CN111182917A - 用于治疗癌症的免疫原性组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫疗法领域，更具体地，涉及用于治疗癌症的组合物。本发明还涉及通过这种方法可获得的组合物，例如药物组合物。更具体地，本发明涉及一种用于获得适合于治疗受试者中的癌症的组合物的离体方法，其包括以下步骤：提供源自该受试者的原发性肿瘤细胞，以及使该肿瘤细胞与溴结构域和末端外结构域家族成员的抑制剂(BET抑制剂)离体接触。

Description

用于治疗癌症的免疫原性组合物

技术领域

本发明涉及免疫疗法领域，更具体地，涉及用于治疗癌症的组合物。本发明还涉及通过这种方法可获得的组合物，例如药物组合物。

背景技术

近年来，已经看到用于癌症的免疫治疗方法的大量增加，通过使用阻断免疫检查点分子的抗体获得了显著的临床成功。¹在接受其他类型免疫治疗的癌症患者中也获得了令人鼓舞的结果，例如过继转移体外活化T细胞和各种治疗性接种策略。^2-7

尽管取得了这些重大进展，许多免疫疗法仍未能在大批癌症患者中诱发临床益处。其主要原因是，肿瘤所采用的免疫逃避机制常常使抗肿瘤免疫无效。在这方面，对免疫治疗的不良临床反应的关键潜在因素是许多肿瘤防止免疫系统识别癌症抗原的内在能力(Cavallo,De Giovanni,Nanni,Forni,&Lollini,2011；Khan,Gregorie,&Tomasi,2008；Landsberg et al.,2012；McGranahan et al.,2017；Munn&Mellor,2013；Respa et al.,2011；Setiadi et al.,2008；van der Burg,Arens,Ossendorp,van Hall,&Melief,2016；Woo et al.,2012；Zaretsky et al.,2016)有证据表明，通常是由干扰素-γ信号传导或抗原呈递机制中断引起的这些能力可能会被肿瘤获得，并且因此尽管有良好的初始反应和持续的免疫治疗，但通常会导致患者延迟复发。⁸因此，显然需要新颖的方法来改善癌症免疫疗法的功效。

先前已经描述了使用自体肿瘤细胞作为免疫疗法中的潜在工具，但是到目前为止，由于肿瘤细胞不能诱导足够的T细胞应答，因此这种尝试几乎没有成功。

发明内容

本发明尤其旨在克服这些问题。特别地，本发明旨在通过提供旨在使用原发性自体肿瘤细胞并用溴结构域和末端外结构域蛋白抑制剂(BET抑制剂或BETi)离体或直接体内治疗这些细胞的方法来改进现有疗法或免疫疗法。

如以下详细讨论的，发明人惊奇地发现BET抑制剂对肿瘤细胞具有多种作用，这对于治疗原因是有益的。特别地，如所附实施例所示，BET抑制剂增强干扰素-γ信号传导，增加干扰素-γ诱导的抗原呈递，抑制组成型和干扰素-γ诱导的HLA II类表达，抑制组成型和干扰素-γ诱导的吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)产生，并抑制肿瘤细胞中组成型和干扰素-γ诱导的PD-L1表达。因此，发明人的发现通过靶向肿瘤固有的分子途径并增强其免疫原性，提供了一种提高癌症免疫疗法功效的有吸引力的方法。

因此，基于发明人关于BET抑制剂对肿瘤细胞的作用的令人惊讶的发现，本发明提供了用于治疗癌症的新用途、方法和组合物。在某些方面，本发明提供了将BET抑制剂直接体内施用给患有癌症的患者的特定亚组。在其他方面，本发明提供了其中原发性癌细胞或患者衍生的癌细胞系离体暴露于BET抑制剂以增强其免疫原性的方法，从而使这些细胞适合用作免疫原性载体以促进抗肿瘤免疫应答，例如通过自体接种。

因此，本发明涉及一种用于获得适合于治疗受试者的癌症的组合物的离体方法，其包括以下步骤：提供源自所述受试者的原发性肿瘤细胞或源自所述受试者的肿瘤细胞系，以及使所述肿瘤细胞离体接触BET抑制剂。或者，可将BET抑制剂体内施用至一个或多个肿瘤细胞位置。

本发明还涉及可通过这种方法可获得或获得的组合物及其在癌症治疗中的用途。

本发明还涉及BET抑制剂在一种或多种肿瘤细胞中增加肿瘤特异性新抗原和/或肿瘤相关抗原的表达和呈递的用途。

本发明还涉及治疗患有癌症的患者的特定亚组的用途和方法，其中将BET抑制剂施用于此类患者并在一个或多个肿瘤细胞位置中增强一种或多种肿瘤细胞中(干扰素-γ诱导的)肿瘤特异性新抗原和/或肿瘤相关抗原的表达和呈递，在一个或多个肿瘤细胞位置中增强一种或多种肿瘤细胞中干扰素γ信号传导，或在一个或多个肿瘤细胞位置中在一种或多种肿瘤细胞中抑制，蛋白质表达涉及免疫抑制途径，例如HLA II类、IDO、PD-L1和CD73。

附图说明

图1.JQ1对由自体TIL识别的黑素瘤细胞有不同的敏感性。

顶行：ANRU、ROAL、KADA和A375肿瘤细胞在JQ1和/或IFNγ存在下培养72小时，洗涤，收获，然后与自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)共培养另外24小时，并与同种异体T细胞一起用于A375细胞。如通过ELISA测定的共培养上清液中的IFNγ水平所表明的，通过单独JQ1或JQ1与IFNγ组合，与DMSO处理的肿瘤细胞相比，除了KADA以外，T细胞识别得到了强烈和显著的增强。第二排和第三排：通过流式细胞仪测定，用JQ1和/或IFNγ处理72小时后，PD-L1和HLA I类表达的直方叠加图。第四和第五行：通过流式细胞仪测定的JQ1和/或IFNγ治疗72小时后，PD-L1和HLA I类表达的定量表达，表明TIL对肿瘤的增强识别与对PD-L1表达的任何影响无关，但似乎更符合JQ1存在下IFNγ对HLA I类的增强诱导作用。第六行：用JQ1和/或IFNγ处理ANRU、ROAL、KADA和A375肿瘤细胞72小时后，HLA II类的定量表达表明在存在JQ1的情况下，可以抑制其诱导，尽管与T细胞识别的关系还不清楚。

图2.JQ1独立于PD-L1增强TIL对肿瘤的识别。

在JQ1和/或IFNγ存在下将ANRU细胞培养0、12、24、48和72小时，然后洗涤、收获并随后在不存在和存在PD-L1阻断抗体的情况下与自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)共培养另外24小时。如通过ELISA测定的共培养上清液中的IFNγ水平所表明的，与DMSO处理的肿瘤细胞相比，TIL的识别随着治疗持续时间的延长而日益增强，而抗体阻断PD-L1的存在没有任何影响。

图3.JQ1增强了IFNγ诱导的抗原呈递机制的激活。

(A)在用JQ1和/或IFNγ处理ANRU，ROAL、KADA和A375细胞72小时后，通过qPCR一系列抗原呈递机制(APM)分子，研究了mRNA表达水平。我们发现，几乎所有这些成分的JQ1都能增强IFNγ的诱导作用，其中对HLA I类、β-2微球蛋白(B2M)、TAP1和TAP2，观察到最显著的作用。(B)未经处理的ANRU细胞和用0.4μM JQ1和/或25ng/ml IFNγ处理12、24、48和72的ANRU细胞中APM成分的mRNA表达水平，显示在存在JQ1的情况下在所有时间点IFNγ明显增强了APM成分的诱导。(C)在用JQ1和/或IFNγ处理72小时后，对ANRU、ROAL、KADA和A375细胞的蛋白质印迹分析也表明在蛋白质水平上，存在JQ1时，IFNγ对APM成分的诱导增强。这对于HLA I类重链最为明显，而在A375细胞中则最明显。

图4.JQ1增强通过自体肿瘤浸润淋巴细胞对肿瘤相关抗原和突变抗原的识别。

将ANRU肿瘤细胞用0.4μM JQ1和/或25ng/ml IFNγ处理72小时，然后与自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)共培养，按其对肿瘤相关抗原MART-1或两种不同的肿瘤特异性突变抗原ETV6.9和NUP210的特异性进行分类(指定为pos)。还将肿瘤细胞与未分类的TIL和没有对上述肿瘤抗原的特异性的TIL(指定为“neg”)共培养。如通过ELISA测定的共培养上清液中的IFNγ水平所表明的，JQ1改善了所有三个TIL群体对指定抗原的特异性的识别，其程度类似于通过单独IFNγ或DMSO预处理后所观察到的程度或更强。

图5.在JQ1、I-BET151和I-BET762存在下，IFNγ对HLA I类诱导的剂量依赖性增 强。

用BET抑制剂JQ1、I-BET151或I-BET762单独或与IFNγ组合将细胞处理72小时。与所有这些BETi组合使用时，通过流式细胞术确定的IFNγ对HLA I类的诱导明显增加了剂量依赖性。

图6.JQ1增强IFNγ诱导的HLA I类表达并抑制多种免疫检查点分子的组成型和 IFNγ诱导。

用流式细胞仪测定的JQ1和/或IFNγ处理72小时后，PD-L1、HLA I类、HLA II类和IDO的定量表达表明，自体TIL增强了对早期传代黑素瘤细胞系的识别，如图1所描绘，与存在JQ1时IFNγ增强的HLA I类诱导相吻合，而在ANRU和ROAL的情况，对PD-L1没有任何影响。JQ1也明显抑制了组成型和IFNγ诱导的HLA II类表达，同时它也抑制了IFNγ诱导的IDO表达。

图7.JQ1增强了IFNγ诱导的抗原呈递机制的激活，并增强了IFNγ信号通路中关 键蛋白的表达。

用流式细胞术在市售的各种来源的人肿瘤细胞系上测定JQ1和/或IFNγ处理72小时后PD-L1、HLA I类、HLA II类和CD73的定量表达。数据表明，JQ1增强了IFNγ对A549(肺癌)、HCT116(结肠癌)和HeLa(宫颈癌)细胞的HLA I类诱导，而JQ1抑制了IFNγ对CD73的诱导。

图8.JQ1增强了IFNγ诱导的抗原呈递机制的激活，并增强了IFNγ信号通路中关 键蛋白的表达。

(A)在用JQ1和/或IFNγ处理ANRU，ROAL、KADA和A375细胞72小时后，通过qPCR一系列抗原呈递机制(APM)分子，研究了mRNA表达水平。我们发现，几乎所有这些成分的JQ1都能增强IFNγ的诱导作用，其中对HLA I类、β-2微球蛋白(B2M)、TAP1、TAP2和LMP10，观察到最显著的作用。

(B)mRNA表达水平，在STAT1和JAK1的ANRU、ROAL和A375细胞中通过RT-qPCR测量，这是在连接至其同源受体的IFNγ的下游参与信号传导的两种蛋白质。数据表明，JQ1强烈增强了IFNγ对STAT1的诱导，而JQ1本身及其组合始终提高了JAK1表达。

图9.通过质谱分析与JQ1和/或IFNγ温育24小时的ANRU细胞裂解液中的蛋白质表达变化。在对照治疗中用DMSO的量的倍数变化相对于表达进行描绘，该DMSO的量等于在其他治疗条件下存在的量。

图10.通过质谱分析与JQ1和/或IFNγ温育24小时的ANRU细胞裂解液中的蛋白质表达变化。

(A)用IFNγ和/或JQ1处理24小时后，通过质谱ANRU细胞检测到的蛋白质的基因集富集分析。描绘了显著富集的途径，按其p值排序，这些途径是通过分析由IFNγ诱导的蛋白质子集确定的，但是如果在JQ1存在的情况下进行IFNγ处理，则其诱导被增强或抑制。红色表示当与JQ1结合使用IFNγ处理时，其被IFNγ诱导的蛋白的途径大部分被抑制。

(B)也用于在图9A中的基因集合富集分析的蛋白质的子集的网络分析。红色表示当与JQ1结合使用IFNγ处理时，其被IFNγ诱导的蛋白的节点大部分被抑制。

图11.蛋白质印迹分析表明，单独使用JQ1或与IFNγ联合使用72小时，MYC表达下调。

图12.JQ1诱导的TIL增强的肿瘤识别能力独立于PD-L1，但由于HLA I类的阻滞而 被废除

在JQ1和/或IFNγ存在下将ANRU细胞培养0、12、24、48和72小时，然后洗涤、收获并随后在不存在和存在PD-L1阻断抗体的情况下与自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)共培养另外24小时。如通过ELISA测定的共培养上清液中的IFNγ水平所表明的，与DMSO处理的肿瘤细胞相比，TIL的识别随着治疗持续时间的延长而日益增强，而抗体阻断PD-L1的存在没有任何影响。同时，阻断HLA I类几乎完全由TIL废止肿瘤识别。

具体实施方式

本发明解决了某些肿瘤不能有效诱导免疫反应的问题。本发明克服了这个问题，其中用BET抑制剂治疗患者或其中从肿瘤中分离出原发性肿瘤细胞，或从肿瘤中衍生出肿瘤细胞系，并与BET抑制剂在体外或离体温育。当给予该受试者时，这样的组合物然后可以在原发性肿瘤细胞的供体中诱导有效的T细胞免疫应答。本领域技术人员将理解，即使最初(即在治疗之前)未识别出未治疗的个体中的靶抗原，或至少没有足够有效地识别以引起保护性抗肿瘤免疫力，对多种肿瘤抗原进行接种也可以通过接种诱导治疗性免疫应答。这通过观察所谓的远端效应得到支持，其是这样的现象：转移性癌症中肿瘤的局部治疗不仅导致治疗的肿瘤消退，而且导致局部治疗范围之外的肿瘤消退。已经说明了多种免疫治疗的肿瘤内施用后的这种效果，表明肿瘤抗原特异性T细胞的局部激活可导致全身性T细胞介导的肿瘤根除(Fransen,Sluijter,Morreau,Arens,&Melief,2011；Fransen,van der Sluis,Ossendorp,Arens,&Melief,2013；Ishihara et al.,2017；Kim et al.,2012；Marabelle,Tselikas,de Baere,&Houot,2017；Sagiv-Barfi et al.,2018)。

这种治疗可以大大改善对肿瘤细胞的免疫反应，并提供一种有用的工具来代替现有的免疫疗法或与之结合使用。使用这种方法具有几个优点，因为令人惊奇地发现，BET抑制剂能够极大地离体诱导在肿瘤细胞中的抗原呈递，特别是与同时或随后暴露于干扰素-γ的组合时。

与向患者全身施用BET抑制剂相比，使用这种方法还具有一些优势。因为本发明的方法不需要向受试者全身或局部施用BET抑制剂，所以它消除了与抑制剂的毒性或不良反应有关的任何潜在问题，以及抑制剂可能不能有效地到达肿瘤的问题。同时，口服和/或静脉内和/或肿瘤内和/或以任何其他方式体内施用BETi仍然具有高度相关性，因为它可以增强用于治疗患者的其他免疫疗法的功效，例如检查点阻断或TCR转基因T细胞或CAR T细胞的过继转移。

因此，本发明涉及一种用于获得适合于治疗受试者的癌症的组合物的离体方法，其包括以下步骤：提供源自所述受试者的原发性肿瘤细胞或源自肿瘤的肿瘤细胞系，以及使所述肿瘤细胞离体接触BET抑制剂。

以如上所述的方式治疗源自受试者的肿瘤细胞，或肿瘤细胞系，强烈诱导自体肿瘤细胞的抗原呈递。当将这种处理过的细胞施用于受试者时，诱导了肿瘤特异性T细胞应答，使得这种细胞非常适合用于受试者中以引发肿瘤特异性免疫应答。

应当理解，发明人的令人惊讶的发现：BET抑制剂能够极大地诱导肿瘤细胞中的抗原呈递，不仅适用于源自受试者的原发性肿瘤细胞，而且可用于诱导肿瘤细胞系中的抗原呈递，例如如源自受试者的肿瘤细胞系或(可商购的)同种异体细胞系，它们可以在相同的HLA I类血清型或单倍体的情况下表达共享的(新)抗原。因此，当本发明关于涉及源自受试者的原发性肿瘤细胞的方法、用途和/或组合物时，我们还包括源自受试者的肿瘤细胞系和/或表达可靶向肿瘤抗原的HLA匹配的同种异体细胞系。

BET抑制剂是一类在临床试验中具有抗癌、免疫抑制和其他作用的药物，已广泛用于研究中。这些分子可逆地结合溴结构域和末端外基序(BET)蛋白的溴结构域，例如BRD2、BRD3、BRD4和BRDT。认为它们可防止BET蛋白与乙酰化组蛋白和转录因子之间的蛋白-蛋白相互作用。自2010年以来，已描述了许多能够靶向BET溴结构域的分子。

像所有细胞一样，肿瘤细胞也使用HLA I类复合物在表面上呈递抗原。随着突变在肿瘤细胞中积累，这些抗原中的一些将包括新抗原。此类新抗原可以被T细胞(例如CD8+T细胞)检测为非自身抗原，从而导致特异性针对肿瘤细胞的免疫反应。

众所周知，肿瘤会发展出避免这种免疫反应的方法；一种这样的方法是通过上调PD-L1，该PD-L1抑制HLA介导的T细胞活化。

溴结构域和末端外结构域(BET)蛋白家族的小分子抑制剂在这方面非常有趣，因为最近发现它们在各种肿瘤小鼠模型以及各种人癌细胞系中均能强烈抑制组成型和诱导型PD-L1表达。^9,10重要的是，对BET蛋白的抑制与抗PD-1检查点阻滞相结合导致带有Myc驱动的淋巴瘤的小鼠产生协同反应。¹⁰

在生理上，BET蛋白形成一类表观遗传“阅读器”，该阅读器使用溴结构域(BRD)模块结合DNA组蛋白尾上的乙酰化赖氨酸，从而充当转录因子和其他核蛋白的支架，以调节基因转录。通过这种方式，它们可以控制关键癌基因(例如c-Myc)和各种抗凋亡蛋白的表达。¹¹

BET抑制剂(BETi)是一类相对较新的抗癌药物，最初被开发用作抑制肿瘤生长的靶向疗法。这些作用首先描述了NUT中线癌中的BETi JQ1，这是一种罕见的恶性肿瘤，其特征是BET蛋白BRD4(主要的BETi靶标之一)与BRD2和BRD3一起过表达。¹²

后来的研究报道了JQ1和BET抑制剂I-BET151和I-BET762在几种其他类型的癌症(包括Myc驱动的血液系统恶性肿瘤、黑色素瘤和神经母细胞瘤)中具有可比的作用。^{13- 15}Brd4被认为是所有这些研究的主要靶标，而对Myc驱动的肿瘤的作用也归因于Myc下调。^16,17作为这些结果的结果，各种BET抑制剂作为实体瘤和血液系统癌症的抗增殖剂目前正处于早期临床开发中。迄今为止，这表明BET抑制剂确实可以在患者中发挥可控和可逆毒性的抗肿瘤活性。¹⁸

尽管用BET抑制剂作为潜在的癌症治疗方法取得了令人鼓舞的结果，但仍需要克服一些缺点。例如，BET抑制剂的全身给药可能是有毒的，或导致不想要的作用，例如自身免疫反应。此外，取决于肿瘤类型，BET抑制剂可能未以足以发挥其作用的量到达肿瘤。最后，已知并非所有的肿瘤类型都对BET抑制剂的治疗产生反应。

现已发现，与PD-L1表达的降低无关，BET抑制剂导致从天然环境分离的肿瘤细胞中抗原呈递增加，特别是与同时或随后暴露于干扰素-γ结合。特别地，并且如在所附实施例中所证实的，发明人发现BET抑制剂对肿瘤细胞具有以下作用：干扰素-γ信号传导增强；抗原呈递增加(例如，干扰素-γ诱导的抗原呈递增加)；抑制组成型和干扰素-γ诱导的HLAII类表达；抑制组成型和干扰素-γ诱导的吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)的产生；抑制组成型和干扰素-γ诱导的PD-L1表达；并抑制组成型和干扰素-γ诱导的CD73表达。基于该发现，发明人利用BET抑制剂的先前未知的作用开发了新的和改进的治疗策略。

为此，开发了一种从患有癌症的受试者中分离原发性肿瘤细胞，并用BET抑制剂离体治疗那些原发性肿瘤细胞的方法。以这种方式，获得了抗原呈递大大增加的原发性肿瘤细胞。这样的细胞是有用的，因为它们可以被施用于受试者以产生有效的肿瘤特异性T细胞应答。

就我们所知，以前没有描述过用BET抑制剂对原发肿瘤细胞进行离体治疗以获得用于癌症治疗的组合物。

现已令人惊讶地发现，从患有癌症的患者中分离肿瘤细胞并用BET抑制剂治疗这些细胞极大地增加了那些细胞的抗原呈递，特别是肿瘤特异性新抗原呈递。因此，这些细胞非常适合作为所述患者中用于免疫治疗的媒介物，以诱导肿瘤细胞特异性免疫反应，因为所处理的细胞源自肿瘤，从而触发免疫系统对肿瘤细胞作出反应。

如果使用同种异体细胞，则不会观察到这种效果。由于以前认为BET抑制剂的作用仅由PD-L1的表达降低来介导，所以迄今为止，尚未考虑或建议使用BET抑制剂来离体治疗原发性肿瘤细胞衍生的自体细胞。

此处提供的数据证明，抗原呈递增加的效果与PD-L1表达无关。

现在，我们发现BET抑制作用可以通过增强抗原呈递机制的激活(例如，由干扰素γ引起)而使肿瘤细胞敏感地被自体和同种异体T细胞离体识别，无论对PD-L1调节的任何作用，它为更有效的治疗开辟了道路，其中从受试者中分离出原发性肿瘤细胞，与BET抑制剂接触，然后再施用回到受试者，和/或用于离体扩增自体T细胞，以用于例如过继转移的随后治疗。

在这里，我们显示出BET抑制作用可以使人黑素瘤和其他癌细胞对自体T细胞的识别敏感。重要的是，BET抑制不仅通过抑制PD-L1，而且通过增强干扰素-γ诱导的抗原呈递机制的激活来诱导这种作用。

因此，本发明还涉及如上所述的方法，其中使肿瘤细胞同时或依次与免疫刺激化合物和BET抑制剂接触。特别优选的免疫刺激性化合物是：干扰素γ，干扰素α，干扰素基因刺激剂(STING)途径的激动剂，细胞周期蛋白依赖性4和/或6抑制剂(例如帕博西尼(palbociclib))，DNA甲基转移酶抑制剂或组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。

我们显示这些机制强烈地使患者来源的黑色素瘤细胞被自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)识别。此外，部分或完全独立于Myc诱导了BET抑制对PD-L1和抗原呈递的影响。

BET抑制剂在各种类型的癌症(包括卵巢癌和B细胞淋巴瘤)中均能抑制组成型PD-L1表达和干扰素-γ诱导的PD-L1表达。而且，显示出抑制肿瘤生长需要在小鼠中具有完整的免疫系统。¹⁰在这里，我们表明抑制BRD4抑制了PD-L1表达。

在本发明的上下文中，术语“离体”应理解为发生在肿瘤细胞所源自的受试者之外。受试者可以是动物或人类，受试者也可以是非人类哺乳动物。

受试者可以患有癌症或癌、实体瘤或血液学癌症。如本文所用，术语“患者”是指接受医学或兽医专业人士的治疗或检查的受试者。

通过鉴定患有癌症的受试者并从受试者中除去一部分或大部分或甚至全部肿瘤细胞来提供原发性肿瘤细胞。诊断患有癌症的受试者、鉴定所述受试者中的肿瘤并去除部分或全部肿瘤的方法是技术人员通常已知的。从受试者分离肿瘤细胞的合适方法的非限制性实例是通过手术、活检或抽血。技术人员将了解其他获得肿瘤细胞的方法以及最合适的获得肿瘤细胞的方法，这取决于肿瘤类型。

一旦从受试者中分离出肿瘤细胞，它们就可以任选地与杂质如非肿瘤细胞或细胞外物质分离。优选地，一旦从受试者中分离出肿瘤细胞，就将其保存在合适的培养基中，然而，在本发明中还设想将肿瘤细胞保存以备后用，例如通过冷冻细胞或将细胞保存在合适的保存介质中。

在本发明的上下文中，术语原发性肿瘤细胞应解释为从受试者的肿瘤中分离并制备用于离体治疗而基本上不修饰肿瘤细胞，例如修饰基因组以产生永生细胞系的细胞。

应当理解，原发肿瘤细胞可以在与受试者分离之后并且在使它们与BET抑制剂接触的步骤之前扩增。离体和体外扩增原发性肿瘤细胞的方法是技术人员众所周知的。

技术人员已知BET抑制剂能够阻断、抑制或下调含BET基序的蛋白质的功能。含有BET结构域的蛋白质的非限制性实例是BRD2、BRD3、BRD4和BRDT蛋白质。BET抑制剂已经在本领域中描述并且是技术人员众所周知的。因此，当在本文中使用时，术语BET抑制剂是指能够阻断、抑制或下调含BET结构域的蛋白质的任何化合物、分子或组合物。根据本发明的BET抑制剂的类别的非限制性实例是小分子、反义核苷酸和抗体。

小分子BET抑制剂通常能够可逆地结合溴结构域和末端外基序(BET)蛋白的溴结构域并防止BET蛋白与乙酰化组蛋白和转录因子之间的蛋白相互作用。

根据本发明的小分子BET抑制剂的优选实例是选自JQ1、MK-8628、BMS-986158、INB54329、ABBV-075、CPI-0610、FT-1101、GS-5829、GSK525762、PLX51107、Ten-010、OTX-015、CPI-0610、3-甲基-1,2,3,4-四氢喹唑啉-2-酮、2-噻唑烷酮、CPI-203、I-BET762(GSK525762A)、I-BET151(GSK1210151A)和RVX208的BET抑制剂。

特别优选的是选自JQ1、I-BET151(GSK1210151A)和I-BET762(GSK525762A)的BET抑制剂。

还应理解，本发明还包括本文所述的小分子BET抑制剂的化学修饰。在本发明的一个更优选的实施方案中，小分子BET抑制剂选自JQ1、MK-8628、BMS-986158、INB54329、ABBV-075、CPI-0610、FT-1101、GS-5829、GSK525762、PLX51107、Ten-010、OTX-015、和CPI-0610。然而，进一步设想BET抑制剂可以是新颖的或先前未知的小分子BET抑制剂。技术人员可以容易地评估化合物的BET抑制活性，例如使用具有溴结构域和末端外基序蛋白的下拉技术，以及检测化合物与溴结构域和末端外基序蛋白的结合。

优选地，将小分子BET抑制剂离体提供给肿瘤细胞足够长的时间，以使细胞在其表面上表达新抗原，例如至少6小时，更优选至少8小时，更优选至少10小时，甚至更优选至少12小时，甚至更优选至少18小时，甚至更优选至少24小时，最优选至少30小时。

或者，根据本发明的BET抑制剂可以是反义基因沉默子，例如但不限于siRNA、miRNA、CRISPR和TALEN。反义寡核苷酸可包含脱氧核糖核酸和/或核糖核酸和/或人工核苷酸，例如核苷酸类似物，核苷酸可包含天然碱基、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或非天然碱基。寡核苷酸还可包含修饰的主链。与修饰的主链类似的核酸的非限制性实例包括肽核酸(PNA)、吗啉代和锁定核酸(LNA)，以及二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。技术人员将了解方案和设计策略，以有效地实现含BET结构域的蛋白的下调。

在本发明的上下文中，术语适于治疗受试者癌症的组合物应解释为当施用于受试者时能够触发抗肿瘤免疫应答的组合物。优选地，抗肿瘤应答是诱导肿瘤特异性T细胞应答。优选地，这种应答是由于根据本发明的组合物在肿瘤细胞上的抗原呈递增加而引起的。

将原发性肿瘤细胞与BET抑制剂离体接触应理解为以足以诱导反应的量和时间为细胞提供BET抑制剂，该反应优选为抗原呈递增加。优选地，BET抑制剂以IC50值的1至10000倍，优选IC50值的5至2000倍，更优选IC50值的10至1000倍之间的浓度离体提供给肿瘤细胞。对于含BET结构域的蛋白质，最优选地所述浓度为所述BET抑制剂的IC50值的25至250倍。

在JQ1的情况下，第一和第二溴结构域的IC 50值分别为77nM和33nM，因此，当在本发明的方法中用作BET抑制剂时，JQ1的浓度优选在50nM至500μM之间，更优选在250nM与100μM之间，更优选在500nM与50μM之间，最优选当在根据本发明的方法中使用时JQ1的浓度在1μM与10μM之间。甚至更优选地，浓度在0.1μM至10μM之间。

应当理解，可以针对每种单独的BET抑制剂调整用BET抑制剂治疗的浓度或持续时间，本领域技术人员将意识到他可以例如使用单独的IC50或Ki值作为起始点来进行，以调节用于本发明方法的BET抑制剂的浓度。

在本发明的上下文中，术语肿瘤特异性T细胞应答应解释为特异性针对肿瘤细胞的体内T细胞介导的免疫应答。由于BET抑制剂的治疗导致体外或离体的肿瘤细胞中抗原呈递增加，因此导致肿瘤特异性抗原的呈递增加。已经证明这种肿瘤特异性抗原引起免疫应答，该免疫应答由识别非天然肿瘤特异性抗原的T细胞介导。

优选地，本发明的方法用于提供适合于治疗受试者的癌症的组合物，其中所述癌症选自急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓细胞白血病(AML)，肾上腺皮质癌，与AIDS有关的癌症，卡波西肉瘤，与AIDS有关的淋巴瘤，原发性CNS淋巴瘤，肛门癌，阑尾癌，星形细胞瘤，非典型性类畸胎/类瘤，皮肤基底细胞瘤，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑肿瘤，乳腺癌，支气管肿瘤，伯基特淋巴瘤，类癌肿瘤，儿童类癌瘤，未知原发性瘤，心脏(心)肿瘤，中枢神经系统非典型类畸形/类肿瘤，胚胎性肿瘤，生殖细胞瘤，原发性CNS淋巴瘤，宫颈癌，胆管癌，脊索瘤，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性粒细胞性白血病(CML)，慢性骨髓增生性肿瘤，结直肠癌，颅咽管瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，导管原位癌(DCIS)，胚胎肿瘤，子宫内膜癌，室管膜瘤，食道癌，粘膜神经母细胞瘤，尤文肉瘤，童年期颅外生殖细胞瘤，生殖腺生殖细胞瘤，眼癌，眼内黑色素瘤，视网膜母细胞瘤，输卵管癌，骨纤维组织细胞瘤，胆囊癌，胃癌(胃部癌)，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤(GIST)，生殖细胞瘤，儿童颅外生殖细胞瘤，性腺生殖细胞瘤，卵巢生殖细胞瘤，睾丸癌，妊娠滋养细胞疾病，毛细胞白血病，头颈癌，心脏肿瘤，肝细胞(肝)癌，朗格汉斯细胞组织细胞增生症，霍奇金淋巴瘤，下咽喉癌，眼内黑素瘤，胰岛细胞瘤，胰腺神经内分泌肿瘤，卡波济肉瘤(软组织肉瘤)，肾(肾细胞)癌，朗格汉斯细胞组织细胞增生症，喉癌，白血病，嘴唇和口腔癌，肝癌，肺癌(非小细胞和小细胞)，淋巴瘤，男性乳腺癌，骨的恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤，黑色素瘤，默克尔细胞癌，间皮瘤，转移性癌，隐匿性原发性的转移性鳞状上皮癌，涉及NUT基因的中线束癌，口腔癌，多发性内分泌肿瘤形成综合征，多发性骨髓瘤/血浆细胞赘生物，蕈样肉芽肿(淋巴瘤)，骨髓增生异常综合征，慢性粒细胞性白血病(CML)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓样增生性肿瘤，鼻腔鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，非霍奇金淋巴瘤，非小细胞肺癌，口腔癌，嘴唇和口腔癌，口咽癌，骨肉瘤和骨的恶性纤维组织细胞瘤，卵巢癌，胰腺癌，胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞瘤)，乳头状瘤病，副神经节瘤，鼻旁窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，咽癌，嗜铬细胞瘤，垂体瘤，浆细胞瘤/多发性骨髓瘤，胸膜肺母细胞瘤，妊娠和乳腺癌，原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤，原发性腹膜癌，前列腺癌，直肠癌，复发性癌症，肾细胞癌(肾癌)，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，儿童(软组织肉瘤)，唾液腺癌(头颈癌)，肉瘤，儿童血管瘤(软组织肉瘤)，尤因肉瘤(骨癌)，卡波西肉瘤(软组织肉瘤)，骨肉瘤(骨癌)，子宫肉瘤，塞氏综合症(淋巴瘤)，皮肤癌，小细胞肺癌，小肠癌，软组织肉瘤，皮肤鳞状细胞癌，鳞状颈癌，胃癌(胃部癌)，T-细胞淋巴瘤，睾丸癌，咽喉癌，鼻咽癌，口咽癌，下咽癌，r胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，肾盂和尿道移行细胞癌，输尿管和肾盂，移行细胞癌，尿道癌，子宫内膜子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，血管肿瘤(软组织肉瘤)，外阴癌和Wilms肿瘤。

在本领域中已经描述了不是所有的肿瘤都对使用BET抑制剂的治疗有反应。现在令人惊讶地发现，通过与干扰素γ(IFNγ)共同刺激肿瘤细胞，可以使至少一些肿瘤对BET抑制剂的作用作出反应。因此，用BET抑制剂和IFNγ对原发性肿瘤细胞进行离体治疗将导致肿瘤细胞中抗原呈递增加，其否则对单独使用BET抑制剂的治疗无反应。因此，当施用时，反应性细胞现在可以成功地用于受试者中以引起肿瘤特异性T细胞反应。

因此，本发明还涉及如上所述的方法，其中使肿瘤细胞同时或相继与干扰素γ和BET抑制剂接触。

用BET抑制剂和γ干扰素同时或顺序治疗的另一个优势是，由于自体肿瘤细胞上抗原呈递的协同增加，免疫反应协同增加。因此，与仅用BET抑制剂或IFNγ治疗肿瘤细胞相比，当用BET抑制剂和IFNγ治疗源自受试者的肿瘤细胞时，将产生协同地更强的肿瘤特异性T细胞应答。

为了有效地利用根据本发明的方法，必须注意当将组合物施用于受试者时不具有致瘤性。

因此，本发明涉及如上所述的方法，其中在将组合物施用于受试者之前，对其进行处理以防止其在体内致瘤。

因此，优选地，以这样的方式处理包含原发性肿瘤细胞的组合物，使得当体内给予受试者时组合物中所含的细胞不能增殖。这种处理方法的例子是使细胞经受电离辐射，或使细胞经受有丝分裂抑制剂或细胞周期抑制剂，但是其他方法是技术人员已知的。

在本发明的一个优选实施方案中，提供了一种方法，其中通过将组合物经受电离辐射进行处理以防止其在体内致瘤。优选地，细胞经受至少20Gy，更优选至少30Gy，甚至更优选至少40Gy，最优选50Gy或更多。

在本发明的另一个优选实施方案中，提供了一种方法，其中该方法另外包括使肿瘤细胞与获自受试者的T细胞或树突细胞离体接触的步骤。

可以预见，根据本发明处理的肿瘤细胞可以用于T细胞(例如自体T细胞)或树突细胞的离体扩增，或用于促进肿瘤抗原在树突细胞上的呈递。该优选方法的优点是在组合物中T细胞或树突状细胞被激活，因此该方法可用于治疗受试者的癌症。

该方法还可以用于产生适用于患者免疫治疗的T细胞和/或树突状细胞，或者还可以用于获得适用于癌症免疫治疗的肿瘤细胞和/或T细胞和/或树突状细胞的组合。

因此，在本发明的另一个优选实施方案中，提供了一种离体方法，用于获得适合于治疗受试者癌症的组合物，其中该方法还包括使肿瘤细胞与从受试者获得的T细胞或树突状细胞离体接触的步骤，并且其中所述组合物包含用BET抑制剂离体处理的T细胞、离体扩增的T细胞或树突状细胞或其组合。扩增T细胞的方法是本领域已知的，并在实施例2中举例说明。

根据本发明的方法对于HLA(例如I类HLA)或PD-L1阴性或具有低或无HLA或PD-L1表达的肿瘤细胞可能是特别有利的。在本发明的上下文中，术语“HLA阴性或HLA I类阴性或PD-L1阴性”应解释为HLA、HLA I类或PD-L1的表达(例如，在与特异性识别这些蛋白质的抗体进行免疫染色时，例如执行免疫组织化学或流式细胞术)不被上调和/或不可检测。

在一个实施方案中，如果表达水平不显著超过非肿瘤细胞或正常肿瘤细胞的，则肿瘤被认为是HLA阴性或PD-L1阴性的。

该表达可以指mRNA水平或蛋白质水平。

PD-L1阳性肿瘤的存在不是患者合格的先决条件，因为BETi还可以增强PD-L1阴性肿瘤的免疫原性。

因此，在本发明的另一个优选实施方案中，提供了一种方法，其中所述肿瘤细胞是HLA阴性肿瘤细胞和/或PD-L1阴性肿瘤细胞。

另外，本发明的方法和用途特别有利于患有IFN-γ受体下游的分子信号传导被破坏或功能差的肿瘤的患者和/或患有具有高组成型或IFN-γ诱导的吲哚胺2,3-二加氧酶和/或II类HLA和/或PD-L1表达的肿瘤的患者。

可以预见，根据本发明的方法可以用于获得适合于治疗癌症的组合物，其中所述癌症是实体瘤或血液学癌症。优选地，癌症是黑素瘤。

实体瘤也称为赘生物，涵盖了绝大多数肿瘤类型，通常是所有不被视为血液学癌症的肿瘤。血液癌症对于本领域技术人员来说也是造血和淋巴组织的肿瘤，并且包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。

在本发明的一个更优选的实施方案中，提供了一种方法，其中癌症是黑素瘤。

在本发明的另一个优选实施方案中，提供了一种方法，其中步骤a)中的肿瘤细胞生长为类器官。

在本领域中众所周知，并非所有原发性肿瘤细胞都容易地离体培养。解决此问题的一种方法是从原发性肿瘤细胞中生长类器官来建立稳定的细胞培养物。然后可以根据本发明的方法用BET抑制剂处理此类类器官。从肿瘤细胞中生长类器官的方法是技术人员已知的，并且由荷兰Utrecht的Hubrecht实验室的Hans Clevers和Ton Logtenberg进行了广泛的描述。

在本发明的另一方面，提供了可通过根据本发明的方法获得的组合物。

在本发明的另一个优选实施方案中，提供了通过根据本发明的方法获得的组合物。

在本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含如上所述的组合物和药学上可接受的载体或赋形剂。

此类组合物的特征在于肿瘤特异性新抗原的表达和呈递增加，其中术语“增加”是指与体内或离体正常、非肿瘤细胞和/或未治疗的肿瘤细胞相比，肿瘤特异性新抗原的表达和呈递水平。

在另一方面，本发明提供了用于药物中的本发明的组合物或药物组合物。

在另一方面，本发明提供了用于治疗癌症的组合物，其中所述治疗包括向受试者施用所述组合物，优选地其中所述施用包括皮内、皮下、肌内、静脉内或肿瘤内施用或其组合。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括将该组合物施用于受试者，其中所述施用优选包括皮内、皮下、肌内、静脉内或肿瘤内施用或其组合。

在另一个可选实施方案中，本发明提供了根据本发明的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症的组合物，其中如上所述的治疗与体内或离体全身或局部施用药物结合，所述药物选自免疫调节化合物、血管生成抑制剂、化学治疗剂或c-Myc下调，优选地其中药物是选自以下的免疫调节化合物：BET抑制剂，免疫刺激性细胞因子，Toll样受体的天然、内源或合成配体，其他免疫刺激性受体的配体，免疫检查点的调节剂，或激动调节剂，表观遗传药物(例如HDAC抑制剂和DNMT抑制剂)或用于靶向治疗的化合物(例如BRAF抑制剂和CDK4/6抑制剂)。

化学治疗剂的非限制性实例包括：烷基化剂，蒽环类，细胞骨架破坏剂(Taxanes)，上环酮，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，拓扑异构酶I抑制剂，拓扑异构酶II抑制剂，激酶抑制剂，核苷酸类似物和前体类似物，肽类抗生素，铂类药剂，类维生素A，长春花生物碱，及其衍生物，

抑制或下调c-Myc的非限制性方法包括使用小分子化合物、RNA干扰、或抗体。

根据本发明的免疫刺激细胞因子的非限制性实例是I型和II型干扰素：IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IL-2，TNFα，GM-CSF，和γC家族的细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15和IL-35。

Toll样受体的天然、内源或合成配体的非限制性实例包括用于以下方面的天然、内源或合成配体：

-TLR1(例如三酰基脂肽，Pam3Cys)

-TLR2(例如脂多糖，热杀死的单核细胞增生李斯特菌)

-TLR3(例如，poly I：C)

-TLR4(例如脂多糖，MPLA)

-TLR5(例如鞭毛蛋白)

-TLR6(例如FSL1)

-TLR7(例如咪喹莫特)

-TLR8(例如R848)

-TLR9(例如CpG-寡核苷酸)

-TLR10

-任何基于减弱和/或碎片化病毒或细菌的TLR激动剂

-任何内源性配体(例如热激蛋白)

其他免疫刺激受体的配体的非限制性实例包括用于以下方面的天然、内源或合成配体：

-晚期糖基化终产物(RAGE)的受体

-干扰素基因刺激物(STING)

免疫检查点调节剂的非限制性实例可以选自：CTLA-4，PD-1，PDL-1，PDL-2，TIM3，LAG3，B7-H3，B7-H4，BTLA，GAL9和A2aR。调节剂可以是肽、抗体、干扰RNA或小分子。在某些情况下，免疫调节剂是单克隆抗体或Ig融合蛋白。

激动性调节剂的非限制性实例包括针对刺激性免疫分子的调节剂，例如4-IBB(CD137)，CD137L，OX40，OX40L，ICOS，CD40，CD40L，CD70，CD27，CD28，CD80，CD86，B7RP1或HVEM。调节剂可以是肽、抗体、干扰RNA或小分子。在某些情况下，免疫调节剂是单克隆抗体或Ig融合蛋白。

表观遗传药物的非限制性实例包括DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTi)、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi)，

用于靶向癌症治疗的药物的非限制性实例包括APR-246，

如上所述，并且如所附实施例所示，发明人已经显示BET抑制剂对肿瘤细胞具有以下作用：干扰素-γ信号传导增强；抗原呈递增加；抑制组成型和干扰素-γ诱导的HLA II类表达；抑制组成型和干扰素-γ诱导的吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)的产生；和抑制组成型和干扰素-γ诱导的PD-L1表达。因此，在另一方面，本发明提供了BET抑制剂的以下用途：增加一种或多种肿瘤细胞中干扰素-γ信号传导；和/或增加一种或多种肿瘤细胞中抗原呈递；抑制一种或多种肿瘤细胞中组成型和干扰素-γ诱导的HLA II类表达；抑制一种或多种肿瘤细胞中组成型和干扰素-γ诱导的吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)的产生；和/或抑制一种或多种肿瘤细胞中组成型和干扰素-γ诱导的PD-L1表达。本领域技术人员将认识到，在肿瘤细胞中引起那些作用对于产生新的治疗方法、用途和组合物将是有益的。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了BET抑制剂增加一种或多种肿瘤细胞中肿瘤特异性新抗原的表达和呈递的用途。

另外，并且与发明人的发现一致，本发明提供了BET抑制剂在肿瘤细胞上具有以下一种或多种作用的用途：增加干扰素-γ信号传导；增加抗原呈递；抑制组成型和干扰素-γ诱导的HLA II类表达；抑制组成型和γ-干扰素诱导的吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)的产生；和抑制组成型和干扰素-γ诱导的PD-L1表达。本领域技术人员将认识到，这样的用途将有利于产生新的治疗方法、用途和组合物。

发明人对BET抑制剂的有益作用的令人惊讶的发现确定了这种抑制剂的新用途，并且确定了可以使用BET抑制剂治疗的癌症患者的新亚组。如上所述，先前描述了BET抑制剂用作抑制肿瘤生长的抗肿瘤疗法。但是，发明人的发现现已证明，BET抑制剂可用于另一种治疗癌症的方法-具体而言，通过诱导和/或增加肿瘤细胞的抗原呈递，在患者体内诱导出肿瘤特异性T细胞应答，导致肿瘤特异性免疫反应。

发明人的发现确定了可以使用BET抑制剂治疗的几个新的癌症患者亚组，具体是：

(i)癌症患者，其包括没有或具有低水平的肿瘤特异性新抗原和/或共享的抗原的表达和呈递的肿瘤细胞-在这些患者中，BETi增强(干扰素-γ诱导的)抗原的呈递，导致T细胞更好地识别和根除肿瘤；和/或

(ii)包含HLA阴性肿瘤细胞和/或PDL-1阴性肿瘤细胞的癌症患者–在此类患者中，BETi增强了HLA的(干扰素-γ诱导)的表达，从而导致T细胞更好地识别和根除肿瘤；和/或

(iii)包含低水平或不存在HLA I类表达的肿瘤细胞的癌症患者–在此类患者中，BETi增强了HLA的(干扰素-γ诱导)的表达，从而导致T细胞更好地识别和根除肿瘤；和/或

(iv)癌症患者，其包含的肿瘤细胞的干扰素-γ反应性和信号传导均较差–在这类患者中，BETi增强肿瘤对干扰素-γ诱导的反应性，从而导致更好的抗原呈递，并因此通过T细胞更好地识别和根除肿瘤；和/或

(v)癌症患者，其包括的肿瘤细胞具有高吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)表达(Holmgaard et al.,2015；Hornyák et al.,2018；Munn&Mellor,2013)–在此类患者中，BETi抑制(干扰素-γ诱导的)IDO表达，导致T细胞的免疫抑制降低，从而更好地T细胞介导消除肿瘤；和/或

(vi)癌症患者，其包括具有高HLA II类表达的肿瘤细胞(Donia et al.,2015；Hemon et al.,2011)-在这样的患者中，BETi抑制(干扰素-γ诱导的)HLA II类表达。可以理解，在健康条件下，HLA II类仅在免疫系统的专业抗原呈递细胞(例如树突状细胞)上表达，以促进免疫反应；但是，在病理条件下，HLA II类通常在肿瘤上异常表达，并以多种方式抑制免疫反应，最重要的是通过成为LAG3的配体，其是与PD1一样的分子，负调节T细胞，并且在CD4 T细胞的情况下使它们偏向抑制表型；和/或

(vii)癌症患者，其包括相比于CD73的表达在健康细胞中的正常水平具有升高的和/或高的CD73表达的肿瘤细胞(D.Allard,Chrobak,Allard,Messaoudi,&Stagg,2018)-–在此类患者中，BETi抑制(干扰素-γ诱导的)CD73表达，导致T细胞的免疫抑制降低，从而更好地T细胞介导消除肿瘤。CD73将细胞外ATP分解代谢为腺苷，从而抑制T细胞的功能。

鉴定和表征此类肿瘤细胞和相关分子标记，从而鉴定待测患者亚组的方法是医学和分子生物学领域的技术人员已知的。

在本发明的优选方面，提供了用于治疗受试者癌症的BET抑制剂，其中所述治疗包括向受试者施用所述组合物，优选地其中所述施用包括皮内、皮下、肌内、静脉内或肿瘤内施用或其组合；并且特征在于所述受试者中的癌症包括没有或仅有低水平的肿瘤特异性新抗原的表达和呈递的肿瘤细胞。

在本发明的另一个优选方面，提供了BET抑制剂用于制备治疗受试者癌症的药物的用途，其中所述治疗包括向受试者施用所述组合物，优选地其中所述施用包括皮内、皮下、肌内、静脉内或肿瘤内施用或其组合；并且特征在于所述受试者中的癌症包括没有或仅有低水平的肿瘤特异性新抗原的表达和呈递的肿瘤细胞。

在本发明的另一个优选方面，提供了一种用于治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括向受试者施用BET抑制剂的步骤，其特征在于所述受试者中的癌症包括没有或仅有低水平的肿瘤特异性新抗原的表达和呈递的肿瘤细胞。

BET抑制剂的适当给药方法、剂量和方案是本领域技术人员已知的。优选地，可以口服和/或通过皮下注射施用BET抑制剂。BET抑制剂的优选剂量为每天1mg，或每天2mg，或每天5mg，或每天10mg，或每天20mg，或每天30mg，或每天40mg，或每天50mg，或每天60mg，或每天70mg，或每天80mg，或每天90mg，或每天100mg，或每天150mg，或每天200mg，或更多。优选地，以这样的剂量和/或通过这样的途径每天一次施用BET抑制剂，持续1天或更长时间，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21或28天。

例如，BET抑制剂RO6870810(基于JQ1的BET抑制剂)可以通过皮下注射在28天周期(连续28天给药或21天给药，然后停药7天)或在21天周期(给药14天，停药7天)每天一次(以递增剂量)施用。

BET抑制剂OTX015/MK-8628(BET抑制剂)以起始剂量10mg施用，口服(PO)每天一次(QD)，每个周期连续21天。

BET抑制剂ZEN003694可以在28天周期每天口服一次。

BET抑制剂GSK525762可以以5毫克(mg)起始剂量施用，口服，每天一次。可以进行剂量递增和/或剂量调整以解决耐受性和安全性问题。剂量递增可持续到每天达到至多200mg剂量。GSK525762可以1毫克、10毫克和30毫克片剂提供和/或与240毫升(mL)水一起施用。

在本发明的优选方面，提供了用于治疗受试者癌症的BET抑制剂，其中所述治疗包括向受试者施用所述组合物，优选地其中所述施用包括皮内、皮下、肌内、静脉内或肿瘤内施用或其组合；并且特征在于所述受试者的癌症包括HLA阴性肿瘤细胞和/或PDL-1阴性肿瘤细胞。

在本发明的另一个优选方面，提供了BET抑制剂用于制备治疗受试者癌症的药物的用途，其中所述治疗包括向受试者施用所述组合物，优选地其中所述施用包括皮内、皮下、肌内、静脉内或肿瘤内施用或其组合；并且特征在于所述受试者的癌症包括HLA阴性肿瘤细胞和/或PDL-1阴性肿瘤细胞。

在本发明的另一个优选方面，提供了一种用于治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括向受试者施用BET抑制剂的步骤，其特征在于受试者中的癌症包含HLA阴性肿瘤细胞和/或PDL-1阴性肿瘤细胞。

鉴定HLA阴性肿瘤细胞和/或PD-L1阴性肿瘤细胞的方法是医学和生物化学领域的技术人员众所周知的。

优选地，在本发明的方法和用途中，施用BET抑制剂可增加受试者癌症的肿瘤细胞中肿瘤特异性新抗原的表达和呈递。另外，并且与发明人的发现一致，BET抑制剂的施用增加了干扰素-γ信号传导；增加了抗原呈递；抑制组成型和干扰素-γ诱导的HLA II类表达；抑制组成型和干扰素-γ诱导的吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)的产生；和抑制组成型和干扰素-γ诱导的PD-L1表达。

优选地，在本发明的方法和用途中，将BET抑制剂与全身或局部施用选自以下的药物组合：免疫调节化合物，血管生成抑制剂，化学治疗剂或c-Myc下调，优选地其中药物是选自以下的免疫调节化合物：免疫刺激性细胞因子，Toll样受体的天然、内源或合成配体，其他免疫刺激性受体的配体，免疫检查点的调节剂，或激动调节剂。

应当理解，当BET抑制剂与这种药物组合施用时，BET抑制剂和药物可以任何顺序施用-例如，BET抑制剂可以在该附加药物之前和/或同时和/或之后施用。

此外，可以将BET抑制剂与其他抗癌疗法联合施用，包括以下中的一种或多种：放射，手术，化学疗法，靶向疗法和/或检查点阻断疗法。应当理解，当BET抑制剂与这种疗法组合施用时，BET抑制剂和药物可以任何顺序施用-例如，BET抑制剂可以在该附加疗法之前和/或同时和/或之后施用。

总之，这项研究首次证明，在高度生理相关的模型中，BET抑制可以增强针对人黑素瘤细胞的功能性和抗原特异性T细胞应答。总体而言，所提供的数据表明，不论PD-L1抑制如何，单独或与IFNγ组合使用的JQ1都能对TIL识别产生强烈的敏感性。重要的是，我们提供的证据表明，BET抑制主要通过增强IFNγ激活APM成分的能力来诱导其敏化作用，而与PD-L1的调节无关。而且，尽管PD-L1强烈下调，但在KADA细胞中未观察到致敏性这一事实表明JQ1的致敏作用主要是由抗原呈递机制的激活介导的。实际上，我们提供的证据表明，BET抑制可以增强对肿瘤相关抗原和肿瘤特异性突变抗原的识别，而后者已被证明与癌症免疫疗法中抗肿瘤T细胞应答的功效特别相关。

以前推测，免疫抑制途径是由免疫系统而非癌细胞驱动的。例如，已显示，在黑素瘤微环境中PD-L1、IDO和Tregs的诱导是由CD8+T细胞22驱动的。由于这主要是通过CD8 T细胞产生IFNγ介导的，因此BET抑制剂的应用可能是增强CD8 T细胞反应的积极作用而同时减少阴性反应的极具吸引力的方法。这也表明，针对阴性调节免疫检查点的癌症免疫治疗方法可能对患有所谓“热”肿瘤(即已存在T细胞浸润)的患者更为有益。另一方面，根据本发明的方法特别适合于治疗具有所谓的“冷”肿瘤(即没有T细胞浸润)的患者，因为它通过激活APM而触发T细胞的涌入。

Nature上的一项基于CRISPR-Cas9文库来模拟黑素瘤的功能丧失突变的非常近期的研究发现与基于T细胞的癌症免疫疗法抗性有关的大多数基因在抗原呈递和IFNγ信号传导中均起关键作用，并与来自The Cancer Genome Atlas.23的患者肿瘤中的溶细胞活性相关。我们的发现表明BETi精确地影响了这些途径的事实进一步支持了这一观点，即它们可能对改善基于T细胞的免疫疗法的临床疗效非常有用。同时，BETi在细胞培养物中显示出明显的抗增殖能力，使其成为一种高度有吸引力的抗癌药物，可在多个层面上影响肿瘤。

总结：已知溴结构域和末端外结构域(BET)家族成员的抑制剂在肿瘤中诱导多种作用。尽管最初打算用作抑制增殖和诱导凋亡的靶向疗法，但最近发现BET抑制可在各种肿瘤小鼠模型和人类癌细胞系中强烈抑制PD-L1的表达。尽管这在人黑素瘤细胞中也有显示，但从未研究过它对抗肿瘤免疫反应有什么功能性后果。因此，我们着手确定这些机制对人黑素瘤细胞功能免疫原性的重要性。

将早期传代的人黑素瘤细胞系单独或与干扰素-γ(IFNγ)组合使用BET抑制剂JQ1处理72小时。随后将细胞用胰蛋白酶消化，洗涤并与自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)共培养24小时。通过ELISA评估共培养上清液的IFNγ水平，作为通过TIL识别肿瘤的量度。在用JQ1和/或IFNγ处理后，还通过流式细胞术评估了细胞系中PD-L1的表达水平。

单独或与IFNγ联合使用JQ1处理早期传代肿瘤细胞系，可使它们明显敏感以被自体TIL识别。重要的是，JQ1明显增强了IFNγ诱导HLA I类、β2微球蛋白和抗原呈递机制组分的能力。尽管PD-L1表达确实被JQ1抑制，但其对IFNγ诱导的抗原呈递的增强作用与TIL改善的功能识别更为强烈地吻合。观察结果也强调了这一点，即当基线和干扰素γ处理后PD-L1细胞阴性时，甚至可以观察到JQ1的增敏作用。我们得出的结论是，BET抑制确实能够通过独立于PD-L1抑制的机制来增强针对人类黑素瘤细胞的抗肿瘤免疫力。

实施例

实施例1：材料和方法

细胞系和培养

根据已公布的方案，从卡罗林斯卡大学医院肿瘤诊所的患者(伦理许可：#2011/143-32/1)建立了早期传代的黑色素瘤细胞系ANRU、ROAL和KADA。在本研究中使用时21个无支原体(MycoAlert试剂盒)细胞系处于其第15到45代。

肿瘤浸润淋巴细胞的培养和扩增

如前所发表进行肿瘤浸润淋巴细胞的培养和扩增。⁴将一块肿瘤(约0.5cm3)切成1mm3的块。将每块置于24孔板的一个孔中，该板包含1mL/孔的CellGro培养基，培养基中补充了2％的自体血浆(通过对手术当天收集的血浆进行离心和热灭活产生)和6,000IU/mLIL-2(Proleukin，瑞士巴塞尔诺华公司)。在培养的第1天，将每个孔中一半的培养基体积替换为补充有血浆和IL-2的新鲜培养基。培养3-4天后，通常可以看到从肿瘤块中出现淋巴细胞。定期监测培养物，并在达到融合之前进行分裂。大约2周后，将扩增的孔合并并计数。为了产生大量的T细胞，将TIL在具有300IU/mL IL-2和30ng/mL抗-CD3抗体(OKT3,Cilag,Zug,瑞士)的自体辐照的饲养细胞(40Gy，TIL∶饲养细胞比例为1：50–1：80)的存在下培养约14天。根据需要分裂细胞或更换培养基。在站立的T75烧瓶中开始培养，但在收获前1周转移到VueLife细胞培养袋中。在培养结束时，收获、合并、表征、计数和冷冻细胞。

流式细胞仪

用以下抗体染色后，进行流式细胞术：抗人HLA-ABC APC-Cy7(克隆W6/32；Biolegend，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)，CD274 BV786(克隆MIH1；BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，美国)。所有数据在Novocyte 2000[？]流式细胞仪(AceaBiosciences，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)上采集，使用FlowJo软件版本10(Treestar)进行分析。

实施例2：JQ1对由自体TIL识别的黑素瘤细胞有不同的敏感性。

我们在本文中显示，用JQ1治疗患者源性早期传代的黑色素瘤细胞系可增强自体TIL的识别。为了研究BET抑制对组成型和诱导的PD-L1表达的潜在抑制作用，我们还研究了JQ1与IFNγ结合的致敏作用。此外，仅通过IFNγ处理细胞就可以了解，与已知的针对T细胞识别的靶细胞致敏化的生理学线索相比JQ1的潜在敏化作用的强度。同时，通过流式细胞术评估了预处理肿瘤细胞中的PD-L1和HLA I类表达，以发现肿瘤-TIL共培养物中的功能性观察是否与PD-L1表达或HLA I类表达的变化有关，这两个标记都是识别靶细胞后T细胞活化的关键决定因素。

在仅存在JQ1的情况下将ANRU培养72小时，然后与自体TIL共培养24小时后，我们观察到T细胞识别的剂量依赖性增加，这可以通过IFNγ产生水平的提高来表明(图1a，顶行)。相反，单独使用IFNγ或与JQ1组合使用ANRU进行预处理不会在共培养期间导致T细胞识别能力的任何提高(图1a，第二行)。有趣的是，这些观察结果与对PD-L1表达的任何影响均不相符，因为在所有条件下都完全不存在该分子在ANRU细胞上的表达。同时，我们确实观察到在存在JQ1的情况下IFNγ对HLA I类诱导的持续增强，而实际上抑制了II类HLA的上调(图1)。

与我们对ANRU的发现相反，即使单独使用JQ1进行预处理，即使在更高的浓度下，也不能使早期传代细胞系ROAL和KADA能够被自体TIL识别。在ROAL的情况下，仅用IFNγ进行处理不会使细胞对自身TIL的识别敏感。但是，TIL的效果明显的确更好，并且可以协同识别经JQ1和IFNγ预处理的ROAL细胞。与在ANRU中观察到的情况相似，如果不是在所有条件下都不存在，则ROAL细胞上PD-L1的表达是微不足道的，而在JQ1存在的情况下，IFNγ会明显更强地诱导HLA I类表达。

KADA的结果以多种方式比其他表现出众。首先，IFNγ预处理使KADA对TIL的识别高度敏感，而IFNγ和JQ1的组合实际上导致了自体TIL对肿瘤细胞识别的降低。令人惊讶的是，KADA显示出高组成型和甚至更高的IFNγ诱导的PD-L1表达水平，而JQ1强烈抑制了该表达水平。再次与对ANRU和ROAL观察到的相反，JQ1实际上减少了IFNγ对HLA I类的诱导。值得注意的是，在存在HLA I类阻断抗体的情况下进行共培养时，在进行任何预处理后，通过TIL进行的肿瘤识别总是被完全废除。

总之，这些数据表明，在没有PD-L1表达的情况下，单独或与IFNγ结合使用的JQ1能够显著地使肿瘤细胞被TIL识别。在JQ1存在的情况下，这些作用仅在IFNγ增强诱导HLAI类的细胞系中观察到。与此相反，JQ1未能致敏黑色素瘤细胞并且甚至降低IFNγ诱导的致敏，尽管强的PD-L1抑制。尽管PD-L1强烈下调，但在KADA细胞中未观察到致敏这一事实表明，JQ1的致敏作用以及其他研究中观察到的免疫学作用主要是由抗原呈递机制的激活介导的。

实施例3：JQ1独立于PD-L1增强TIL对肿瘤的识别。

接下来，我们开始进一步证实JQ1可以增强TIL对功能性肿瘤的识别，而不管对PD-L1的影响如何。为了测试这一点，我们在存在和不存在PD-L1阻断抗体的情况下，将ANRU肿瘤细胞与自体TIL共培养24小时。合适的PD-L1阻断抗体是可商购的，包括抗人CD274(B7-H1，PD-L1)抗体(克隆29E.2A3；目录号329709；Biolegend)，抗人CD274(B7-H1，PD-L1)抗体(克隆MIH3；目录号374502；Biolegend)，抗PD-L1(CD274)中和抗体(目录号71213；BPSBioscience)，PD-L1/B7-H1/CD274阻断抗体(克隆R639；目录号10084-R639；SinoBiological)和人PD-L1/B7-H1抗体(目录号AF156；R and D Systems)。将肿瘤细胞预处理12、24、48和72小时，以通过流式细胞术检查随时间推移的任何PD-L1诱导或抑制作用，并定义JQ1诱导的肿瘤敏化的时间动力学，以在共培养物中进行TIL识别。我们认为，如果ANRU肿瘤细胞在所有情况下均为PD-L1阴性，那么在任何时间点，自体TIL的识别都不会受到PD-L1阻断的影响。实际上，在进行任何预处理后，在ANRU肿瘤-TIL共培养物中均未观察到PD-L1阻断作用(图2)。此外，在任何时间段进行IFNγ预处理都不会导致TIL对肿瘤识别的改善。仅在将肿瘤与JQ1一起温育的情况下观察到TIL的识别能力提高，而单独用JQ1预处理72小时后，效果显然最为突出。

实施例4：JQ1增强了IFNγ诱导的抗原呈递机制的激活。

图1中的数据表明，JQ1增强了IFNγ对ANRU和ROAL以及A375细胞的HLA I类诱导。此外，HLA I类阻断抗体的存在总是在与预处理过的肿瘤共培养中完全废除了T细胞识别。这使我们假设JQ1在这些细胞系中的抗原呈递水平上诱导其作用。因此，我们研究了单独用JQ1和/或IFNγ预处理后抗原呈递机制(APM)众所周知组分的mRNA和蛋白表达。我们发现，几乎所有这些成分的JQ1都能增强IFNγ的诱导作用(图3a)，其中对HLA I类、β-2微球蛋白(B2M)、TAP1和TAP2，观察到最显著的作用。

为了研究这些作用的时间动力学，以相同的方式处理ANRU细胞系12、24、48和72小时。再次，JQ1在所有时间点都增强了IFNγ对APM成分的诱导(图3b)。如通过TAP1、TAP2、Tapasin、HLA I类重链、LMP2和LMP10的蛋白质印迹所示，在蛋白质水平上也可以看到在JQ1存在下通过IFNγ增强APM成分的诱导(图3c)。这对于HLA I类重链最为明显，而在A375细胞中则最明显。

实施例5：JQ1增强通过自体TIL对肿瘤相关抗原和突变抗原的识别

在本文中，我们解决了在JQ1治疗后增强自体TIL的肿瘤识别是针对肿瘤相关抗原还是肿瘤特异性突变抗原的问题。因此，我们将ANRU细胞与TIL共培养，并按其对肿瘤相关抗原MART-1或两种不同的肿瘤特异性突变体抗原(称为ETV6.9和NUP210)的特异性分类。我们发现，JQ1改善了所有三个TIL群体的识别度，与单独的IFNγ相比，其程度相似或强得多(图4)。这表明BET抑制确实可以改善对各种类型的肿瘤抗原的识别。

实施例6：JQ1剂量依赖性地增强IFNγ对HLA I类的诱导

为了进一步证实JQ1增强人黑素瘤细胞上对HLA I类诱导的能力，我们测试了JQ1浓度增加与标准浓度IFNγ结合的效果。在JQ1的存在下，在A375细胞和ROAL细胞上，我们都检测到了IFNγ对HLA I类诱导的明显剂量依赖性增强(图5，顶行)。对ANRU细胞进行了类似的观察(数据未显示)。

实施例7：在I-BET151和I-BET762存在下，IFNγ对HLA I类诱导的剂量依赖性增强

为了评估其他BETi是否能够介导与JQ1相似的HLA I类效应，我们分别用I-BET151和I-BET762单独或与IFNγ组合处理A375和ROAL细胞。我们发现，与这些BETi组合使用时，IFNγ诱导HLA I类明显增加(图5，第二和第三行)。这表明增强HLA I类表达的能力(尤其是与IFNγ结合使用)是BETi的普遍特征。

实施例8：用小分子BET抑制剂或任何其他BET抑制手段治疗自体肿瘤细胞的基本 方案。

·如本文所述，为每位患者建立了自体肿瘤细胞系。

·用BET抑制剂(BETi)治疗肿瘤细胞至少1天。在BETi治疗期间或之后，肿瘤细胞也可能暴露于干扰素-γ(IFNγ)和/或多种其他免疫刺激性化合物(例如I型干扰素)。

·通过在共培养物中确定多种免疫学标志物(包括HLA I类和II类、PD-L1和吲哚胺2,3-二加氧酶)的表达变化及其激活自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的能力，评估了BETi对肿瘤细胞免疫原性的影响。

实施例9：单独或相互组合应用BETi治疗的肿瘤的潜在用途：

1.通过向患者施用被辐射或接受其他任何方法的自体经BETi处理的肿瘤细胞以预防其在体内致瘤，将其用作个性化治疗性癌症疫苗。

2.促进可用于过继细胞疗法的肿瘤抗原特异性TIL(例如自体肿瘤抗原特异性TIL)或自体PBMC的离体活化和扩增，例如，按照方案2(见下文)(Dijkstra et al.,2018)。

3.促进离体(专业)抗原呈递细胞(APC)对肿瘤特异性抗原的呈递，以用于过继细胞疗法，例如根据方案2(见下文)。

4.例如根据方案X(见下文)，鉴定肿瘤特异性抗原

5.验证生物信息学工具预测的表位的表现形式和免疫原性。

实施例10：用作个性化治疗疫苗

·有关向患者给药的重要参数：

ο注射的肿瘤细胞数量可在10到1x10¹³之间

ο肿瘤细胞可以皮内注射(i.d.)，皮下注射(s.c.)，肌内注射(i.m.)或静脉注射(i.v.)和瘤内注射(i.t)。

ο注射可以进行一次，也可以以任何一种频率(例如每天、每周、每月、每年)重复多次。

·所有接受离体治疗的自体肿瘤细胞的患者均可以进行预处理，或可以预期同时或随后以任何方式(例如通过放射、化学疗法、靶向化合物和免疫调节剂或其组合)进行治疗，以产生最佳的经BETi处理的肿瘤细胞的治疗效果。

实施例11：使用BETi处理的自体肿瘤细胞促进肿瘤抗原特异性TIL的离体活化和 扩增。

·如本文所述，为每位患者建立了自体肿瘤细胞系。

·肿瘤细胞处理72小时，或用任一BETi更长。在BETi治疗期间或之后，肿瘤细胞也可能暴露于干扰素-γ(IFNγ)和/或多种其他免疫刺激性化合物(例如I型干扰素)。

·随后或同时，将肿瘤细胞与自体肿瘤浸润淋巴细胞或来自如本文所述产生的自体PBMC的T细胞共培养。

·在共培养期间，可添加其他免疫刺激化合物，例如白介素-2和激动性抗人CD3ε抗体OKT3。

·BETi的低浓度也可以在TIL扩增或T细胞从自体PBMC扩增的过程中存在，因为这在过继免疫治疗模型中已经显示出增强T细胞的持久性和功能²⁴。

实施例12：使用BETi处理的自体肿瘤细胞增强专业抗原呈递细胞(APC)的抗原呈 递。

·自体原代树突状细胞、单核细胞衍生的树突状细胞或人工APC可离体暴露于经BETi治疗的整个或局部性自体肿瘤。

实施例13：使用BETi处理的自体肿瘤细胞鉴定免疫原性肿瘤特异性抗原。

·共培养BETI治疗的肿瘤与自体TIL和/或外周T细胞。

·确定并分类在此共培养物中最强激活的T细胞克隆

·评估已鉴定的T细胞克隆的抗原特异性

·使用信息来设计个性化的基于肽、RNA或DNA的疫苗，可以在使用免疫刺激性化合物(包括BETi)治疗后或与之同时给予患者。

经BETi处理的自体肿瘤细胞也可用于验证生物信息学工具使用DNA测序数据(例如全外显子序列数据)预测的肿瘤特异性抗原表位的表现和免疫原性。

实施例14：方案

方案1A：肿瘤细胞系的产生

早期传代的黑色素瘤细胞系是根据已发布的方案生成的。²⁵简而言之，通过以下步骤建立细胞系：

1)通过手术切除、细针抽吸或其他方式从原发肿瘤和/或远处转移中获得肿瘤组织标本，并保存在含15％胎牛血清的完全RPMI-1640培养基中(从此处开始称为R15)以运输。

2)运输期间从组织释放到培养基中的细胞被收集并分别置于R15中的培养物中。

3)称取肿瘤组织标本，并在R15中用解剖刀切碎。

4)在切碎过程中释放的细胞分别置于R15中的培养物中。

5)根据组织类型，在37℃和5％CO2的旋转瓶中，用RPMI+5％FBS中的3125单位/克1型胶原酶消化剩余的组织块1-4h。对于纤维化肿瘤组织，可以使用6250单位/克1型胶原酶。

6)消化后，将细胞洗涤两次，冷冻保存或直接在带有R15的组织培养瓶中培养。

7)采用差异附着、营养饥饿和差异胰蛋白酶消化程序来消除成纤维细胞污染。

8)分离的肿瘤细胞在组织培养瓶中的R15中生长，每周两次或更多次更换培养基(如有必要)，直到形成汇合的单层。汇合时，用室温钙和无镁磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤贴壁细胞一次，并用胰蛋白酶/EDTA分离，然后重悬于R15培养基中。

9)对培养的肿瘤细胞进行常规胰蛋白酶消化，收获，并以10–20 106细胞/ml悬浮在冷冻小管中的冷冷冻培养基中。

方案1B：用小分子BET抑制剂(BETi)或任何其他BET抑制方法治疗自体肿瘤细胞的 基本方案的实例。

1)根据方案1A为每位患者建立自体肿瘤细胞系。

2)用任何方式处理肿瘤细胞至少1天，以抑制BET蛋白，例如JQ1，浓度在0.1到10μM之间。

3)在BETi治疗之前、之中或之后，肿瘤细胞也可暴露于：

·干扰素-γ(IFNγ)

·任何其他免疫刺激性化合物(例如I型干扰素)

·任何具有癌症选择性的靶向化合物(例如BRAF和MEK抑制剂)。

4)BETi对肿瘤细胞免疫原性的影响将通过以下评估：

·确定各种免疫标志物的表达变化，包括I类和II类HLA、PD-L1和吲哚胺2,3-二加氧酶。

·它们在共培养物中可以激活自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的能力。

可选的修饰

·在步骤4中使用的肿瘤(细胞)可以通过任何方式处理，以抑制BET蛋白，例如JQ1，浓度在0.1到100μM之间。也可以与浓度在1到10000ng/ml之间的IFNγ或任何其他免疫刺激性化合物(例如I型干扰素)或可以预期改善用BETi处理的细胞治疗的靶向化合物联用进行治疗。

·肿瘤细胞的治疗可在与iDC共培养之前进行1到30天或更长时间。备选地，由于已经描述了BET溴结构域抑制作用和IFNγ都促进DC的免疫原性，所以在与iDC共培养期间可以进行肿瘤细胞的治疗。

·肿瘤细胞也可用基因进行转导，所述基因编码共刺激分子CD80、CD86、CD70和/或伽玛C家族、CD83和树突细胞或T细胞吸引趋化因子的免疫刺激细胞因子，或可增强BET处理的肿瘤作为抗原呈递细胞的功能的任何其他分子。

方案2：肿瘤浸润淋巴细胞的培养和扩增

1)从原发肿瘤或远处转移瘤获得了活检(约0.5cm3)。

2)将肿瘤组织切成1mm3的小块。

3)将肿瘤块分别置于24孔板的一个孔中，该板包含1mL/孔CellGro培养基，其中补充：

·2％的自体血浆(在获得组织的当天产生)

·6,000IU/mL白介素-2(IL-2)

4)在培养的第1天，将每个孔中一半的培养基体积替换为补充有自体血浆和IL-2的新鲜培养基。

5)在培养的第3-4天：淋巴细胞通常开始出现

6)定期监测培养物，并在达到融合之前进行分裂。

7)约2周后：合并并计数具有扩增细胞的孔。

8)为了产生大量细胞，将TIL在以下条件存在下培养大约14天：

·自体的照射的PBMC(40Gy，TIL：进料比1：50–1：80)

·300IU/mL IL-2

·30ng/mL抗CD3抗体(OKT3)

9)细胞分裂或必要时更换培养基。

10)培养在直立的T75烧瓶中开始，但可以在收获前1周转移到VueLife细胞培养袋中。

11)最后，收集、合并、表征、计数和冷冻细胞。

方案3：单能细胞衍生的树突状细胞的产生

树状细胞(DC)是根据已发布的方案生成的。²⁶简要地说，该方案包括以下步骤：

1)通过淘洗从白细胞分离产品中分离出单核细胞

2)单核细胞在VueLife细胞培养袋中以200万个细胞/mL在CellGro培养基中培养，存在以下：

·100ng/mL的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)

·20ng/mL白介素-4(IL-4)。

3)培养的第2天：加入一体积的新鲜含细胞因子的培养基。

4)培养的第5天：

·未成熟的DC(iDC)可暴露于：

i)自体肿瘤裂解物(每百万细胞10–30μg)，例如源自可能已经体外暴露于BETi的肿瘤细胞

ii)自体肿瘤细胞(整个)，例如可能已经离体暴露于BETi。

iii)以任何方式裂解或碎片化的自体肿瘤细胞(例如，可能首先暴露于离体BETi的细胞)

在添加之前，可以对肿瘤细胞进行辐照或以任何其他方式进行处理，以防止它们在与DC共培养时长出来。

·在补充有如上IL-4和GM-CSF的培养基中将iDC的细胞数调节到200万个细胞/ml。

·通过添加以下诱导iDC的成熟：

i)20ng/mL肿瘤坏死因子(TNF)-α

ii)任何可以使iDC成熟的其他免疫刺激化合物(的组合)，例如Toll样受体的配体或干扰素-γ(IFNγ)。

5)在第7天，收获成熟的DC(mDC)，对其进行计数、表征和在等分1750万个细胞中冷冻。这里可包括额外的步骤，以冲洗或通过任何其他方式除去iDC成熟所用的化合物。

6)在进行DC接种的当天，将一安瓿的冷冻mDC在37℃水浴中快速融化，计数并评估其生存力。将细胞重悬于0.2mL NaCl(0.15M)中，并使用胰岛素注射器皮内施用。

在步骤4中使用的肿瘤(细胞)可以通过任何方式处理，以抑制BET蛋白，例如JQ1，浓度在0.1到10μM之间。也可以与浓度为1至200ng/ml的IFNγ结合进行治疗。肿瘤细胞的治疗可在与iDC共培养之前进行1到5天的时间。备选地，由于已经描述了BET溴结构域抑制作用和IFNγ都促进DC的免疫原性，所以在与iDC共培养期间可以进行肿瘤细胞的治疗。

方案4：经BETi治疗的肿瘤患者的一般治疗指南

·所有施用离体处理的自体肿瘤细胞的患者都可以采用不严重抑制免疫的方法(例如通过放射、化学疗法、靶向化合物、表观遗传药物和免疫调节剂或其组合)进行预处理，并预期产生经BETi处理的肿瘤细胞的最佳治疗效果。

·对施用离体BETi处理的自体肿瘤细胞的患者可以采用预期可产生BETi处理的肿瘤细胞的最佳治疗效果的任何方式同时或随后治疗，特别是可以预期进一步增强经BETi处理的自体肿瘤细胞的治疗效果的特定免疫调节药剂。

·这些指南不排除可能对用离体BETi处理的自体肿瘤细胞进行早期治疗、同时发生或将要进行未来治疗的患者进行治疗，而这些治疗实际上可能无益于影响离体BETi处理的自体肿瘤细胞的临床治疗结果。

如图6所示，JQ1增强IFNγ诱导的HLA I类表达并抑制多种免疫检查点分子的组成型和IFNγ诱导。

如图7所示，JQ1增强了IFNγ诱导的抗原呈递机制的激活，并增强了IFNγ信号通路中关键蛋白的表达。

如图8所示，JQ1增强了IFNγ诱导的抗原呈递机制的激活，并增强了IFNγ信号通路中关键蛋白的表达。

图9显示了通过质谱分析与JQ1和/或IFNγ温育24小时的ANRU细胞裂解液中的蛋白质表达变化。

图10显示了通过质谱分析与JQ1和/或IFNγ温育24小时的ANRU细胞裂解液中的蛋白质表达变化。

如图11所示，蛋白质印迹分析表明，单独使用JQ1或与IFNγ联合使用72小时，MYC表达下调。

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Claims (27)

1.获得适合于治疗受试者癌症的组合物的离体方法，包括以下步骤：

a)提供源自所述受试者的原发性肿瘤细胞，以及

b)使所述肿瘤细胞与溴结构域和末端外结构域家族成员的抑制剂(BET抑制剂)离体接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在进行步骤b)之前在体外培养所述细胞以增加细胞数量。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中同时或依次使所述肿瘤细胞与免疫刺激化合物，优选干扰素γ和所述BET抑制剂接触。

4.根据权利要求1-3所述的方法，其中对所述组合物进行处理，以使其在步骤b)之后在体内没有致瘤性。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述肿瘤细胞与获自所述受试者的T细胞或树突细胞离体接触的步骤。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞是HLA阴性肿瘤细胞和/或PD-L1阴性肿瘤细胞。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体瘤或血液学癌症。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述BET抑制剂选自JQ1、MK-8628、BMS-986158、INB54329、ABBV-075、CPI-0610、FT-1101、GS-5829、GSK525762、PLX51107、Ten-010、OTX-015、CPI-0610、3-甲基-1,2,3,4-四氢喹唑啉-2-酮、2-噻唑烷酮、CPI-203、I-BET762(GSK525762A)、I-BET151(GSK1210151A)和RVX208，优选地所述BET抑制剂选自JQ1、I-BET151(GSK1210151A)和I-BET762(GSK525762A)。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中将步骤a)中的肿瘤细胞体外生长为类器官。

11.可通过根据权利要求1-10中任一项所述的方法获得的组合物。

12.通过根据权利要求1-10中任一项所述的方法获得的组合物。

13.药物组合物，其包含根据权利要求11或12所述的组合物和药学上可接受的载体或赋形剂。

14.根据权利要求11或12所述的组合物，或根据权利要求13所述的药物组合物，其用于药物中。

15.根据权利要求11-13中任一项所述的组合物，其用于治疗癌症，其中所述治疗包括向受试者施用所述组合物，优选地其中所述施用包括皮内、皮下、肌内、静脉内或肿瘤内施用或其组合。

16.根据权利要求11或12所述的组合物或根据权利要求13所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述治疗包括向受试者施用所述组合物，优选地其中所述施用包括皮内、皮下、肌内、静脉内或肿瘤内施用或其组合。

17.一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括以下步骤：对受试者施用根据权利要求11或12所述的组合物或根据权利要求13所述的药物组合物，并且优选地其中所述施用包括皮内、皮下、肌内、静脉内或肿瘤内施用或其组合。

18.根据权利要求15所述使用的组合物，或者根据权利要求16所述的用途，或者根据权利要求17所述的用于治疗癌症的方法，其中将所述治疗与全身或局部施用选自以下的药物组合：免疫调节化合物，血管生成抑制剂，化学治疗剂或c-Myc下调，优选地其中所述药物是选自以下的免疫调节化合物：BET抑制剂，免疫刺激性细胞因子，Toll样受体的天然、内源或合成配体，其他免疫刺激性受体的配体，免疫检查点的调节剂，或激动调节剂。

19.溴结构域和末端外域家族成员的抑制剂(BET抑制剂)在一种或多种肿瘤细胞中增加肿瘤特异性新抗原的表达和呈递的用途。

20.用于治疗受试者癌症的溴结构域和末端外家族成员的抑制剂(BET抑制剂)，其中所述治疗包括向受试者施用所述组合物，优选地其中所述施用包括皮内、皮下、肌内、静脉内或肿瘤内施用或其组合；并且特征在于所述受试者中的癌症包括没有或仅有低水平的肿瘤特异性新抗原的表达和呈递的肿瘤细胞。

21.溴结构域和末端外家族成员的抑制剂(BET抑制剂)在制备用于治疗受试者癌症的药物中的用途，其中所述治疗包括向受试者施用所述组合物，优选地其中所述施用包括皮内、皮下、肌内、静脉内或肿瘤内施用或其组合；并且特征在于所述受试者中的癌症包括没有或仅有低水平的肿瘤特异性新抗原的表达和呈递的肿瘤细胞。

22.一种用于治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括以下步骤：向受试者施用溴结构域和末端外结构域家族成员的抑制剂(BET抑制剂)，其特征在于所述受试者中的癌症包括没有或有低水平的肿瘤特异性新抗原的表达和呈递的肿瘤细胞。

23.用于治疗受试者癌症的溴结构域和末端外家族成员的抑制剂(BET抑制剂)，其中所述治疗包括向受试者施用所述组合物，优选地其中所述施用包括皮内、皮下、肌内、静脉内或肿瘤内施用或其组合；并且特征在于所述受试者中的癌症包括HLA阴性肿瘤细胞和/或PD-L1阴性肿瘤细胞。

24.溴结构域和末端外家族成员的抑制剂(BET抑制剂)在制备用于治疗受试者癌症的药物中的用途，其中所述治疗包括向受试者施用所述组合物，优选地其中所述施用包括皮内、皮下、肌内、静脉内或肿瘤内施用或其组合；并且特征在于所述受试者中的癌症包括HLA阴性肿瘤细胞和/或PD-L1阴性肿瘤细胞。

25.一种用于治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括以下步骤：向受试者施用溴结构域和末端外结构域家族成员的抑制剂(BET抑制剂)，其特征在于受试者中的癌症包括HLA阴性肿瘤细胞和/或PD-L1阴性肿瘤细胞。

26.根据权利要求20或23所述使用的抑制剂，或根据权利要求21或24所述的用途，或根据权利要求22或25所述的方法，其中施用溴结构域和末端外域家族成员的抑制剂(BET抑制剂)在所述受试者的癌症的肿瘤细胞中增加了肿瘤特异性新抗原的表达和呈递。

27.根据权利要求20、23或26所述使用的抑制剂，或根据权利要求21、24或26所述的用途，或根据权利要求22、25或26所述的方法，其中溴结构域和末端外结构域家族成员的所述抑制剂(BET抑制剂)与全身或局部施用选自以下的药物组合：免疫调节化合物，血管生成抑制剂，化学治疗剂或c-Myc下调，优选地其中所述药物是选自以下的免疫调节化合物：免疫刺激性细胞因子，Toll样受体的天然、内源或合成配体，其他免疫刺激性受体的配体，免疫检查点的调节剂，或激动调节剂。

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