CN111334524A - 一种提高烟草镉敏感性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高烟草镉敏感性的方法，具体涉及利用叶盘浸染法，将MhNRAMP6在烟草内过量表达，MhNRAMP6基因的开放阅读框(ORF)长度为1638bp，编码含有545个氨基酸的蛋白，预测其蛋白质分子量为59.12kD，定位于质膜，并具有11个强跨膜螺旋；其核苷酸序列如SEQ No.1所示。含超表达基因MhNRAMP6的烟草镉敏感性更强，进而降低了烟草的耐镉性，避免了由于烟草种植区重金属Cd污染加剧，导致烟草产生各种胁迫反应，而通过增加烟草根系镉的吸收，富集环境镉，达到降低外界环境镉浓度的目的。

Description

一种提高烟草镉敏感性的方法

技术领域

本发明涉及一种提高烟草镉敏感性的方法，属于镉对烟草生长影响的研究领域。

背景技术

镉(Cadmium，Cd)是具有较强毒性的重金属，较低浓度即可抑制植物生长。经长期吸收积累就会促进植物细胞产生大量活性氧，促使蛋白质变性、失活，进而破坏植物细胞膜，造成细胞内部结构损伤，破坏细胞代谢平衡，引起叶片出现斑点降低光合作用效率，导致植株生长缓慢、植株矮小，甚至引发植物病变和死亡，最终影响作物产量和品质(陈爱葵等，2013；马艳华等，2014)。随着工业化发展，水源的污染、废气的排放等已经造成我国部分用于农业产生的土壤镉含量严重超标，有的区域甚至达到124mg kg^-1(Yuan et al.,2016)。许多果园的土壤也已经被镉污染，严重威胁着果品安全(Cheng et al.,2015)。

水果和农作物可食用部分中的镉以食物链传递的方式一级一级在人体富集，对人的身体健康造成危害。镉会引起心脑血管疾病，导致高血压和心血管的扩张，还会抑制血红蛋白的合成，干扰微量元素吸收，造成肾脏功能受损害和肺部受伤害；镉还会破坏骨钙，如果长期摄入镉则会造成骨质疏松甚至脊柱畸形等问题，对生殖系统也会产生不可逆的损害，比如“痛骨病”就是一种因镉污染造成的疾病(Akesson et al，2014；张佳，2016)。

烟草(Nicotiana tabacum)是中国重要的经济作物之一(刘国顺,2003)。围绕烟草的抗病、抗逆、品质、低害和农艺等性状对烟草品种进行定向改良，一直以来都是烟草育种的工作重心(杨铁钊,2003)。烟草是分子生物学和基因工程研究的模式植物，是“植物王国的小白鼠”，很多研究将转基因技术应用到烟草上，比如利用转基因烟草清理汞污染严重的土壤、吸收军事TNT污染、获取防艾滋病病毒抗体等，因此具有重要的价值。通过调节烟草根系的镉吸收能力，对改善环境镉污染和土壤修复具有重要意义。

发明内容

本发明针对上述问题，提供了一种提高烟草镉敏感性的方法，本发明利用超表达基因MhNRAMP6提高了烟草的镉敏感性，降低了其耐镉性。

发明人利用同源克隆和PCR技术从平邑甜茶根系中分离出一个MhNRAMP(自然抗性相关巨噬细胞蛋白)基因，它的开放阅读框(ORF)长度为1638bp，编码含有545个氨基酸的蛋白，预测其蛋白质分子量为59.12kD，定位于质膜，并具有11个强跨膜螺旋，推测其可能为跨膜蛋白。MhNRAMP6与苹果的MdNRAMP6的同源性最高，高达99.08％，该基因命名为MhNRAMP6，其核苷酸序列如SEQ No.1所示。

本发明的技术方案如下：

一种提高烟草镉敏感性的方法，利用叶盘浸染法，将MhNRAMP6在烟草内过量表达。具体步骤如下：

(2)利用带有酶切位点的特异性引物进行PCR扩增pMD18-T-MhNRAMP6，产物与pROKII重组并构建了含MhNRAMP6基因的植物过表达载体pROKII-MhNRAMP6，转化农杆菌GV3101，获得带目的片段的表达载体的阳性菌株；特异性引物及酶切位点为：

F:CGGGAATGGCTGTGGCCAGTACGG(BamHI)；

R：GGGGTAGGTCTACCGAAAATATCGA(KpnI)；

(2)选取1cm×1cm幼嫩叶片在分化培养基中预培养2d，其中，分化培养基为MS+0.5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1NAA；

(3)将叶片放入含有农杆菌(OD600为0.8)的1/2MS悬浮液中浸泡5min取出，滤纸吸干多余菌液；

(4)在28℃黑暗条件条件下，将浸染后的叶片在分化培养基中培养2d；

(5)随后在筛选继代培养基和筛选生根培养基中进行培养，15d更换一次培养基，获得生长状态良好的烟草；其中，筛选继代培养基为MS+0.5mg·L^-1

6-BA+0.05mg·L^-1NAA+50mg·L^-1Kana+500mg·L^-1Cef，筛选生根培养基为MS+0.2mg·L^-1IBA+50mg·L^-1Kana+200mg·L^-1Cef；

(6)将步骤(5)获得的烟草通过荧光定量PCR方法，获得转基因烟草植株。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明将MhNRAMP6基因在烟草中超表达，经过实验证明超表达MhNRAMP6基因的烟草镉敏感性更强，进而降低了烟草的耐镉性，避免了由于烟草种植区重金属Cd污染加剧，导致烟草产生各种胁迫反应，而通过增加烟草根系镉的吸收，富集环境镉，达到降低外界环境镉浓度的目的。

附图说明

图1为镉处理下转MhNRAMP6和野生型酵母生长情况；

图2为5μM CdSO₄处理条件下酵母的生长曲线；

图3为转MhNRAMP6和野生型酵母生长84h后的镉含量；

图4为MhNRAMP6超表达的烟草与野生型烟草荧光定量PCR结果图：

图5为镉对MhNRAMP6超表达的烟草与野生型烟草生长的影响；

图6为MhNRAMP6超表达的烟草与野生型烟草根系中Cd²⁺吸收速率对比图；

图7为MhNRAMP6超表达的烟草与野生型烟草根系中平均Cd²⁺净吸收速率对比图

图8为MhNRAMP6超表达的烟草与野生型烟草株系内的Cd含量对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例：一种提高烟草镉敏感性的方法

利用叶盘浸染法，将MhNRAMP6在烟草内过量表达，MhNRAMP6基因的开放阅读框(ORF)长度为1638bp，编码含有545个氨基酸的蛋白，预测其蛋白质分子量为59.12kD，定位于质膜，并具有11个强跨膜螺旋；其核苷酸序列如SEQ No.1所示。具体步骤如下：

(1)利用带有酶切位点的特异性引物进行PCR扩增pMD18-T-MhNRAMP6，产物与pROKII重组并构建了含MhNRAMP6基因的植物过表达载体pROKII-MhNRAMP6，转化农杆菌GV3101，获得带目的片段的表达载体的阳性菌株；特异性引物及酶切位点为：

F:CGGGAATGGCTGTGGCCAGTACGG(BamHI)；

R：GGGGTAGGTCTACCGAAAATATCGA(KpnI)；

(2)选取幼嫩叶片(1cm×1cm)在分化培养基(MS+0.5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^{- 1}NAA)中预培养2d；

(3)将其放入含有农杆菌(OD600为0.8)的1/2MS悬浮液中浸泡5min取出，滤纸吸干多余菌液；

(4)浸染后的叶片在分化培养基中(28℃黑暗条件)培养2d；

(5)随后在筛选继代培养基(MS+0.5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1NAA+50mg·L^-1Kana+500mg·L^-1Cef)和筛选生根培养基(MS+0.2mg·L^-1IBA+50mg·L^-1Kana+200mg·L^-1Cef)中进行培养，15d更换一次培养基；

(6)将步骤(5)获得的烟草通过荧光定量PCR方法，获得转基因烟草植株。

实验例

1试验材料

1.1烟草

烟草品种为NC89，约长至4-5片叶。

1.2菌株及载体

本试验采用的菌株：大肠杆菌(Escherichia coli)为Trans 5α，农杆菌为GV3101，均购自北京全式金生物科技(TRANS)公司。酵母菌株为BY4741，市售。

1.3酶、试剂盒及引物

限制性内切酶、EasyTaq酶、TransTaq HiFi DNAPolymerase购自北京全式金生物科技(TRANS)公司。

cDNA反转录试剂盒(PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit,6210A)、反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect RealTime，TaKaRa，RR047A)和荧光实时定量PCR试剂盒TB Green^TM Premix Ex Taq^TM II(TaKaRa，RR820Q)由宝生物公司提供；RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)、DNA胶回收试剂盒(Axygen)、质粒小提试剂盒、植物基因组DNA的提取试剂盒(Plant Genomic DNAKit)、由北京天根(TIANGEN)生化科技有限公司产品提供；载体连接试剂盒Ligation-Free Cloning System由爱必梦生物科技有限公司(ABM，加拿大)提供。

实验所有引物序列合成和测序由华大生物技术有限公司完成。

1.4实验仪器

(1)人工气候箱，宁波市乐电仪器制造有限公司；

(2)AppliedBiosystems Veriti PCR仪，美国ABI；

(3)实时荧光定量PCR仪

96，罗氏诊断产品(上海)有限公司；

(4)超微量分光光度仪Nanodrop-2000UV-Vis Spectrophotometer，ThermoFisher Scientific Inc(美国)；

(5)电泳凝胶成像SmartGel^TMImageAnalysis System，北京赛智创业科技有限公司；

(6)台式高速冷冻离心机SIGMA 3-18K，德国；

(7)微型掌上离心机Mini-10K，Hema Medical Instrument Co.Ltd(珠海)；

(8)超高分辨率激光共聚焦显微镜，德国蔡司公司(ZEISS)；

1.5试剂和培养基的配制

(1)分化培养基：MS培养基中加入0.5mg·L^-16-BA和0.05mg·L^-1NAA，并加入琼脂粉，在121℃下高压灭菌20min后，倒入培养瓶中备用。

(2)继代培养基：MS培养基中加入0.5mg·L-16-BA和0.05mg·L-1NAA，并加入琼脂粉，在121℃下高压灭菌20min后，温度降至60℃以下，加入50mg·L-1卡那霉素和500mg·L-1头孢霉素，摇匀后倒入培养瓶中备用。

(3)筛选生根培养基：MS培养基中加入0.2mg·L-1IBA和琼脂粉，在121℃下高压灭菌20min，温度降至60℃以下，再计入50mg·L-1卡那霉素和200mg·L-1头孢霉素，摇匀后倒入培养瓶中备用。

(4)非损伤微测技测试液配方：

测试液：0.1mM KCl，0.1mM CaCl₂，0.05mM CdSO₄，0.3mM MES，pH5.8；

(5)LB体培养基：取NaCl 5g，取酵母提取物2.5g，取蛋白胨5g，取琼脂粉7.5g(液体培养基不需要琼脂)，然后加入ddH₂O并定容至500ml，在121℃下高压灭菌20min，温度降至60℃左右后，根据需要加入氨苄青霉素(Amp)或者卡那霉素(Kan)达到100mg·L^-1和50mg·L^-1等抗生素，倒板后4℃保存备用。

(6)YPDA培养基：取胰化蛋白胨10g，取酵母提取物5g，取腺嘌呤0.2％，然后加入450ml ddH₂O，调节pH值为6.5后，在121℃下高压灭菌20min，待温度降至60℃后加入20％的葡萄糖(已抽滤灭菌)50ml。

(7)酵母选择性培养基SD-U的配制方法(100ml)：0.67g氮源，2mg色氨酸，10mg亮氨酸，2mg组氨酸，加ddH₂O补90ml后，在121℃下高压灭菌20min，温度降至60℃左右后加入20％的葡萄糖(已抽滤灭菌)10ml。固体培养基的琼脂含量为2％。

1.6构建表达载体

本实验中所用酵母表达载体为pYES2，植物超表达载体为pROKII-GFP，在根据基因和载体序列特性在引物两端加上合适的酶切位点。采用AxyPrep质粒小提试剂盒(Axygen)来提取质粒，以此质粒为模板进行PCR反应。利用双酶切对载体进行线性化处理，酶切反应体系如下：

37℃反应1-2h，用1％琼脂糖凝胶电泳观察酶切片段大小，判断酶切是否成功。

回收酶切产物，根据Ligation-Free Cloning System试剂盒进行PCR产物与载体连接反应，然后转化Trans 5α，筛选阳性克隆菌落，送华大测序确定序列正确。提取质粒。

1.7转化农杆菌感受态细胞

(1)冰上融化感受态细胞；

(2)加入1-2ul质粒DNA，冰浴30min，液氮中迅速冷冻1min，再37℃水浴3min，再迅速冰浴2min；

(3)加入1ml无抗生素的液体LB培养基，28℃，200rpm/min，振荡培养3h；

(4)12000rpm离心1min，100ul液体LB培养基悬浮菌体；

(5)将转化后的菌液涂于附加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的固体LB培养基上，至于28℃培养2-3d；

(6)进行菌落PCR鉴定。

1.8酵母转化

本实验采用醋酸锂转化方法进行酵母转化：

(1)取BY4741酵母菌落在YPDA固体培养基上划线并在30℃条件下活化培养3-4d。

(2)随后挑取单菌落(直径2-3mm)接种至5mlYPDA液体培养基中，在30℃、200rpm条件下振荡培养8-12h。

(2)取0.5ml菌液接种至50mlYPDA液体培养基(培养基装在250ml三角瓶中)中，30℃，200rpm条件下培养3-5h直至浓度达到2×10⁷个细胞/ml(OD600＝0.15-0.3)。

(3)将菌液完全加至无菌离心管中，室温条件下，3500rpm，离心3min，收集细胞。

(4)用枪头吸尽上清液后，用30ml灭菌后的双蒸水重悬细胞，室温条件下，3500rpm，离心3min；

(5)弃尽上清液后，用1.4ml 1.1×TE/LiAc重悬。将重悬的菌液转移到2个1.5ml离心管中12000rpm，离心15s

(6)弃上清，每管用600ul 1.1×TE/LiAc重悬，准备进行转化。

(7)往管中加入以下试剂(360μl)：240μl PEG 3350(50％w/v)，36μl 1.0mol/L醋酸锂，5μl鲑鱼精DNA(热变形的2.0mg/ml)，质粒5μl，重悬菌体并充分混匀。

(8)42℃水浴30min；

(9)3500rpm离心10min，再用无菌水洗两遍，随后加入500μl水重悬菌体，取100μl涂板至SD-U固体培养基；

(10)30℃培养3d后挑取阳性单菌落，进行菌落PCR鉴定。

1.9烟草叶盘转化

(1)利用带有酶切位点的特异性引物进行PCR扩增pMD18-T-MhNRAMP6，产物与pROKII重组并构建了含MhNRAMP6基因的植物过表达载体pROKII-MhNRAMP6，转化农杆菌GV3101，获得带目的片段的表达载体的阳性菌株；特异性引物及酶切位点为：

F:CGGGAATGGCTGTGGCCAGTACGG(BamHI)；

R：GGGGTAGGTCTACCGAAAATATCGA(KpnI)；

(2)选取幼嫩叶片(1cm×1cm)在分化培养基(MS+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA)中预培养2d；

(3)将其放入含有农杆菌(OD600为0.8)的1/2MS悬浮液中浸泡5min取出，滤纸吸干多余菌液；

(4)浸染后的叶片在分化培养基中(28℃黑暗条件)培养2d；

(5)随后在筛选继代培养基(MS+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA+50mg·L-1Kana+500mg·L-1Cef)和筛选生根培养基(MS+0.2mg·L-1IBA+50mg·L-1Kana+200mg·L-1Cef)中进行培养，15d更换一次培养基；

(6)选将步骤(5)获得的烟草通过荧光定量PCR方法，获得转基因烟草植株。

1.10生物信息学分析方法

利用NCBI中BLAST进行碱基序列同源性比对分析；借助DNAMAN分析MhNRAMP6基因的开放阅读框(ORF)；运用Compute pI/Mw软件分析氨基端序列的理化性质；借助软件SignalP4.1 Server对基因MhNRAMP6进行信号肽的分析；利用ExPASy软件分析蛋白的亲水性和疏水性；利用MEGA4.0软件进行多序列比对并构建系统进化树；借助Protparam软件分析跨膜结构；借助SMART(SimpleModularArchitecture Research Tool)对蛋白质序列的结构功能域分析。

1.11Cd²⁺流速测定

采用北京旭月公司的非损伤微测技术(NMT)测定活体烟草根尖Cd²⁺动态流速，预先将烟草根系从烟草植株中切离，将含有根尖的烟草根系在装有测试液的测试盒中平衡10min。测试时，将烟草根系置于测试液中，用盖玻片将其固定压好，将电极尖端置于距离烟草根尖200μm处，数据持续采集25min。

1.12利用ICP-MS测定镉含量

取0.2g烟草根系样品至消煮管中，加7mL优级纯HNO₃静置过夜，上机前加入1mL30％优级纯双氧水，用微波消解仪消解。用超纯水定容至50ml，最后利用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定镉含量。

2.结果分析

2.1转MhNRAMP6基因的酵母对镉的吸收和耐性分析

2.1.1过表达MhNRAMP6对Cd胁迫下酵母生长的影响

将带目的基因的酵母表达载体pYES2-MhNRAMP6和空表达载体pYES2转入酵母菌株BY4741中，筛选得到过表达MhNRAMP6的酵母阳性菌株。摇菌活化，然后将两种酵母的OD₆₀₀值稀释成5个浓度，分别为1、0.1、0.01、0.001、0.0001，取4μl菌液点在含有0μM、10μM和30μMCdSO₄的SD-U固体培养基上。如图1所示，未镉处理时，两种酵母的菌在不同浓度下生长状况基本一致，说明含有空表达载体和MhNRAMP6基因表达载体的酵母长势基本一致。10μMCdSO₄处理一定程度上抑制两种酵母的生长，但表达MhNRAMP6基因的酵母菌落更小，说明抑制效果更强，当镉浓度达到30μM时，在浓度为0.01的转基因酵母已经看不见菌落，而浓度0.001空载酵母时仍然可以缓慢生长。综合上述结果，转基因酵母比空载酵母对镉处理更敏感，受到严重的毒害作用。

进一步研究酵母表达MhNRAMP6基因对其耐镉性的影响，测定两种酵母在镉处理下的生长曲线。取5μL已活化至50ml含有5μM CdSO₄的SD-U液体培养基中培养，每隔6h测定生长曲线共培养84h。结果如图2所示，未经过镉处理的两种酵母生长速度基本相同，说明含有空表达载体和MhNRAMP6基因表达载体的酵母长势基本一致。镉处理条件下，两种酵母进入指数型增长阶段明显晚于无镉处理的对照组，增速低于对照组，说明镉明显抑制了酵母的生长。镉处理条件下在0-36h时，空载酵母和表达MhNRAMP6基因酵母生长都比较缓慢，镉处理36h之后，两种酵母才进入指数型增长的，转基因的酵母仍比空载酵母生长缓慢。到84h时，两者细胞数量基本达到稳定期，空载酵母数量仍然高于转基因酵母。从生长曲线可以看出，表达MhNRAMP6基因使酵母在镉处理条件下生长缓慢、数量减少。

综上，镉处理条件下转基因酵母在生长曲线与点板实验结果一致，可以说明在镉胁迫下过表达MhNRAMP6基因能够使酵母生长受到更严重的抑制作用，转MhNRAMP6基因降低了酵母的耐镉性，提高了其镉敏感性。

2.1.2过表达MhNRAMP6对Cd胁迫下酵母镉积累的影响

为了更进一步分析MhNRAMP6基因对酵母积累镉的影响，将带有空载体和基因MhNRAMP6的酵母活化，并在含5μM CdSO₄的SD-U液体培养基中培养84h后，测定其镉含量。如图3所示，镉处理后，表达MhNRAMP6基因酵母的镉含量显著高于空载体酵母的镉含量，说明MhNRAMP6基因的过量表达增加了酵母对镉的吸收。由于转基因酵母菌内积累了更多的镉离子，导致更为严重的镉毒害作用，使转基因酵母生长受抑制。

2.2转基因烟草检测与分析

2.2.1转MhNRAMP6基因通过荧光定量PCR进行检测

MhNRAMP6超表达的烟草与野生型烟草荧光定量PCR结果如图4所示。2.2.2转MhNRAMP6基因的烟草对镉的吸收和耐性分析

利用叶盘浸染法，将MhNRAMP6在烟草内过量表达，获得的3个MhNRAMP6超表达的烟草株系(TR1,TR2,TR3)。表型分析显示，正常条件下MhNRAMP6超表达的烟草与野生型烟草生长无明显差异，而在含有50μM Cd的固体MS培养基上，MhNRAMP6超表达的烟草植株的生长明显弱于野生型，说明MhNRAMP6超表达的烟草植株对Cd更敏感(增加了敏感性)，如图5所示。

利用非损伤微测技术活体检测烟草根系Cd²⁺流速发现，野生型烟草根系的Cd²⁺吸收速率显著低于MhNRAMP6超表达的烟草，如图6所示。平均Cd²⁺净吸收速率显示同样结果，如图7所示。

分析根系、叶片和种子内的Cd含量发现，Cd胁迫处理后，各组织内Cd含量显著增加，但是MhNRAMP6超表达的烟草株系内的Cd含量均显著高于野生型烟草，如图8所示。

将叶片内Cd含量与根系内Cd含量做比值定义为Cd由根系向叶片转运的转运系数(TF_叶/根)，通过比较转基因烟草和野生型烟草的Cd由根系向叶片转运的转运系数TF(叶/根)发现，MhNRAMP6超表达的烟草的TF(叶/根)高于野生型，说明MhNRAMP6的过量表达增加了Cd由烟草根系向叶片内的转运。而由叶片向种子内的Cd转运系数TF(种子/叶)无明显变化，如表1所示。

表1 CdSO₄处理下烟草植株的转运系数

结果表明，烟草中，MhNRAMP6基因的超表达使得烟草生长受到抑制，增加了烟草根系镉的吸收和积累，从而增加了烟草植株对Cd的敏感性。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种提高烟草镉敏感性的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1635

<212> DNA

<213> 平邑甜茶(Malus sylvestris)

<400> 1

atggctgtgg ccagtacggc ttctgcgcag ccacagttca ttgcaagcac tggaaaccga 60

agcttctcta atgcaccgct cattgaggac acagatactg aacaaattgt tgttcctgat 120

aagacaagct ggaaaaatct ctttgcctac atgggtccag ggtttcttgt ttcaattgcg 180

tatatagatc ctggaaattt tgagacggat ttgcagtcag gggcgcagta caagtatggg 240

ctactctgga taatattagt tgcttcatgt gctgctcttg tcattcagtc ccttgcagcc 300

aatcttgggg tggtcacagg aaagcatttg gcagagcact gtagagcgga atatcctaga 360

gtaacaaact tcattctttg ggttcttgct gagatttcta tagttgcatg tgacattcct 420

gaagtgattg gaactgcctt tgcattgaac atgctcttca acatacccat atggattggc 480

gtacttctga caggacttag tacattgatt cttctggcat tacagcaata tggggttagg 540

aaacttgaat tcttgatcgc attccttgta ctcacaattg ctggatgctt ctttgctgag 600

cttggctacg caaaacctga cgctactgaa gttttggacg ggctttttgt tccccaactc 660

aaaggaaatg gtgctactgg tcttgcaatt tctcttcttg gtgctatggt tatgccgcac 720

aatctcttcc tccactctgc attggtgctt tctgggaaaa taccacgatc tgtccgtggc 780

atcaaagaag catgcagatt ttatatgata gaaagtggct ttgctctcat ggtggcattc 840

ctaataaatg tatccgttat ttctgtaagt ggtgcagttt gcaattcccc agatttgaat 900

gctgaagata agatgaactg ccaggacttg gatttgaata aagcctcctt tttactaaga 960

aatgttttag gtagttggag ttccaagctt tttgctgtag cattgcttgc atcaggtcaa 1020

agttctacta taacaggaac atatgcaggg caatatgtta tgcgggggtt tcttgattta 1080

cgactgaagc catggcttcg aaacttttta accagatgct tggcaatagt ccctagtttg 1140

attgttgcag tcattggcgg ttctgctggg gctggaaagc tgattattat tgcatcaatg 1200

attttatcgt ttgagctgcc tttcgctctt attccacttc ttaagttcac aagttgcaag 1260

accaagatgg gtacacatgc caactctact gcgatttcag ctctcacttg gatcattggt 1320

tctctgctga tggccataaa tgtatattac ctgatgagta gatttatcaa gttgcttctt 1380

cacaaccact tcaaagttgt gggcattgtc tttcttggaa tgttaggatt ctctggtatg 1440

ggattgtatt tggctggaat cgcgtatctg gtgttccgta aaaacaagga ggctacgcat 1500

cttttggctc taacaacacc tgaaagtagg caaacggaaa ctgggcagca gggtactgga 1560

tcgatgtatc atctcgaaag agaagacatt atgagcatgc agctgcctca gaagaggtct 1620

accgaaaata tcgac 1635

Claims (2)

1.一种提高烟草镉敏感性的方法，其特征在于，利用叶盘浸染法，将MhNRAMP6在烟草内过量表达，MhNRAMP6基因的核苷酸序列如SEQ No.1所示。

2.根据权利要求1所示的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

(1)利用带有酶切位点的特异性引物进行PCR扩增pMD18-T-MhNRAMP6，产物与pROKII重组并构建了含MhNRAMP6基因的植物过表达载体pROKII-MhNRAMP6，转化农杆菌GV3101，获得带目的片段的表达载体的阳性菌株；特异性引物及酶切位点为：

F:CGGGAATGGCTGTGGCCAGTACGG(BamHI)；

R：GGGGTAGGTCTACCGAAAATATCGA(KpnI)；

(2)选取1cm×1cm幼嫩叶片在分化培养基中预培养2d，其中，分化培养基为MS+0.5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1NAA；

(3)将叶片放入含有农杆菌(OD600为0.8)的1/2MS悬浮液中浸泡5min取出，滤纸吸干多余菌液；

(4)在28℃黑暗条件条件下，将浸染后的叶片在分化培养基中培养2d；

(5)随后在筛选继代培养基和筛选生根培养基中进行培养，15d更换一次培养基，获得生长状态良好的烟草；其中，继代培养基为MS+0.5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1NAA+50mg·L^{- 1}Kana+500mg·L^-1Cef，筛选生根培养基为MS+0.2mg·L^-1IBA+50mg·L^-1Kana+200mg·L^{- 1}Cef；

(6)将步骤(5)获得的烟草通过荧光定量PCR方法，获得转基因烟草植株。

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