CN111265528A - 法匹拉韦在治疗冠状病毒感染方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及式I所示法匹拉韦类化合物，及其药物上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，及含有此化合物的药物组合物，用于治疗冠状病毒的感染。

Description

法匹拉韦在治疗冠状病毒感染方面的应用

技术领域

本发明涉及下面式I所示化合物法匹拉韦，其几何异构体及其药物上可接 受的盐和/或两者溶剂化物和/或两者水合物，及含上述化合物的药物组合物， 用于治疗冠状病毒特别是SARS和2019新型冠状病毒(2019-nCoV)感染方面 的用途。

背景技术

法匹拉韦(式I化合物),化学名为6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺，是一种核 苷类似物的药物，是一种病毒RNA聚合酶抑制剂。该类药物是一种广谱抗病 毒药物，目前已在日本被批准作为抗流感药物上市。

法匹拉韦对丝状病毒科、布尼亚病毒科、沙粒病毒科、披膜病毒科等烈 性RNA病毒科成员以及正黏病毒科、副黏病毒科、小RNA病毒科、黄病毒科 等其他RNA病毒科成员在体外及体内均具有良好的抑制效果，但是对冠状病 毒的活性未见报道。法匹拉韦在进入细胞后能够被转化为三磷酸活性形式， 在病毒RNA的转录与复制时掺入RNA链，非特异性终止病毒RNA链的延伸， 进而实现抗病毒作用。

有研究报道，T-705在vero E6细胞系上能够有效抑制病毒感染后上清中的 病毒滴度，对EBOV扎伊尔型的半数抑制浓度(IC50)为67μmol/L。利用I型 干扰素受体缺陷的IFNAR-/-C57BL/6小鼠模型进行体内药效学研究结果显示， 在安慰剂组100％死亡的攻毒剂量下，以300mg/kg/d的给药剂量从第6天开始给 药至第13天，保护率为100％，与此同时，体质量、谷丙转氨酶、谷草转氨酶 和病毒血症等参数也有明显改善。英国防卫科学与技术实验室的相关研究结 果显示，法匹拉韦在1.95g/L的高浓度时对Vero C1008细胞无细胞毒性，当药 物浓度在62.5mg/L以上时，可以完全抑制EBOV扎伊尔型对细胞的CPE作用。 在I型、II型干扰素同时缺陷的A129小鼠模型中，以安慰剂组100％死亡的剂量 对小鼠进行攻毒，攻毒之后1h立即以300mg/kg/d(2次/d，每次150mg/kg) 的给药剂量进行灌胃给药，连续给药14d，能够保护100％的小鼠免于死亡， 且给药组的小鼠体质量具有显著改善。

2019新型冠状病毒(2019-nCoV)是以前从未在人类中发现的冠状病毒新 毒株。2019新型冠状病毒感染的症状主要以肺炎为主，依据病情的轻重程度 可分为单纯性感染、轻症肺炎、重症肺炎、急性呼吸窘迫综合症、脓毒症、 脓毒症休克等。单纯性感染的患者可能有非特异性症状，例如发热、咳嗽、 咽痛、鼻塞、乏力、头痛、肌肉疼痛或不适，老年人和免疫抑制者可能会出 现非典型症状。轻症肺炎的患者主要以咳嗽、呼吸困难+呼吸急促为主。重症 肺炎可见于青少年、成人或儿童，主要症状为呼吸频率增加，严重的呼吸衰 竭或呼吸困难，中心型发绀、嗜睡、意识不清或惊厥、抽气等。急性呼吸窘 迫综合症的肺部影像为双侧磨玻璃影，但不能完全由积液、大叶渗出或者肺 不张或者肺部块影解释，以肺水肿为主要症状。脓毒症患者往往有致命的器 官功能障碍，脓毒性休克是最为危重的患者，死亡可能性较高。目前，针对 新型冠状病毒感染，临床上以支持治疗为主，无特异抗病毒药物可用。

发明内容

本发明目的是发现对冠状病毒特别是SARS和2019新型冠状病毒 (2019-nCoV)有抗病毒活性的药物，可用于其感染引起相关疾病如单纯性感 染如发热、咳嗽和咽痛等、肺炎、急性或严重急性呼吸道感染、低氧性呼吸 衰竭及急性呼吸窘迫综合征、脓毒症和脓毒性休克等的救治。本发明通过创 造性的研究发现式I所示化合物法匹拉韦，具有抑制SARS和2019新型冠状 病毒(2019-nCoV)复制方面的功能，在治疗SARS和2019新型冠状病毒(2019-nCoV)引起的疾病方面具有很好的治疗效果。

本发明提供具有式I结构的化合物，其几何异构体，及其药物上可接受的 盐和/或其溶剂化物或其水合物:

根据本发明，本发明化合物的可药用盐包括其无机或有机酸盐，以及无 机或有机碱盐，本发明涉及上述盐的所有形式。其中包括但不限于：钠盐、 钾盐、钙盐、锂盐、葡甲胺盐、盐酸盐，氢澳酸盐，氢腆酸盐，硝酸盐，硫 酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，磷酸氢盐，乙酸盐，丙酸盐，丁酸盐，草酸盐， 三甲基乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，乳酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，琥珀酸 盐，马来酸盐，富马酸盐，苦味酸盐，天冬氨酸盐，葡糖酸盐，苯甲酸盐， 甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐等。

根据本发明，式I化合物可在细胞上抑制病毒复制，减少细胞培养物中病 毒核酸载量。

本发明的发明人在经过创造性的发明和研究后，发现了式I化合物的一些 新作用特点：

第一，式I化合物可以在微摩尔级浓度下降低2019新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的细胞病毒核酸载量水平；

第二、式I化合物对SARS病毒感染的小鼠具有显著的保护作用。

本发明还涉及含有式I化合物及其药学上可接受的盐和/或其药物上可 接受的溶剂化物或其水合物和药物上可接受的载体的药物组合物。该药物 组合物可以经多种途径施用，例如口服片剂，胶囊，粉剂，口服液，注射 剂和透皮制剂。根据常规的药物上的惯例，药学上可接受的载体包括稀释 剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、润滑剂、着色剂、调味剂或其它常规添加 剂。典型的药学上可接受的载体包括例如微晶纤维素、淀粉、交连聚维酮、 聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮、麦芽糖醇，柠檬酸，十二烷基磺酸钠或硬脂酸 镁等。

本发明的另一个方面涉及药物组合物，其含有本发明化合物至少一种 药学上可接受的载体。所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各 种形式。

本发明涉及通式I所示的化合物，其几何异构体或其药物上可接受的盐 和/或其溶剂化物和/或其水合物在制备用于治疗冠状病毒特别是SARS冠状 病毒和2019新型冠状病毒(2019-nCoV)引起的疾病或感染(包括但不限于呼 吸系统疾病(例如单纯性感染如发热、咳嗽和咽痛等、肺炎、急性或严重 急性呼吸道感染(SARI)、低氧性呼吸衰竭及急性呼吸窘迫综合征、脓 毒症和脓毒性休克、重症急性呼吸综合征(SARS)等))的药物中的用途，

本发明还涉及一种药物组合物，其包含所述的式Ⅰ化合物、其几何异 构体或其药物上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，

优选地，所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料，具体 地，所述药物组合物为固体制剂、注射剂、外用制剂、喷剂、液体制剂、 或复方制剂。

本发明还涉及所述包含所述的式Ⅰ化合物、其几何异构体或其药物上 可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物或所述式Ⅰ化合物、 其几何异构体或其药物上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物在制备 用于治疗呼吸系统疾病但不限于呼吸系统疾病(包括单纯性感染如发热、咳 嗽和咽痛等、肺炎、急性或严重急性呼吸道感染、低氧性呼吸衰竭及急性呼 吸窘迫综合征、脓毒症和脓毒性休克、重症急性呼吸综合征(SARS)等) 的药物中的用途。

本发明还涉及一种在有需要的哺乳动物中治疗和/或预防疾病的方法 或者在有需要的哺乳动物中抑制冠状病毒特别是SARS冠状病毒 (SARS-CoV)或2019新型冠状病毒(2019-nCoV)复制或繁殖的方法，该方 法包括给有需要的哺乳动物施用治疗和/或预防有效量的权利要求3的药物 组合物或权利要求1所述的化合物、其几何异构体、其药物上可接受的盐和 /或其溶剂化物和/或其水合物，其中所述的疾病包括冠状病毒特别是SARS 冠状病毒和2019新型冠状病毒(2019-nCoV)引起的病毒感染性疾病。

根据本发明，所述的冠状病毒特别是SARS冠状病毒和2019新型冠状病 毒(2019-nCoV)引起的病毒感染性疾病包括但不限于呼吸系统疾病(例如 单纯性感染如发热、咳嗽和咽痛等、肺炎、急性或严重急性呼吸道感染、 低氧性呼吸衰竭及急性呼吸窘迫综合征、脓毒症和脓毒性休克、重症急性 呼吸综合征(SARS)等)。

本发明还涉及所述包含所述的式Ⅰ化合物、其几何异构体或其药物上可 接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物在制备用于治疗冠状 病毒特别是SARS冠状病毒和2019新型冠状病毒(2019-nCoV)引起的疾病或 感染(例如呼吸系统疾病(例如单纯性感染如发热、咳嗽和咽痛等、肺炎、 急性或严重急性呼吸道感染、低氧性呼吸衰竭及急性呼吸窘迫综合征、脓 毒症和脓毒性休克、重症急性呼吸综合征(SARS)等))的药物中的用途。

附图说明

图1.法匹拉韦有效降低2019新型冠状病毒感染的veroE6细胞上病毒核 酸载量。(a)法匹拉韦在细胞感染2019新型冠状病毒48h后能够抑制细胞上 的病毒RNA载量，且抑制活性呈剂量依赖性。纵坐标为样品中病毒RNA的 拷贝数，横坐标为药物浓度；(b)法匹拉韦在受试浓度下对受试细胞处理48h， 观察不到细胞毒性。纵坐标为相对于阴性对照组(只有细胞，未加药物)的 细胞活力百分比，横坐标为药物浓度。

图2.法匹拉韦有效保护SARS冠状病毒感染小鼠免于死亡。在小鼠攻毒 后4h及接下来的时间每天给予一次的腹腔法匹拉韦注射，对照组给予同等体 积的溶剂注射，可见对照组全部死亡，而法匹拉韦治疗组小鼠存活，且存活 率呈剂量依赖关系。

具体实施方式

下面的实施例是本发明说明性优选实施方案，对本发明不构成任何限 制。

实施例1：法匹拉韦降低2019新型冠状病毒感染的细胞病毒核酸载量实验 (1)药物处理

用2％细胞维持液将2019-nCoV病毒稀释成相应浓度，然后加入24孔板 中使每孔含有病毒量为100TCID₅₀，再用2％细胞维持液将法匹拉韦分别稀释 成相应浓度，加入到对应的孔中，使药物最终浓度分别为100μM、33μM、11μM、 3.7μM、1.23μM、0.41μM、0.14μM，然后放37℃、5％CO₂孵箱继续培养48h， 细胞对照组只加不含有任何受试药物的2％细胞维持液。

(2)RNA提取

1)取受试培养板的上清液100μL，加入无核酸酶EP管中，然后每孔加入 350μLBuffer RLT，用移液枪吹吸混匀使其充分裂解后，离心取上清；

2)所得混合液加入等体积的70％乙醇，混匀；

3)将上述混合液转入无RNA酶的离心柱中，12000rpm离心15s，弃废液；

4)加入700μL Buffer RW1,12000rpm离心15s，弃废液；

5)加入500μL Buffer RPE,12000rpm离心15s，弃废液；

6)加入500μL Buffer RPE,12000rpm离心2min，弃废液；

7)换新的无RNA酶的2ml收集管，12000rpm离心1min，使滤柱干燥；

8)换上新的1.5ml收集管，每管加入30μl不含RNA酶的水，12000rpm 离心2min，洗脱液即含有相应的RNA，加入RNA酶抑制剂，用Nano Drop 检测各RNA浓度。

(3)RNA反转录

实验采用TaKaRa公司生产的反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT reagent Kit withgDNA Eraser，货号RR047Q)进行RNA反转录，步骤如下。

①gDNA去除：收集各实验组RNA样品，分别取1μg进行反转录。首先， 向各实验组RNA中加入2μl 5×gDNA Eraser Buffer，用RNase Free水补足 反应体系至10μl，充分混匀，42℃水浴2min去除样品中可能存在的g DNA；

②逆转录：向①所得样品中加入适量的酶和引物Mix及反应缓冲液，用 RNaseFree水补足体积至20μl，37℃水浴反应15min，之后投入85℃水中 5sec，既可转录得到cDNA。

(4)Real-time PCR

荧光定量PCR采用TB Green Premix(Takara，Cat#RR820A)混好反应 体系，在StepOne Plus Real-time PCR仪(品牌：ABI)进行扩增反应和读数。 计算原病毒液每毫升所含拷贝数。步骤如下：

①首先建立标准品：将质粒pMT-RBD稀释成5×10⁸copies/μL,5×10⁷copies/μL, 5×10⁶copies/μL,5×10⁵copies/μL,5×10⁴copies/μL,5×10³copies/μL,5×10² copies/μL。取2μL标准品或cDNA模板用于qPCR反应。；

②实验过程中所用引物序列如下(均为5’-3’方向表示)：

RBD-qF:CAATGGTTTAACAGGCACAGG

RBD-qR:CTCAAGTGTCTGTGGATCACG

③反应程序如下：

预变性：95℃5分钟；

循环参数：95℃15秒，54℃15秒，72℃30秒。共40个循环；

(5)药物对细胞毒性测试

药物对细胞毒性的检测利用CCK-8试剂盒(Beoytime)测定。具体步骤 如下：

①96孔板中接种1×10⁴个Vero-E6(ATCC)细胞，37℃培养8小时。

②将药物用DMSO稀释到合适的母液浓度，再用含2％FBS的MEM培 养基稀释到与药物处理同样的浓度，弃96孔板中原培养基，取100μL含药物 的MEM培养基加入到细胞中，每个浓度做三个复孔。注意设置阴性对照(细 胞孔中加DMSO，而不是药物，和培养基)和空白对照(不含细胞，加DMSO 和培养基)。加药完毕，细胞37℃培养48小时。

③向待测孔中加入20μL CCK-8溶液(Beoytime)，轻轻混匀，不要产生 气泡，37℃继续培养2小时。在酶标仪上读取OD₄₅₀，计算细胞活性：

细胞活性(％)＝(A_{(药物处理组)}-A_{(空白对照)})/(A_{(阴性对照)}-A_{(空白对照)})×100％

(6)实验结果

病毒增殖抑制实验的结果显示，受试化合物在100μM，33μM，11.1μM 以及3.7μM的浓度下，均能够有效抑制感染上清中病毒基因组的复制(表1 和图1)

表1.受试化合物(法匹拉韦)的抗病毒实验

细胞毒性结果显示，在所有受试浓度下，受试化合物的处理均未改变细 胞活力，即受试化合物在所有浓度下对细胞均无毒性作用(表2和图1)。

表2.受试化合物(法匹拉韦)的细胞毒性实验

实施例2：法匹拉韦保护SARS冠状病毒感染小鼠免于死亡

(1)小鼠分组与标记

将3-4周龄、9-13g的A129小鼠随机分为4组，即病毒对照组、高剂量 给药组、中剂量给药组和低剂量给药组，每组10只，耳钉标记。

(2)药物配置

利用0.5％CMC-Na作为溶剂溶解法匹拉韦。先精确称量药物，加入适量 0.5％CMCNa溶液，涡旋和超声交替处理15min，直至样品呈颗粒均匀的悬 浊液，然后进行2倍的稀释，按照200mg/kg、100mg/kg以及50mg/kg的给药 剂量稀释好。4℃保存备用。

(3)小鼠攻毒、给药及数据采集

攻毒采用腹腔注射方式，每只小鼠按照1*10⁶PFU的攻毒剂量进行腹腔注 射SARS冠状病毒。攻毒后4h、24h、48h、72h、96h、120h、144h各腹腔给 药一次，给药剂量为200mg/kg、100mg/kg以及50mg/kg。每日定点称重并记 录，同时记录小鼠死亡情况，绘制生存曲线。

(4)实验结果

体内实验结果显示，小鼠的终末生存率和给药剂量呈量效依赖性关系(表 3和图2)，显示受试化合物的处理能够有效保护小鼠免于SARS冠状病毒感 染所致的死亡。

表3受试化合物(法匹拉韦)的体内抗病毒实验

Claims (6)

1.通式I所示的化合物，其几何异构体或其药物上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物在制备用于治疗冠状病毒特别是SARS冠状病毒和2019新型冠状病毒(2019-nCoV)引起的疾病或感染(包括但不限于呼吸系统疾病(例如单纯性感染如发热、咳嗽和咽痛等、肺炎、急性或严重急性呼吸道感染、低氧性呼吸衰竭及急性呼吸窘迫综合征、脓毒症和脓毒性休克、重症急性呼吸综合征(SARS)等))的药物中的用途，

2.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的式Ⅰ化合物、其几何异构体、其药物上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，

优选地，所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料，具体地，所述药物组合物为固体制剂、注射剂、外用制剂、喷剂、液体制剂、或复方制剂。

3.权利要求2的药物组合物或权利要求1所述的化合物、其几何异构体、其药物上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物在制备用于治疗呼吸系统疾病但不限于呼吸系统疾病(包括单纯性感染如发热、咳嗽和咽痛等、肺炎、急性或严重急性呼吸道感染、低氧性呼吸衰竭及急性呼吸窘迫综合征、脓毒症和脓毒性休克等)的药物中的用途。

4.一种在有需要的哺乳动物中治疗和/或预防疾病的方法或者在有需要的哺乳动物中抑制冠状病毒特别是SARS冠状病毒(SARS-CoV)或2019新型冠状病毒(2019-nCoV)复制或繁殖的方法，该方法包括给有需要的哺乳动物施用治疗和/或预防有效量的权利要求3的药物组合物或权利要求1所述的化合物、其几何异构体、其药物上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，其中所述的疾病包括冠状病毒特别是SARS和2019新型冠状病毒(2019-nCoV)引起的病毒感染性疾病。

5.权利要求4所述的方法，其中所述的冠状病毒特别是SARS冠状病毒和2019新型冠状病毒(2019-nCoV)引起的病毒感染性疾病包括但不限于呼吸系统疾病(例如单纯性感染如发热、咳嗽和咽痛等、肺炎、急性或严重急性呼吸道感染、低氧性呼吸衰竭及急性呼吸窘迫综合征、脓毒症和脓毒性休克、重症急性呼吸综合征(SARS)等)。

6.权利要求2的药物组合物在制备用于治疗冠状病毒特别是SARS冠状病毒和2019新型冠状病毒(2019-nCoV)引起的疾病或感染(例如呼吸系统疾病(例如单纯性感染如发热、咳嗽和咽痛等、肺炎、急性或严重急性呼吸道感染、低氧性呼吸衰竭及急性呼吸窘迫综合征、脓毒症和脓毒性休克、重症急性呼吸综合征(SARS)等))的药物中的用途。

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