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CN111303159A - 用于治疗由布鲁顿酪氨酸激酶(btk)介导的疾病的吡唑甲酰胺化合物 - Google Patents

用于治疗由布鲁顿酪氨酸激酶(btk)介导的疾病的吡唑甲酰胺化合物 Download PDF

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CN111303159A
CN111303159A CN202010276876.4A CN202010276876A CN111303159A CN 111303159 A CN111303159 A CN 111303159A CN 202010276876 A CN202010276876 A CN 202010276876A CN 111303159 A CN111303159 A CN 111303159A
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compounds
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J·J·克劳福德
S·贾梅-菲圭罗阿
W·李
F·J·罗裴茨-塔比阿
S-S·苏
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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

本发明提供了具有各种取代基的式I吡唑甲酰胺化合物，包括其立体异构体、互变异构体和可药用的盐，用于抑制Btk，用于治疗癌症和免疫性疾病，例如由Btk介导的炎症。本发明还公开了在哺乳动物细胞中使用式I化合物体外、原位和体内诊断和治疗此类疾病或相关病理状态的方法。

Description

用于治疗由布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)介导的疾病的吡唑甲酰 胺化合物
本申请是申请日为2015年10月1日、优先权日为2014年10月2日的中国专利申请201580052620.2的分案申请。
技术领域
概括地讲，本发明涉及用于治疗由布鲁顿酪氨酸激酶(Btk,BTK)介导的疾病的化合物，包括炎症、免疫性疾病和癌症，更具体地讲，本发明涉及能够抑制Btk活性的化合物。本发明还涉及使用化合物用于在体外、原位和体内诊断或者治疗哺乳动物细胞或相关病理状态的方法。
背景技术
蛋白激酶(人类酶的最大家族)包括超过500种蛋白质。布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)是酪氨酸激酶Tec家族的一员，是早期B-细胞发育以及成熟B-细胞活化、信号传导和存活的调节者(T.Hunter,Cell 1987 50:823－829)。
通过B-细胞受体(BCR)的B-细胞信号传导可能导致广泛的生物学输出，这反过来又依赖于B-细胞的发育阶段。BCR信号的幅度和持续时间必须精确调节。异常的BCR-介导的信号可能导致失调的B-细胞活化和/或导致多种自身免疫性和/或炎性疾病的病原性自身抗体的形成。人类Btk突变导致与X相关的血中丙种球蛋白缺乏(XLA)。此疾病与下列有关：B细胞的成熟受损，免疫球蛋白的产生降低，T细胞非依赖性免疫应答受损和相应于BCR刺激的持续钙信号的显著衰减。在过敏性疾病和/或自身免疫性疾病和/或炎性疾病中Btk的作用的证据已经在Btk缺陷型小鼠模型中确立。例如，在系统性红斑狼疮(SLE)的标准鼠科临床前模型中，已显示Btk缺乏导致疾病恶化的显著改善。另外，Btk缺乏小鼠对胶原诱导的关节炎的发病也具有抗性，并且不容易患葡萄球菌诱导的关节炎。大量的证据支持在自身免疫性和/或炎性疾病的发病机制中B细胞和体液免疫系统发挥作用。研发的用于消耗B细胞的蛋白类疗法(例如
Figure BDA0002445089910000011
Genentech/Biogen Idec)代表了一种治疗多种自身免疫和/或炎性疾病的方法。鉴于Btk在B-细胞活化中的作用，Btk的抑制剂可以用作B-细胞疾病和B-细胞介导的病原性活性(例如自身抗体的产生)的抑制剂。Btk还可以在破骨细胞、肥大细胞和单核细胞中表达，并且已经被证明对这些细胞的功能是重要的。例如，小鼠Btk缺乏与受损的IgE介导的肥大细胞活化(TNF-α和其它炎性细胞因子的释放显著降低)有关，人Btk缺乏与由活化的单核细胞导致的TNF-α的产生的显著降低相关。
因此，Btk活性的抑制可以用于治疗过敏性疾病和/或自身免疫性疾病和/或炎性疾病，例如：SLE、类风湿性关节炎(Whang等(2014)Drug Discovery Today，印刷中(inpress)；Kim等(2011)Bioorganic&Med.Chem.Letters 21:6258－6263)、多脉管炎、原发性血小板减少性紫癜(ITP)、重症肌无力、过敏性鼻炎和哮喘(Di Paolo等(2011)NatureChem.Biol.7(1):41－50；Liu(2011)Drug Metab.and Disposition 39(10):1840－1849；Liu等(2011)Jour.of Pharm.and Exper.Ther.338(1):154－163；Lou等(2012)J.Med.Chem.55(10):4539－4550；Xu D.等(2012)Jour.Pharm.and Exp.Ther.341(1):90－103)。此外，已经报道Btk能够在细胞凋亡中发挥作用(Islam和Smith Immunol.Rev.2000178:49)；因而，Btk活性的抑制可以用于治疗癌症，还可以治疗B细胞淋巴瘤、白血病和其它恶性血液病(US 7514444；Feldhahn等J.Exp.Med.2005 201:1837)。另外，鉴于Btk在破骨细胞功能中的作用，Btk活性的抑制可以用于治疗骨病，例如骨质疏松症。
发明内容
发明概述
概括地讲，本发明涉及具有布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)调节活性的吡唑甲酰胺化合物，其具有式I结构：
Figure BDA0002445089910000021
包括立体异构体、互变异构体或其可药用的盐。各种取代基如本文中所定义。
本发明的一个方面为药用组合物，其含有式I化合物和可药用的载体、助流剂、稀释剂或赋形剂。药用组合物还可以含有第二种治疗药物。
本发明的另一方面为制备药用组合物的方法，该方法包括使得式I化合物与可药用载体的组合。
本发明包括治疗疾病或病症的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的式I化合物，所述患者患有由布鲁顿酪氨酸激酶介导的选自下列的疾病或病症：免疫性疾病、癌症、心血管疾病、病毒性感染、炎症、代谢性/内分泌功能疾病和神经性疾病。
本发明包括用于治疗由布鲁顿酪氨酸激酶介导的病症的试剂盒，其包括：a)包含式I化合物的第一种药用组合物；和b)使用说明书。
本发明包括用作药物的式I化合物。
本发明包括用于治疗由布鲁顿酪氨酸激酶介导的选自下列的疾病或病症的式I化合物：免疫性疾病、癌症、心血管疾病、病毒性感染、炎症、代谢性/内分泌功能疾病和神经性疾病。
本发明包括在治疗疾病或病症中与其它治疗药物组合使用的式I化合物。
本发明包括式I化合物在生产用于治疗下列疾病的药物中的用途：免疫性疾病、癌症、心血管疾病、病毒性感染、炎症、代谢性/内分泌功能疾病和神经性疾病，其中所述药物能够介导布鲁顿酪氨酸激酶。
本发明包括用于治疗下列疾病的式I化合物：免疫性疾病、癌症、心血管疾病、病毒性感染、炎症、代谢性/内分泌功能疾病和神经性疾病，其中所述药物能够介导布鲁顿酪氨酸激酶。
本发明包括制备式I化合物的方法。
本发明包括本文中所述的发明。
示例性实施方案的详述
现在将详细地说明本发明的某些实施方案，其实例描述于随附的结构和分子式中。尽管本发明将结合所列举的实施方案进行描述，但是应当理解，它们并不应当将本发明限制于那些实施方案。相反，本发明意图涵盖所有的可选方案、修订方案和等同方案，它们均可以包含在由权利要求所定义的本发明的范围之内。本领域技术人员可以识别与本文中所述那些方法和材料类似或等同的多种方法和材料，它们可以用于实施本发明。本发明不以任何方式限定于所描述的方法和材料。在一个或多个引入的文献、专利和类似文献与本申请不同或有矛盾的情况下，包括但不限于定义的术语、术语的用法、描述的技术等，以本申请为准。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域中技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文中所述那些方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于实施或测试本发明，下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献以其全部内容引入本文作为参考。除非另有说明，在本申请中使用的命名法是基于IUPAC系统命名的。
定义
当表明取代基的数目时，术语“一个或多个”是指从一个取代基至最多可能的取代数目的范围，即一个氢被取代至所有的氢被取代基取代。术语“取代基”表示取代母体分子上氢原子的原子或原子团。术语“取代的”表示携有一个或多个取代基的一个特定基团。当任何基团可以携有多个取代基并且提供了各种可能的取代基时，所述取代基可以独立选择并且不需要是相同的。术语“未取代的”是指指定的基团不携带取代基。术语“任选取代的”是指指定的基团是未取代的或者被独立选自可能取代基的一个或多个取代基取代。当指示取代基的数目时，术语“一个或多个”是指从一个取代基至最高可能数目的取代，即，取代基替换一个氢，最多替换所有的氢。当表明取代基的数目时，
本文中使用的术语“烷基”是指1－12个碳原子(C1-C12)的饱和的直链或支链单价烃基团，其中烷基可以任选被一或多个下文所述的取代基独立取代。在另一个实施方案中，烷基为1－8个碳原子(C1-C8)，或者为1－6个碳原子(C1-C6)。烷基的示例包括但不限于甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(正-Pr、正-丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、异-丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、正-丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、异-丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、仲-丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、叔-丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(正-戊基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3、1-庚基、1-辛基等。
本文中使用的术语“亚烷基”是指1－12个碳原子(C1-C12)的饱和的直链或支链二价烃基团，其中亚烷基可以任选被一或多个下文所述的取代基独立取代。在另一个实施方案中，亚烷基为1－8个碳原子(C1-C8)，或者为1－6个碳原子(C1-C6)。亚烷基的示例包括但不限于亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)等。
术语“链烯基”是指具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp2双键)的2－8个碳原子(C2-C8)的直链或支链单价烃基团，其中所述链烯基任选被一或多个本文中所述取代基独立取代，包括具有“顺式”和“反式”取向的基团，或者选择的“E”和“Z”取向。示例包括但不限于乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)等。
术语“亚链烯基”是指具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp2双键)的2－8个碳原子(C2-C8)的直链或支链二价烃基团，其中所述亚链烯基可以任选被一或多个本文中所述取代基独立取代，包括具有“顺式”和“反式”取向的基团，或者“E”和“Z”取向。示例包括但不限于亚乙烯基(-CH＝CH-)、烯丙基(-CH2CH＝CH-)等。
术语“炔基”是指具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp三键)的2－8个碳原子(C2-C8)的直链或支链单价烃基团，其中所述炔基可以任选被一或多个本文中所述取代基独立取代。示例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)、丙炔基(炔丙基，-CH2C≡CH)等。
术语“亚炔基”是指具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp三键)的2－8个碳原子(C2-C8)的直链或支链二价烃基团，其中所述亚炔基可以任选被一或多个本文中所述取代基独立取代。示例包括但不限于亚乙炔基(-C≡C-)、亚丙炔基(亚炔丙基，-CH2C≡C-)等。
术语“碳环”、“碳环基”、“碳环环”和“环烷基”是指单价非芳族的饱和的或部分不饱和的环，该环可以为具有3至12个碳原子(C3-C12)的单环或7至12个环碳原子的双环。具有7至12个原子的双环碳环可以排列为例如双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统，具有9或10个环原子的双环碳环可以排列为双环[5,6]或[6,6]系统，或者排列为桥接系统，例如双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷和双环[3.2.2]壬烷。螺碳环基部分也包括在本定义的范围内。螺碳环基部分的实例包括[2.2]戊烷基、[2.3]己烷基和[2.4]庚烷基。单环碳环的示例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一基、环十二烷基等。碳环基任选被一或多个本文中所述取代基独立取代。
“芳基”是指通过从母体芳族环系的单个碳原子上除去一个氢原子而衍生的6－20个碳原子(C6-C20)的单价芳族烃基团。某些芳基在示例性结构上表示为“Ar”。芳基包括包含与饱和的、部分不饱和的环或者芳族碳环稠合的芳族环的双环基团。典型的芳基包括但不限于由下列基团衍生的基团：苯(苯基)、取代的苯、萘、蒽、联苯基、茚基、茚满基、1,2-二氢萘、1,2,3,4-四氢萘基等。芳基任选被一或多个本文中所述取代基独立取代。
“亚芳基”是指通过从母体芳族环系的二个碳原子上除去二个氢原子而衍生的6－20个碳原子(C6-C20)的二价芳族烃基团。某些亚芳基在示例性结构上表示为“Ar”。亚芳基包括包含与饱和的、部分不饱和的环或者芳族碳环稠合的芳族环的双环基团。典型的亚芳基包括但不限于由下列基团衍生的基团：苯(亚苯基)、取代的苯、萘、蒽、亚联苯基、亚茚基、亚茚满基、1,2-二氢萘、1,2,3,4-四氢萘等。亚芳基任选被一或多个本文中所述取代基独立取代。
术语“杂环”、“杂环基”和“杂环环”在本文中可互换使用，是指3至约20个环原子的饱和或部分不饱和(即在所述环中具有一个或多个双键和/或三键)的碳环基团，其中至少一个环原子为选自氮、氧、磷和硫的杂原子，其余的环原子为C，其中一个或多个环原子任选被下文描述的一个或多个取代基独立取代。杂环可以是具有3－7个环成员(2－6个碳原子和1－4个选自N、O、P和S的杂原子)单环或者具有7－10个环成员(4－9个碳原子和1－6个选自N、O、P和S的杂原子)的双环，例如双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统。杂环描述于Paquette,Leo A.；“Principles of Modern Heterocyclic Chemistry(现代杂环化学原理)”(W.A.Benjamin,New York,1968)，特别是第1、3、4、6、7和9章；“The Chemistry ofHeterocyclic Compounds,A series of Monographs(杂环化合物化学，系列专著)”(JohnWiley&Sons,New York,1950至今),特别是第13、14、16、19和28卷；和J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566。“杂环基”还包括其中杂环基团与饱和的、部分不饱和的环或芳族碳环或杂环环稠合的基团。杂环环的示例包括但不限于吗啉-4-基、哌啶-1-基、哌嗪基、哌嗪-4-基-2-酮、哌嗪-4-基-3-酮、吡咯烷-1-基、硫代吗啉-4-基、S-二氧代硫代吗啉-4-基、氮杂环辛烷-1-基、氮杂环丁烷-1-基、八氢吡啶并[1,2-a]吡嗪-2-基、[1,4]二氮杂环庚-1-基、吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶子基、吗啉代、硫代吗啉代、硫氧杂环己基(thioxanyl)、哌嗪基、高哌嗪基、氮杂环丁基、氧杂环丁基、硫杂环丁基(thietanyl)、高哌啶基、氧杂环庚烷基(oxepanyl)、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、氧氮杂
Figure BDA0002445089910000071
基(oxazepinyl)、二氮杂
Figure BDA0002445089910000072
基、硫氮杂
Figure BDA0002445089910000073
基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二噁烷基、1,3-二氧戊环基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫戊环基(dithiolanyl)、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂双环[3.1.0]己烷基、3-氮杂双环[4.1.0]庚烷基、氮杂双环[2.2.2]己烷基、3H-吲哚基、喹嗪基和N-吡啶基脲。螺杂环基部分应当也包括在本发明定义的范围内。螺杂环基部分的示例包括氮杂螺[2.5]辛基和氮杂螺[2.4]庚烷基。其中2个环原子被氧代(＝O)取代的杂环基团为嘧啶酮基(pyrimidinonyl)和1,1-二氧代-硫代吗啉基。本文中的杂环基团任选被一或多个本文中所述取代基独立取代。
术语“杂芳基”是指5-、6-或7-元环的单价芳族基团，包括5－20个原子的稠合环系(其中至少一个为芳族)，其包含一或多个独立选自氮、氧和硫的杂原子。杂芳基的示例为吡啶基(包括例如2-羟基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、嘧啶基(包括例如4-羟基嘧啶基)、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、四氢异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、中氮茚基、2,3-二氮杂萘基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、1,5-二氮杂萘基和呋喃并吡啶基。杂芳基任选被一或多个本文中所述取代基独立取代。
杂环或杂芳基可以是碳(碳连接的)或氮(氮连接的)键合的，如果是可能的话。举例而非限定，碳键合的杂环或杂芳基键合的位置为吡啶的2、3、4、5或6位，哒嗪的3、4、5或6位，嘧啶的2、4、5或6位，吡嗪的2、3、5或6位，呋喃、四氢呋喃、噻喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位，噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位，异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位，氮丙啶的2或3位、氮杂环丁烷的2、3或4位、喹啉的2、3、4、5、6、7或8位或异喹啉的1、3、4、5、6、7或8位。
举例而非限定，氮键合的杂环或杂芳基键合的位置为氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氢吲哚、1H-吲唑的1位，异吲哚或异吲哚啉的2位，吗啉的4位，咔唑或β-咔啉的9位。
术语“治疗”是指治疗性治疗，其中所述目的是减缓(减轻)不期望的生理变化或病症，如关节炎或癌症的发展或扩散。在本发明中，有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解，疾病程度的减轻，疾病状态的稳定(即不恶化)，疾病进程的延缓或减慢，疾病状态的改善或缓和减轻，以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以是指与如果不接受治疗的预期存活相比可以延长存活。那些需要治疗的个体包括患有所述病症或病症的那些个体。
短语“治疗有效量”是指下列情况下本发明化合物的量：(i)治疗特定疾病、状况或病症，(ⅱ)减少、改善或消除特定疾病、病症或紊乱的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文中所述特定疾病、病症或紊乱的一种或多种症状的发作。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数目；减少肿瘤的大小；抑制(即，减缓至一定程度并优选终止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即，减缓至一定程度并优选终止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与癌症相关的症状。药物可以在一定程度上预防已有癌细胞生长和/或杀死已有的癌细胞，它可能是抑制细胞的和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，可以例如通过评价疾病进展时间(TTP)和/或确定应答率(RR)测定疗效。
本文中使用的“炎性疾病”可以是指任何疾病、病症或综合征，其中过度的或失调的炎性应答可能导致过度的炎性症状、宿主组织损伤或组织功能损害。“炎性疾病”还是指通过白细胞流入和/或中性粒细胞趋化而介导的病理状态。
本文中使用的“炎症”是指由于组织损害或破坏而引发的局部、保护性应答，这可以用于破坏、稀释或杜绝(隔绝)有害成分和受损的组织。炎症显而易见地与白细胞流入和/或中性粒细胞趋化有关。炎症可以起因于病原生物体和病毒的感染，还可以起因于非传染性途径，例如创伤或心肌梗死或中风后的再灌注、外来抗原的免疫应答和自身免疫应答。因此，适合于采用式Ⅰ化合物治疗的炎性病症包括与特异性防御系统的反应以及非特异性防御系统的反应有关的病症。
“特异性防御系统”是指对于特定抗原的存在作出反应的免疫系统的组成部分。由特异性防御系统的应答导致的炎症的示例包括对外来抗原的典型应答、自身免疫性疾病和由T细胞介导的迟发型超敏反应应答。慢性炎性疾病、实体移植的组织和器官(例如肾和骨髓移植)的排斥以及移植物抗宿主病(GVHD)是特异性防御系统的炎性反应的进一步示例。
本文中使用的术语“非特异性防御系统”是指由不能免疫记忆的白细胞(例如粒细胞和巨噬细胞)介导的炎性病症。至少部分由非特异性防御系统反应导致的炎症的示例包括与下列病症相关的炎症：例如成人(急性)呼吸窘迫综合征(ARDS)或多器官损伤综合征；再灌注损伤；急性肾小球肾炎；反应性关节炎；具有急性炎症性成分的皮肤病；急性化脓性脑膜炎或其它中枢神经系统炎性疾病(例如中风)；热损伤；炎性肠病；粒细胞输注相关综合征；和细胞因子诱导的毒性。
本文所使用的“自身免疫性疾病”是指其中组织损伤与对人体自身成分由体液或细胞介导的反应相关的任何病症。
本文中使用的“过敏性疾病”是指由于过敏导致的任何症状、组织损伤或组织功能的丧失。本文中使用的“关节炎疾病”是指特征在于可归因于多种病因学的关节炎性病变的任何疾病。本文中使用的“皮炎”是指皮肤疾病大家族中的任何一种，其特征在于可归因于多种病因的皮肤炎性症病。本文中使用的“移植排斥”是指针对移植组织如器官或细胞(例如骨髓)的任何免疫反应，其特征在于接枝的和周围组织的功能丧失、疼痛、肿胀、白细胞增多和血小板减少。本发明的治疗方法包括用于治疗与炎性细胞活化有关的病症的方法。
“炎性细胞激活”是指在炎性细胞(包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、粒细胞(即多形核白细胞，如嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)、肥大细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞和内皮细胞)中通过增生性细胞响应的刺激物(包括但不限于细胞因子、抗原或自身抗体)的诱导、可溶性介质(包括但不限于细胞因子、氧自由基、酶、前列腺素或血管活性胺)的产生或者新的或增加数量的介质(包括但不限于主要组织相容性抗原或细胞粘附分子)的细胞表面表达。本领域技术人员应当理解，这些细胞中的这些表型的一种或组合的激活可以促进炎性疾病的发生、延续或恶化。
术语“NSAIDs”是“非甾体抗炎药”的缩写，是具有镇痛、解热(降低升高的体温并且在不损害意识的情况下缓解疼痛)作用的治疗药物，并且在较高剂量时，具有抗炎作用(减少炎症)。术语“非甾体”用于将这些药物与类固醇区别，其(在广泛的其它作用中)也有类花生酸抑制、抗炎作用。作为镇痛药，NSAIDs的与众不同在于它们是非麻醉性的。NSAIDs包括阿司匹林、布洛芬和萘普生。NSAIDs通常适用于其中存在疼痛和炎症的急性或慢性疾病的治疗。NSAIDs通常适用于下列疾病的症状缓解：类风湿性关节炎、骨关节炎、炎性关节病(例如强直性脊柱炎)、银屑病关节炎、莱特尔氏综合征、急性痛风、痛经、转移性骨痛、头痛和偏头痛、手术后疼痛、由于炎症和组织损伤导致的轻度至中度疼痛、发热、肠梗阻和肾绞痛。大多数的NSAIDs作为酶环氧合酶的非选择性抑制剂，同时抑制环氧合酶-1(COX-1)和环氧合酶-2(COX-2)同工酶。环氧合酶能够催化源自花生四烯酸(其本身通过磷脂酶A2衍生自细胞磷脂双分子层)的前列腺素和血栓素的形成。前列腺素(除其它外)扮演了炎症过程中的信使分子的角色。COX-2抑制剂包括塞来考昔、艾托考昔、罗美昔布、帕瑞考昔、罗非考昔和伐地考昔。
术语“癌症”是指或描述哺乳动物中的生理学状况，其典型特征在于失调的细胞生长。“肿瘤”包含一种或多种癌细胞。癌症的示例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体的示例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”)，肺腺癌和肺鳞状细胞癌；腹膜癌、肝细胞癌、胃癌包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头和颈癌。
“恶性血液病”(英英拼写“血液学”恶性肿瘤)是能够影响血液、骨髓和淋巴结的癌症类型。由于以上三者与免疫系统密切相关，影响以上三者之一的疾病往往也会影响到其它：尽管淋巴瘤是淋巴结的疾病，但它常常会传播到骨髓，影响血液。恶性血液病是恶性肿瘤(“癌症”)，它们通常由血液学和/或肿瘤学专家治疗。在某些中心，“血液学/肿瘤科”是内科的一个专科，而在其它地方，它们被认为是独立的部门(也有手术和放射肿瘤学家)。并非所有的血液病都是恶性的(“癌”)；这些其它血液病症也可以通过血液学专家进行治疗。恶性血液病可以派生自两个主要的血细胞系：骨髓和淋巴细胞系。骨髓细胞系通常产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞；淋巴细胞系产生B、T、NK和浆细胞。淋巴瘤、淋巴细胞性白血病和骨髓瘤源自淋巴系，而急性和慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征和骨髓增生性疾病起源于骨髓。白血病包括急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性单核细胞白血病(AMOL)和小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)。淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤(共有四种亚型)和非霍奇金淋巴瘤(NHL，所有亚型)。
“化疗药”是用于癌症治疗的化学化合物，无论是何种作用机制。化疗药的种类包括但不限于：烷化剂、抗代谢物、纺锤体毒植物生物碱、细胞毒药物/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、抗体、光敏剂和激酶抑制剂。化疗药包括用于“靶向治疗”和常规化疗中使用的化合物。化疗药的示例包括：依鲁替尼(IMBRUVICATM,APCI-32765,Pharmacyclics Inc./Janssen Biotech Inc.；CAS Reg.No.936563-96-1,US 7514444)、艾代拉利司(idelalisib)(原名CAL-101,GS 1101,GS-1101,Gilead Sciences Inc.；CASReg.No.1146702-54-6)、埃罗替尼(
Figure BDA0002445089910000111
Genentech/OSI Pharm.)、多西他赛(
Figure BDA0002445089910000112
Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶,CAS Reg.No.51-21-8)、吉西他滨(
Figure BDA0002445089910000113
Lilly)、PD-0325901(CAS No.391210-10-9,Pfizer)、顺铂(顺-二胺，二氯铂(II),CAS No.15663-27-1)、卡铂(CAS No.41575-94-4)、紫杉醇(
Figure BDA0002445089910000114
Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、曲妥珠单抗(
Figure BDA0002445089910000115
Genentech)、替莫唑胺(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮杂双环[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺,CAS No.85622-93-1,
Figure BDA0002445089910000119
Figure BDA0002445089910000116
Schering Plough)、他莫昔芬((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺,
Figure BDA0002445089910000117
)和多柔比星
Figure BDA0002445089910000118
Akti-1/2、HPPD和雷帕霉素。
化疗药包括Bcl-2抑制剂和JAK抑制剂。
更多的化疗药示例包括：奥沙利铂(
Figure BDA00024450899100001110
Sanofi)、硼替佐米(
Figure BDA00024450899100001112
Millennium Pharm.)、舒尼替尼(
Figure BDA00024450899100001111
SU11248,Pfizer)、来曲唑(
Figure BDA00024450899100001113
Novartis)、甲磺酸伊马替尼(
Figure BDA00024450899100001114
Novartis)、XL-518(考比替尼，MEK抑制剂，Exelixis，WO 2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制剂,AZD6244,ArrayBioPharma,Astra Zeneca)、SF-1126(PI3K抑制剂,Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制剂,Novartis)、XL-147(PI3K抑制剂,Exelixis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、氟维司群(
Figure BDA00024450899100001115
AstraZeneca)、亚叶酸、雷帕霉素(西罗莫司,
Figure BDA00024450899100001116
Wyeth)、拉帕替尼(
Figure BDA00024450899100001117
GSK572016,Glaxo Smith Kline)、洛那法尼(SARASARTM,SCH 66336,Schering Plough)、索拉非尼(
Figure BDA0002445089910000121
BAY43-9006,Bayer Labs)、吉非替尼(
Figure BDA0002445089910000122
AstraZeneca)、伊立替康(
Figure BDA0002445089910000123
CPT-11,Pfizer)、替吡法尼(ZARNESTRATM,Johnson&Johnson)、ABRAXANETM(不含Cremophor)、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Il)、凡德他尼(rINN,ZD6474,
Figure BDA0002445089910000124
AstraZeneca)、苯丁酸氮芥、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)、西罗莫司酯化物(
Figure BDA0002445089910000125
Wyeth)、帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)、坎磷酰胺(canfosfamide)(
Figure BDA0002445089910000126
Telik)、噻替派和环磷酰胺
Figure BDA0002445089910000127
烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如苯佐替派、卡波昆、美妥替哌和uredopa；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(methylamelamines)类，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基硫代磷酸胺和三甲基蜜胺(trimethylomelamine)；番荔素(acetogenins)(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱类(包括合成的类似物拓扑替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素类(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；a sarcodictyin；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺(氮芥)、氮芥氧化物盐酸盐、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲洛磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和ranimnustine；抗生素类，如烯二炔类抗生素(例如卡奇霉素、卡奇霉素γ1I、卡奇霉素ωI1(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.(1994)33:183－186)；dynemicin,dynemicin A；双膦酸类，例如氯膦酸盐；拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关的色蛋白烯二炔抗菌素发色团)、阿克拉霉素(Aclacinomycin)、放线菌素(Actinomycin)、氛茴霉素(Authramycin)、偶氮丝氨酸(Azaserine)、博来霉素(Bleomycin)、放线菌素C(Cactinomycin)、Carabicin、洋红霉素(Carminomycin)、嗜癌菌素(Carzinophilin)、色霉素(Chromomycin)、放线菌素D(Dactinomycin)、柔红霉素(Daunombicin)、地托比星(Detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉并-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(Epimbicin)、依索比星(Esombicin)、伊达比星(Idarubicin)、萘莫柔比星(nemorubicin)、麻西罗霉素(Marcellomycin)、丝裂霉素类(Mitomycins)(例如丝裂霉素C)、霉酚酸(Mycophenolic Acid)、诺拉霉素(Nogalamycin)、橄榄霉素(Olivomycin)、培洛霉素(Peplomycin)、泊非霉素(Porfiromycin)、嘌呤霉素(Puromycin)、三铁阿霉素(Quelamycin)、罗多比星(Rodorubicin)、链黑菌素(Streptonigrin)、链脲菌素(Streptozocin)、杀结核菌素(Tubercidin)、乌苯美司(Ubenimex)、净司他丁(Zinostatin)、佐柔比星(Zombicin)；抗代谢物类，例如氨甲蝶呤(Methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(Denopterin)、氨甲蝶呤(Methotrexate)、蝶罗呤(Pteropterin)、三甲曲沙(Trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(Fludarabine)、6-巯基嘌呤(Mercaptopurine)、硫脒嘌呤(Thiamiprine)、硫鸟嘌呤(Thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(Ancitabine)、阿扎胞苷(Azacitidine)、6-氮尿苷(Azauridine)、卡莫氟(Carmofiar)、阿糖胞苷(Cytarabine)、双脱氧尿苷(Dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(Doxifluridine)、依诺他滨(Enocitabine)、氟尿苷(Floxuridine)；雄激素类，例如卡鲁睾酮(Calusterone)、曲他雄酮丙酸盐(Dromostanolone Propionate)、环硫雄醇(Epitiostanol)、美雄烷(Mepitiostane)、睾内酯(Testolactone)；抗肾上腺类，例如氨鲁米特(Aminoglutethimide)、米托坦(Mitotane)、曲洛司坦(Trilostane)；叶酸补充剂，例如叶酸(Folinic Acid)；醋葡醛内酯(Aceglatone)；醒磷酰胺糖苷(AldophosphamideGlycoside)；氨基乙酰丙酸(Aminolevulinic Acid)；恩尿嘧啶(Eniluracil)；安吖啶(Amsacrine)；塔布辛(Bestrabucil)；比生群(Bisantrene)；依达曲沙(Edatraxate)；地磷酰胺(Defosfamide)；地美可辛(Demecolcine)；地吖醌(Diaziquone)；Elfornithine；依利醋铵(Elliptinium Acetate)；埃博霉素；依托格鲁(Etoglucid)；硝酸镓(galliumnitrate)；羟脲(Hydroxyurea)；香菇多糖(Lentinan)；氯尼达明(Lonidamine)；美登木素生物碱类(Maytansinoids)，例如美登素(Maytansine)和安丝菌素(Ansamitocin)；米托胍腙(Mitoguazone)；米托蒽醌(Mitoxantrone)；莫派达醇(Mopidamol)；尼曲吖啶(Nitracrine)；喷司他丁(Pentostatin)；蛋氨氮芥(Phenamet)；吡柔比星(Pirarubicin)；洛索蒽醌(Losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(Ethylhydrazide)；丙卡巴肼(Procarbazine)；
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多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(Razoxane)；根霉素(Rhizoxin)；西佐喃(Sizofiran)；锗螺胺(Spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(Tenuazonic Acid)；三亚胺醌(Triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(Trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(Verrucarin A)、杆孢菌素(Roridin A)和蛇形菌素(Anguidin))；乌拉坦(Urethan)；长春地辛(Vindesine)；达卡巴嗪(Dacarbazine)；甘露莫司汀(Mannomustine)；二溴甘露醇(Mitobronitol)；二溴卫矛醇(Mitolactol)；派泊溴烷(Pipobroman)；加胞嘧啶(Gacytosine)；阿糖胞苷(Ambinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派(Thiotepa)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物，例如顺铂(Cisplatin)和卡铂(Carboplatin)；长春花碱(Vinblastine)；依托泊苷(Etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(Ifosfamide)；米托蒽醌(Mitoxantrone)；长春新碱(Vincristine)；长春瑞滨(Vinorelbine)(NAVELBINE)；米托蒽醌(Novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(Edatrexate)；道诺霉素(Daunomycin)；氨基蝶呤(Aminopterin)；卡培他滨(capecitabine)(
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Roche)；伊班膦酸盐(Ibandronate)；CPT-11；拓朴异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸类(Retinoids)，例如视黄酸(Retinoic Acid)；以及任何上述药物的可药用的盐、酸和衍生物。
“化疗药”的定义中还包括：(i)能够调节或抑制针对肿瘤的激素作用的抗激素药，例如抗雌激素药和选择性雌激素受体调节剂(SERMs)，包括例如他莫昔芬(包括
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柠檬酸他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和
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(柠檬酸托瑞米芬)；(ii)能够抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其能够调节肾上腺中雌激素的产生，例如4(5)-咪唑类、氨鲁米特、
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(醋酸甲地孕酮)、
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(依西美坦；Pfizer)、福美坦、法倔唑、
Figure BDA0002445089910000145
(伏氯唑)、
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(来曲唑；Novartis)和
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(阿那曲唑；AstraZeneca)；(iii)抗雄激素药，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲他沙滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂，例如MEK抑制剂(WO 2007/044515)；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，尤其那些在与异常细胞增殖有关的信号通路中抑制了基因(例如PKC-α、Raf、H-Ras)表达的反义寡核苷酸，例如奥利默森(oblimersen)(
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Genta Inc.)；(vii)核酶，如VEGF表达抑制剂(例如
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)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，如基因治疗疫苗，例如
Figure BDA00024450899100001411
和
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rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂，例如
Figure BDA00024450899100001414
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rmRH；(ix)抗血管生成剂，例如贝伐单抗(
Figure BDA00024450899100001416
Genentech)以及任意上述药物的可药用的盐、酸或衍生物。
“化疗药”定义中还包括治疗性抗体，例如阿仑单抗(Campath)、贝伐单抗(
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Genentech)；西妥昔单抗(
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Imclone)；帕尼单抗(
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Amgen)、利妥昔单抗(
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Genentech/Biogen Idec)、帕妥珠单抗(OMNITARGTM,2C4,Genentech)、曲妥珠单抗(
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Genentech)、托西莫单抗(Bexxar,Corixia)和抗体药物缀合物，吉妥单抗奥唑米星(
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Wyeth)。
作为化疗药与本发明的Btk抑制剂组合使用的有治疗效能的人源化单克隆抗体包括：阿仑单抗、阿泊珠单抗、阿塞珠单抗、atlizumab、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、贝伐单抗、比伐单抗(bivatuzumab mertansine)、莫坎妥珠单抗(Cantuzumabmertansine)、西利珠单抗(cedelizumab)、赛妥珠单抗(certolizumab Pegol)、cidfusituzumab、cidtuzumab、达利珠单抗(daclizumab)、依库丽单抗(eculizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、泛维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、奥吉妥珠单抗(gemtuzumab ozogamicin)、奥英妥珠单抗(inotuzumabOzogamicin)、伊匹单抗(ipilimumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊珠单抗(mepolizumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、motovizumab、那他珠单抗(natalizumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、nolovizumab、numavizumab、ocrelizumab、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗、帕考珠单抗(pascolizumab)、pecfusituzumab、pectuzumab、帕妥珠单抗、培克珠单抗、ralivizumab、雷珠单抗、reslivizumab、瑞利珠单抗(reslizumab)、resyvizumab、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西利珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、替他珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗、特非珠单抗(tefibazumab)、托珠单抗、托利珠单抗(toralizumab)、曲妥珠单抗、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)、tucusituzumab、umavizumab、乌珠单抗(urtoxazumab)和维西珠单抗(visilizumab)。
“代谢物”是指定的化合物或其盐在体内通过代谢产生的产物。化合物的代谢物可以使用本领域中已知的常规技术来鉴定，它们的活动使用如本文所述的那些试验来确定。此类产物可能例如产生自所施用化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺化、酯化、脱酯化、酶裂解等。因此，本发明包括本发明化合物的代谢物，包括通过以下过程中产生的化合物：使得本发明的式I化合物与哺乳动物接触一段时间，该时间足以获得其代谢产物。
术语“包装说明书”用于指通常包含在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于与使用此类治疗产品有关的适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或警告的信息。
术语“手性”是指与镜像配对分子具有不可重叠性的分子，而术语“非手性”是指与其镜像配对分子具有可重叠性的分子。
术语“立体异构体”是指具有相同化学组成但原子或基团的空间排列不同的化合物。
“非对映体”是指具有两个或更多个手性中心并且其分子彼此不为镜像的立体异构体。非对映体具有不同的物理性质，例如熔点、沸点、光谱性质和反应性。非对映体的混合物可通过高分辨分析方法分离，例如电泳法和色谱法。
“对映体”是指化合物的两种立体异构体，其彼此的镜像为不可重叠的。
本文中使用的立体化学定义和惯例通常遵循S.P.Parker编写的McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；和Eliel,E.和Wilen,S.,“有机化合物的立体化学(Stereochemistry of Organic Compounds)”,John Wiley&Sons,Inc.,New York,1994。本发明的化合物可以含有不对称或手性中心，因此以不同的立体异构形式存在。本发明化合物所有立体异构形式，包括但不限于非对映体、对映体和阻转异构体以及它们的混合物如外消旋混合物，构成本发明的一部分。许多有机化合物存在光学活性形式，即它们具有旋转平面偏振光的平面的能力。在描述旋光学活性化合物时，前缀D和L或者R和S，用于表示该分子的手性中心的绝对构型。所述前缀d和l或(+)和(-)用于指定化合物对平面偏振光的旋转的符号，用(-)或l表示化合物是左旋的。带有(+)或d前缀的化合物是右旋的。对于给定的化学结构，这些立体异构体是相同的，只是它们是彼此的镜像。特定的立体异构还可被称为对映异构体，此类异构体的混合物通常称为对映体混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，这可能发生在化学反应或过程中没有立体选择性或立体专一性时。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”是指两种类型的对映体的没有光学活性的等摩尔混合物。对映体可以通过手性分离方法从外消旋混合物中分离，如超临界流体色谱(SFC)。在分离的对映异构体中手性中心构型的指定可以是试验性的(tentative)，为用于说明，在表1中给出结构，立体化学最终例如通过X-射线晶体数据确认。
术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指可以经由低能垒互相转化的不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(也称为质子异变互变异构体)包括经由质子迁移的互变现象，如酮-烯醇和亚胺-烯胺的异构化。化合价互变异构体包括通过某些结合电子的重排的互变现象。
术语“可药用的酸加成盐”是指不是生物学上或其它方面不合需要的盐。可药用的盐包括酸和碱加成盐。短语“可药用的”表示该物质或组合物必须是化学上和/或毒理学上可兼容的，包括与制剂的其它成分和/或采用其处理的哺乳动物。
术语“可药用的盐”是指那些与下列酸形成的可药用的盐：无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、碳酸、磷酸；选自脂族、环脂族、芳族、芳基-脂族、杂环、羧酸和磺酸类有机酸的有机酸：例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸、抗坏血酸、谷氨酸、邻氨基苯甲酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、扑酸、苯乙酸、甲磺酸“甲磺酸盐(酯)”、乙磺酸、对甲苯磺酸和水杨酸。
术语“可药用的碱加成盐”是指那些与有机或无机碱形成的可药用的盐。可药用的无机碱的示例包括钠、钾、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝的盐。从可药用的有机无毒碱衍生的盐包括下列的盐：伯、仲和叔胺；取代胺，包括天然存在的取代胺、环胺和碱性离子交换树脂，例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙基氨基乙醇、三甲胺、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶和聚胺树脂。
“溶剂化物”是指一或多个溶剂分子与本发明化合物的结合物或复合物。形成溶剂化物的溶剂的示例包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
术语“EC50”是半数最大有效浓度，是指能够在体内获得50％最大特定效果所需要的特定化合物的血浆浓度。
术语“Ki”是抑制常数，表示特定抑制剂与受体的绝对结合亲和力。其可以采用竞争结合实验测定，其等于当其中如果没有竞争配体(例如放射性配体)存在时特定抑制剂会占据受体50％的浓度。Ki值可以经对数转换为pKi值(-log Ki)，其中较高的值以指数方式表示更大的效能。
术语“IC50”是半数最大抑制浓度，是指能够在体外获得50％生物学过程抑制所需要的特定化合物的血浆浓度。IC50值可以经对数转换为pIC50值(-log IC50),其中较高的值以指数方式表示更大的效能。IC50值不是一个绝对值，而是取决于实验条件，例如使用的浓度，其可以使用Cheng-Prusoff方程转化为绝对抑制常数(Ki)(Biochem.Pharmacol.(1973)22:3099)。可以计算其它抑制百分比参数,例如IC70、IC90等。
“本发明化合物”和“式I化合物”包括式I化合物及其立体异构体、几何异构体、互变异构体、溶剂化物、代谢物和可药用的盐。
本文中给出的任何分子式或结构(包括式I化合物)也应当表示该化合物的水合物、溶剂化物和多晶型物以及它们的混合物。
本文中给出的任何分子式或结构(包括式I化合物)也应当表示该化合物的未标记形式以及同位素标记形式。同位素标记的化合物具有本文中给出的结构式所描绘的结构，但是其中的一或多个原子被具有选定原子或质量数的原子所代替。可以掺入到本发明化合物中的同位素的示例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，例如但不限于2H(氘,D)、3H(氚)、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl和125I。本发明包括各种同位素标记的本发明化合物，例如那些其中掺入放射性同位素(例如3H、13C和14C)的化合物。此类同位素标记的化合物可以用于代谢研究、反应动力学研究、检测或成像技术，例如正电子成像术(PET)或单光子发射计算机断层成像术(SPECT)，包括用于药物或底物组织分布实验或者用于患者的放射性治疗。本发明的氘标记的或取代的治疗性化合物已经提高了DMPK(药物代谢和药物动力学)特性，涉及分布、代谢和排泄(ADME)。由于其具有较好的代谢稳定性，采用较重同位素(特别是氘)的取代可以提供一定的治疗上的益处，例如增加体内半衰期或降低剂量需求。18F标记的本发明化合物可以用于PET或SPECT研究。通常，可以根据下文所述实施例和制备方法中所公开的方法，采用容易获得的同位素标记试剂代替非同位素标记试剂，制备同位素标记的本发明化合物及其前药。另外，由于其具有较好的代谢稳定性，采用较重同位素(特别是氘(即2H或D))的取代可以提供一定的治疗上的益处，例如增加体内半衰期或降低剂量需求或者改善治疗指数。应当理解，在本文中氘可以被视为是式(I)化合物的取代基。此类较重同位素(特别是氘)的浓度可以通过同位素富集因子定义。在本发明的化合物中，没有特别指定为具体同位素的任何原子应当表示该原子的任何稳定的同位素。除非另有说明，当一个位置被特别指定为“H”或“氢”时，所述位置应理解为其天然丰度同位素组成的氢。因此，在本发明化合物中，被特别指定为氘(D)的任何原子应当是表示氘。
吡唑甲酰胺化合物
本发明提供了式I的吡唑甲酰胺化合物及其药物制剂，其可以有效地用于治疗由Btk调节的疾病和/或病症。
式I化合物具有下列结构或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐：
Figure BDA0002445089910000191
其中：
X为CH或N；
R1、R2和R3独立选自H、-C(O)NH2、C6-C20芳基、C3-C12碳环基、C2-C20杂环基、C1-C20杂芳基、-NH2、-NH-(C6-C20芳基)、-NH-(C1-C20杂芳基)、-C(O)-(C1-C12烷基)、-C(O)-(C3-C12碳环基)、-NH-(C1-C12亚烷基)-(C2-C20杂环基)、-NH-(C1-C20杂芳基)-(C2-C20杂环基)、-NHC(O)-(C3-C12碳环基)、-NHC(O)-(C1-C12烷基)、-(C6-C20芳基)-C(O)-(C2-C20杂环基)和-(C1-C20杂芳基)-(C2-C20杂环基)；
或R1和R2任选形成稠合的6元芳基、碳环基、杂环基或杂芳基环；
至少一个R1、R2和R3为-C(O)NH2；
R4选自H、F、Cl、CN、-CH2OH、-CH(CH3)OH、-C(CH3)2OH、-CH(CF3)OH、-CH2F、-CHF2、-CH2CHF2、-CF3、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NHC(O)CH3、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2OH、环丙基、环丙基甲基、1-羟基环丙基、咪唑基、吡唑基、3-羟基-氧杂环丁烷-3-基、氧杂环丁烷-3-基和氮杂环丁烷-1-基；
R5为H、F、Cl或CN；
R6选自下列结构：
Figure BDA0002445089910000201
Figure BDA0002445089910000211
其中波浪线表示连接点；并且
烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基任选被一或多个独立选自下列的基团取代：F、Cl、Br、I、-CN、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH2NH2、-CH2NHCH3、-CH2N(CH3)2、-CH2OH、-CH2OCH3、-CH2CH2OH、-C(CH3)2OH、-CH(OH)CH(CH3)2、-C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2SO2CH3、-CH2OP(O)(OH)2、-CH2F、-CHF2、-CF3、-CH2CF3、-CH2CHF2、-CH(CH3)CN、-C(CH3)2CN、-CH2CN、-CO2H、-COCH3、-CO2CH3、-CO2C(CH3)3、-COCH(OH)CH3、-CONH2、-CONHCH3、-CON(CH3)2、-CONH(CH2CH2N(CH3)2)、-C(CH3)2CONH2、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NHCOCH3、-N(CH3)COCH3、-NHS(O)2CH3、-N(CH3)C(CH3)2CONH2、-N(CH3)CH2CH2S(O)2CH3、-NO2、＝O、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2OCH3、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2N(CH3)2、-OP(O)(OH)2、-S(O)2N(CH3)2、-SCH3、-S(O)2CH3、-S(O)3H、环丙基、氧杂环丁基、氮杂环丁基、1-甲基氮杂环丁烷-3-基)氧基、N-甲基-N-氧杂环丁烷-3-基氨基、氮杂环丁烷-1-基甲基、吡咯烷-1-基和吗啉代。
式I化合物的典型的实施方案包括其中X为N.
式I化合物的典型的实施方案包括其中X为CH.
式I化合物的典型的实施方案包括其中R1为-C(O)NH2.
式I化合物的典型的实施方案包括其中R2为-C(O)NH2。
式I化合物的典型的实施方案包括其中R3为-C(O)NH2。
式I化合物的典型的实施方案包括其中R1、R2和R3中的一个为-NH-(C6-C20芳基)或-NH-(C1-C20杂芳基),其中芳基和杂芳基任选被一或多个独立选自下列的基团取代：F、Cl、Br、I、-CN、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH2NH2、-CH2NHCH3、-CH2N(CH3)2、-CH2OH、-CH2OCH3、-CH2CH2OH、-C(CH3)2OH、-CH(OH)CH(CH3)2、-C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2SO2CH3、-CH2OP(O)(OH)2、-CH2F、-CHF2、-CF3、-CH2CF3、-CH2CHF2、-CH(CH3)CN、-C(CH3)2CN、-CH2CN、-CO2H、-COCH3、-CO2CH3、-CO2C(CH3)3、-COCH(OH)CH3、-CONH2、-CONHCH3、-CON(CH3)2、-CONH(CH2CH2N(CH3)2)、-C(CH3)2CONH2、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NHCOCH3、-N(CH3)COCH3、-NHS(O)2CH3、-N(CH3)C(CH3)2CONH2、-N(CH3)CH2CH2S(O)2CH3、-NO2、＝O、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2OCH3、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2N(CH3)2、-OP(O)(OH)2、-S(O)2N(CH3)2、-SCH3、-S(O)2CH3、-S(O)3H、环丙基、氧杂环丁基、氮杂环丁基、1-甲基氮杂环丁烷-3-基)氧基、N-甲基-N-氧杂环丁烷-3-基氨基、氮杂环丁烷-1-基甲基、吡咯烷-1-基和吗啉代。
式I化合物的典型的实施方案包括其中R4为-CH2OH。
式I化合物的典型的实施方案包括其中R5为H。
式I化合物的典型的实施方案包括其中R6为：
Figure BDA0002445089910000221
式I化合物的典型的实施方案包括其中R6为：
Figure BDA0002445089910000222
式I化合物的典型的实施方案包括其中所述化合物选自表1。
本发明的式I化合物可以包含不对称或手性中心，因此存在不同的立体异构体形式。本发明化合物的所有立体异构形式应当包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体以及它们的混合物(例如外消旋混合物)，它们构成了本发明的一部分。在某些情况下，立体化学尚未确定，或者临时(provisionally)指定。
此外，本发明包括所有非对映体，包括顺-反(几何)和构象异构体。例如，如果式I化合物包含双键或稠合的环，则顺式-和反式-形式以及它们的混合物均包含在本发明的范围内。
在本文所示的结构中，当未指定任何具体手性原子的立体化学时，则应当考虑所有立体异构体并且包括在本发明的化合物中。当立体化学通过用代表特定构型的实楔或虚线表示时，则该立体异构体如此指定和定义。
本发明化合物可以以非溶剂化物或可药用的溶剂的溶剂化物形式存在，所述溶剂为例如水、乙醇等，本发明应当涵盖溶剂化和非溶剂化这两种形式。
本发明化合物也可以存在不同的互变异构形式，所有这些形式均包括在本发明的范围之内。术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指可以经由低能垒互相转化的不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(也称为质子异变互变异构体)包括经由质子迁移的互变现象，如酮-烯醇和亚胺-烯胺的异构化。化合价互变异构体包括通过某些结合电子的重排的互变现象。
生物学评价
作为酶活性(或其它生物学活性)抑制剂的式Ⅰ化合物的相对功效可以通过测定每个化合物抑制所述活性至预定程度的浓度然后比较获得的结果进行确定。通常，优选的测定为在生化测定中抑制活性达50％的浓度，即50％抑制浓度或“IC50”。IC50值的测定可使用本领域中已知的常规技术来完成。在一般情况下，IC50值可以通过测定所研究的抑制剂浓度范围内给定酶的活性来确定。然后使用实验获得的酶活性的值对使用的抑制剂的浓度作图。显示50％的酶活性(相对于不存在任何抑制剂的活性)的抑制剂的浓度作为IC50值。类似地，其它抑制剂浓度可通过适当的活性测定确定。例如，在某些情况下，可以确定90％抑制浓度，即IC90等。
I化合物可以通过标准生物化学Btk激酶试验(实施例901)测试。
可以用于测试式I化合物的标准细胞Btk激酶试验的通用方法为Ramos细胞Btk试验(实施例902)。
标准细胞B-细胞增生试验可以用于测试式I化合物与源自Balb/c小鼠脾脏纯化的B-细胞(实施例903)。
标准细胞T-细胞增生试验可以用于测试式I化合物与源自Balb/c小鼠脾脏纯化的T-细胞(实施例904)。
式I化合物的CD86抑制试验可以通过采用纯化自8-16周龄Balb/c小鼠脾脏的小鼠全脾细胞的抑制B细胞活性进行(实施例905)。
式I化合物的B-ALL细胞存活试验可以通过测定在培养基中存活的B-ALL细胞数进行(实施例906)。
式I化合物的CD69全血试验可以通过测定化合物抑制通过表面IgM与山羊F(ab’)2抗人IgM的交联激活人全血中B淋巴细胞的CD69的产生的能力进行(实施例907)。CD69为与淋巴细胞迁移和细胞因子分泌有关的一类II C-型凝聚素。CD69表达代表了白细胞激活的最初可获得的标识之一，其快速诱导通过转录激活发生(Vazquez等(2009)Jour.ofImmunology Published October 19,2009,doi:10.4049/jimmunol.0900839)。通过选择性Btk抑制剂的抗原受体刺激的浓度依赖性抑制能够诱导淋巴细胞激活标记物CD69的细胞表面表达(Honigberg等(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.107(29):13075－13080)。因此，通过选择性Btk抑制剂的CD69抑制可能与某些B-细胞疾病的疗效有关。在表1中给出了示例性式I化合物的CD69 Hu Blood FACS IC70值。
式I化合物的抗炎作用也可以通过小鼠或大鼠的胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)试验测试(William RO(2004)Methods of Mol.Med.98:207－216)。胶原蛋白诱导的关节炎为类风湿性关节炎(RA)的动物模型，其被广泛用于解决疾病发病机理的问题并验证治疗靶点。关节炎通常通过在辅助剂中采用自体或异源II型胶原蛋白进行免疫作用在小鼠或大鼠中诱导产生。对胶原蛋白诱导的关节炎的易感性与主要组织相容性复合物II型基因密切相关，关节炎的发展伴随着健康T-和B-细胞对II型胶原蛋白的响应。CIA的主要病理性特征包括具有多形核和单核细胞渗透、关节翳形成、软骨退化、骨侵蚀和纤维化的增生性滑膜炎。在RA中，促炎性细胞因子(例如肿瘤坏死因子α(TNFα)和白介素(IL)-1β)在CIA小鼠的患关节炎的关节中大量表达，这些分子的阻断导致了疾病严重程度的降低。采用式I化合物的制剂注入试验对象的尾端，通过全身性给予在不完全佐剂(Incomplete Freund adjuvant)中的胶原蛋白使得关节炎的发作同步发生(升高)。爪子和肢体关节的炎症采用包括爪子评价的计分系统量化。
式I的示例性化合物的细胞毒性或细胞抑制活性可以如下测定：在细胞培养基中建立增生的哺乳动物肿瘤细胞系，加入式I化合物，将细胞培养约6小时至约5天；和测定细胞存活力(实施例908)。基于细胞的体外测定用于测定存活力，即增生(IC50)、细胞毒性(EC50)和细胞凋亡的诱导(半胱天冬酶激活)，其可以用于预测对血液恶性肿瘤和实体瘤的临床疗效。
式I化合物与化疗药物的组合的体外效能可以通过实施例908的细胞增生试验测定；CellTiter-
Figure BDA0002445089910000241
发光细胞存活力试验,购自Promega Corp.,Madison,WI。该均相试验方法基于鞘翅目荧光素酶的重组表达(US 5583024；US 5674713；US 5700670)，基于存在的ATP(一种代谢活化的细胞的指示剂)量化方法测定培养基中存活细胞数(Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160:81－88；US 6602677)。CellTiter-
Figure BDA0002445089910000242
试验以96或384孔模式进行，使其适合于进行自动化高通量筛选(HTS)(Cree等(1995)AntiCancer Drugs 6:398－404)。该均相试验方法包括直接向补充有血清的介质中培养的细胞中加入单一试剂(CellTiter-
Figure BDA0002445089910000252
Reagent)。无需细胞洗涤、介质除去以及多次移液步骤。加入试剂并混合后，10分钟系统检测384孔模式中的少至15个细胞/孔。
均相“加入-混合-检测”模式导致细胞裂解，发光信号的产生与存在的ATP量成比例。ATP的量与培养基中存在的细胞数成正比。CellTiter-
Figure BDA0002445089910000253
试验产生了“光晕型”发光信号，由荧光素酶反应产生，其半衰期通常大于5小时，这取决于细胞类型和使用的介质。存活细胞体现为相对发光单位(RLU)。底物(Beetle荧光素)通过重组萤火虫荧光素酶氧化脱羧，同时ATP转化为AMP并产生光子。半衰期的延长不再需要使用试剂注射器，提供了多个板的连续的或批模式处理的灵活性。该细胞增生试验可以采用各种多孔模式进行，例如96或384孔模式。通过光度计或CCD像机成像设备记录数据。发光输出表示为随时间变化的相对光度单位(RLU)。
式I的示例性化合物及其与化疗药物的组合的抗增生性效能可以通过对抗某些血液学肿瘤细胞系的CellTiter-
Figure BDA0002445089910000254
试验(实施例908)测定。确定试验化合物和组合产品的EC50值。
根据本发明的方法制备、表征表1中的典型式I化合物并测试其Btk的抑制，其具有下列结构及相应的名称(ChemDraw Ultra,Version 11.0.1,和ChemBioDraw,Version11.0,CambridgeSoft Corp.,Cambridge MA)。当式I化合物或中间体具有一个以上的名称时，则用化学结构定义该化合物。
在与BTK结合中以及在CD69全血试验中，表1中的示例性式I化合物显示了与对抗某些B细胞疾病疗效有关的令人惊奇的和出乎意料的特性。
表1.
Figure BDA0002445089910000251
Figure BDA0002445089910000261
Figure BDA0002445089910000271
Figure BDA0002445089910000281
Figure BDA0002445089910000291
Figure BDA0002445089910000301
Figure BDA0002445089910000311
Figure BDA0002445089910000321
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Figure BDA0002445089910000341
Figure BDA0002445089910000351
Figure BDA0002445089910000361
Figure BDA0002445089910000371
Figure BDA0002445089910000381
式I化合物的给药
本发明化合物可通过适合于待治疗的病症的任何途径给药。适当的途径包括口服、肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、动脉内、皮内、鞘内和硬膜外)、透皮、直肠、鼻、局部(包括口腔和舌下)、阴道、腹膜内、肺内和鼻内。对于局部免疫抑制治疗而言，该化合物可通过病灶内给药，包括灌注或在移植前采用抑制剂以其它方式与移植物接触。应当理解，优选的途径可以例如根据接收者的条件而改变。当该化合物口服给药时，它可以与可药用的载体或赋形剂一起配制成丸剂、胶囊剂、片剂等。当化合物肠胃外给药时，其可以与可药用的肠胃外载体一起以单位剂量可注射形式配制，如下文详述。
治疗人类患者的剂量范围为约10mg至约1000mg的式I化合物。典型剂量可以为约100mg至约300mg的化合物。剂量可以为每日一次(QID)给药，每天两次(BID)给药或更频繁给药，这取决于药物代谢动力学和药效学性质，包括具体化合物的吸收、分布、代谢和排泄。此外，毒性因素可能影响剂量和给药方案。当口服给药时，丸剂、胶囊或片剂可每日摄入或者在指定的时间段内较不频繁地摄入。该方案可以重复多个治疗周期。
式I化合物的治疗方法
本发明的式I化合物可以用于治疗患有由与Btk的相关的异常细胞生长、功能或行为引发的疾病或病症的人或动物患者，因此，例如免疫疾病、心血管疾病、病毒感染、炎症、代谢/内分泌疾病或神经性疾病也可以通过包括给予如上文所定义的本发明化合物的方法进行治疗。患有癌症的人类或动物患者也可以通过包括给予如上文所定义的本发明化合物的方法进行治疗。患者的病症由此可以提高或改善。
式I化合物可以在体外、原位和体内用于诊断或治疗哺乳动物细胞、器官或相关病理学病症，例如全身和局部炎症、免疫-炎性疾病如类风湿关节炎、免疫抑制、器官移植排斥、过敏、溃疡性结肠炎、克罗恩病、皮炎、哮喘、系统性红斑狼疮、干燥综合征、多发性硬化、硬皮病/系统性硬化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、抗中性粒细胞细胞质抗体(ANCA)血管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、银屑病和用于一般关节保护作用。
本发明的方法也包括治疗此类疾病，例如关节炎疾病，如类风湿关节炎、单关节关节炎、骨关节炎、痛风性关节炎、脊椎炎；Behcet病；败血症、败血性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性败血症、革兰氏阳性败血症、中毒性休克综合征；继发于败血症的多器官损伤综合征、创伤或出血；眼部疾病，例如过敏性结膜炎、春季结膜炎、葡萄膜炎和甲状腺相关眼病；嗜酸性肉芽肿；肺或呼吸道病症，例如哮喘、慢性支气管炎、过敏性鼻炎、ARDS、慢性肺部炎性疾病(例如慢性阻塞性肺病)、矽肺、肺结节病、胸膜炎、肺泡炎、脉管炎、肺气肿、肺炎、支气管扩张和肺氧中毒；心肌、脑或四肢的再灌注损伤；纤维化，例如囊性纤维化；瘢痕疙瘩形成或瘢痕组织形成；动脉粥样硬化；自身免疫疾病，例如系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性甲状腺炎、多发性硬化、某些形式的糖尿病和雷诺氏综合征；移植排斥疾病，例如GVHD和异种移植排斥反应；慢性肾小球肾炎；炎性肠病，例如慢性炎症性肠病(CIBD)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和坏死性小肠结肠炎；炎性皮肤病，例如接触性皮炎、特应性皮炎、牛皮癣或荨麻疹；发热和由于感染导致的肌痛；中枢或外周神经系统的炎性病症，例如脑膜炎、脑炎、由于微小创伤导致的脑或脊髓损伤；干燥综合征；涉及白细胞渗出的疾病；酒精性肝炎；细菌性肺炎；抗原-抗体复合物介导的疾病；低血容量性休克；I型糖尿病；急性和迟发性超敏反应；由于白细胞失调和转移导致的疾病状态；热损伤；粒细胞输血相关综合症；细胞因子诱导的毒性。
本发明的方法还包括治疗选自下列的癌症：乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、生殖泌尿道癌、食道癌、喉癌、成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、胃癌、皮肤癌、角化棘皮瘤、肺癌、表皮样癌、大细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞癌、肺腺癌、骨癌、结肠癌、腺瘤、胰腺癌、腺癌、甲状腺癌、滤泡癌、未分化癌、乳头状癌、精原细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、膀胱癌、肝癌和胆道癌、肾癌、胰腺癌、骨髓疾病、淋巴瘤、毛细胞癌、口腔癌、鼻咽癌、咽癌、唇癌、舌癌、口癌、小肠癌、结肠-直肠癌、大肠癌、直肠癌、脑和中枢神经系统癌、霍奇金病、白血病、支气管癌、甲状腺癌、肝和肝内胆管癌、肝细胞癌、胃癌、神经胶质瘤/成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾和肾盂癌、膀胱癌、子宫体癌、子宫颈癌、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴细胞性白血病、慢性淋巴性白血病(CLL)、骨髓性白血病、口腔和咽癌、非霍奇金淋巴瘤、黑素瘤和绒毛状结肠腺瘤。
本发明的方法可以有效地用于治疗患有或可能患有再灌注损伤的个体，即其中组织或器官经历一段时间局部缺血随后再灌注的情况下产生的伤害。术语“缺血”是指由于动脉血流入阻塞导致的局部组织贫血。再灌注后短暂性局部缺血通过受影响部位血管内皮细胞特征性地导致中性粒细胞活化和迁移。然后活化的中性粒细胞的集聚又导致了反应性氧代谢物的产生，这损坏了相关组织或器官的组成成分。“再灌注损伤”的这种现象通常与下列病症有关：例如血管性中风(包括全身性和局部缺血)、失血性休克、心肌缺血或梗塞、器官移植和脑血管痉挛。举例说明，一旦心脏无法接收血液，那么当开始心脏再灌注时，再灌注损伤就会发生在心脏搭桥手术终止时或在心脏骤停期间。预期Btk活性的抑制可以导致在这种情况下减少再灌注损伤的量。
药物制剂
为了使用本发明化合物对哺乳动物(包括人)进行治疗性治疗，通常将其按照标准药学实践配制为药物组合物。根据本发明的这一方面，提供了药用组合物，其包含本发明化合物以及与之结合的可药用的稀释剂或载体。
典型的制剂可以通过将本发明化合物与载体、稀释剂或赋形剂混合来制备。适当的载体、稀释剂和赋形剂是本领域技术人员公知的，包括下列材料：如碳水化合物、蜡类、水溶性和/或可溶胀聚合物、亲水性或疏水性材料、明胶、油、溶剂、水等。使用的具体的载体、稀释剂或赋形剂取决于应用本发明化合物的方式和目的。溶剂通常选择本领域技术人员公认为可以安全(GRAS)给药于哺乳动物的溶剂。在一般情况下，安全的溶剂是无毒的水性溶剂，例如水和其它可在水中溶解或混溶的无毒溶剂。适当的水性溶剂包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(例如PEG 400、PEG 300)等以及它们的混合物。该制剂还可以包含一种或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、矫味剂和其它已知的添加剂，从而可以提供具有良好外观的药物(即本发明化合物或其药物组合物)或用于生产药用产品(即药物)的辅料。
所述制剂可以使用常规的溶解和混合方法来制备。例如，在一种或多种的上述辅料存在下，将批量药物(即本发明化合物或稳定形式的该化合物(例如，与环糊精衍生物或其它已知的络合剂的复合物))溶解在适当的溶剂中。本发明化合物通常配制成药物剂型，以提供药物的容易控制的剂量并且使得患者顺应处方的治疗方案。
应用的药物组合物(或制剂)可以包装成各种形式，这取决于给药的方法。一般而言，用于配送的物品包括以适当的形式在其中盛放药物制剂的容器。适当的容器是本领域技术人员公知的，包括例如瓶(塑料和玻璃)、小袋、安瓿、塑料袋、金属圆筒等。容器还可以包括防干扰(tamper-proof)配备，以防止对包装内容物的不慎接触。此外，在该容器上有描述容器的内含物的标签。标签还可以包括适当的警告用语。
本发明化合物的药物制剂可以制备用于各种途径和类型的给药备。例如，具有期望纯度的式I化合物可任选与可药用的稀释剂、载体、赋形剂或稳定剂(雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)(1980)第16版,Osol,A.Ed.)混合，制成冻干制剂形式、研磨的粉末或水溶液。在环境温度下、在适当的pH值下、以需要的纯度，制剂可以通过与生理学可接受的载体混合进行，即在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的载体。所述制剂的pH主要取决于具体用途和化合物的浓度，但其范围可为约3至约8。适当的实施方案是在pH 5的乙酸盐缓冲液中的制剂。
化合物通常可以存储为固体组合物、冻干制剂或水溶液。
本发明的药用组合物可以根据良好医疗实践的方式配制、给药和施用，即给药的量、浓度、方案、周期、载体和途径。在此背景下考虑的因素包括特定待治疗的病症、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的起因、递送药剂的部位、施药的方法、施药方案以及医师公知的其它因素。待给药的化合物的“治疗有效量”取决于此类多种因素，并且是改善或治疗过度增生性疾病所必需的最小量。
作为一般建议，每次非胃肠道给药的抑制剂的初始药物有效量的范围为约0.01－100mg/kg，即约0.1至20mg/kg患者体重，使用的化合物的典型初始剂量范围为0.3至15mg/kg/天。
可接受的稀释剂、载体、赋形剂和稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚，丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲基或丙基酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。在胶体药物传递系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)或在大珠滴乳液(macroemulsions)中，活性药物成分也可以包封在制备的微囊中，例如通过凝聚技术或通过界面聚合技术制备，分别例如羟甲基纤维素或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊。此类技术公开于《雷明顿药物科学》，第16版,Osol,A.Ed.(1980)。
可以制备式I化合物的缓释制剂。缓释制剂的适当的示例包括含有式I化合物的固体疏水聚合物的半渗透基质，该基质是成形制品，例如薄膜或微囊形式。缓释基质的示例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(US 3773919)、L-谷氨酸和γ-乙基L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的注射用微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
所述制剂包括适合于本文中详述的给药途径的那些制剂。所述制剂可以方便地以单位剂型存在，可以通过药学领域中公知的任何方法来制备。技术和制剂通常可以发现于《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)(Mack Publishing Co.,Easton,PA)。此类方法包括将活性成分与由一种或多种辅料成分组成的载体一起混合的步骤。一般而言，制剂可以通过如下方法制备：使得活性成分与液体载体或细粉固体载体或它们两者均匀地和紧密地结合，然后，如果需要的话，使产物成形。
适于口服给药的式I化合物的制剂可以制备为离散的单位，例如丸剂、胶囊剂、扁囊剂或片剂，其各自含有预定量的式I化合物。压制片剂可以通过在适当的机器中将自由流动形式(如粉末或颗粒)的活性成分压缩来制备，上述成分可以任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合。模制片剂可以通过在适当的机器中将用惰性液体稀释剂润湿的粉末状活性成分的混合物模制来制备。所述片剂可以任选进行包衣或刻痕，任选进行配制以提供活性成分的缓慢或控制释放。可以制备用于口服的片剂、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散粉末或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊例如明胶胶囊、糖浆剂或酏剂。用于口服使用的式I化合物的制剂可根据本领域已知的用于生产药物组合物的任何方法制备，此类组合物可以含有一种或多种成分，包括甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂，以便于提供适口的制剂。含有活性成分以及与之混合的适合于生产片剂的无毒的可药用赋形剂的片剂是可以接受的。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，如碳酸钙或碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，如玉米淀粉或海藻酸；结合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以是未包衣的，或者可以通过已知技术进行包衣(包括微囊化)以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供较长时间的持续作用。例如，可以采用延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯单独使用，或者与蜡类一起使用。
对于治疗眼睛或其它外部组织而言，例如口腔和皮肤，制剂优选采用含有活性成分的局部软膏剂或乳膏，所述活性成分的量为0.075至20％w/w。当在软膏剂中配制时，活性成分可以与石蜡或水可混溶的软膏基质一起使用。或者，活性成分可以与水包油乳膏基质一起配制成乳膏。如果需要，乳膏基质的水相可以包括多元醇，即具有两个或多个羟基的醇，例如丙二醇、丁-1,3-二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇(包括PEG 400)以及它们的混合物。外用制剂最好可以包含能够促进活性成分通过皮肤或其它受影响部位的吸收或渗透的化合物。此类皮肤渗透促进剂的示例包括二甲基亚砜及其相关类似物。本发明的乳剂的油相可以通过已知的方式由已知成分构成。当相仅包含一种乳化剂时，其最好包含至少一种乳化剂与脂肪或油或者与脂肪和油两者一起的混合物。优选，同时包含亲水性乳化剂与作为稳定剂的亲脂性乳化剂。还优选同时包含油和脂肪。含有或不含有稳定剂的乳化剂组成了所谓的乳化蜡，该蜡与油和脂肪一起组成所谓的乳化软膏基质，其形成乳膏制剂的油分散相。适用于本发明的制剂使用的乳化剂和乳剂稳定剂包括
Figure BDA0002445089910000432
60、
Figure BDA0002445089910000431
80、鲸蜡硬脂醇、苄醇、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯和月桂基硫酸钠。
式I化合物的水性混悬液含有活性物质以及与之混合的适于制备水性混悬液的赋形剂。此类赋形剂包括助悬剂，如羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素、聚维酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂，如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)，环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物(如聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂族醇(例如十七乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol))的缩合产物、环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的缩合产物(如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂(例如乙基或正丙基对羟基苯甲酸酯)、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂(例如蔗糖或糖精)。
式I化合物的药用组合物可以是无菌注射制剂的形式，例如无菌可注射水性或油性混悬液。该混悬液可以根据本领域中已知的方法采用如上所述的那些适当的分散剂或湿润剂和助悬剂制备。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬液，例如在1,3-丁二醇中的溶液，或作为冻干粉末制备。可以使用的可接受的介质和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油可以常规地用作溶剂或混悬介质。为此目的，任何温和的固定油都可以使用，包括合成的单或二甘油酯。此外，脂肪酸(如油酸)同样可用于制备注射剂。
可与载体物质结合以产生单一剂型的活性成分的量取决于所治疗的宿主和具体的给药模式。例如，预期用于口服给药于人类的定时释放制剂可含有约1－1000mg的活性物质，其与适当和方便量的载体材料结合，该载体材料为组合物总重量的约5至约95％(重量:重量)。该药物组合物可以制备以提供容易测定的给药量。例如，用于静脉内输注的水溶液每毫升可以含有约3－500μg活性成分以便于以约30mL/hr的速度输注适当的体积。
适用于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂能够与预期接受者的血液等渗的溶质；还包括水性和非水性无菌混悬液，其可包括助悬剂和增稠剂。
适用于局部给药至眼睛的制剂还包括滴眼剂，其中活性成分溶解或悬浮于合适的载体中，尤其是用于活性成分的水性溶剂。所述活性成分优选以约0.5－20％w/w的浓度存在于此类制剂中，例如约0.5－10％w/w，例如约1.5％w/w。
适用于在口腔中局部给药的制剂包括：锭剂，其含有在调味基质(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的活性成分；软锭剂，其包含在惰性基(例如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯胶)中的活性成分；漱口剂，其包含在适当的液体载体中的活性成分。
适用于直肠给药的制剂可以为栓剂，其包含适当的惰性基质，例如可可脂或水杨酸酯。
适用于肺内或鼻腔给药的制剂的粒径范围为例如0.1－500微米(包括增量为微米例如0.5、1、30微米、35微米的粒径范围在0.1－500微米)，其可以通过鼻腔通道快速吸入给药，或者通过口腔吸入给药，以便于到达肺泡小囊。适当的制剂包括活性成分的水性或油性溶液。适用于气雾剂或干粉给药的制剂可以根据常规方法制备，可以与其它治疗药物一起传递，例如目前用于治疗或预防下面所述疾病的化合物。
适用于阴道给药的制剂可以为阴道栓剂、棉塞、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂，除活性成分外其含有如本领域中已知的适当的载体。
所述制剂可以包装在单剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，可以以冷冻干燥(冻干)状态存储，在即将使用之前仅需要加入无菌液体载体(例如水)用于注射。即时注射溶液和混悬液可以制备自先前描述种类的无菌粉末、颗粒和片剂。优选的单位剂量制剂是含有如本文上述或其适当部分的日剂量或单位每日亚剂量的活性成分的那些制剂。
本发明还提供了兽用组合物，其包含至少一种如上所定义的活性成分以及兽用载体。兽用载体是用于施用所述组合物的材料，其可以是固体、液体或气体材料，这些材料是惰性的或在兽医领域中是可接受的，并且与活性成分相容。这些兽用组合物可以通过肠胃外给药、口服给药或通过任何其它期望的途径给药。
组合疗法
式I化合物可以单独使用，或者与用于治疗本文中所述疾病或病症的其它治疗药物组合使用，例如炎症或过度增生性疾病(例如癌症)。在某些实施方案中，式I化合物可以在药物组合产品中或给药方案中与其它第二种治疗化合物组合，所述第二种治疗化合物具有抗炎或抗增生性质，或者其可以用于治疗炎症、免疫应答疾病或过度增生性疾病(例如癌症)。所述其它治疗药可以是Bcl-2抑制剂、JAK抑制剂、抗炎药、免疫调节剂、化疗药、细胞凋亡增强剂、神经营养因子、用于治疗心血管疾病的药物、用于治疗肝病的药物、抗病毒药物、用于治疗血液疾病的药物、用于治疗糖尿病的药物和用于治疗免疫缺陷疾病的药物。第二种治疗药物可以是NSAID抗炎药。第二治疗药物可以是化学治疗剂。药物组合制剂或给药方案的第二种化合物优选对式I化合物具有互补活性，如此可以使得它们不会不利地彼此影响。此类化合物合适地存在于组合产品中的量应当能够有效地用于预期目的。在一个实施方案中，本发明的组合物包含式I化合物或其立体异构体、互变异构体、溶剂化物、代谢物或其药学上可接受的盐或其前药的它们的化合物，其与治疗药物组合，例如NSAID。
所述组合治疗可以作为同时或序贯方案施用。当顺序给药时，所述组合可以以两次或两次以上的给药施用。组合给药包括使用不同制剂或者单一的药物制剂的共同给药，以及以任意顺序的连续给药，其中优选在一段时间内两种(或所有)活性药物能够同时发挥其生物学活性。
任何上述共同给药的药物的适当的剂量是那些目前所使用的剂量，该剂量由于新指定的药物和其它治疗药物或疗法的组合作用(协同作用)可能有所降低。
组合治疗可以提供“协同作用”并被证明是“协同的”，即，当活性成分一起使用时所获得的作用大于分别使用这些化合物产生的作用的总和。当活性成分是：(1)共同配制并在一个组合的单位剂量制剂中同时施用或递送；(2)作为单独的制剂通过交替或平行递送；或(3)通过一些其它给药方案，可以获得协同作用。当以交替疗法递送时，当化合物以不同的注射器通过不同的注射剂、通过不同的丸剂或胶囊剂或者通过不同的输液按顺序给药或递送时，可以获得协同作用。一般而言，在交替治疗期间，各种活性成分的有效剂量可以按顺序给予，即连续地给予，而在组合疗法中，两种或多种活性成分的有效剂量可以一起给予。
在治疗的一个具体的实施方案中，式I化合物或其立体异构体、互变异构体、溶剂化物、代谢物或其药学上可接受的盐或其前药可以与其它治疗性、激素类或抗体药物(例如那些本文描述的药物)组合，也可以与手术治疗和放疗组合应用。因此，本发明的组合疗法包括至少一种式I化合物或其立体异构体、互变异构体、溶剂化物、代谢物或药学上可接受的盐或前药的给药，还包括至少一种其它癌症治疗方法的使用。式I化合物和其它药物活性治疗成分的量和给药的相对时间根据实现所需的组合治疗效果进行选择。
式I化合物的代谢物
本文所述的式I的体内代谢产物均包含在本发明的范围内。此类产物可能产生自例如给予的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺化、酯化、脱酯化、酶裂解等。因此，本发明包括式I化合物的代谢物，包括通过以下过程中产生的化合物：使得本发明的化合物与哺乳动物接触一段时间，该时间足以获得其代谢产物。
代谢物产物通常是通过下列方法鉴别：制备放射性同位素(例如14C或3H)标记的本发明化合物，以可检测剂量经胃肠外给予(例如，大于约0.5mg/kg)动物，例如大鼠、小鼠、豚鼠、猴或人，允许足够的时间以发生代谢(通常约30秒至30小时)，自尿、血液或其它生物样品中分离其转化产物。因为它们是被标记的，因此这些产物容易分离(其它的可以通过使用能够结合存在于代谢物中的表位的抗体进行分离)。代谢物结构可以通过常规方法确定，例如通过MS、LC/MS或NMR分析。一般而言，代谢物的分析以本领域技术人员公知的常规药物代谢研究相同的方法完成。只要它们不以其它方式在体内发现，所述代谢产物就可以用于诊断分析，用于确定本发明化合物的治疗剂量。
制品
在本发明的另一个实施方案中，提供了含有用于治疗上述疾病和病症的原料的制品或“套盒”。在一个实施方案中，所述套盒包括容器，其包含包含式I化合物或其立体异构体、互变异构体、溶剂化物、代谢物或药学上可接受的盐或前药的容器。所述套盒还可以包括容器上的或与容器关联的标签或包装说明书。术语“包装说明书”是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包括关于使用此类治疗产品的关于适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或警告的信息。适当的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、泡罩包装等。所述容器可以由各种材料例如玻璃或塑料制成。该容器可以保存有效地治疗疾病的式I化合物或其制剂，其可以具有无菌接口(例如，所述容器可以是静脉注射液袋，或者是具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。该组合物中至少一种活性成分为式I化合物。所述标签或包装说明书表明了该组合物用于治疗选择的病症，例如癌症。此外，所述标签或包装说明书表明了待治疗的患者是患有下列疾病的患者：例如过度增生性疾病、神经变性、心脏肥大、疼痛、偏头痛或神经创伤性疾病或事件。在一个实施方案中，所述标签或包装说明书表明了含有式I化合物的组合物可以用于治疗由异常细胞生长导致的疾病。所述标签或包装说明书也表明了所述组合物可以用于治疗其它疾病。或者，该制品还可以包含第二种容器，其包含可药用的缓冲液,例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐-缓冲的生理盐水、林格氏液和葡萄糖溶液。它还包括从商业和用户立场上讲所需的其它原料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
所述套盒还可以包含式I化合物给药的说明书和可能存在的第二种药物制剂。例如，如果套盒包含含有式I化合物的第一种组合物以及第二种药物制剂，则该套盒还可以包含将第一种和第二种药用组合物同时、连续或分别给予需要的患者的说明书。
在另一个实施方案中，套盒适用于传递固体口服形式的式I化合物，如片剂或胶囊剂。此类套盒优选包括多个单位剂量。此类套盒可以包括具有根据其预期使用的顺序而指导剂量的卡片。此类套盒的示例是“泡罩包装”。泡罩包装在包装工业中是众所周知的，可以广泛用于包装药物单位剂型。如果需要的话，可以提供记忆辅助工具，例如以数字、字母或其它标记的形式，或者具有日历插页，指明了其中给予剂量的治疗方案的天数。
根据一个实施方案，套盒可以包括：(a)其中包含式I化合物的第一容器；和任选的(b)其中包含第二种药物制剂的第二容器，其中所述第二种药物制剂含有具有抗过度增生活性的第二种化合物。或者，所述套盒还可以包括第三种容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它还可以包括从商业和用户立场上讲所需的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
在某些其它实施方案中，其中所述套盒包含式I的组合物和第二种治疗药物，该套盒可以包括用于容纳不同组合物的容器，如分开的瓶或分开的铝箔袋，然而，不同的组合物也可包含在单个、未分开的容器中。典型的套盒包括用于不同组分给药的说明书。当不同组分优选以不同的剂型(例如，口服和肠胃外)施用、以不同的剂量间隔施用或者当组合的单个组分的滴定是处方医师所期望施用的时，套盒形式是特别有益的。
式I化合物的制备
式I化合物可以通过合成路线合成，所述路线包括与化学领域中公知的路线类似的路线，特别是可以参考本文中说明书，还可以参考下面文献中所述的那些其它杂环类的路线：Comprehensive Heterocyclic Chemistry(杂环化学概览)II,Editors Katritzky和Rees,Elsevier,1997,例如第3卷；Liebigs Annalen der Chemie,(9):1910－16,(1985)；Helvetica Chimica Acta,41:1052－60,(1958)；Arzneimittel-Forschung,40(12):1328－31,(1990)，它们每一个均可以明确地引入本文作为参考。原料通常可以获自商业途径，例如Aldrich Chemicals (Milwaukee,WI)，或者可以采用本领域技术人员众所周知的方法容易地制备(例如，通过文献中描述的通用方法制备：Louis F.Fieser和Mary Fieser,Reagents for Organic Synthesis(有机合成试剂),第1－23卷,Wiley,N.Y.(1967－2006ed.)或Beilsteins Handbuch der organischen Chemie,4,Aufl.ed.Springer-Verlag,Berlin,包括增补版(还可以通过Beilstein在线数据库获取)。
在合成式I化合物和必要的原料和中间体中使用的化学合成转化方法和保护基团方法(保护和脱保护)在本领域是已知的，包括例如描述于下列文献中的方法：R.Larock,Comprehensive Organic Transformations(有机转化概览),VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基团),第3版,John Wiley and Sons(1999)；L.Paquette,ed.,Encyclopedia ofReagents for Organic Synthesis(有机合成试剂百科全书),John Wiley and Sons(1995)及其后续版本。
式I化合物可以单独制备，或作为化合物库制备，其包含至少2种化合物，例如5至1000种化合物，或10至100种化合物。式I化合物库可以通过本领域技术人员已知的方法，通过组合的‘分裂和混合’方法制备，或者通过使用液相或固相化学的多个平行合成方法制备。因此，根据另一方面，本发明提供了包含至少2种化合物或其药学上可接受的盐的化合物库。
实施例提供了制备式I化合物的典型方法。本领域技术人员应当理解，其它合成路线也可以用于合成式I化合物。尽管具体的原料和试剂在实施例中已有描述和讨论，但是其它原料和试剂可以容易地替代以提供各种衍生物和/或反应条件。此外，通过本文描述的方法制备的许多示例性化合物可以根据本申请公开的内容采用本领域技术人员公知的常规化学进一步修饰。
在式化合物I的制备中，中间体的远端官能团(例如伯胺或仲胺)的保护可能是必须的。是否需要此类保护应当取决于远端官能团的性质以及制备方法的条件。适当的氨基-保护基团包括乙酰基、三氟乙酰基、叔-丁氧基羰基(BOC)、苄氧基羰基(CBz)和9-芴基亚甲基氧基羰基(Fmoc)。本领域技术人员可以容易地确定是否需要此类保护。保护基团及其应用的通用描述参见T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基团),John Wiley&Sons,New York,1991T。
用于制备式I化合物的有用的试验方法、中间体和试剂可以参考WO2011/140488；US 2012/0010191；WO2013/067274；US 2013/0116235；WO2013/067277；US 2013/0116245；WO2013/067260；US 2013/0116262；WO2013/067264；US 2013/0116246，它们以其整体内容引入本文作为参考。
式I化合物101-146的示例性实施方案更充分地描述于下面的实施例中，可以用于制备其它式I化合物。
各种低价Pd(II)和Pd(0)钯催化剂、预催化剂和配体可以在Suzuki或Suzuki/Miyaura偶合步骤中使用(Miyaura,N.(2002)Top.Curr.Chem.,219:11－59；Kotha,S.等(2002)Tetrahedron,58:9633－9695；Bellina,F.等(2004)Synthesis,15:2419－2440；Hassan,J.等(2002)Chem.Rev.102:1359－1470；Littke,A.F.等(2002)Angew.Chem.,Int.Ed.41:4176－4211；Barder,T.E.等(2005)J.Am.Chem.Soc.,127:4685－4696；Walker,S.D.等(2004)Angew.Chem.,Int.Ed.,43:1871-1876；Yin,J.等(2002)J.Am.Chem.Soc.,124:1162-1163)，包括PdCl2{PtBu2(p-R-Ph)}2(Guram等(2006)Organic Letters8(9):1787－1789)、PdCl2(PPh3)2、Pd(t-Bu)3、PdCl2 dppf CH2Cl2、Pd(PPh3)4、Pd(OAc)2/PPh3、Cl2Pd[(Pet3)]2、Pd(DIPHOS)2、Cl2Pd(Bipy)、[PdCl(Ph2PCH2PPh2)]2、Cl2Pd[P(o-tol)3]2、Pd2(dba)3/P(o-tol)3、Pd2(dba)/P(呋喃基)3、Cl2Pd[P(呋喃基)3]2、Cl2Pd(PMePh2)2、Cl2Pd[P(4-F-Ph)3]2、Cl2Pd[P(C6F6)3]2、Cl2Pd[P(2-COOH-Ph)(Ph)2]2、Cl2Pd[P(4-COOH-Ph)(Ph)2]2和包封的催化剂Pd EnCatTM 30、Pd EnCatTM TPP30和Pd(II)EnCatTM BINAP30(US 2004/0254066)。
低价Pd(II)和Pd(0)钯催化剂、预催化剂和配体的示例性实施方案为"Buchwald"催化剂、钯环(palladacycles)和配体，包括2-二环己基膦基-2,4,6-三异丙基联苯(X-Phos,CAS Reg.No.564483-18-7)和氯代(2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基-1,1′-联苯基)[2-(2′-氨基-1,1′-联苯基)]钯(II)(X-Phos氨基联苯基氯化钯预催化剂,CASReg.No.1310584-14-5),可以获自商业(Johnson Matthey,West Deptford,NJ；Sigma-Aldrich Fine Chemicals和其它供应商)。参见US 7223879、US 6395916、US 6307087。
分离方法
在式I化合物的制备方法中，将反应产物彼此之间和/或与原料之间进行分离是有益的。根据本领域中的常规技术可以将各个步骤或系列步骤的需要的产物分离和/或纯化至需要的纯度(homogeneity)。典型的此类分离技术包括多相萃取、自溶剂或溶剂混合物中结晶、蒸馏、升华或色谱方法。色谱方法可以包括多种方法，例如反相和正相；体积排阻；离子交换；高、中和低压液相色谱方法和设备；小批量分析(small scale analytical)；模拟移动床(SMB)和制备性薄层或厚层色谱以及小批量薄层和快速色谱技术。
其它类型的分离方法包括采用选择的试剂处理混合物，所述试剂能够与需要的产物、未反应的原料、副产物等结合或使其分离。此类试剂包括吸附剂或吸收剂，例如活性炭、分子筛、离子交换介质等。或者，所述试剂在碱性材料情况下可以是酸；在酸性材料情况下可以是碱；结合剂，例如抗体、结合蛋白；选择性螯合剂，例如冠醚；液体/液体离子提取试剂(ion extraction reagents)(LIX)等。适当的分离方法的选择取决于所涉及材料的性质，例如蒸馏和升华中的沸点和分子量，色谱分析中是否存在极性官能团，多相萃取中酸性和碱性介质中材料的稳定性等。
非对映异构混合物可以根据其物理化学性质的差异通过本领域技术人员公知的方法分离为它们各自的非对映异构体，例如通过色谱和/或分步结晶的方法。通过与适当的光学活性化合物(例如手性辅助物，如手性醇或Mosher酰氯)的反应，通过对映体混合物转化为非对映体混合物，分离该非对映体并将各个非对映体转化(例如水解)为相应的纯对映体，如此可以分离对映体。并且，某些本发明化合物也可以是阻转异构体(例如，取代的联芳基化合物)，它们被视为是本发明的一部分。对映体也可以通过手性HPLC柱分离。
单一立体异构体(例如基本上不含其立体异构体的对映体)可以通过外消旋混合物的拆分而获得，采用的方法为例如使用光学活性的拆分试剂形成非对映异构体(Eliel,E.和Wilen,S.“有机化合物的立体化学(Stereochemistry of Organic Compounds),”JohnWiley&Sons,Inc.,New York,1994；Lochmuller,C.H.,(1975)J.Chromatogr.,113(3):283－302)。本发明的手性化合物的外消旋混合物可以通过适当的方法分离，包括：(1)采用手性化合物形成离子非对映异构体盐，通过分步结晶或其它方法分离，(2)采用手性衍生化试剂形成非对映异构体化合物，分离该非对映异构体，转化为纯立体异构体，和(3)直接在手性条件下分离基本上纯的或富含的立体异构体。参见“Drug Stereochemistry,Analytical Methods and Pharmacology(药物立体化学、分析方法和药理学),”IrvingW.Wainer,Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York(1993)。
在方法(1)中，非对映异构体盐可以通过光学纯的手性碱(例如马钱子碱、奎宁、麻黄碱、番木鳖碱、α-甲基-β-苯基乙基胺(安非他明)等)与携有酸性官能团的不对称化合物(例如羧酸和磺酸)的反应形成。非对映异构体盐可以通过分步结晶或离子色谱方法分离。对于氨基化合物的光学异构体的分离而言，加入手性羧酸或磺酸(例如樟脑磺酸、酒石酸、扁桃酸或乳酸)可以形成非对映异构体盐。
或者，通过方法(2)，待拆分的底物可以与手性化合物的一种对映体反应，形成非对映异构体对(E.和Wilen,S.“有机化合物的立体化学(Stereochemistry of OrganicCompounds)”,John Wiley&Sons,Inc.,1994,p.322)。非对映异构体化合物如下形成：通过使得不对称化合物与光学纯的手性衍生化试剂(例如薄荷基衍生物)反应，随后分离非对映异构体并水解，获得纯的或富含的对映体。确定光学纯度的方法包括：在外消旋混合物的碱或Mosher酯α-甲氧基-α-(三氟甲基)苯基乙酸酯(Jacob III.J.Org.Chem.(1982)47:4165)存在下，制备手性酯(例如薄荷基酯，如(-)薄荷基氯代甲酸酯)，分析两种阻转异构体或非对映异构体的1H NMR光谱。根据用于分离阻转异构的萘基-异喹啉的方法(WO 96/15111)，阻转异构体化合物的稳定的非对映异构体可以通过正相和反相色谱分离。在方法(3)中，两种对映体的外消旋混合物可以通过使用手性固定相的色谱分离(“Chiral LiquidChromatography(手性液相色谱)”(1989)W.J.Lough,Ed.,Chapman和Hall,New York；Okamoto,J.Chromatogr.,(1990)513:375－378)。富含或纯化的对映体可以通过用于区分其它具有不对称碳原子的手性分子的方法加以区别，例如旋光和圆二色光谱。
具体实施方式
实施例
实施例1三环酰胺,4,4-二甲基-1,10-二氮杂三环并[6.4.0.02,6]十二-2(6),7-二烯-9-酮1e的制备
Figure BDA0002445089910000531
下面的两个方法改编自Organic Preparations and Procedures Int.,29(4):471－498。还根据US 8716274中实施例107的方法，向配备磁力搅拌器和氮气入口的500-mL单颈圆底烧瓶中加入2-氯代-4,4-二甲基环戊-1-烯甲醛(38g,240mmol)的苯(240mL)溶液。向该溶液中加入乙氧基羰基亚甲基三苯膦(84g,240mmol)。将混合物搅拌14h。然后，蒸发溶剂，将残留物用己烷(2L)研磨，将产物自PPh3副产物中萃取出来。有机层经硫酸钠干燥并真空浓缩。残留物通过柱色谱纯化，采用100％己烷-1:1己烷/乙酸乙酯梯度洗脱，获得37％收率(20g)的(E)-3-(2-氯代-4,4-二甲基环戊-1-烯基)丙烯酸乙酯1a。
向配备磁力搅拌器和氮气入口的250-mL单颈圆底烧瓶中加入1a(17g,74mmol)的DMSO(100mL)溶液。向该溶液中加入叠氮化钠(9.6g,150mmol)。然后将混合物加热至75℃，搅拌8h。冷却至室温后，加入H2O(100mL)和CH2Cl2(200mL)，分离有机层。水层用CH2Cl2(50mL)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并真空浓缩。残留物通过柱色谱纯化，采用100％己烷-1:1己烷/乙酸乙酯梯度洗脱，获得37％收率(5.7g)的5,5-二甲基-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-甲酸乙酯1b。
向配备磁力搅拌器和氮气入口的250-mL单颈圆底烧瓶中加入1b(6.2g,30mmol)的DMF(57mL)溶液。向该溶液中加入NaH(80％的矿物油分散液,1.26g,42.1mmol)。将获得的混合物于室温下搅拌90min。然后，加入溴乙腈(2.94mL,42mmol)。将混合物搅拌14h。然后，加入水(100mL)和乙酸乙酯(200mL)，分离有机层。水层用乙酸乙酯萃取(2×50mL)。合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并真空浓缩。残留物通过柱色谱纯化，获得95％收率(7g)的1-(氰基甲基)-5,5-二甲基-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-甲酸乙酯1c。
向500-mL Parr反应瓶中充入氮，加入10％披钯炭(50％湿的,2.0g干重)、1c(4.5g,18mmol)、12％盐酸(9.2mL,37mmol)、乙酸乙酯(80mL)和乙醇(52mL)。将反应瓶与Parr氢化器连接，排空，充入氢气使得压力达到50psi，振摇6h。然后，排空氢气，向反应瓶中充入氮气。加入
Figure BDA0002445089910000543
521(10.0g)，将混合物通过
Figure BDA0002445089910000544
521垫过滤。滤饼用乙醇洗涤(2×50mL)，将合并的滤液减压浓缩至干。粗品残留物1-(2-氨基乙基)-5,5-二甲基-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-甲酸乙酯盐酸盐1d无需进一步纯化可以直接用于下一步骤。
向配备磁力搅拌器和氮气入口的100-mL单颈圆底烧瓶中充入氮气，加入粗品1-(2-氨基乙基)-5,5-二甲基-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-甲酸乙酯盐酸盐1d(～18mmol)、乙醇钠(6.2g,92mmol)和乙醇(120mL)。将混合物于55℃搅拌过夜。然后，将反应混合物减压浓缩，将残留物在乙酸乙酯(200mL)和水(100mL)之间分配。将溶液过滤。固体用乙酸乙酯(15mL)洗涤，获得850mg需要的产物107e。分离有机层，水层用乙酸乙酯萃取(2×100mL)。合并的有机层经硫酸钠干燥并减压浓缩近干。过滤溶液，固体(1.44g)用乙酸乙酯(15mL)洗涤。将合并的固体真空干燥，获得61％收率(2.3g)的4,4-二甲基-1,10-二氮杂三环并[6.4.0.02,6]十二-2(6),7-二烯-9-酮1e(CAS Reg.No.1346674-23-4)：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ1.23(6H,s),2.47(2H,s),2.5(2H,s),3.65(2H,s),3.93-3.96(2H,m),5.82(1H,s),6.703(1H,s)；MS-ESI[M+H]+＝205.0。
实施例2 3-(苯基氨基)-1H-吡唑-4-甲腈2的制备
Figure BDA0002445089910000541
步骤1:3-氨基-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-4-甲腈2a和5-氨基-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-4-甲腈2b
Figure BDA0002445089910000542
于0℃向化合物3-氨基-1H-吡唑-4-甲腈的DMF(100mL)的溶液中一次性加入NaH(60％,7.4g,185mmol)。将反应混合物于0℃搅拌30min，滴加SEMCl(2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基氯(Sigma-Aldrich Catalog#238902,CAS Reg.No.76513-69-4,17.1g,92.5mmol)。将反应混合物于室温下搅拌18h，用DCM稀释，有机层用饱和的氯化铵溶液洗涤。有机层经硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残留物经快速色谱纯化(Biotage,80g正相硅胶,UV254,PE/EtOAc＝20/1-3/2)，获得2a和2b的1:1混合物(4.8g,22％)，为白色固体。
步骤2:3-(苯基氨基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-4-甲腈2c和5-(苯基氨基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-4-甲腈2d
Figure BDA0002445089910000551
将获自上面的2a和2b(1g,4.2mmol)、溴代苯(655mg,4.2mmol)、Pd2(dba)3(193mg,0.21mmol)、X-phos(200mg,0.42mmol)和Cs2CO3(4.1g,12.6mmol)在二氧六环(5mL)中的混合物在手套式操作箱中于100℃加热18h。反应混合物用EtOAc稀释，用水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残留物经快速色谱纯化(Biotage,40g正相硅胶,UV 254检测并收集,PE/EtOAc＝10/1)，获得为异构体混合物的2c和2d(1g,75％)。MS-ESI[M+H]+＝315.0。
步骤3:向2c和2d(1g,3.18mmol)的EtOH(10mL)混合物中加入aq.HCl(2N,10mL)。将反应混合物于80℃搅拌18h，冷却至0℃，用aq.NaOH溶液(1N)中和，然后用EtOAc萃取。合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残留物经快速色谱纯化(Biotage,40g正相硅胶,UV 254,DCM/MeOH＝30/1)，获得3-(苯基氨基)-1H-吡唑-4-甲腈2(0.3g,50％)，为黄色固体。MS-ESI[M+H]+＝185.0。
实施例3 2-(1-羟基-1,3-二氢-[1,2]氧杂硼杂环戊并[4,3-c]吡啶-4-基)-7,7-二甲基-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-环戊二烯并[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-1-酮3的制备
Figure BDA0002445089910000561
步骤1:3b的制备
Figure BDA0002445089910000562
向醛3a(500mg,1.46mmol)的MeOH(8mL)和DCM(20mL)的混合物中一次性加入NaBH4(110mg,3mmol)。将反应混合物于室温下搅拌2h，然后用水骤冷，减压浓缩。残留物经快速色谱纯化(Biotage,40g正相硅胶,UV 254,DCM/MeOH＝20/1)，获得醇3b(500mg,99％)，为白色固体。MS-ESI[M+H]+＝346.0。
步骤2:将3b(500mg,1.45mmol)、四羟基二硼(387mg,4.35mmol)、Xphos-Pd-G2(12mg,0.015mmol)、X-phos(14mg,0.03mmol)和KOAc(426mg,4.35mmol)的EtOH(20mL)混合物在手套式操作箱中于80℃加热2h。将反应混合物冷却至室温(RT)，浓缩。将残留物在DCM和水之间分配。分离有机层，用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残留物溶于甲苯，于室温下放置2h。收集获得的沉淀物，干燥，获得2-(1-羟基-1,3-二氢-[1,2]氧杂硼杂环戊并[4,3-c]吡啶-4-基)-7,7-二甲基-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-环戊二烯并[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-1-酮3(320mg,65％)，为白色固体。MS-ESI[M+H]+＝338.1。
实施例4(S)-5-(2-甲基-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)吡啶-2-胺4的制备
Figure BDA0002445089910000563
步骤1:(S)-3-甲基-4-(6-硝基吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔-丁基酯4a的制备
Figure BDA0002445089910000564
向5-溴-2-硝基吡啶(5.0g,24.63mmol)、(S)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔-丁基酯(4.9g,24.63mmol)、碳酸铯(24.1g,73.89mmol)和BINAP(1.5g,2.46mmol)的1,4-二氧六环(50mL)的溶液中加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(1.1g,1.23mmol)。将混合物于100℃、氮气环境中搅拌16小时。将混合物冷却至18℃，用水(50mL)稀释，用乙酸乙酯萃取(100mL×3)。合并的有机层用盐水洗涤(80mL)，经硫酸钠干燥，浓缩。残留物经硅胶色谱纯化，采用石油醚:乙酸乙酯＝1:1洗脱，获得4a(3.0g,38％)，为棕色固体。
步骤2:(S)-2-甲基-1-(6-硝基吡啶-3-基)哌嗪4b的制备
向4a(2.5g,7.76mmol)的二氯甲烷(60mL)混合物中加入三氟乙酸(30mL)。将混合物于18℃搅拌2小时。将混合物浓缩至残留物，将其用乙酸乙酯(15mL)研磨，过滤，真空干燥，获得8b(2.2g,粗品)，为棕色固体。
步骤3:(S)-2-甲基-1-(6-硝基吡啶-3-基)-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪4c的制备
Figure BDA0002445089910000572
向4b(2.2g,9.90mmol)和氧杂环丁烷-3-酮(49.50mmol,2.9mL)的甲醇(30mL)混合物中加入氰基硼氢化钠(3.1g 49.50mmol)。将反应混合物于50℃、氮气环境中搅拌18小时。将获得的混合物用饱和的氯化铵溶液(100mL)稀释，用乙酸乙酯萃取(100mL×3)。合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残留物经硅胶色谱纯化，采用乙酸乙酯洗脱，获得4c(1.2g,40％)，为黄色固体。
步骤4:向4c(1.2g,4.31mmol)和钯(在活性炭上的10wt％,500mg)的甲醇(50mL)混合物中充入氢气，于18℃搅拌3小时。将混合物通过
Figure BDA0002445089910000573
(Imerys MineralsCalifornia,Inc.,Sigma-Aldrich Co.)垫过滤，浓缩滤液，获得为固体的(S)-5-(2-甲基-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)吡啶-2-胺4(700mg,65％)。MS-ESI[M+H]+＝249.1。
实施例5 1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈5的制备
Figure BDA0002445089910000581
步骤1:3-碘-1H-吡唑-4-甲腈5a的制备
Figure BDA0002445089910000582
于-10℃，30分钟内向3-氨基-1H-吡唑-4-甲腈(6.6g,61.1mmol)的CH2I2(90mL)的溶液中滴加亚硝酸异戊酯(55.5mL)。将反应混合物加热至100℃2h，浓缩。残留物经硅胶色谱纯化(PE/EA＝4/1)，获得3-碘-1H-吡唑-4-甲腈5a(6.7g,50％)，为黄色固体。MS-ESI[M+H]+＝220.0。
步骤2：将2-(1-羟基-1,3-二氢-[1,2]氧杂硼杂环戊并[4,3-c]吡啶-4-基)-7,7-二甲基-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-环戊二烯并[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-1-酮3(100mg,0.3mmol)、5a(65mg,0.3mmol)、Cu(OAc)2(65mg,0.36mmol)、吡啶(28mg,0.36mmol)、Et3N(36mg,0.36mmol)和
Figure BDA0002445089910000584
分子筛在无水DCM(20mL)中的混合物于25℃搅拌18h。反应混合物用DCM稀释，过滤。滤液用饱和的氯化铵水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残留物通过prep-TLC纯化(正相硅胶,UV 254,DCM/MeOH＝20/1)，获得1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈5(62mg,39％)，为白色固体。MS-ESI[M+H]+＝529.0.
实施例101 3-苯胺基-1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]吡唑-4-甲酰胺101
步骤1:101a的制备
Figure BDA0002445089910000583
将获自实施例2的3-(苯基氨基)-1H-吡唑-4-甲腈2(60mg,0.33mmol)、获自实施例3的2-(1-羟基-1,3-二氢-[1,2]氧杂硼杂环戊并[4,3-c]吡啶-4-基)-7,7-二甲基-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-环戊二烯并[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-1-酮3(122mg,0.36mmol)、Cu(OAc)2(119mg,0.66mmol)、吡啶(52mg,0.66mmol)、Et3N(67mg,0.66mmol)和
Figure BDA0002445089910000592
分子筛的无水DCM(20mL)溶液的混合物于30℃搅拌18h。反应混合物用DCM稀释，过滤。滤液用饱和的氯化铵水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩.残留物通过制备性TLC纯化(正相硅胶,UV 254,DCM/MeOH＝30/1)，获得101a(30mg,18％)，为黄色固体。MS-ESI[M+H]+＝494.1。
步骤2:将101a(100mg,0.2mmol)、浓氢氧化铵(18M NH4OH,21mL)、30％过氧化氢(H2O2,1.2mL)和H2O(6mL)的MeOH(15mL)混合物于室温下搅拌2天。浓缩反应混合物。残留物通过制备性TLC纯化(正相硅胶,UV 254,DCM/MeOH＝20/1)，获得101(43mg,42％)，为白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.25(s,1H),8.81(s,1H),8.55(d,J＝5.6Hz,1H),7.89(s,1H),7.64(d,J＝5.2Hz,1H),7.58(d,J＝8.8Hz,2H),7.37(bs,1H),7.30(t,J＝8Hz,2H),6.88(t,J＝3.2Hz,1H),6.59(s,1H),4.94(t,J＝5.6Hz,1H),4.74(m,1H),4.46(m,1H),4.22(m,3H),3.94(d,J＝13.6Hz,1H),2.58(d,J＝7.2Hz,2H),),2.43(s,2H),1.22(s,6H)；MS-ESI[M+H]+＝512.1.
实施例102 1-[3-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-2-(羟基甲基)苯基]-3-(2-吡啶基氨基)吡唑-4-甲酰胺102
步骤1:102a和102b的制备
Figure BDA0002445089910000591
将4,4-二甲基-1,10-二氮杂三环并[6.4.0.02,6]十二-2(6),7-二烯-9-酮1e(1g,4.9mmol)、2-溴-6-碘苄基乙酸酯(4.3g,12.3mmol)、CuI(468mg,2.45mmol)、Cs2CO3(3.2g,9.8mmol)的二氧六环(20mL)混合物加热至105℃，搅拌16h。反应混合物用水处理，用EtOAc萃取。合并的萃取液经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残留物经快速色谱纯化(Biotage,40g柱,硅胶,UV254,DCM/EtOAc＝10:1)，获得102a和102b的混合物(1.4g,60％)，其无需分离可以直接用于下一步骤。MS-ESI[M+H]+＝431.0和479.0。
步骤2:102c和102d的制备
Figure BDA0002445089910000601
将102a和102b(1.4g,3.25mmol)和氢氧化钠(520mg,12.99mmol)在二氧六环(20mL)和水(20mL)中的混合物于25℃搅拌16h。反应混合物用EtOAc萃取。合并的萃取液经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残留物经快速色谱纯化(Biotage,40g柱,硅胶,UV254,DCM/EtOAc＝10:1)，获得102c和102d的混合物(1.2g,95％)，为黄色固体。MS-ESI[M+H]+＝389.9/390.9和436.9。
步骤3:102e的制备
Figure BDA0002445089910000602
将化合物102c和102d(1.2g,3.1mmol)、四羟基二硼(824mg,9.25mmol),XPhos-Pd-G2(25mg,0.031mmol)、X-Phos(30mg,0.062mmol)、KOAc(910mg,9.25mmol)的EtOH(20mL)混合物在氮气环境中加热至80℃2hr。反应混合物用水(20mL)处理，用DCM萃取。合并的萃取液经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残留物经快速色谱纯化(Biotage,40g柱,硅胶,UV254,DCM/MeOH＝20/1)，获得102e(1g,90％)，为黄色固体。MS-ESI[M+H]+＝337。
步骤4：102f的制备
Figure BDA0002445089910000603
向102e(600mg,1.79mmol)、3-碘-1H-吡唑-4-甲腈(390mg,1.79mmol)、Et3N(361mg,3.57mmol)、吡啶(283mg,3.57mmol)、Cu(OAc)2(389mg,2.15mmol)的DCM(10mL)混合物中充入O2(2X)，于室温下搅拌16h。将混合物过滤，滤饼用DCM(10mL)洗涤。浓缩合并的滤液，残留物经快速色谱纯化(Biotage,40g柱,硅胶,UV254,DCM/MeOH＝25/1)，获得1-[3-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-2-(羟基甲基)苯基]-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈102f(400mg,23％)，为黄色固体。MS-ESI[M+H]+＝528.0。
步骤5:102g的制备
Figure BDA0002445089910000611
将102f(150mg,0.28mmol)、吡啶-2-胺(40mg,0.43mmol)。Pd2(dba)3(26mg,0.028mmol)、Xantphos(29mg,0.056mmol)、Cs2CO3(228mg,0.7mmol)的二氧六环(10mL)混合物加热至100℃，搅拌16h。过滤反应混合物，滤饼用MeOH洗涤。浓缩合并的滤液，残留物通过prep-TLC纯化(DCM:MeOH＝25:1)，获得102g(30mg,20％)，为黄色固体。
步骤6:根据实施例101(步骤2)的方法，制备102。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.71(s,1H),8.59(s,1H),8.20(s,1H),7.90(d,J＝6.0Hz,1H),7.71(s,1H),7.48-7.61(m,3H),6.88(t,J＝5.2Hz,1H),6.52(s,1H),4.98(t,J＝6.0Hz,1H),4.38(m,3H),4.02-4.01(m,3H),3.88(m,1H),3.29(s,1H),2.56(s,2H),2.42(s,2H),1.21(s,6H)；MS-ESI[M+H]+＝512.2。
实施例103 1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-(2-吡啶基氨基)吡唑-4-甲酰胺103
步骤1:103a的制备
Figure BDA0002445089910000612
将1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈5(230mg,0.43mmol)、吡啶-2-胺(60mg,0.64mmol)、Pd2(dba)3(39mg,0.043mmol)、Xantphos(49mg,0.086mmol)和Cs2CO3(259mg,1.1mmol)的无水二氧六环(10mL)混合物在手套式操作箱中加热至90℃18h。将反应混合物冷却至RT，过滤。浓缩滤液，残留物通过制备性TLC纯化(正相硅胶,UV 254,DCM/MeOH＝25/1)，获得103a(130mg,61％)，为黄色固体；MS-ESI[M+H]+＝495.1。
步骤2:根据实施例101步骤2的方法，将103a的腈基团水解，获得103:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.76(s,1H),8.85(s,1H),8.57(d,J＝5.6Hz,1H),8.22(d,J＝3.6Hz,1H),8.04(d,J＝8.0Hz,1H),7.77(t,J＝8.0Hz,1H),7.61(m,1H),7.43(s,1H),6.92(t,J＝5.2Hz,1H),6.59(s,1H),4.98(t,J＝6.0Hz,1H),4.73(m,1H),4.46(m,1H),4.27(m,1H),3.95(m,1H),2.59(d,J＝14.4Hz,1H),2.43(s,2H),1.21(s,6H)；MS-ESI[M+H]+＝513.1.
实施例104 1-[3-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯[3,5-b]吡嗪-3-基)-2-(羟基甲基)苯基]-3-(嘧啶-4-基氨基)吡唑-4-甲酰胺104
根据实施例102的方法，使得嘧啶-4-胺与102f反应，获得104:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.5(s,1H),8.69(s,1H),8.63(s,1H),8.51(d,J＝10.4Hz,1H),7.94(m,2H),7.49-7.59(m,4H),6.52(s,1H),4.97(t,J＝4.8Hz,1H),4.36(d,J＝4.4Hz,2H),4.21-4.16(m,3H),3.88(t,J＝0.8Hz,1H),2.57(s,2H),2.42(s,2H),1.22(s,6H)；MS-ESI[M+H]+＝513.2.
实施例105 1-[3-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯[3,5-b]吡嗪-3-基)-2-(羟基甲基)苯基]-3-[(1-甲基三唑-4-基)氨基]吡唑-4-甲酰胺105
根据实施例102的方法，采用1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-胺作为原料，制备105。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.10(s,1H),8.52(s,1H),7.93(s,1H),7.76(br s,1H),7.54(m,3H),7.31(s,1H),6.51(s,1H),4.97(t,J＝4.8Hz 1H),4.35(d,J＝4.8Hz,2H),4.20(m,3H),3.99(s,3H),3.87(m,1H),2.57(s,2H),2.42(s,2H),1.22(s,6H)；MS-ESI[M+H]+＝516.2
实施例106 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-(2-吡啶基氨基)吡唑-4-甲酰胺106
Figure BDA0002445089910000621
根据实施例103的方法，采用1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈106a作为原料，制备106。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.84(s,1H),8.70(d,J＝5.2Hz,1H),8.54(d,J＝2.8Hz,1H),8.20(d,J＝4.0Hz,1H),7.90(m,3H),7.75(m,2H),6.95(t,J＝6.8Hz,1H),4.74(s,2H),1.49(s,9H)；MS-ESI[M+H]+＝529.2
实施例107 3-(环丙烷羰基氨基)-1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]吡唑-4-甲酰胺107
步骤1:N-(4-氰基l-1H-吡唑-3-基)环丙烷甲酰胺107a的制备
Figure BDA0002445089910000631
将3-氨基-1H-吡唑-4-甲腈(100mg,0.93mmol)、CPCA(8.5μL,1.02mmol)、HBTU(421.0mg,1.11mmol)、DIEA(2.1mL,0.44M)和DMF(10mL)混合，于室温下搅拌。72h后，将反应物用饱和的碳酸氢钠水溶液稀释，用EtOAc萃取(3×)。合并的有机萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，直接使用。MS-ESI[M+H]+＝177.0。
步骤2:根据实施例109步骤2和3的方法，使得107a与2-(1-羟基-1,3-二氢-[1,2]氧杂硼杂环戊并[4,3-c]吡啶-4-基)-7,7-二甲基-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-环戊二烯并[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-1-酮3反应，获得107，为灰白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.34(s,1H),8.82(s,1H),8.57(d,J＝5.3Hz,1H),7.83(s,1H),7.54(d,J＝5.4Hz,1H),7.45(s,1H),6.57(s,1H),5.11(s,1H),4.58(d,J＝12.7Hz,1H),4.40(d,J＝7.7Hz,1H),4.21(m,3H),3.93(d,J＝11.8Hz,1H),2.65-2.51(m,2H),2.43(s,2H),1.23(d,J＝5.2Hz,6H),0.88-0.81(m,4H)；MS-ESI[M+H]+＝504.4。
实施例108 1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]吲唑-3-甲酰胺108
步骤1:1-(2-(7,7-二甲基-1-氧代-3,4,7,8-四氢-1H-环戊二烯并[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-1H-吲唑-3-甲酸甲酯108a的制备
Figure BDA0002445089910000632
将2-(1-羟基-1,3-二氢-[1,2]氧杂硼杂环戊并[4,3-c]吡啶-4-基)-7,7-二甲基-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-环戊二烯并[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-1-酮3(200mg,0.6mmol)、1H-吲唑-3-甲酸甲酯(158mg,0.9mmol)、乙酸铜(II)(163mg,0.9mmol)和吡啶(95mg,1.2mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(20mL)混合物于20℃、空气中搅拌16小时。将获得的混合物倒入水(100mL)中，用乙酸乙酯萃取(50mL×3)。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残留物通过prep-TLC纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1)，获得108a(50mg,17％)，为白色固体。MS-ESI[M+H]+＝486.1。
步骤2:将108a(50mg,0.103mmol)的NH3-MeOH(20mL)混合物在密封的试管中于100℃搅拌16小时。冷却反应物，浓缩挥发性溶剂。残留物通过prep-TLC纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1)，获得108(27.3mg,57％)，为白色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.63(d,J＝5.2Hz,1H),8.45(d,J＝8.4Hz,1H),7.51-7.49(m,2H),7.40-7.39(m,2H),6.91(s,1H),6.82(s,1H),5.50(s,1H),4.58-4.57(m,2H),4.18(m,4H),3.55(m,1H),2.56(s,2H),2.50(s,2H),1.26(s,6H)；MS-ESI[M+H]+＝471.2。
实施例109 4-(环丙烷羰基氨基)-1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]吡唑-3-甲酰胺109
步骤1:N-(3-氰基-1H-吡唑-4-基)环丙烷甲酰胺109a的制备
Figure BDA0002445089910000641
向4-氨基-1H-吡唑-3-甲腈(270mg,2.4977mmol)的DMF的溶液中加入环丙烷甲酸(1.1equiv.,2.7475mmol)、HBTU(1.2equiv.,2.9972mmol)和DIEA(10equiv.,24.977mmol)。反应完成后，将反应物用饱和的碳酸氢钠水溶液稀释，用乙酸乙酯萃取。真空浓缩有机层，通过快速柱色谱在硅胶上纯化，获得109a。MS-ESI[M+H]+＝177.1。
步骤2:N-(3-氰基-1-(2-(7,7-二甲基-1-氧代-3,4,7,8-四氢-1H-环戊二烯并[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-基)-3-甲酰基吡啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)环丙烷甲酰胺109b的制备
Figure BDA0002445089910000642
使得109a(190mg,1.0784mmol)的DMSO(4mL,56mmol)溶液与2-(1-羟基-1,3-二氢-[1,2]氧杂硼杂环戊并[4,3-c]吡啶-4-基)-7,7-二甲基-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-环戊二烯并[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-1-酮3和叔丁醇钾(183.4mg,1.6177mmol)反应，在微波中于130℃加热90分钟。将反应物用水稀释，用乙酸乙酯萃取。浓缩有机相，通过柱色谱纯化(洗脱液：0－70％乙酸乙酯的庚烷溶液；0－4％甲醇的DCM溶液)，获得109b。MS-ESI[M+H]+＝484.5。
步骤3:于0℃，向109b(78.6mg,0.163mmol)的甲醇(2.0mL,49mmol)溶液中加入硼氢化钠(6.2mg,0.163mmol，2.5hr后，第二次加入硼氢化钠(6.2mg,0.163mmol)。1h后，将反应物温热至室温2hr，用DCM稀释，用饱和的碳酸氢钠水溶液萃取。有机相用盐水洗涤，浓缩，通过柱色谱纯化(洗脱液：0－5％甲醇的DCM溶液)，直接使用。将粗品产物溶于乙醇和水(2:1；3mL)的混合物中，加入二(二甲基膦基氧基)铂二甲基膦酸(3.4mg,0.008mmol)。将获得的混合物加热至90℃2.5h，使其冷却至室温16h。真空浓缩反应物，通过HPLC纯化，获得109:MS-ESI[M+H]+＝503.6。
实施例110 1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲酰胺110
根据实施例108的方法，采用1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲酸甲基酯作为原料，制备110:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.80(d,J＝8.0Hz,1H),8.64(d,J＝5.2Hz,1H),8.61-8.60(m,1H),7.56(d,J＝5.2Hz,1H),7.40(dd,J＝8.0,4.4Hz,1H),7.10(s,1H),6.80(s,1H),5.60(s,1H),4.59(s,2H),4.36-4.18(m,4H),3.48(s,1H),2.56(s,2H),2.49(s,2H),1.26(s,6H)；MS-ESI[M+H]+＝472.3。
实施例111 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-[(1-甲基三唑-4-基)氨基]吡唑-4-甲酰胺111
步骤1：1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈111a的制备
Figure BDA0002445089910000651
根据实施例3和5的方法，采用2-(7-叔-丁基-5-氟-4-氧代吡啶并[4,3-d]哒嗪-3(4H)-基)-4-氯代吡啶甲醛作为原料，制备111a。MS-ESI[M+H]+＝545.8。
步骤2：根据实施例105的方法，使得111a和1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-胺反应获得111：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.16(s,1H),8.79(s,1H),8.68(d,J＝7.0Hz,1H),8.58(d,J＝3.0Hz,1H),8.07(s,1H),7.92-7.87(m,overlap,3H),7.80(d,J＝16.5Hz,1H),7.48(s,1H),5.12(t,J＝6.5Hz,1H),4.60-4.56(m,2H),4.03(s,3H),1.39(s,9H)；MS-ESI[M+H]+＝533.0。
实施例112 1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-[(2-氟环丙烷羰基)氨基]吡唑-4-甲酰胺112
根据实施例109的方法，采用N-(4-氰基-1H-吡唑-3-基)-2-氟-环丙烷甲酰胺作为原料，制备112。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.40(s,1H),8.84(s,1H),8.57(d,J＝5.3Hz,1H),7.85(s,1H),7.56(d,J＝5.4Hz,1H),7.47(s,1H),6.58(d,J＝3.7Hz,1H),5.08-4.88(m,2H),4.58(m,1H),4.41(m,1H),4.32-4.12(m,3H),3.93(d,J＝11.9Hz,1H),2.58(d,J＝4.6Hz,2H),2.43(s,2H),1.62(d,J＝23.3Hz,1H),1.22(s,6H)；MS-ESI[M+H]+＝522.2。
实施例113 1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]吡唑-4-甲酰胺113
根据实施例109步骤2和3的方法，采用1H-吡唑-4-甲腈(2.0equiv.,1.745mmol)作为原料，制备113：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.79(d,J＝0.7Hz,1H),8.58(d,J＝5.3Hz,1H),8.20(d,J＝0.6Hz,1H),7.77(s,1H),7.59(d,J＝5.3Hz,1H),7.22(s,1H),6.59(s,1H),5.03(t,J＝5.6Hz,1H),4.52(d,J＝10.8Hz,1H),4.41(d,J＝6.3Hz,1H),4.27(d,J＝11.3Hz,1H)；MS-ESI[M+H]+＝421.2。
实施例114 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-苯基-吡唑-4-甲酰胺114
步骤1:1-(2-(6-(叔-丁基)-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-苯基-1H-吡唑-4-甲腈114a的制备
Figure BDA0002445089910000661
将碳酸铯(3equiv.,0.2756mmol)、5(50mg,0.09mmol)、4,4,5,5-四甲基-2-苯基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(28.1mg,0.14mmol)和二(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(7.1mg,0.01mmol)在1,4-二氧六环(0.9mL)和水(0.1mL)中的混合物在微波中加热至110℃15min。加入4,4,5,5-四甲基-2-苯基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(28.1mg,0.14mmol)，将反应物在微波中加热至110℃20min，随后加入4,4,5,5-四甲基-2-苯基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(56.2mg,0.28mmol)，在微波中于110℃加热20min。将反应物用水稀释，用乙酸乙酯萃取。有机相用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩通过柱色谱纯化(洗脱液：0－80％乙酸乙酯的庚烷溶液；0－3％甲醇的DCM溶液)，获得目标产物。MS-ESI[M+H]+＝495.4。
步骤2：将114a(25.7mg,0.05mmol)置于乙醇(1.0mL,17mmol)和水(0.5mL,30mmol)中，采用二(二甲基膦基氧基)铂二甲基膦酸(1.1mg,0.003mmol)在氮气环境中处理。将反应物加热至90℃21h，浓缩，通过HPLC纯化，获得114：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.82(s,1H),8.72(d,J＝5.4Hz,1H),8.57(d,J＝2.5Hz,1H),7.92(d,J＝1.8Hz,1H),7.89-7.82(m,4H),7.79(dd,J＝13.1,1.7Hz,1H),7.72(s,1H),7.47-7.40(m,3H),7.32(s,1H),5.15(s,1H),4.56(d,J＝18.7Hz,2H),1.40(s,9H),1.16(s,2H)；MS-ESI[M+H]+＝513.2。
实施例115 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-(1-甲基吡唑-4-基)吡唑-4-甲酰胺115
步骤1：1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-1'-甲基-1H,1'H-3,4'-联吡唑-4-甲腈115a的制备
Figure BDA0002445089910000671
向小瓶中加入1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈111a(100mg,0.184mmol)、1-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡唑(76.5mg,0.367mmol)、碳酸铯(179.6mg,0.55mmol)和Pd(dppf)Cl2(14.2mg,0.018mmol)。加入脱气的1,4-二氧六环(3.7mL)和水(1mL)。将反应混合物抽真空/再充入N2(3×)。将小瓶加盖，将反应混合物于90℃搅拌2h。将粗品反应物通过硅藻土垫过滤，滤垫用EtOAc充分冲洗(3×20mL)。滤液用水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残留物通过硅胶柱色谱纯化(EtOAc:MeOH梯度洗脱)，获得75.7mg(82.7％)的115a。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.21(s,1H),8.77(d,J＝5.3Hz,1H),8.36(d,J＝2.5Hz,1H),8.09(s,2H),7.92(d,J＝5.4Hz,1H),7.57(d,J＝11.4Hz,2H),4.58-4.41(m,3H),4.00(s,3H),1.44(s,9H)；MS-ESI[M+H]+＝499.3。
步骤2：向溶于EtOH(7.6mL)和H2O(2.2mL)的115a(75.7mg,0.15mmol)的搅拌溶液中加入二(二甲基膦基氧基)铂二甲基膦酸(5.2mg,0.012mmol)，将反应混合物于90℃空气中搅拌4h。将反应物在DCM中稀释。有机层用水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。粗品混合物通过制备性HPLC纯化，获得为固体的115(50.3mg,64.1％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.80(s,1H),8.71(d,J＝5.3Hz,1H),8.57(d,J＝2.6Hz,1H),8.38(s,1H),7.98(d,J＝0.8Hz,1H),7.92(d,J＝1.7Hz,1H),7.82(d,J＝5.3Hz,1H),7.79(dd,J＝13.1,1.7Hz,1H),7.68(br s,1H),7.23(br s,1H),5.08(t,J＝5.5Hz,1H),4.65-4.44(m,2H),3.89(s,3H),1.39(s,9H)；MS-ESI[M+H]+＝517.2。
实施例116 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-[(5-氯代-2-吡啶基)氨基]吡唑-4-甲酰胺116
步骤1:1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-(5-氯代吡啶-2-基氨基)-1H-吡唑-4-甲腈116a的制备
Figure BDA0002445089910000681
向小瓶中加入1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈111a(40.0mg,0.073mmol)、5-氯代吡啶-2-胺(12.3mg,0.095mmol)、XantPhos(10.6mg,0.018mmol)、碳酸铯(71.8mg,0.22mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(9.0mg,0.009mmol)。加入脱气的1,4-二氧六环(1.4mL)，将反应混合物抽真空/再充入N2(3×)。将小瓶加盖，将反应混合物于95℃搅拌2.5h。将粗品反应物通过硅藻土垫过滤，滤垫用EtOAc充分洗涤(3×20mL)。滤液用水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残留物通过硅胶柱色谱纯化(EtOAc:MeOH梯度洗脱)，获得15.9mg(39.7％)的116a。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.19(s,1H),8.77(d,J＝5.4Hz,1H),8.37(t,J＝2.3Hz,1H),8.25(d,J＝2.5Hz,1H),7.95(d,J＝8.9Hz,1H),7.90(d,J＝5.3Hz,1H),7.68(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),7.59(s,2H),7.33(s,1H),4.60-4.44(m,3H),1.44(s,9H)；MS-ESI[M+H]+＝545.3。
步骤2:根据实施例115步骤2的方法，采用116a作为原料，制备116。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.87(s,1H),8.84(s,1H),8.70(d,J＝5.4Hz,1H),8.57(d,J＝2.6Hz,1H),8.26(dd,J＝2.6,0.8Hz,1H),8.04(dd,J＝8.8,0.7Hz,1H),7.93(br s,1H),7.92(d,J＝1.7Hz,1H),7.89(dd,J＝9.0,2.7Hz,1H),7.84(d,J＝5.3Hz,1H),7.79(dd,J＝13.1,1.7Hz,1H),7.52(br s,1H),5.12(t,J＝5.1Hz,1H),4.58(d,J＝23.5Hz,2H),1.40(s,9H)；MS-ESI[M+H]+＝563.2。
实施例117 3-氨基-1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]吡唑-4-甲酰胺117
Figure BDA0002445089910000691
根据实施例114步骤2的方法，将3-氨基-1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]吡唑-4-甲腈117a转化为117：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.61(s,1H),8.48(d,J＝5.4Hz,1H),7.61-7.53(m,1H),7.49(d,J＝5.4Hz,1H),7.03(s,1H),6.57(d,J＝0.6Hz,1H),5.81(s,2H),5.01(t,J＝5.9Hz,1H),4.64(dd,J＝13.0,4.9Hz,1H),4.42(dd,J＝13.0,6.6Hz,1H),4.28-4.15(m,2H),3.91(d,J＝12.1Hz,1H),2.58(d,J＝6.3Hz,2H),2.43(s,2H),1.22(s,6H)；MS-ESI[M+H]+＝436.2。
实施例118 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-[(5-哌嗪-1-基-2-吡啶基)氨基]吡唑-4-甲酰胺118
步骤1:4-(6-(1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基-甲基)吡啶-4-基)-4-氨基甲酰基-1H-吡唑-3-基氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔-丁基酯118a的制备
Figure BDA0002445089910000692
根据实施例116的方法，使得作为原料的4-(6-氨基-3-吡啶基)哌嗪-1-甲酸叔-丁基酯与1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈111a反应，获得118a：MS-ESI[M+H]+＝713.4。
步骤2:向118a(36mg,0.05mmol)的MeOH(1mL)和DCM(1mL)溶液中加入HCl(4M)的1,4-二氧六环(0.6mL)溶液，将反应混合物于40℃搅拌1.5h，然后减压浓缩。粗品产物通过制备性HPLC纯化，获得为固体的118(5.6mg,17.0％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.45(s,1H),8.81(s,1H),8.68(d,J＝5.3Hz,1H),8.57(d,J＝2.6Hz,1H),7.92(d,J＝1.9Hz,2H),7.87(t,J＝7.9Hz,2H),7.84-7.76(m,2H),7.44(dd,J＝9.2,3.0Hz,2H),5.14(t,J＝5.5Hz,1H),4.63(br s,1H),4.55(br s,1H),2.99(br s,4H),2.87(br s,4H),1.40(s,9H),1H notseen；MS-ESI[M+H]+＝613.3。
实施例119 1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-[(1-甲基三唑-4-基)氨基]吡唑-4-甲酰胺119
根据实施例115的方法，采用1-甲基三唑-4-胺作为原料，制备119。MS-ESI[M+H]+＝517.2.
实施例120 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-[[5-[(2S)-2-甲基-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基]-2-吡啶基]氨基]吡唑-4-甲酰胺120
根据实施例116的方法，采用5-[(2S)-2-甲基-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基]吡啶-2-胺作为原料，制备120。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.49(s,1H),8.82(s,1H),8.68(d,J＝5.4Hz,1H),8.57(d,J＝2.6Hz,1H),7.95-7.88(m,3H),7.87(br s,1H),7.82(d,J＝5.3Hz,1H),7.79(dd,J＝13.1,1.7Hz,1H),7.48(dd,J＝9.0,2.9Hz,1H),7.43(br s,1H),5.16(t,J＝5.6Hz,1H),4.63(br s,1H),4.56(td,J＝6.4,3.2Hz,3H),4.48(t,J＝6.0Hz,1H),4.43(t,J＝6.0Hz,1H),3.76-3.67(m,1H),3.41(p,J＝6.3Hz,1H),3.17-3.09(m,1H),3.03-2.94(m,1H),2.60-2.54(m,1H),2.39-2.30(m,2H),2.25-2.17(m,1H),1.40(s,9H),0.96(d,J＝6.4Hz,3H)；MS-ESI[M+H]+＝683.3。
实施例121 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-[1-(二氟甲基)吡唑-4-基]吡唑-4-甲酰胺121
根据实施例115的方法，采用1-(二氟甲基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡唑作为原料，制备121。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.95(d,J＝0.6Hz,1H),8.87(s,1H),8.73(d,J＝5.3Hz,1H),8.57(d,J＝2.5Hz,1H),8.32(s,1H),7.99-7.89(m,2H),7.84(d,J＝5.3Hz,1H),7.82-7.75(m,2H),7.33(br s,1H),5.10-5.02(m,1H),4.58(brs,1H),4.52(br s,1H),1.39(s,9H)；MS-ESI[M+H]+＝553.2。
实施例122 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-(1,3-二甲基吡唑-4-基)吡唑-4-甲酰胺122
根据实施例115的方法，采用1,3-二甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡唑作为原料，制备122。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.80(s,1H),8.70(d,J＝5.4Hz,1H),8.56(d,J＝2.6Hz,1H),8.28(s,1H),7.91(d,J＝1.7Hz,1H),7.83(d,J＝5.4Hz,1H),7.79(dd,J＝13.1,1.7Hz,1H),7.62(s,1H),7.22(s,1H),5.09(s,1H),4.57(d,J＝17.1Hz,2H),3.80(s,3H),2.36(s,3H),1.39(s,9H)；MS-ESI[M+H]+＝531.2。
实施例123 1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-(丙酰基氨基)吡唑-4-甲酰胺123
步骤1:1-(2-(7,7-二甲基-1-氧代-3,4,7,8-四氢-1H-环戊二烯并[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-吡唑-3-甲腈123a的制备
Figure BDA0002445089910000711
根据实施例5的方法，采用3-(三苯甲基氨基)-1H-吡唑-4-甲腈作为原料，制备123a。MS-ESI[M+H]+＝660.6。
步骤2:4-氨基-1-(2-(7,7-二甲基-1-氧代-3,4,7,8-四氢-1H-环戊二烯并[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-1H-吡唑-3-甲腈123b的制备
Figure BDA0002445089910000712
于0℃，将123a(400mg,0.6ammol)在乙醚(30mL,287mmol)中的搅拌混合物采用HCl(4M)的1,4-二氧六环(3.0mL,12mmol)溶液处理，随后采用DCM(12mL)处理，将反应物逐渐温热至室温。1.5h后，反应物用DCM稀释，采用MP-碳酸盐树脂处理30分钟，过滤并真空浓缩。粗品产物通过硅胶快速色谱纯化(洗脱液：0－20％甲醇的DCM溶液)，获得123b，为白色固体。MS-ESI[M+H]+＝418.4。
步骤3:将二异丙基乙胺(DIEA,25μL,0.14mmol)和丙酸(5μL,0.07mmol)加至123b(20mg,0.04790mmol)的DMF(1mL,12.9mmol)溶液中。将反应物冷却至0℃，搅拌10min。加入HATU(27.9mg,0.07mmol)，将反应物搅拌同时温热至70℃8h。加入另一份丙酸(7.5μL,0.11mmol)、DIEA(25μL,0.14mmol)和HATU(27.9mg,0.07mmol)，将反应物于90℃搅拌4h，随后于60℃搅拌72h。加入水，将反应物用乙酸乙酯萃取。有机相用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩，通过柱色谱纯化(洗脱液：0－3％甲醇的DCM溶液)。然后将产物置于乙醇(2mL,34.3mmol)和水(1.0mL,56mmol)中，加入二(二甲基膦基氧基)铂二甲基膦酸(0.05equiv.,0.002395mmol)。将反应物在密封瓶中于90℃搅拌16h，浓缩，通过HPLC纯化，获得123。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.56-8.49(m,2H),7.43(d,J＝5.4Hz,1H),6.59(s,1H),5.73(s,2H),3.33(s,5H),2.61-2.50(m,2H),2.43(s,3H),2.01-1.91(m,2H),1.22(s,6H),0.79(t,J＝7.5Hz,3H)；MS-ESI[M+H]+＝492.2。
实施例124 3-乙酰氨基-1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]吡唑-4-甲酰胺124
根据实施例123的方法，采用乙酸作为原料，制备124。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.47(d,J＝5.3Hz,1H),7.92(s,1H),7.38(d,J＝5.3Hz,1H),6.79(s,1H),5.63-5.04(m,1H),4.99(s,2H),4.52-4.47(m,1H),4.31-4.00(m,3H),2.56(d,J＝4.4Hz,2H),2.51(s,1H),2.49(s,2H),1.79(s,3H),1.27(s,1H),1.26(s,6H)；MS-ESI[M+H]+＝478.2。
实施例125 1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-[[5-[(2S)-2-甲基-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基]-2-吡啶基]氨基]吡唑-4-甲酰胺125
步骤1:(S)-1-(2-(7,7-二甲基-1-氧代-3,4,7,8-四氢-1H-环戊二烯并[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-((5-(2-甲基-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-1H-吡唑-4-甲腈125a的制备
Figure BDA0002445089910000721
向获自实施例5的1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈5(40mg,0.08mmol)、获自实施例4的(S)-5-(2-甲基-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)吡啶-2-胺4(30mg,0.12mmol)和碳酸铯(52mg,0.16mmol)的1,4-二氧六环(10mL)混合物中加入Brettphos(4.3mg,0.008mmol)和Ruphos预催化剂(3mg,0.004mmol)。将混合物于100℃、氮气环境中搅拌3小时。将获得的混合物倒入水(100mL)中，用乙酸乙酯萃取(50mL×3)。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残留物通过prep-TLC纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1)，获得125a(10mg,20％)，为白色固体。MS-ESI[M+H]+＝649.3。
步骤2:根据实施例115步骤2的方法，采用125a作为原料，制备125。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.82(s,1H),8.57(d,J＝5.2Hz,1H),7.93-7.90(m,2H),7.70(d,J＝5.6Hz,1H),7.60(d,J＝7.2Hz,1H),6.74(s,1H),4.72-4.60(m,6H),4.40-4.35(m,1H),4.26-4.25(m,2H),4.01-3.98(m,1H),3.58(m,2H),3.12(m,2H),2.61-2.48(m,7H),2.32(m,1H),1.25(s,6H),1.00(d,J＝6.4Hz,1H)；MS-ESI[M+H]+＝667.3。
实施例126 1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-4-[[5-[(2S)-2-甲基-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基]-2-吡啶基]氨基]吡唑-3-甲酰胺126
步骤1:4-溴-1-(2-(7,7-二甲基-1-氧代-3,4,7,8-四氢-1H-环戊二烯并[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-1H-吡唑-3-甲酸甲酯126a的制备
Figure BDA0002445089910000731
向获自实施例3的2-(1-羟基-1,3-二氢-[1,2]氧杂硼杂环戊并[4,3-c]吡啶-4-基)-7,7-二甲基-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-环戊二烯并[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-1-酮3(300mg,0.89mmol)、4-溴-1H-吡唑-3-甲酸甲酯(182mg,0.89mmol)、乙酸铜(II)(194mg,1.07mmol)和三乙胺(108mg,1.07mmol)的二氯甲烷(5mL)混合物中加入吡啶(85mg,1.02mmol)。将混合物于60℃、氧气环境中搅拌1小时。加入水，有机层经无水硫酸钠干燥，浓缩。残留物通过prep-TLC纯化(二氯甲烷:甲醇＝30:1)，获得126a(100mg,22％)，为黄色固体。MS-ESI[M+Na]+＝536.1/538.1。
步骤2:(S)-1-(2-(7,7-二甲基-1-氧代-3,4,7,8-四氢-1H-环戊二烯并[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-4-((5-(2-甲基-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-1H-吡唑-3-甲酸甲酯126b的制备
Figure BDA0002445089910000741
将126a(70mg,0.14mmol)、8(34mg,0.14mmol)、Brettphos(7.3mg,0.014mmol)、碳酸铯(89mg,0.27mmol)和Brettphos预催化剂G3(6.2mg,0.007mmol)的1,4-二氧六环(2mL)混合物于100℃、氮气环境中搅拌1小时。将获得的混合物用水(5mL)稀释，用乙酸乙酯萃取(20mL×3)。合并的有机层经硫酸钠干燥，浓缩。残留物通过prep-TLC纯化(二氯甲烷:甲醇＝30:1)，获得126b(20mg,22％)，为黄色固体。MS-ESI[M+H]+＝682.2。
步骤3:将126b(20mg,0.03mmol)在氨-四氢呋喃(50mL)中的混合物在密封试管中于100℃搅拌16小时。将获得的混合物浓缩，残留物通过prep-TLC纯化(二氯甲烷:甲醇＝30:1)，获得为固体的126(4.4mg,23％)：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.52(s,1H),8.62(s,1H),8.54(d,J＝5.2Hz,1H),8.03(s,1H),7.58(d,J＝5.6Hz,1H),7.32-7.30(m,2H),6.86(s,1H),6.80(s,1H),6.75(d,J＝8.8Hz,1H),5.43(s,1H),4.81-4.78(m,1H),4.71-4.65(m,6H),4.23-4.14(m,2H),3.61-3.49(m,2H),3.40-3.38(m,1H),3.07(m,2H),2.58-2.40(m,7H),2.20-2.10(m,1H),1.28(s,6H),0.96(d,J＝6.4Hz,3H)；MS-ESI[M+H]+＝667.2。
实施例127 1-[3-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-5-氟-2-(羟基甲基)苯基]-3-(1-甲基吡唑-4-基)吡唑-4-甲酰胺127
步骤1：1-(3-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-5-氟-2-(羟基甲基)苯基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈127a
Figure BDA0002445089910000751
根据实施例115的方法，使得2-溴-6-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-4-氟苯甲醛和1-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡唑在钯催化下反应，形成127a：MS-ESI[M+H]+＝561.9。
步骤2：根据实施例115的方法，将127a转化为127：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.72(s,1H),8.32(d,J＝2.4Hz,1H),8.19(s,1H),8.01(s,1H),7.59-7.57(m,2H),7.50(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),7.23-7.20(m,1H),4.48(s,1H),4.32(s,2H),3.96(s,3H),1.44(s,9H)；MS-ESI[M+H]+＝534.1。
实施例128 3-(丁酰基氨基)-1-[2-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]吡唑-4-甲酰胺128
根据实施例123的方法，将4-氨基-1-(2-(7,7-二甲基-1-氧代-3,4,7,8-四氢-1H-环戊二烯并[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-1H-吡唑-3-甲腈123b和丁酸偶合，形成128：1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.46(d,J＝5.3Hz,1H),7.96(s,1H),7.39(d,J＝5.3Hz,1H),6.78(s,1H),5.51(d,J＝13.8Hz,3H),5.05(d,J＝47.8Hz,3H),4.57-4.43(m,1H),4.18(d,J＝46.8Hz,3H),2.55(d,J＝5.2Hz,2H),2.49(s,2H),2.00(t,J＝7.5Hz,2H),1.41(h,J＝7.4Hz,2H),1.26(s,6H),0.79(t,J＝7.4Hz,3H)；MS-ESI[M+H]+＝506.4。
实施例129 3-(5-氨基吡嗪-2-基)-1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]吡唑-4-甲酰胺129
根据实施例130的方法，将1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈111a转化为129：MS-ESI[M+H]+＝530.2。
实施例130 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-[3-[2-(二甲基氨基)乙基氨基甲酰基]苯基]吡唑-4-甲酰胺130
步骤1:3-(1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-4-氰基-1H-吡唑-3-基)-N-(2-(二甲基氨基)乙基)苯甲酰胺130a的制备
Figure BDA0002445089910000761
向1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈111a(40mg,0.073mmol)的无水ACN(1mL)的溶液中加入[3-(2-二甲基氨基乙基氨基甲酰基)苯基]硼酸(26.4mg,0.112mmol)、Pd(dppf)Cl2与DCM的复合物(9mg,0.0112mmol)和1M碳酸钾的水(1mL)溶液。将反应混合物抽真空/再充入N2(3X)。将反应混合物于110℃搅拌1h。粗品反应物用EtOAc(2mL)和饱和的NH4Cl水溶液(2mL)稀释。分离各层。将有机层通过硅藻土垫过滤，经硫酸镁干燥，减压浓缩，获得粗品130a，其无需纯化可以直接用于步骤2。
步骤2：向溶于THF(0.5mL)的粗品130a(0.07mmol)中加入EtOH(0.5mL)、二(二甲基膦基氧基)铂二甲基膦酸(3.0mg,0.007mmol)和H2O(1mL)，将反应混合物于90℃、空气中搅拌2h。将反应物在DCM中稀释。有机层用水和盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩。粗品产物通过制备性HPLC纯化，获得为固体的130(5.1mg,11.1％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.85(s,1H),8.74(d,J＝5.3Hz,1H),8.57(d,J＝2.5Hz,1H),8.47(t,J＝5.6Hz,1H),8.26(t,J＝1.7Hz,1H),8.01-7.71(m,6H),7.52(t,J＝7.7Hz,1H),7.32(s,1H),5.13(t,J＝5.4Hz,1H),4.56(d,J＝18.2Hz,2H),3.44-3.34(m,2H),2.61-2.52(m,1H),2.47(d,J＝8.2Hz,1H),2.25(s,6H),1.40(s,9H)；MS-ESI[M+H]+＝627.3
实施例131 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-[4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)苯基]吡唑-4-甲酰胺131
根据实施例130的方法，使得(4-甲基哌嗪-1-基)-[4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基]甲酮和111a反应，形成131：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.84(s,1H),8.73(d,J＝5.3Hz,1H),8.57(d,J＝2.5Hz,1H),7.97-7.84(m,4H),7.84-7.74(m,2H),7.52-7.41(m,2H),7.35(s,1H),5.12(t,J＝5.4Hz,1H),4.56(d,J＝21.4Hz,2H),3.62(s,2H),2.38-2.28(m,5H),2.20(s,3H),1.39(d,J＝3.6Hz,9H)；MS-ESI[M+H]+＝639.3。
实施例132 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)吡唑-4-甲酰胺132
根据实施例130的方法，使得5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶和111a反应，形成132：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.75(s,1H),8.86(s,1H),8.73(d,J＝5.3Hz,1H),8.65(d,J＝2.0Hz,1H),8.57(d,J＝2.5Hz,1H),8.41(d,J＝2.0Hz,1H),7.98-7.87(m,2H),7.79(dd,J＝13.1,1.8Hz,1H),7.72(s,1H),7.51(dd,J＝3.4,2.4Hz,1H),7.31(s,1H),6.56-6.48(m,1H),5.14(t,J＝5.4Hz,1H),4.59(d,J＝21.7Hz,2H),1.40(s,9H)；MS-ESI[M+H]+＝553.2。
实施例133 3-[4-(氨基甲基)苯基]-1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]吡唑-4-甲酰胺133
根据实施例130的方法，将1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈111a转化为133：MS-ESI[M+H]+＝542.2。
实施例134 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-(1-异丁基吡唑-4-基)吡唑-4-甲酰胺134
根据实施例130的方法，将1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈111a转化为134：MS-ESI[M+H]+＝559.3。
实施例135 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-吡啶基]吡唑-4-甲酰胺135
根据实施例130的方法，使得1-甲基-4-(5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡啶-2-基)哌嗪和111a反应，形成135：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.82(s,1H),8.71(d,J＝5.3Hz,1H),8.58(dd,J＝11.8,2.5Hz,2H),8.00(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),7.92(d,J＝1.8Hz,1H),7.90-7.75(m,2H),7.70(s,1H),7.29(s,1H),6.89(d,J＝9.0Hz,1H),5.11(t,J＝5.4Hz,1H),4.55(d,J＝20.5Hz,2H),3.60-3.52(m,4H),2.43(q,J＝5.5,4.9Hz,4H),2.24(s,3H),1.39(s,9H)；MS-ESI[M+H]+＝612.3。
实施例136 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-吡啶基]吡唑-4-甲酰胺136
根据实施例130的方法，使得5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶和111a反应，形成136：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.83(s,1H),8.74(d,J＝5.3Hz,1H),8.57(d,J＝2.5Hz,1H),8.16(d,J＝5.2Hz,1H),7.96-7.84(m,2H),7.83-7.72(m,2H),7.41(s,2H),7.09(dd,J＝5.1,1.2Hz,1H),6.52(s,0H),5.13(t,J＝5.4Hz,1H),4.53(d,J＝17.6Hz,2H),3.50(t,J＝4.9Hz,4H),2.41(t,J＝5.0Hz,4H),2.22(s,3H),1.39(s,9H)；MS-ESI[M+H]+＝612.3。
实施例137 3-(6-乙酰氨基-3-吡啶基)-1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]吡唑-4-甲酰胺137
根据实施例130的方法，将1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈111a转化为137：MS-ESI[M+H]+＝571.2。
实施例138 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-(6-羟基-3-吡啶基)吡唑-4-甲酰胺138
根据实施例130的方法，将1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈111a转化为138：MS-ESI[M+H]+＝530.2。
实施例139 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-(5-甲基磺酰基-3-吡啶基)吡唑-4-甲酰胺139
根据实施例130的方法，将1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈111a转化为139：MS-ESI[M+H]+＝592.2。
实施例140 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-(3-喹啉基)吡唑-4-甲酰胺140
根据实施例130的方法，将1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈111a转化为140：MS-ESI[M+H]+＝564.2。
实施例141 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-[4-(羟基甲基)苯基]吡唑-4-甲酰胺141
根据实施例130的方法，使得[4-(羟基甲基)苯基]硼酸和111a反应，形成141：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.80(s,1H),8.72(d,J＝5.3Hz,1H),8.57(d,J＝2.5Hz,1H),7.98-7.75(m,5H),7.68(s,1H),7.41-7.34(m,2H),7.31(s,1H),5.23(t,J＝5.7Hz,1H),5.13(t,J＝5.4Hz,1H),4.55(d,J＝5.8Hz,2H),2.59-2.52(m,2H),1.40(s,9H)；MS-ESI[M+H]+＝543.2。
实施例142 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-嘧啶-5-基-吡唑-4-甲酰胺142
根据实施例130的方法，将1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈111a转化为142：MS-ESI[M+H]+＝515.2。
实施例143 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-(4-吡啶基)吡唑-4-甲酰胺143
根据实施例130的方法，将1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈111a转化为143：MS-ESI[M+H]+＝514.2。
实施例144 1-[2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代-酞嗪-2-基)-3-(羟基甲基)-4-吡啶基]-3-(3-吡啶基)吡唑-4-甲酰胺144
根据实施例130的方法，将1-(2-(6-叔-丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-3-(羟基甲基)吡啶-4-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈111a转化为144：MS-ESI[M+H]+＝514.2。
实施例145 1-[3-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-5-氟-2-(羟基甲基)苯基]-3-[[5-[(2S)-2-甲基-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基]-2-吡啶基]氨基]吡唑-4-甲酰胺145
步骤1：1-(3-(7,7-二甲基-1-氧代-3,4,7,8-四氢-1H-环戊二烯并[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-基)-5-氟-2-(羟基甲基)苯基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈145a的制备
Figure BDA0002445089910000791
根据实施例111的方法，采用2-溴-6-(7,7-二甲基-4-氧代-1,2,6,8-四氢环戊二烯并[3,4]吡咯并[3,5-b]吡嗪-3-基)-4-氟-苯甲醛作为原料，制备145a。MS-ESI[M+H]+＝545.8。
步骤2：根据实施例125的方法,将145a转化为145：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.39(s,1H),8.72(s,1H),8.00(s,1H),7.34-7.27(m,1H),7.22-7.20(m,1H),6.97-6.93(m,2H),6.75(s,1H),6.25(br s,2H),4.70-4.63(m,6H),4.57-4.46(m,4H),3.53-3.49(m,3H),3.08(s,2H),2.59-2.53(m,5H),2.46(s,2H),2.21-2.16(m,1H),1.29(s,6H),0.98-0.94(m,3H)；MS-ESI[M+H]+＝684.3。
实施例146(S)-1-(5-氟-2-(羟基甲基)-3-(1-氧代-3,4,6,7,8,9-六氢吡啶并[[3,4-b]吲嗪-2(1H)-基)苯基)-3-((5-(2-甲基-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-1H-吡唑-4-甲酰胺146
步骤1:1-(5-氟-2-(羟基甲基)-3-(1-氧代-3,4,6,7,8,9-六氢吡啶并[[3,4-b]吲嗪-2(1H)-基)苯基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈146a的制备
Figure BDA0002445089910000801
向2-(6-氟-1-羟基-1,3-二氢苯并[c][1,2]氧杂环戊硼烷-4-基)-3,4,6,7,8,9-六氢吡啶并[[3,4-b]吲嗪-1(2H)-酮(80mg,0.23mmol)和3-碘-1H-吡唑-4-甲腈(51.5mg,0.23mmol)的二氯甲烷(2mL)混合物中加入
Figure BDA0002445089910000802
MS(80mg)、乙酸铜(51.4mg,0.28mmol)和三乙胺(28.3mg,0.28mmol)。在氧气环境下、于50℃搅拌1小时后，将反应物用水(10mL)骤冷，用乙酸乙酯萃取(15mL×3)。合并的有机萃取物用盐水洗涤(10mL×2),经无水硫酸钠干燥，浓缩。残留物通过柱色谱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝10:1－1:1)，获得146a(45mg,36％)，为浅黄色固体。MS-ESI[M+H]+＝532.1。
步骤2:(S)-1-(5-氟-2-(羟基甲基)-3-(1-氧代-3,4,6,7,8,9-六氢吡啶并[[3,4-b]吲嗪-2(1H)-基)苯基)-3-((5-(2-甲基-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-1H-吡唑-4-甲腈146b
Figure BDA0002445089910000811
向1-(5-氟-2-(羟基甲基)-3-(1-氧代-3,4,6,7,8,9-六氢吡啶并[[3,4-b]吲嗪-2(1H)-基)苯基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲腈146a(45mg,0.085mmol)和(S)-5-(2-甲基-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)吡啶-2-胺4(32mg,0.13mmol)的1,4-二氧六环(3mL)混合物中加入BrettPhos-Pd-G3(8mg,0.0085mmol)、碳酸铯(56mg,0.17mmol)，随后加入Brettphos(9mg,0.017mmol)。在氮气环境下、于110℃搅拌6小时后，将反应混合物用水稀释，用乙酸乙酯萃取(20mL×3)。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，浓缩。残留物经硅胶色谱纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1)，获得146b(9mg,16％)，为黄色固体。MS-ESI[M+H]+＝652.3。
步骤3:将(S)-1-(5-氟-2-(羟基甲基)-3-(1-氧代-3,4,6,7,8,9-六氢吡啶并[[3,4-b]吲嗪-2(1H)-基)苯基)-3-((5-(2-甲基-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-1H-吡唑-4-甲腈146b(9mg,0.0138mmol)和氢化(二甲基膦酸-kp)[氢二(二甲基磷-kp]]铂(hydrido(dimethylphosphinous acid-kp)[hydrogen bis(dimethylphosphinito-kp]]platinum(II))(II)(1mg,0.00138mmol)在乙醇(1mL)和水(0.5mL)中的混合物在氮气环境下、于90℃搅拌2小时。将其用二氯甲烷(20mL)稀释，用水(10mL)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，浓缩。残留物经硅胶色谱纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1)，获得146(2.7mg,29％)，为黄色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.39(s,1H),8.71(s,1H),8.02(d,J＝2.0Hz,1H),7.47-7.43(m,1H),7.37-7.34(m,1H),7.11-7.09(m,1H),6.98(dd,J＝8.6,2.6Hz,1H),6.25(s,1H),4.72-4.62(m,4H),4.53(d,J＝12.0Hz,1H),4.38(d,J＝12.4Hz,1H),4.06-4.05(m,2H),3.94-3.83(m,2H),3.54-3.42(m,1H),3.40(br s,1H),3.17-3.08(m,3H),2.97-2.90(m,1H),2.85-2.82(m,2H),2.58-2.55(m,1H),2.42-2.46(m,2H),2.23-2.14(m,1H),2.06-2.03(m,3H),1.89-1.86(m,3H),1.70(br s,1H),0.96(m,3H)；MS-ESI[M+H]+＝670.3。
实施例901生物化学Btk试验
可以采用标准生物化学Btk-激酶试验的通用方法如下测试式I化合物。制备不含Btk酶的主混合物(master mix minus Btk酶)，其含有1×细胞信号传导激酶缓冲液(25mMTris-HCl,pH 7.5、5mMβ-甘油磷酸酯，2mM二硫苏糖醇,0.1mM Na3VO4、1mM MgCl2)、0.5μMPromega PTK生物素化的肽底物2和0.01％BSA。制备含有Btk酶的主混合物，其含有1×细胞信号传导激酶缓冲液、0.5μM(微摩尔浓度)PTK生物素化的肽底物2、0.01％BSA和100ng/孔(0.06mU/孔)Btk酶。Btk酶如下制备：将具有C末端V5和6×His标记的全长人野生型Btk(编号NM-000061)亚克隆到pFast
Figure BDA0002445089910000821
载体(Invitrogen/Life Technologies)，用于制备携带杆状病毒的这种表位标记的Btk。杆状病毒的传代(generation)是根据Invitrogen在其关于“Bac-to-Bac Baculovirus Expression Systems(Bac-to-Bac杆状病毒表达系统)公开的方案中详细描述的方法进行的(Invitrogen/Life Technologies,Cat.Nos.10359-016和10608-016)。第3代病毒用于感染Sf9细胞以过度表达重组Btk蛋白。然后，Btk蛋白采用Ni-NTA柱纯化至均质。根据敏感Sypro-Ruby染色分析，最终蛋白制剂的纯度高于95％。在水中制备200μM的ATP溶液，用1N NaOH调节至pH 7.4。将在5％DMSO中的1.25μL(微升)的化合物转移到96孔1/2面积的Costar聚苯乙烯板中。化合物可以单独测试，采用11-点剂量-响应曲线(起始浓度为10μΜ；1:2稀释)。将18.75μL的不含酶主混合物(作为阴性对照)和含酶主混合物转移至96孔1/2面积的Costar聚苯乙烯板的适当孔中。5μL的200μΜATP加入到96孔1/2面积Costar聚苯乙烯板的混合物中，使得ATP的终浓度为40μΜ。将反应物在室温下温育1小时。采用含有30mM EDTA、20nM SA-APC和1nM PT66 Ab的Perkin Elmer 1×检测缓冲液终止反应。采用使用激发滤光片330nm、发射滤光片665nm和第二个发射滤光片615nm的Perkin Elmer Envision，采用时间分辨荧光读取该板。随后计算IC50值。或者，可以采用LanthaScreen试验通过其磷酸化的肽产物的定量测定评价Btk活性。在肽产物上的荧光素和检测抗体上的铽之间产生的FRET(荧光共振能量转移)随着能够减少肽磷酸化的Btk抑制剂的加入而降低。在25μL(微升)的最终反应体积中，将Btk(h)(0.1ng/25μl反应物)与50mMHepes pH 7.5、10mM MgCl2、2mM MnCl2、2mM DTT、0.2mM NaVO4、0.01％BSA和0.4uM荧光素poly-GAT一起温育。于室温下温育60分钟后，通过于室温下30分钟内加入在60mM EDTA中的终浓度为2nM的Tb-PY20检测抗体终止反应。采用于340nM激发以及495nm和520nm发射采用Perkin Elmer Envision进行测定。示例性Btk抑制IC70值如表1所示。
实施例902 Ramos细胞Btk试验
可以用于测试式I化合物活性的标准细胞Btk-激酶试验的通用方法如下。在试验化合物存在下，将Ramos细胞以0.5×107个细胞/ml的密度于37℃培养1hr。然后将细胞通过与10μg/ml抗人类IgM F(ab)2一起于37℃培养5分钟进行刺激。使细胞沉淀，裂解，对澄清的裂解液进行蛋白分析。每个样品的相同蛋白量采用抗-phosphoBtk(Tyr223)抗体(CellSignaling Technology#3531；Epitomics,cat.#2207-1)或phosphoBtk(Tyr551)抗体(BDTransduction Labs#558034)进行SDS-PAGE和免疫印迹法评价Btk自磷酸化，或者采用抗-Btk抗体(BD Transduction Labs#611116)控制每种裂解液的Btk总量。
实施例903 B-细胞增生试验
可以用于测试式I化合物活性的标准B-细胞增生试验的通用方法如下。采用B-细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech,Cat#130-090-862)，自8－16周龄Balb/c小鼠的脾纯化B-细胞。将试验化合物在0.25％DMSO中稀释，与2.5×105个纯化的小鼠脾B-细胞一起温育30分钟，然后加入10μg/ml抗小鼠IgM抗体(Southern Biotechnology Associates Cat#1022-01)，最终体积为100μl。24hr温育后，加入1μCi 3H-胸苷(1微居里的氚化胸苷)，将板再温育36hr，然后采用SPA[3H]胸苷摄取分析系统(Amersham Biosciences#RPNQ 0130)根据生产商的方案收获。SPA珠荧光采用液体闪烁/发光计数仪(microbeta)(WallaceTriplex 1450,Perkin Elmer)计数。
实施例904 T细胞增生试验
可以用于测试式I化合物的活性的标准T细胞增生试验的通用方法如下。采用PanT细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech,Cat#130-090-861)，自8－16周龄Balb/c小鼠的脾纯化T细胞。将试验化合物在0.25％DMSO中稀释，在采用10μg/ml抗-CD3(BD#553057)和抗-CD28(BD#553294)抗体预涂布的平底透明板中，与2.5×105个纯化的小鼠脾T细胞一起在100μl的最终体积下于37℃温育90分钟。24hr温育后，加入1μCi 3H-胸苷，将板再温育36hr，然后采用SPA[3H]胸苷摄取分析系统(Amersham Biosciences#RPNQ 0130)生产商方案收集。SPA-珠类荧光采用microbeta计数仪(Wallace Triplex 1450,Perkin Elmer)计数。
实施例905 CD86抑制试验
可以采用用于B细胞活性抑制的标准试验的通用方法如下测试式I化合物。通过红血细胞裂解(BD Pharmingen#555899)自8－16周龄Balb/c小鼠的脾脏纯化全部小鼠脾细胞。将试验化合物采用0.5％DMSO稀释，与1.25×106个脾细胞一起在200μl最终体积中在平底透明板(Falcon 353072)中于37℃一起温育60分钟。然后通过加入15μg/ml IgM(JacksonImmunoResearch 115-006-020)刺激细胞，于37℃、5％CO2环境下温育24hr。温育24hr后，将细胞转移至锥底透明的96-孔板中，通过以1200×g×5min离心沉淀。将细胞通过CD16/CD32(BD Pharmingen#553142)预封闭(preblocked),随后采用CD19-FITC(BD Pharmingen#553785)、CD86-PE(BD Pharmingen#553692)和7AAD(BD Pharmingen#51-68981E)三重染色。将细胞在BD FACS
Figure BDA0002445089910000841
流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA)上分选，对CD19+/7AAD-群设门。测定分选的群上CD86表面表达水平与试验化合物浓度的关系。
实施例906 B-ALL细胞存活试验
下面是用于标准B-ALL(急性淋巴母细胞白血病)细胞存活研究的方法，采用XTT读数测定存活细胞的数目。可以采用该试验测试式I化合物在培养基中抑制B-ALL细胞存活的能力。可以使用的一种人B-细胞急性淋巴母细胞白血病系为SUP-B15,人Pre-B-细胞ALL系可以获自ATCC。
将在100μl的Iscove培养基+20％FBS中的SUP-B15 pre-B-ALL细胞以5×105细胞/ml的浓度涂布在多个96-孔微量板上。然后加入试验化合物，终浓度为0.4％的DMSO溶液。将细胞于37℃、5％CO2环境中培养至多3天。3天后，将细胞以1:3分配到含有试验化合物的新的96-孔板中，使其再生长至多3天。每个24h的周期后，向双份的96孔板之一加入50μl的XTT溶液，于2、4和20小时根据生产商的说明读取吸光度读数。然后采集试验线性范围(0.5－1.5)内仅用DMSO处理的细胞的OD读数，测定相对于仅用DMSO处理细胞，用化合物处理的孔中存活细胞百分比。
实施例907 CD69全血试验
人血获自健康志愿者，其设定条件如下：1周不服药，不吸烟。通过静脉穿刺将血(对于8个试验化合物约20ml)收集到含有肝素钠的
Figure BDA0002445089910000842
(Becton,Dickinson和Co.)试管中。
DMSO中的10mM式I化合物溶液以1:10在100％DMSO中稀释，然后在100％DMSO中以三倍系列稀释，用于10点剂量-响应曲线。然后将化合物以1:10在PBS中稀释，随后向2ml的96-孔板中一式两份加入等份的5.5μl的各个化合物；加入5.5μl的10％DMSO的PBS溶液作为对照和无刺激孔。向每个孔中加入人全血-HWB(100μl)。混合后，将板于37℃、5％CO2、100％湿度温育30分钟。向每个孔(不包括无刺激孔)中加入山羊F(ab’)2抗-人IgM(10μl的500μg/ml溶液，最终为50μg/ml)，混合，将板再温育20小时。在20小时温育结束时，将样品与荧光标记的抗体一起于37℃、5％CO2、100％湿度温育30分钟。用于补偿调节和起始电压设定包括感应控制(induced control)、未染色和单染色。然后根据生产商说明书采用PharM LyseTM(BD Biosciences Pharmingen)裂解样品。然后将样品转移至在LSRII设备的BDBiosciences HTS 96孔系统上运行的96孔板中。获取数据，平均荧光强度值采用BDBiosciences DIVA软件获得。结果首先通过FACS分析软件(Flow Jo)进行分析。试验化合物的抑制浓度(IC50、IC70、IC90等)定义为CD69细胞阳性(也就是抗-IgM刺激的CD20阳性)百分比降低例如50％的浓度(减去无刺激背景的8个孔的平均值后8个对照孔的平均值)。IC70值通过Prism第5版的方法计算，采用非线性回归曲线拟合，如表1所示。
实施例908体外细胞增生试验
采用下列方案(Mendoza等(2002)Cancer Res.62:5485－5488)，通过细胞增生试验测定式I化合物的效能。CellTiter-
Figure BDA0002445089910000851
发光细胞存活性试验(包括试剂和方案)获自商业(Promega Corp.,Madison,WI,Technical Bulletin TB288)。该试验评价了化合物加入细胞和抑制细胞增生的能力。试验原理是基于通过在匀相试验中定量测定存在的ATP而测定存在的存活细胞的数目，在所述匀相试验中加入Cell-Titer Glo试剂导致细胞裂解，通过荧光素酶反应产生荧光信号。荧光信号与存在的ATP的量成正比。
将在正常生长培养基中的一组B-细胞淋巴瘤细胞系(BJAB,SUDHL-4,TMD8,OCI-Ly10,OCI-Ly3,WSU-DLCL2)涂布到384-孔板中，向每个孔中加入系列稀释的BTK抑制剂或仅加入DMSO。96小时培养后通过CellTiter-
Figure BDA0002445089910000852
(Promega)测定细胞活性。数据表示为相对于DMSO处理的对照细胞的BTK抑制剂处理的细胞的相对细胞存活性。数据点是每个剂量水平的4次重复试验的平均值。误差条表示平均值的SD。
步骤：第1天-接种细胞板(384-孔，黑色，透明底，microclear，带盖TC板，获自Falcon#353962)，收集细胞，以每孔1000个细胞的密度、54μl的体积在384孔的各孔中接种细胞，3天测试。细胞培养基：RPMI或DMEM高葡萄糖，10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，P/S。于37℃、5％CO2培养O/N。
第二天-向细胞中加入药物，化合物稀释液，DMSO板(1:2系列，用于9个点)，在96孔板的第二列中加入20μl的10mM化合物。采用Precision以1:2系列加入板(10μl+20μl 100％DMSO)，总共9个点。培养板为96-孔锥底聚丙烯板，获自Nunc(cat.#249946)(1:50稀释)，向所有孔中加入147μl的培养基。采用Rapidplate自DMSO板的每个孔中转移3μl的DMSO+化合物到培养板的每个相应的孔中。
向细胞中加入药物，细胞板(1:10稀释)，直接向细胞(在细胞上已经有54μl的培养基)中加入6μl的培养基+化合物。在不经常打开的培养箱中于37℃、5％CO2培养3天。
第5天-发色板，于室温下使得Cell Titer Glo缓冲液融化。于37℃移出细胞板，约30分钟内平衡至室温。将Cell Titer Glo缓冲液加至Cell Titer Glo底物(瓶到瓶)。向每个细胞孔中加入30μl Cell Titer Glo试剂(Promega cat.#G7572)。置于板振动器上约30分钟。在Analyst HT读板仪(half second per well)上读取发光。
细胞存活性试验和结合试验：将细胞以1000－2000个细胞/孔接种到384-孔板16h。在第二天，在96孔板中在DMSO中制备9个1:2系列化合物稀释液。然后采用
Figure BDA0002445089910000861
机器人(Zymark Corp.,Hopkinton,MA)将化合物稀释到生长培养基中。然后将稀释的化合物以一式四份加入384孔细胞板中，于37℃、5％CO2培养。4天后，根据Cell-Titer Glo(Promega)生产商说明书通过发光测定存活细胞的相对数目，在WallacMultilabel
Figure BDA0002445089910000862
(PerkinElmer,Foster City)上读数。EC50值采用
Figure BDA0002445089910000863
4.0软件(GraphPad,San Diego)计算。在所有的试验中，式I化合物和化疗药可以同时加入，或者间隔4小时加入(一个接一个按顺序)。
另一个典型的体外细胞增生试验包括下列步骤：
1.将在培养基中含有约104个细胞的等份的100μl细胞培养物加至384孔不透明壁板的每个孔中。
2.制备含有培养基但不含细胞的对照孔。
3.将化合物加至试验孔中，培养3－5天。
4.将板平衡至室温约30分钟。
5.CellTiter-Glo试剂的体积等于每个孔中加入的细胞培养基的体积。
6.将内容物在定轨振荡器上混合2分钟诱导细胞裂解。
7.将板于室温下培养10分钟使得荧光信号稳定。
8.记录荧光，在曲线图中以RLU＝相对荧光单位表示。
尽管为了便于清楚地理解。在上面通过举例说明和实施例的方式对本发明进行了相当详细地描述，但是这些描述和实施例不应当被视为限定本发明的范围。因此，所有适当的修改和等同方案应当被视为也包含在随附权利要求所定义的本发明的范围内。本文中引用的所有专利和科学文献的公开明确地以其全部内容引入本文作为参考。

Claims (31)

1.选自式I的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用的盐：
Figure FDA0002445089900000011
其中：
X为CH或N；
R1、R2和R3独立选自H、-C(O)NH2、C6-C20芳基、C3-C12碳环基、C2-C20杂环基、C1-C20杂芳基、-NH2、-NH-(C6-C20芳基)、-NH-(C1-C20杂芳基)、-C(O)-(C1-C12烷基)、-C(O)-(C3-C12碳环基)、-NH-(C1-C12亚烷基)-(C2-C20杂环基)、-NH-(C1-C20杂芳基)-(C2-C20杂环基)、-NHC(O)-(C3-C12碳环基)、-NHC(O)-(C1-C12烷基)、-(C6-C20芳基)-C(O)-(C2-C20杂环基)和-(C1-C20杂芳基)-(C2-C20杂环基)；
或者R1和R2任选形成稠合的6元芳基、碳环基、杂环基或杂芳基环；
R1、R2和R3中至少一个为-C(O)NH2；
R4选自H、F、Cl、CN、-CH2OH、-CH(CH3)OH、-C(CH3)2OH、-CH(CF3)OH、-CH2F、-CHF2、-CH2CHF2、-CF3、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NHC(O)CH3、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2OH、环丙基、环丙基甲基、1-羟基环丙基、咪唑基、吡唑基、3-羟基-氧杂环丁烷-3-基、氧杂环丁烷-3-基和氮杂环丁烷-1-基；
R5为H、F、Cl或CN；
R6选自下列结构：
Figure FDA0002445089900000021
Figure FDA0002445089900000031
其中波浪线表示连接点；并且
烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基任选被一或多个独立选自下列的基团取代：F、Cl、Br、I、-CN、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH2NH2、-CH2NHCH3、-CH2N(CH3)2、-CH2OH、-CH2OCH3、-CH2CH2OH、-C(CH3)2OH、-CH(OH)CH(CH3)2、-C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2SO2CH3、-CH2OP(O)(OH)2、-CH2F、-CHF2、-CF3、-CH2CF3、-CH2CHF2、-CH(CH3)CN、-C(CH3)2CN、-CH2CN、-CO2H、-COCH3、-CO2CH3、-CO2C(CH3)3、-COCH(OH)CH3、-CONH2、-CONHCH3、-CON(CH3)2、-CONH(CH2CH2N(CH3)2)、-C(CH3)2CONH2、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NHCOCH3、-N(CH3)COCH3、-NHS(O)2CH3、-N(CH3)C(CH3)2CONH2、-N(CH3)CH2CH2S(O)2CH3、-NO2、＝O、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2OCH3、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2N(CH3)2、-OP(O)(OH)2、-S(O)2N(CH3)2、-SCH3、-S(O)2CH3、-S(O)3H、环丙基、氧杂环丁基、氮杂环丁基、1-甲基氮杂环丁烷-3-基)氧基、N-甲基-N-氧杂环丁烷-3-基氨基、氮杂环丁烷-1-基甲基、吡咯烷-1-基和吗啉代。
2.权利要求1的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用的盐，其中X为N。
3.权利要求1的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用的盐，其中X为CH。
4.权利要求1-3中任一项的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用的盐，其中R1为-C(O)NH2。
5.权利要求1-4中任一项的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用的盐，其中R2为-C(O)NH2。
6.权利要求1-5中任一项的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用的盐，其中R3为-C(O)NH2。
7.权利要求1-6中任一项的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用的盐，其中R1、R2和R3中一个为-NH-(C6-C20芳基)或-NH-(C1-C20杂芳基)，其中芳基和杂芳基任选被一或多个独立选自下列的基团取代：F、Cl、Br、I、-CN、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH2NH2、-CH2NHCH3、-CH2N(CH3)2、-CH2OH、-CH2OCH3、-CH2CH2OH、-C(CH3)2OH、-CH(OH)CH(CH3)2、-C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2SO2CH3、-CH2OP(O)(OH)2、-CH2F、-CHF2、-CF3、-CH2CF3、-CH2CHF2、-CH(CH3)CN、-C(CH3)2CN、-CH2CN、-CO2H、-COCH3、-CO2CH3、-CO2C(CH3)3、-COCH(OH)CH3、-CONH2、-CONHCH3、-CON(CH3)2、-CONH(CH2CH2N(CH3)2)、-C(CH3)2CONH2、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NHCOCH3、-N(CH3)COCH3、-NHS(O)2CH3、-N(CH3)C(CH3)2CONH2、-N(CH3)CH2CH2S(O)2CH3、-NO2、＝O、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2OCH3、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2N(CH3)2、-OP(O)(OH)2、-S(O)2N(CH3)2、-SCH3、-S(O)2CH3、-S(O)3H、环丙基、氧杂环丁基、氮杂杂环丁烷基、1-甲基氮杂环丁烷-3-基)氧基、N-甲基-N-氧杂环丁烷-3-基氨基、氮杂环丁烷-1-基甲基、吡咯烷-1-基和吗啉代。
8.权利要求1-7中任一项的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用的盐，其中R4为-CH2OH。
9.权利要求1-8中任一项的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用的盐，其中R5为H。
10.权利要求1-9中任一项的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用的盐，其中R6为
Figure FDA0002445089900000041
11.权利要求1-9中任一项的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用的盐，其中R6为：
Figure FDA0002445089900000042
12.权利要求1的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用的盐，所述化合物选自表1中的化合物。
13.药用组合物，该药用组合物含有权利要求1-12中任一项的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用的盐和可药用的载体、助流剂、稀释剂或赋形剂。
14.权利要求13的药用组合物，该药用组合物还包含一种治疗药物。
15.制备药用组合物的方法，所述方法包括将权利要求1-12中任一项的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用的盐以及可药用的载体、助流剂、稀释剂或赋形剂混合。
16.治疗有效量的权利要求13的药用组合物在生产药物中的用途，所述药物用于治疗由布鲁顿酪氨酸激酶介导的选自下列的疾病或病症：炎性疾病、免疫性疾病、癌症、心血管疾病、病毒性感染、炎症、代谢性/内分泌功能性疾病和神经性疾病。
17.权利要求1-12中任一项的化合物或其立体异构体、互变异构体或可药用的盐在生产药物中的用途，所述药物用于由布鲁顿酪氨酸激酶介导的选自下列的疾病或病症：炎性疾病、免疫性疾病、癌症、心血管疾病、病毒性感染、炎症、代谢性/内分泌功能疾病和神经性疾病。
18.权利要求16或17的用途，其中所述疾病或病症选自全身和局部炎症。
19.权利要求16或17的用途，其中所述疾病或病症选自关节炎、与免疫抑制有关的炎症、器官移植排斥反应、过敏、溃疡性结肠炎、克罗恩病、皮炎、哮喘、系统性红斑狼疮、干燥综合征、多发性硬化、硬皮病/系统性硬化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、抗中性粒细胞细胞质抗体(ANCA)血管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、银屑病。
20.权利要求16或17的用途，其中所述免疫性疾病为类风湿性关节炎。
21.权利要求16或17的用途，其中所述疾病或病症为选自下列的癌症：乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、生殖泌尿道癌、食道癌、喉癌、成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、胃癌、皮肤癌、角化棘皮瘤、肺癌、表皮样癌、大细胞癌、小细胞癌、骨癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、滤泡癌、未分化癌、乳头状癌、精原细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、膀胱癌、胆道癌、毛细胞癌、口腔癌、鼻咽癌、咽癌、唇癌、舌癌、口癌、小肠癌、结肠-直肠癌、大肠癌、直肠癌、脑和中枢神经系统癌、霍奇金病、支气管癌、肝和肝内胆管癌、神经胶质瘤、子宫内膜癌、肾和肾盂癌、子宫体癌、多发性骨髓瘤、淋巴细胞性白血病、骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤和绒毛状结肠腺瘤。
22.权利要求16或17的用途，其中所述疾病或病症为选自下列的癌症：非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、肝细胞癌、胃癌、慢性淋巴性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、口腔和咽癌。
23.权利要求16或17的用途，其中所述疾病或病症为选自下列的癌症：腺瘤、骨髓疾病、淋巴瘤和白血病。
24.权利要求16或17的用途，其中所述疾病或病症为腺癌。
25.权利要求16或17的用途，其中所述疾病或病症为肺腺癌或肝癌。
26.权利要求16或17的用途，其中所述疾病或病症为恶性血液病。
27.权利要求26的用途，其中所述恶性血液病为白血病或淋巴瘤。
28.权利要求16或17的用途，该药物与另一种治疗药物组合使用，所述治疗药物选自：抗炎药、免疫调节剂、化疗药、细胞凋亡增强剂、神经营养因子、用于治疗心血管疾病的药物、用于治疗肝病的药物、抗病毒药物、用于治疗血液疾病的药物、用于治疗糖尿病的药物和用于治疗免疫缺陷疾病的药物。
29.权利要求28的用途，其中所述另一种治疗药物为Bcl-2抑制剂或JAK抑制剂。
30.权利要求28的用途，其中所述另一种治疗药物为依鲁替尼。
31.治疗由布鲁顿酪氨酸激酶介导的疾病的套盒，该套盒包括：
a)权利要求13的药用组合物；和
b)使用说明书。
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