究院，关于成年人超重和肥胖症的识别、评估和治疗的临床指南(1998))。然而，在本发明的一些实施例中，至少部分地还意在包括以25kg/m2或更大、26kg/m2或更大、27kg/m2或更大、28kg/m2或更大、29kg/m2或更大、29.5kg/m2或更大、或29.9kg/m2或更大的体重指数(BMI)为特征的疾病、障碍或病症，所有这些都通常被称为超重(国家健康研究所，关于成年人超重和肥胖症的识别、评估和治疗的临床指南(1998))。肥胖症可能是由任何原因引起的，无论是遗传的还是环境的。在一个实施例中，“肥胖症治疗”是指如果在肥胖症发病之前进行治疗，则防止肥胖症或肥胖症相关疾病的发生。此外，如果对已经患有或有肥胖症或肥胖症相关障碍症状的受试者开始治疗，则此类治疗有望预防或防止肥胖症或肥胖症相关疾病的进展。
术语“肥胖症相关疾病”包括所有与肥胖症相关或至少部分由肥胖症引起的障碍。肥胖症相关障碍包括，例如糖尿病；心血管疾病；高血压；深静脉血栓形成；骨关节炎；阻塞性睡眠呼吸暂停；癌症和非酒精性脂肪肝。
“I型糖尿病”是指由于自身免疫性破坏胰岛素产生细胞和降低身体产生胰岛素的能力而导致的糖尿病。胰岛素的缺失导致血糖升高。
如本文所用的“治疗(treat/treating/treatment)”及其语法变体包括以部分或完全预防、延迟、治愈、康复、缓和、减轻、改变、补救、改善、改良、稳定化、缓解和/或降低一种或多种疾病或病症、疾病或病症的症状、或疾病或病症的潜在病因的强度或频率为意图或目的而施用组合物。根据本发明所述的治疗可防范性、预防性、姑息性或补救性地应用。预防性治疗是在发病前(例如，在出现明显的癌症迹象之前)、在早期发作期间(例如，在癌症的初始体征和症状之后)或在癌症的确定发展之后向受试者施用。预防性给药/施用可在感染症状出现之前一天或数天至数年发生。
在本文公开的一个方面，是治疗本文公开的任何疾病(诸如例如，肥胖症或糖尿病)的方法，其中，施用步骤b)包括将多个微针插入生物屏障。本发明还公开了治疗本文公开的任何疾病(诸如例如，肥胖症或糖尿病)的方法，其中该多个颗粒还包含pH改变剂和pH-响应性基质。在一个方面，该pH改变剂降低纳米粒内的pH，其中pH的降低降解该pH-响应性基质并释放脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂。
本文还公开了治疗本文公开的任何疾病(诸如例如，肥胖症或糖尿病)的方法，其中，施用步骤b)调节(例如，增加)一个或多个褐色脂肪细胞基因(诸如例如，Ucp1、Dio2、Elovl3、Cidea、Pgc-1α、Cox7al或Cox8b)、脂联素和/或PPARγ靶点aP2的表达。
在一个方面，本文公开了治疗本文公开的任何疾病(诸如例如，肥胖症或糖尿病)的方法，其中该方法降低一个或多个白色脂肪细胞基因的表达。本文还公开了治疗本文公开的任何疾病(诸如例如，肥胖症或糖尿病)的方法，其中该方法增加受试者的能量消耗和脂肪酸氧化，增加胰岛素敏感性和/或避免显著的皮肤损伤。
实例
以下实例用于示出根据本发明所公开的主题的组合物、方法和结果。这些实例并非旨在包括本文所公开的主题的所有方面，而是示出代表性的方法和结果。这些实例并非旨在排除对本领域的技术人员显而易见的本发明的等同物和变型。
实例1.
本文公开了一种局部诱导褐变技术，其可包括由载药纳米粒(NP)和交联基质组成的可降解微针(MN)贴片(图1)。以罗格列酮(Rosi)或CL316243作为模型褐变剂加载在NP中。NP可以进一步整合至基于微针(MN)阵列的透皮装置中，用于将药物持续递送至皮下脂肪组织中。MN贴片提供了一种局部、方便、无痛的施用方法。在小鼠模型中，MN贴片以安全有效的方式局部递送褐变剂，以抑制脂肪细胞肥大，从而改善代谢。
结果和讨论
加载Rosi的NP的合成与表征。以酸敏感右旋糖酐衍生物为原料，采用双乳液法制备了可降解NP。通过酸催化反应与乙氧基丙烯缀合，合成了酸敏感右旋糖酐，使羟基89％取代的衍生右旋糖酐(间葡聚糖)成为侧链缩醛(图6)。Rosi是过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的激动剂，通过上调解偶联蛋白、VEGF和血管生成素样4刺激脂肪组织转化。Rosi被包封在右旋糖酐NP用于WAT褐变。引入葡萄糖氧化酶(Gox)和过氧化氢酶(CAT)两种酶在生理葡萄糖浓度下产生酸性环境。Gox能够将葡萄糖转化为葡萄糖酸以降低局部pH；而CAT则有助于消耗Gox-介导的酶促反应过程中产生的不需要的过氧化氢。扫描电子显微镜(SEM)显示，得到的NP呈球形，呈单分散分布(图2e)。根据动态光散射(DLS)测定，水动力颗粒大小约为250nm(图2a)。NP的负载能力为5.2重量％，包封效率约为55％。为了监测Rosi的释放动力学，NP在含有葡萄糖的PBS缓冲液中以正常血糖水平(100mg/dL)在人体内培养。然后，NP在酶诱导的酸性环境中逐渐解离，引发包封药物的释放(图2b)。含GOx的NP在3天内逐渐降解，如400nm处的UV吸收率降低所示(图2D)，然后释放嵌入的药物(图2c、图e)。相反，从不含GOx的NP中收集不重要的药物。
为了验证Rosi NP的有效性，采用体外脂肪细胞模型PgKO-PPARγ1，其中Pparg-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中PPARγ(γ1)的较短形式的重建仅在外源性噻唑烷二酮类配体(例如Rosi)存在下才能挽救脂肪细胞分化。如脂滴结合蛋白基因aP2和围脂滴蛋白诱导脂肪细胞形成一样，Rosi NP诱导脂肪细胞形成的效率与裸Rosi相同(图2F)，两者都是典型的PPARγ靶基因。除成脂潜能外，还比较了Rosi NP的褐变能力。在完全分化的3T3-L1脂肪细胞中，Rosi NP表现出与裸Rosi相同的行为，上调褐色脂肪细胞标志物Elovl3和Cidea，并抑制白色脂肪细胞基因Resistin和Adipsin(图2g)。因此，所公开的纳米粒化策略可以在葡萄糖生理水平下维持Rosi的恒定释放而不影响其效率。
褐变剂MN-阵列贴片的制备与表征。将NP嵌入聚合物MN-阵列贴片中，用于褐变剂的局部递送。简单地说，NP首先通过离心加载至硅酮MN-模具的尖端区域，然后添加碱溶液。考虑到其良好的生物相容性和力学性能，选择了甲基丙烯酸酯化的HA(m-HA)为基料。将m-HA碱溶液与交联剂N,N’-亚甲基双(丙烯酰胺)(MBA)混合，在UV光(365nm，9mW/cm2，30s)照射下通过聚合反应进一步交联光引发剂。交联的基于HA基质可以增强MN的刚度(图7)以有效渗透皮肤，并促进药物从MN尖端的持续释放，这有助于维持脂肪组织中的局部高药物浓度。MN阵列在7×7mm2的贴片上含有121根针，中心到中心间隔为600μm。每个MN都有一个锥形，其中MN的基部直径约为300μm，高度约为800μm(图2i)。放大的SEM图像显示了NP在尖端的分布(图2j)。
MN对瘦型小鼠的体内研究。在小鼠模型上考察了该体系的体内褐变效果。除Rosi外，将第二种化合物CL 316243(β3-肾上腺素能受体激动剂)用于右旋糖酐NP并加载在MN中。CL 316243是一种有效的产热活化剂，但其作用机理与Rosi不同。CL 316243刺激G蛋白Gαs激活腺苷酸环化酶，从而引起环磷酸腺苷(cAMP)的积累，从而导致产热和脂类分解。通过加入这种独特的褐变剂，比较了NP系统与其他药物的适用性。具体地说，宽型C57BJ/6小鼠被随机分为三组(n＝6)，分别用仅由交联m-HA制成的空载体(EV)、包封Rosi NP的HA-MN(10mg/kg体重(bw))和腹股沟WAT加载CL 316243 NP的MN(1mg/kg bw)(CL)进行治疗。MN有效地穿透小鼠腹股沟部位的皮肤，如经Mn-治疗的组织的台盼蓝染色所示(图2l)。如荧光显微镜所示，向皮肤中渗透的MN将MN尖端暴露在腹股沟脂肪组织中，并成功地将模型药物递送至脂肪细胞(图8)。不含GOx加载的MN的Cy5.5-标记的不可降解NP的活体荧光成像证实NP在整个治疗期间在治疗皮肤区域受到良好的限制(图9)。MN的SEM显示用药后尖端塌陷，进一步显示药物完全释放(图2k)。体内荧光成像也证实了3天内的体内缓释作用。与加载游离Cy5.5的MN贴片的快速释放相比，加载可降解NP的贴片显示出良好的缓释能力(图10)。小鼠每三天用MN贴片治疗一次。治疗六天后，处死小鼠，收集腹股沟脂肪组织进行组织学和基因分析。腹股沟WAT的苏木精-伊红(H&E)染色显示，Rosi MN和CL 316243 MN治疗组，尤其是后者，单腔白色脂肪细胞萎缩，出现淡黄色脂肪细胞，这是典型的米黄色脂肪细胞形态(图3a)。基因表达分析进一步显示，通过MN递送褐变剂，腹股沟WAT发生褐变转化(图3b)。两组与线粒体活性和脂质利用有关的具有代表性的褐色脂肪细胞基因Ucp1、Dio2、Elovl3、Cidea、Pgc-1、Cox7a1、Cox8b均上调，而炎症基因IL-6下调。有趣的是，pan-脂肪细胞标志物脂联素没有受到影响，显示出对褐变的选择性调节。值得注意的是，典型的PPARγ靶点aP2被Rosi MN上调，而不是被CL 316243 MN上调，显示出它们不同的褐变机制。
在确定了MN法体内诱导褐变的可行性后，对Rosi MN和CL 316243 MN的褐变效应进行了持久性和生理学意义的测试。为此，将Rosi Mn-或CL 316243 Mn-治疗的小鼠与载体MN-治疗的对照小鼠暴露于间接量热分析中，以测量其全身代谢反应。三组小鼠在实验过程中均因单室应激而减轻体重，而CL 316243 MN组则倾向于减轻更多的体重(图4a)。CL316243 MN组体重减少的原因是脂肪质量减少，特别是内脏附睾WAT(eWAT)(图4b、图c)。能量平衡的变化仅仅是由能量消耗引起的，因为Rosi MN和CL 316243都不会影响热量的摄入(图4d)。值得注意的是，两种治疗都增加了耗氧量(图4E)作为诱导褐变的结果(图3)。与CL316243 MN不同的是，当小鼠更活跃时，Rosi MN降低了黑暗周期中的自主活动(图4f)，符合两种药物不同的褐变机制。此外，Rosi和CL 316243都降低了呼吸交换比(RER)(图4g)，如释放的Co2/消耗的O2所示，表明褐变后脂肪酸的利用偏好，因为与脂肪酸相比，碳水化合物完全氧化只需要75％的氧气(3:4比率)。总的来说，量热研究表明，Rosi或CL 316243褐变剂的MN递送是诱导褐变和改善代谢的有效途径。
MN对饮食诱导肥胖小鼠的体内研究。MN褐变剂贴片的生理效果显著，令人鼓舞。因此，我们评估了MN对肥胖小鼠的治疗潜力。在高脂饮食(HFD)诱导的肥胖症C57BL/6小鼠中，在一侧腹股沟区(Rosi或Cl)使用MN褐变剂贴片，在另一侧使用空HA MN作为载体对照(EV-R和EV-C)(图5a)。对对照小鼠，双侧用空HA MN(EV)治疗。Rosi是一种有效的胰岛素增敏剂，但也会导致体重增加。令人惊讶的是，Rosi的MN递送也阻止了类似于CL 316243 MN的体重增加，从而在四周治疗结束时产生约15％的抑制作用(图5b)。在腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)中，给小鼠注射葡萄糖后，Rosi-MN和CL 316243 MN均能有效地改进葡萄糖清除率(图5c)，将对照组小鼠的空腹血糖水平(糖尿病的诊断指标)从140mg/dL降至约110mg/dL(图5d)，表明胰岛素敏感性提高。有趣的是，这种胰岛素敏感性的改善是由褐变引起的，而不是由Rosi本身的胰岛素增敏功能引起的，因为CL 316243也显示了同样的作用。由于如图4所示的褐变和脂肪利用率的增加，观察到eWAT减少约30％(图5e)但不是在经典的肩胛间BAT中(图5f)。更重要的是，MN递送褐变剂可局部减少腹股沟脂肪垫。与未治疗侧(EV-R或EV-C)相比，Rosi MN或CL 316243 MN治疗侧的尺寸减小(图5g、图h)。H&E染色切片显示仅在使用含药物贴片的小鼠腹股沟WAT中的脂肪细胞较小，但在使用空白对照贴片的另一个部位没有观察到明显的褐变(图5i)。褐色脂肪细胞基因在治疗侧更易被诱导，尤其是通过Rosi Mn(图5j)，表现出MN贴片的限制性褐变效应。脂联素基因在Rosi MN和CL 316243 MN治疗部位均上调(图5j)，显示脂肪健康状况改善。PPARγ下游靶点aP2仅由MN Rosi诱导(图5j)，进一步显示MN贴片的局部效应。施用一个月后，在Mn-治疗区域周围小鼠皮肤的H&E染色组织学图像显示皮肤中无明显损伤，表明MN贴片具有良好的生物相容性(图11)。
结论
本文公开了一种基于有助于WAT局部褐变的NP整合微针贴片的技术。在葡萄糖存在下，可降解的NP释放褐变剂至皮下，促进WAT向褐色脂肪组织的转化。重要的是，MN将褐变剂限制在治疗区域，从而将系统性(例如口服或静脉)施用褐变剂对其他器官的潜在副作用降至最低。体内数据进一步证明系统性增加能量消耗和脂肪酸氧化，有效控制饮食诱导肥胖小鼠体重，并改善胰岛素敏感性。综上所述，本文提供一种通过MN施用药物的替代策略，作为临床治疗肥胖症及其合并症(诸如2型糖尿病)的潜在疗法。
方法
材料。除非另有说明，所有化学品均购自Sigma-Aldrich，并在收到时使用。罗格列酮购自艾博抗(美国马萨诸塞州剑桥市)。CL 316243购自Cayman Chemical(美国密歇根州安阿伯市)。采用微孔纳米纯净化系统(电阻率大于18.2MΩcm-1)制备去离子水。
加载罗格列酮的右旋糖酐纳米粒的制备。采用改进的双乳液法制备了右旋糖酐纳米粒(NP)。简单地说，将含有200mg间葡聚糖和20mg罗格列酮(Rosi)的5mL二氯甲烷(DCM)用0.5mL含有3.5mg酶(葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶的重量比为4:1)的水溶液通过超声乳化45个周期(1s，每个周期的作用为40％)。将得到的初级溶液进一步倒入25mL 1％海藻酸钠水溶液(Mv＝1.6×105Da)中进行另一次45周期的超声处理。将双乳液立即转移至150mL的0.2％海藻酸钠中，并在室温下搅拌2小时以蒸发DCM。之后，以10000rpm离心收集纳米粒，并用蒸馏水洗涤三次。在317nm的吸收率下，用Nanodrop 2000C光谱仪(Thermo Scientific)测量了纳米粒释放的Rosi的UV-Vis吸收，确定了Rosi的加载量(LC)和包封率(EE)。计算LC和EE为LC＝B/C，EE＝B/A，其中A为Rosi的预期包封量，B为Rosi的包封量，而C为颗粒的总重量。用动态光散射(DLS)测定了颗粒粒径和多分散强度。在DI水中适当稀释后，用同一仪器由其电泳迁移率测定NP的zeta电位。在室温下测量了三份。用FEI Verios 460L场发射扫描电子显微镜(FESEM)研究了NP的形貌。
体外释放研究。通过在37℃的定轨振荡器上，在1mL PBS缓冲液(NaCl，137mM；KCl，2.7mM；Na2HPO4，10mM；KH2PO4，2mM；pH 7.4)中培养纳米粒，在其中加入100mg/dL葡萄糖，以达到人体血糖正常水平，评估右旋糖酐纳米粒中Rosi的体外释放曲线。在预定的时间点，离心样品(10000rpm，1分钟)，取上清液10μL，用Nanodrop 2000C光谱仪测量317nm处的UV-Vis吸收率进行分析。
褐变剂微针(MN)贴片的制备。每个MN都是用Blueacre科技有限公司的均匀硅树脂模具制造的，每个针有一个300μm×300μm的圆形底座基部，逐渐变细到800μm的高度。针被布置成11×11阵列，尖端与尖端之间的间距为600μm。为了制备加载纳米粒的微针，首先用吸管将制备的纳米粒悬浮液沉积在MN模具表面(30μL/阵列)。然后，将模具置于真空(600mmHg)下5分钟，使溶液充满MN腔。随后，使用Hettich通用32R离心机以2000rpm的速度对覆盖的模具离心10分钟。最后，将3mL预混的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA,w/v:2％)、光引发剂(Irgacure 2959,w/v:0.5％)和m-HA溶液(w/v:4％)添加至制备的微模储液罐，并在真空干燥器下在20℃下干燥。m-HA是根据先前报道的方法合成的。完全干燥后，小心地将MN贴片从硅酮模具上分离，并通过UV照射进行交联聚合(波长：365nm，强度为9mW/cm2)，持续30秒。所得的MN-阵列贴片存储在一个密封的六孔容器中。在FEI Verios 460L场发射扫描电镜(FESEM)上表征MN的形态。
瘦型小鼠体内褐变研究。使用来自查尔斯河(美国北卡罗来纳州罗利市)或杰克逊实验室的8周龄雄性C57BL/6小鼠。该动物研究方案得到北卡罗来纳州立大学机构动物管理和使用委员会以及北卡罗来纳大学教堂山分校或得到哥伦比亚大学动物护理和使用委员会的批准。将小鼠关在22±1℃的笼子里，在12小时的光/暗循环中自由饮水和正常饮食。实验前给小鼠至少一周的适应期。三组动物(n＝6)每3天在腹股沟区分别用透明质酸(HA)MN贴片(EV)、加载Rosi NP的MN贴片(10mg/kg)(Rosi)或加载CL316243 NP的MN贴片(1mg/kg)(CL)治疗。对于间接量热法研究，小鼠接受综合实验室动物监测系统(CLAMS)。在治疗期间监测代谢活动，包括耗氧量、食物摄入、自主活动和体重。施用六天后，处死动物，收集腹股沟脂肪组织进行组织学和RNA分析。测量肩胛间褐变脂肪组织(BAT)和附睾白色脂肪组织(WAT)的重量。
褐变MN贴片对饮食诱导肥胖症(DIO)小鼠的治疗作用。雄性C57BL/6小鼠饲喂高脂饲料(HFD；60％kcal来自脂肪)8周，诱导肥胖症和胰岛素抵抗。在异氟醚麻醉下，用空HA、Rosi(10mg/kg)或CL316243(1mg/kg)通过腹股沟区一侧的透皮贴片对三组五只小鼠进行治疗。每只小鼠的另一侧腹股沟组织用空HA微针贴片治疗。将每个贴片每3天更换一次，持续4周。在治疗期间监测体重。治疗3周后进行小鼠糖耐量试验。在葡糖糖施用前让小鼠禁食16小时(过夜)。向小鼠腹腔注射葡萄糖(在PBS中稀释2g/kg)，并随时间监测血糖水平。MN处理4周后，用CO2窒息处死小鼠，收集脂肪组织(腹股沟WAT、附睾WAT、肩胛间BAT)进行分析。同时收集治疗区周围皮肤组织进行MN贴片的生物相容性评价。
侧链缩醛改性右旋糖酐(间葡聚糖)的合成。将1.0g右旋糖酐(Mn＝9～11kDa)加入火焰干燥的圆底烧瓶中，用氮气吹扫。向烧瓶中加入10mL无水二甲基亚砜(DMSO)，搅拌至右旋糖酐完全溶解。向溶液中添加对甲苯磺酸吡啶(PPTS，15.6mg、0.062mmol)，然后添加2-乙氧基丙烯(4.16mL、37mmol)。将反应混合物用氮气吹扫，用封口膜密封，防止反应物蒸发。将反应物在室温下搅拌30分钟，然后通过添加1mL三乙胺进行淬火。然后将混合物沉淀并在碱性水(pH～8)中洗涤三次以防止不希望的降解，并以8000rpm离心15分钟收集。将产品冻干以获得白色固体。
1H NMR(DMSO-d6，300MHz，δppm)：1.10(m,OCH2CH3)，1.30(m,C(CH3)2)，3.40(m,OCH2CH3)，3.55-3.85(br，右旋糖酐C2-H～C6-H)，4.88(br，右旋糖酐C1-H)
机械强度测试。通过将MN压在不锈钢板上，测定了MN的机械强度。顶部不锈钢板向Mn-阵列贴片移动的速度为1μm/s。
皮肤渗透效率测试。在腹股沟处皮肤上注射MN-阵列后，用CO2窒息处死小鼠，用台盼蓝激发皮肤并染色，用光学显微镜(Leica EZ4 D立体显微镜)成像。为了评价Mn-阵列贴片的生物相容性，将组织样品固定在10％福尔马林中18小时，然后包埋在石蜡中，切成50μm切片，用苏木精和伊红(H&E)染色进行组织学分析。
RNA分析。按照制造商的说明，通过将TriZol试剂和NucleoSpin RNA试剂盒与DNA酶I消化(Macherey-Nagel)结合，从组织或细胞中提取RNA。利用高容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems)以1μg总RNA合成cDNA。在Bio-Rad CFX96实时PCR平台上，采用GoTaqqPCR主混合(Promega)进行定量实时PCR(Q-PCR)。以亲环素A(培养细胞)或RPL23(组织)为参考基因，采用ΔΔCt法计算相关基因表达。表1列出了引物序列。
表1.Q-PCR DNA引物序列列表
Figure BDA0002490353960000251
Figure BDA0002490353960000261
统计分析。所有结果均以平均值±SEM或平均值±SD表示。采用学生氏t检验进行统计分析。在p值<0.05的情况下，实验组与对照组之间的差异具有统计学意义。
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Claims (49)

1.一种颗粒，包含：脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂。
2.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述脂肪组织褐变剂包含罗格列酮(Rosi)、CL316243或其组合。
3.根据权利要求1所述的颗粒，进一步包含pH-改变剂。
4.根据权利要求3所述的颗粒，其中所述pH-改变剂降低pH。
5.根据权利要求3所述的颗粒，其中所述pH-改变剂包含葡萄糖响应性酶。
6.根据权利要求4所述的颗粒，其中所述pH-改变剂包含葡萄糖氧化酶(GOx)。
7.根据权利要求1所述的颗粒，进一步包含过氧化物代谢酶。
8.根据权利要求6所述的颗粒，其中所述过氧化物代谢酶包含过氧化氢酶(CAT)。
9.根据权利要求1所述的颗粒，进一步包含pH-响应性基质。
10.根据权利要求9所述的颗粒，其中所述pH-响应性基质可在与生理pH相比相对酸性pH下降解。
11.根据权利要求9所述的颗粒，其中所述pH-响应性基质包含聚合物。
12.根据权利要求11所述的颗粒，其中所述pH-响应性聚合物基质包含含有右旋糖酐单体的聚合物。
13.根据权利要求12所述的颗粒，其中所述右旋糖酐单体包含间葡聚糖单体。
14.根据权利要求11所述的颗粒，其中所述聚合物包含至少89％的缩醛侧基。
15.根据权利要求1所述的颗粒，进一步包含表面活性剂。
16.根据权利要求15所述的颗粒，其中所述表面活性剂包含海藻酸钠。
17.根据权利要求16所述的颗粒，其中所述海藻酸钠包封所述pH-响应性基质。
18.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒的直径优选为约175nm至约400nm，更优选为约200nm至约300nm，且最优选为约225nm至约275nm。
19.包含根据权利要求1所述的纳米粒的贴片。
20.一种用于穿过受试者生物屏障的材料运输装置，包含：
多个微针，所述多个微针各自具有基部端和尖端；
基底，所述微针的所述基部端附接或整合至所述基底；以及
包含脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的多个颗粒。
21.根据权利要求20所述的装置，其中所述多个颗粒附接至所述多个微针。
22.根据权利要求20所述的装置，其中所述多个微针包含生物相容性聚合物。
23.根据权利要求22所述的装置，其中所述生物相容性聚合物包含甲基丙烯酸酯化的透明质酸(m-HA)。
24.根据权利要求22所述的装置，其中所述生物相容性聚合物是交联的。
25.根据权利要求20所述的装置，其中所述多个微针具有约200μm至约800μm的中心到中心间隔。
26.根据权利要求20所述的装置，其中所述多个微针具有约600nm至1.8m的高度。
27.一种局部递送脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的方法，包含：
a.提供一种用于穿过受试者生物屏障的材料运输装置，包含：多个微针，所述多个微针各自具有基部端和尖端；
基底，所述微针的所述基部端附接或整合至所述基底；以及包含脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的多个颗粒；以及
b.向需要脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的受试者施用所述装置。
28.根据权利要求27所述的方法，其中将所述装置施用到所述受试者身体的位置，所述位置包含真皮下白色脂肪组织。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述施用步骤b)包含将所述多个微针插入生物屏障。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述多个颗粒进一步包含pH改变剂和pH-响应性基质。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述pH改变剂降低纳米粒内的pH，并且其中pH的所述降低降解所述pH-响应性基质并释放所述脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂。
32.根据权利要求27所述的方法，其中所述装置在高血糖条件下释放所述脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂。
33.根据权利要求27所述的方法，其中所述方法避免所述脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的全身效应。
34.根据权利要求27所述的方法，进一步包含将真皮下白色脂肪组织的至少一部分转化为褐色脂肪组织。
35.一种治疗有此需要的受试者的疾病的方法，包含：
a.提供一种用于穿过受试者生物屏障的材料运输装置，包含：多个微针，所述多个微针各自具有基部端和尖端；
基底，所述微针的所述基部端附接或整合至所述基底；以及包含脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂的多个颗粒；以及
b.向需要治疗疾病的受试者施用所述装置。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述疾病是肥胖症或糖尿病。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述施用步骤b)包含将所述多个微针插入生物屏障。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述多个颗粒进一步包含pH改变剂和pH-响应性基质。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述pH改变剂降低纳米粒内的pH，并且其中pH的所述降低降解所述pH-响应性基质并释放所述脂肪组织褐变剂和/或脂肪调节剂。
40.根据权利要求35所述的方法，其中所述方法减小受试者的重量。
41.根据权利要求35所述的方法，其中所述方法减少受试者的真皮下白色脂肪组织。
42.根据权利要求35所述的方法，其中所述施用步骤b)调节一个或多个褐色脂肪细胞基因的表达。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述一个或多个褐色脂肪细胞基因包含Ucp1、Dio2、Elovl3、Cidea、Pgc-1α、Cox7al或Cox8b。
44.根据权利要求35所述的方法，其中所述施用步骤b)增加脂联素的表达。
45.根据权利要求35所述的方法，其中所述施用步骤b)增加PPARγ靶点aP2的表达。
46.根据权利要求35所述的方法，其中所述施用步骤b)降低一个或多个白色脂肪细胞基因的表达。
47.根据权利要求35所述的方法，其中所述方法增加所述受试者的能量消耗及脂肪酸氧化。
48.根据权利要求35所述的方法，其中所述方法增加胰岛素敏感性。
49.根据权利要求35所述的方法，其中所述方法避免显著的皮肤损伤。
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