CN111154676B - 鼠李糖乳杆菌胞外多糖及其制备方法和所用菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ZFM231，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019883。该菌株在葡萄糖为碳源的M RS培养基中培养，培养后的粗多糖经DEAE‑52柱层析以及Sephadex G‑100凝胶柱分离纯化后得到四种不同的胞外多糖组分EPS‑0M,EPS‑0.1M,EPS‑0.3M和EPS‑0.5M。本发明鼠李糖乳杆菌胞外多糖及其四个组分具有较强的抗氧化能力；四个组分具有显著的脂肪酶抑制活性，且有较强的降低胆固醇及甘油三酯的效果。通过构建肠道微生物体外发酵模型实验表明各组分均对肠道菌群有较好的调节作用。

Description

鼠李糖乳杆菌胞外多糖及其制备方法和所用菌

技术领域

本发明涉及微生物学中的多糖技术领域，具体涉及到一种微生物胞外多糖，尤其是涉及一种鼠李糖乳杆菌来源的胞外多糖多种组分的制备及用途。

背景技术

益生菌是可以改善宿主肠道微生态平衡、调节微生态失衡的活性微生物，胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)是多数细菌、少数酵母菌及丝状真菌在生长代谢过程中分泌到细胞外的一种不分支或带有分支结构的单糖重复单元构成的大分子水溶性化合物，是其适应环境的产物。

鼠李糖乳杆菌是由健康人体肠道中分离的最重要的益生菌之一，具有肠道粘着率高、定植能力强、能促进细胞分裂等特性。已有研究表明鼠李糖乳杆菌胞外多糖具有抗氧化、降低血清胆固醇、降血脂、改善肠道微生态平衡、增强免疫力等多种生物活性，但多为对于粗多糖的研究，对于不同多糖组分的分析尚未有明确报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖及其制备方法和所用菌。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacilusrhamnosus)菌株：为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ZFM231，保藏编号为：CCTCCNO:M 2019883。

本发明还提供了一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖，利用CCTCC NO:M 2019883的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ZFM231发酵而得。

本发明还提供了鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：

1)、将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ZFM231按照1％(体积比)的接种量接种于M RS液体培养基，于(37±0.5)℃恒温培养发酵12～48h(优选24小时)；得发酵培养液；

2)、发酵培养液经离心取上清，除去蛋白(通过三氯乙酸(TCA)法除去蛋白)，得到除蛋白质的上清液；

3)、将除蛋白质的上清液采用水提醇沉法提取多糖，得粗多糖溶液(Lactobacillus rhamnosus ZJM231粗多糖溶液)；

4)、粗多糖溶液透析(3500Da)后浓缩、冷冻干燥，得鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS。

作为本发明的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法的改进：

步骤2)中除去蛋白的方法为：在离心所得的上清(上清发酵液)中加入三氯乙酸(TCA)水溶液，使三氯乙酸终浓度为(4±0.5)g/100ml，于3～5℃静置10～14h；离心除去沉淀(变性蛋白沉淀)，得到除蛋白质的上清液；

说明：三氯乙酸(TCA)水溶液中TCA的浓度约为70～90g/100ml；

所述步骤3)的水提醇沉法为：将除蛋白质的上清液浓缩(约50℃旋蒸)至为原体积的20～30％，然后加入为浓缩液4.5～5.5体积倍的3～5℃的冷乙醇，于3～5℃静置10～14h，离心，将离心所得的沉淀干燥至乙醇挥发，加无菌水(体积用量约为浓缩液的1/5)复溶，得粗多糖溶液；

所述步骤4)为：于去离子水中，将粗多糖溶液用3500Da的透析袋透析70～74h，期间每2h换一次去离子水；透析液浓缩后冷冻干燥，得鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS。

作为本发明的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法的进一步改进：

所述步骤1)为：于37℃恒温培养发酵24h，得发酵培养液。

作为本发明的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法的进一步改进，将所得的鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS进行分离纯化，依次进行以下步骤：

①、DEAE Cellulose-52层析柱粗分：

按照300mg/5～8ml的料液比，将鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS溶于去离子水中，离心，取上清液；

将上清液上样至DEAE Cellulose-52层析柱，依次用去离子水、以及浓度分别为0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L的NaCl溶液作为洗脱剂分别进行洗脱，流速为1mL/min；

分别收集去离子水、以及浓度分别为0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L的NaCl溶液这4种洗脱剂各自对应的洗脱液，经透析(3500Da)、浓缩、冷冻干燥，分别对应得到四种初步纯化多糖(EPS-0、EPS-0.1、EPS-0.3、EPS-0.5)；

②、Sephadex G-100凝胶色谱柱纯化：

将步骤①所得四种初步纯化多糖分别进行以下操作：

按照250mg/4.8～5.2ml的料液比，将初步纯化多糖溶于去离子水中，离心，取上清液；

将上清液过0.45μm滤膜后，加样于Sephadex G-100凝胶色谱柱中，用去离子水作为洗脱剂进行洗脱，流速为0.25mL/min，获得洗脱液；

将所得洗脱液经浓缩、冷冻干燥后，获得相应纯化多糖组分(即，EPS-0M,EPS-0.1M,EPS-0.3M和EPS-0.5M)。

注：采用Sephadex G-100凝胶色谱柱，层析柱规格为60cm×Φ1.6cm，柱子的有效体积为50cm×Φ1.6cm。

本发明中的鼠李糖乳杆菌Lactobacilus rhamnosus是从新鲜牛奶中筛选获得，代号为ZFM231。通过16S rDNA序列鉴定得知该菌株属于鼠李糖乳杆菌亚种。

保藏信息如下：

保藏名称：鼠李糖乳杆菌ZFM231 Lactobacillus rhamnosusZFM231，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，CCTCC NO:M 2019883，保藏时间2019年11月1日。

本发明的菌株在葡萄糖为碳源的M RS培养基中培养24h，胞外多糖产量可达220mg/L。培养后的粗多糖经DEAE-52柱层析以及Sephadex G-100凝胶柱分离纯化后得到四种不同的胞外多糖组分EPS-0M,EPS-0.1M,EPS-0.3M和EPS-0.5M，它们的分子量分别为1.40×10⁴,1.01×10⁴,1.42×10⁴,和2.47×10⁴Da。其化学组成及单糖组成如下表1和表2所示。体外实验表明，本发明鼠李糖乳杆菌胞外多糖及其四个组分具有较强的抗氧化能力；四个组分具有显著的脂肪酶抑制活性，且有较强的降低胆固醇及甘油三酯的效果。通过构建肠道微生物体外发酵模型实验表明各组分均对肠道菌群有较好的调节作用。以上生物活性表明发明鼠李糖乳杆菌胞外多糖及其四个组分在制备抗氧化、降血脂及调节肠道菌群产品方面具有广阔的应用价值。

体外抗氧化实验表明，本发明的鼠李糖乳杆菌胞外多糖(EPS)及四个组分具有较强的抗氧化能力(还原力、DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力及金属离子螯合能力)。

体外高胆固醇细胞模型实验表明，发明的鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS及四个组分具有降低细胞内胆固醇浓度的活性。所述的细胞模型为HepG2细胞。

通过构建肠道微生物体外发酵模型实验表明，本发明的鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS及四个组分能较好地被肠道微生物降解利用，并从产气量来看，能够对肠道菌群有较好的调节作用。所述的肠道微生物体外发酵模型为人体粪便悬液。

综上，本发明提供了一种鼠李糖乳杆菌产多糖的发酵以及胞外多糖的提取方法，并对胞外多糖进行分离纯化。对各纯化组分进行化学成分分析和结构表征；并对纯化多糖的抗氧化活性，肠道菌群调节活性和降血脂等活性进行研究，为鼠李糖乳杆菌相关食品的研发提供技术支持。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是本发明中鼠李糖乳杆菌ZFM231胞外多糖在DEAE-52阴离子交换柱上的洗脱曲线；

图2是鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS不同组分的体外抗氧化特性；

图3是鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS不同组分对脂肪酶的抑制率；

图4是鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS不同组分对HepG2细胞内胆固醇(上图)及甘油三酯(下图)浓度的影响；

图5是鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS不同组分对肠道菌群体外发酵产气量的影响；

图6是鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS不同组分对短链脂肪酸的影响；

图7是鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS不同组分对肠道菌群Alpha多样性指数的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、鼠李糖乳杆菌(Lactobacilus rhamnosus)菌株的获取：

取新希望双峰乳液奶牛养殖基地(杭州)的新鲜牛奶按照以下方法进行培养：取1ml鲜牛奶加入9ml的无菌水中，按照10^－1的梯度稀释，梯度范围为10^－1～10^－6，吸取10^－2、10－³、10^－4和10^－5稀释度的稀释液1ml于平板中，均匀涂布，将制备好的平板放置在37℃培养箱中培养48h。挑选涂布平板上的单菌落，接种到MRS培养基上，培养3d左右，将有产酸迹象的单菌落接种到乳酸菌培养基，观察菌落形态、显微形态特征，研究生理生化变化，并对细菌进行分子生物学鉴定，保存。取用20％甘油保藏在-80℃的菌株划线于MRS固体培养基上，37℃静置培养；挑取单菌落于MRS液体培养基，37℃静置培养，连续传代两次。发酵产物呈乳白色，菌落周围有大量粘稠状物质连接；用无菌接种环轻轻挑取菌落，有明显拉丝。

将上述菌株进行保藏，保藏信息如下：

保藏名称：鼠李糖乳杆菌ZFM231 Lactobacillus rhamnosusZFM231，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，CCTCC NO:M 2019883，保藏时间2019年11月1日。

实施例2、鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提取

1、MRS培养基的配制：

MRS液体培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、吐温-80 1mL、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、牛肉浸膏10g，加双蒸水定容至1L，调节至pH 7.0。常规高温灭菌(1.1个大气压，121℃下灭菌15min)。

MRS固体培养基：在上述MRS液体培养基的基础上加入1.5g/100mL的琼脂；其余等同。

2、鼠李糖乳杆菌发酵液的制备：

活化菌株：将超净台紫外灭菌30min，于-80℃取出Lactobacillus rhamnosusZJM231冻存管，置于常温解冻待用。于超净台中将MRS固体培养基缓慢均匀倒入培养皿中，待其凝固将培养皿盖子合上倒置。取一次性灭菌接种环蘸取菌株冻存管液用平板划线培养法活化菌株，然后置于37℃恒温培养箱中倒置，培养24-48h。

一代液体培养：将上一步得到的培养皿取出，于超净台中用无菌接种环挑取一个长势良好的菌落于10ml的MRS液体培养基并置于37℃恒温培养箱中12～18h(优选18小时)。然后将培养皿置于4℃保存，为保持其活性，1个月转接一次。

二代液体培养：将有明显菌体沉淀的上述鼠李糖乳杆菌培养液取出，以1％(体积％)的接种量接种于M RS液体培养基进行液体发酵多糖，37℃恒温培养箱12～24h(优选24小时)；得发酵培养液。

3.鼠李糖乳杆菌的鉴定和产糖情况

Lactobacillus rhamnosus ZJM231活化菌株通过16S rDNA测序进行鉴定。菌株37℃培养箱中活化培养48h后，Lactobacillus rhamnosus ZJM231固体培养基上的发酵产物呈乳白色，菌落周围有大量粘稠状物质连接。用无菌接种环轻轻挑取菌落，有明显拉丝情况，证明该菌种产糖能力较强。

4.鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提取

TCA法除蛋白质：将上述步骤2“二代液体培养”所得的发酵培养液，于4℃条件下8000rpm离心15min，弃菌体沉淀取上清发酵液，加入80％(w/v，即，80g/100ml)的TCA水溶液，使TCA(三氯乙酸)终浓度为4％(w/v)，4℃静置隔夜(约12h)。此时，有变性蛋白沉淀产生，将其离心除去；得到除蛋白质的上清液。

水提醇沉法提多糖：将除蛋白质的上清液旋蒸(50℃的蒸发温度)浓缩至约为原体积的25％，然后加入浓缩液5倍体积的冷乙醇(4℃)，置于4℃，隔夜后10000rpm离心10min取沉淀，室温干燥至乙醇充分挥发后，加适量无菌水(体积用量约为浓缩液的1/5)复溶，得Lactobacillus rhamnosus ZJM231粗多糖溶液。

透析：将上述粗多糖溶液用3500Da的透析袋透析72h，期间每2h换一次去离子水。透析完成后将透析袋中的截留液旋蒸(50℃的蒸发温度)浓缩至为原体积的25％，冷冻(-60℃的冷冻温度)干燥24h，得鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS。

100ml的发酵培养液最终能获得22mg的鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS。

将碳源由葡萄糖分别改成“麦芽糖、蔗糖、乳糖、果糖”，即，将MRS培养基中的葡萄糖作上述相应更改，用量保持不变；其余等同于上述发酵培养和多糖提取，最终所得结果如下：

碳源为麦芽糖时，100ml的发酵培养液最终能获19.8g的鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS。

碳源为蔗糖时，100ml的发酵培养液最终能获得20.3g的鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS。

碳源为乳糖时，100ml的发酵培养液最终能获得20.8g的鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS。

碳源为果糖时，100ml的发酵培养液最终能获得19.9g的鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS。

实施例3、鼠李糖乳杆菌EPS的分离纯化及各组分成分分析

1.DEAE-52柱层析分离纯化鼠李糖乳杆菌EPS粗多糖

(1)Cellulose DEAE-52的预处理：取200g DEAE-52粉末置于800mL-1000mL去离子水中，用玻璃棒轻轻搅拌片刻，然后静置待其沉降后倾去上层漂浮的纤维素单体和杂质碎片。多次均匀搅拌，静置24h后使其充分溶胀，将去离子水倒净，并用碱-酸-碱法处理纤维素。用800mL 0.5M的NaOH溶液浸泡1h，轻轻搅拌，待其沉降后将水倒净，再用去离子水反复浸洗直至溶液pH为7，防止后续酸洗放热对填料产生影响。再分别改用800mL 0.5M的HCl溶液和800mL 0.5M的NaOH溶液重复上述操作直至pH为中性，最后超声波清洗器中脱气30min备用。

(2)装柱与平衡：取规格为60cm×Φ2.6cm(有效长度约为50cm)的层析柱垂直固定好在铁架台上，在柱子下端加入少量去离子水除去柱中空气。关闭柱子下端出水口，柱内保留少量去离子水，将活化好的纤维素填料用玻璃棒紧靠柱壁引流，缓慢连续倒入柱子中，防止过程中带入气泡。沉降过程中确保填料液面始终没于水面以下，待填料自然沉降至液面不再变化时，打开蠕动泵以3倍的洗脱流速冲压柱床，去离子水平衡24h备用。

(3)上样与洗脱：取300mg EPS用7mL去离子水溶解，配成合适浓度的多糖溶液，转速8000r/min，离心10min，取上清液。上样体积7mL，符合有效柱床体积的1％～5％。用滴管将柱床上方多余的水吸去，再将多糖溶液缓慢滴加在填料表面，待其自然沉降至填料里。依次用去离子水、0.1M、0.3M、0.5M和0.7M的NaCl溶液为洗脱剂进行梯度洗脱(洗脱流速为1mL/min，每管10mL)。绘制多糖的洗脱曲线，其中横坐标为管数，纵坐标为490nm吸光度值，最后分别合并各多糖组分。

可以每管收集液的吸光度值(OD₄₉₀)作为该种洗脱剂洗脱完毕的依据，每种洗脱剂体积用量分别约为500ml。

将第1管～50管进行合并，放入3500Da的透析袋，于去离子水中透析48h，60℃旋蒸至原体积的1/40，然后冷冻干燥(-60℃的冷冻温度干燥24小时)，得EPS-0。得率为23.75％。

将第51管～100管进行合并，放入3500Da的透析袋，于去离子水中透析48h，60℃旋蒸至原体积的1/40，然后冷冻干燥(-60℃的冷冻温度干燥24小时)，得EPS-0.1。得率为18.75％。

将第101管～150管进行合并，放入3500Da的透析袋，于去离子水中透析48h，60℃旋蒸至原体积的1/40，然后冷冻干燥(-60℃的冷冻温度干燥24小时)，得EPS-0.3。得率为17.5％。

将第151管～200管进行合并，放入3500Da的透析袋，于去离子水中透析48h，60℃旋蒸至原体积的1/40，然后冷冻干燥(-60℃的冷冻温度干燥24小时)，得EPS-0.5。得率为25％。

得率(％)＝(各组分质量/多糖总量)×100。结果见图1。

由图1可知，洗脱曲线峰形尖细、峰宽较窄，说明洗脱后分离效果较好。EPS经DEAE-52层析柱一级粗分后可以得到5个组分，由于0.7M NaCl洗脱的组分含量过少，本发明主要收集前四个组分用作后续活性研究。其中EPS-0为中性多糖，收集后浓缩并冷冻干燥；其余三种组分EPS-0.1、EPS-0.3、EPS-0.5为酸性多糖。分离后的回收率为85％，可见分离对EPS的损失较小。比较四个组分的占比情况，其中EPS-0.5最多，EPS-0其次，EPS-0.3和EPS-0.5基本持平。

2.Sephadex G-100凝胶柱纯化

(1)Sephadex G-100的预处理：称取10g Sephadex G-100凝胶粉末于200mL蒸馏水中，室温下浸泡48h。期间用玻璃棒轻轻搅拌，多次换去离子水使其充分溶胀，然后将上层细小颗粒倒去。

(2)Sephadex G-100装柱与平衡：取规格为60cm×Φ1.6cm的层析柱垂直固定好在铁架台上，在柱子下端加入少量去离子水除去柱中空气。关闭柱子下端出水口，柱内保留少量去离子水，将活化好的G-100填料用玻璃棒紧靠柱壁引流，缓慢连续倒入柱子中，尽可能一次倒净，防止产生气泡和出现分层。沉降过程中确保填料液面始终没于水面以下，待填料自然沉降至液面不再变化时，打开蠕动泵用去离子水以1.2倍的洗脱流速冲压柱床，平衡流速不可过大，防止柱子底部被压实影响出水，平衡24h备用。

(3)上样和洗脱：

经上述DEAE分离出的EPS各组分(初步纯化多糖EPS-0、EPS-0.1、EPS-0.3、EPS-0.5)各取250mg分别进行如下操作：

用5mL去离子水溶解，配成合适浓度的溶液，转速8000r/min，离心10min，取上清液并用0.45μm的水膜过滤。用滴管将柱床上方多余的水吸去，再将过滤后的多糖溶液缓慢滴加在填料表面，待其自然沉降至填料里。然后用去离子水进行洗脱(洗脱流速为0.25mL/min，去离子水体积用量为1L)，每管5mL。绘制多糖的洗脱曲线，将洗脱液合并后，浓缩(60℃旋蒸至原体积的1/40)、冷冻干燥(-60℃冻干24小时)后，计算相应组分的回收率。

回收率(％)＝(该组分回收质量/该组分上样量)×100

得到EPS-0M,EPS-0.1M,EPS-0.3M和EPS-0.5M的回收率分别为88％、90％、89％和88％。

实施例4、多糖化学组成分析

1.总糖含量的测定

鼠李糖乳杆菌ZJM231胞外多糖及各纯化组分的总糖含量采用苯酚-硫酸法测定(Dubois,M.,Gilles,K.A.,Hamilton,J.K.,Rebers,P.A.,&Smith,F.Colorimetric methodfor determination of sugars and related substances.Analytical Chemistry 1956,28,350–356.)。

2.蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝法测定(Bradford,M.M.A rapid and sensitive method forthe quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principleof protein-dye binding.Analytical Biochemistry 1976,72,248–254.)。

3.硫酸根含量的测定

硫酸根含量按文献采用浊度法测定(Kawai,Y.,Seno,N.,&Anno,K.A modifiedmethod for chondrosulfatase assay.Analytical Biochemistry 1969,32,314–321.)。

4.糖醛酸含量的测定

糖醛酸含量采用硫酸-咔唑法，以葡萄糖作为标准测定(Bitter,T.,&Muir,H.M.Amodified uronic acid carbazole reaction.Analytical Biochemistry 1962,4,330–334.)。

5.单糖组成的测定

单糖组成采用GC-MS法测定(Shi,M.J.,Wei,X.Y.,Xu,J.,Chen,B.J.,Zhao,D.Y.,Cui,S.,Zhou,T.Carboxymethylated Degraded Polysaccharides from Enteromorphaprolifera:Preparation and in Vitro Antioxidant Activity.Food Chemistry 2017,215,76–83.)。

各纯化组分的总糖、蛋白质、硫酸根、糖醛酸含量及各组分单糖组成结果如表1和表2所示。

表1、各纯化组分化学组成

表2、各组分的单糖组成含量

实施例5、鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS各组分分子量测定

配制1mg/mL的标准品溶液：称取2mg分子量为6.1×10³、9.6×10³、2.1×10⁴、4.7×10⁴、1.07×10⁵、1.94×10⁵、3.37×10⁵、6.42×10⁵Da的普兰多糖标准品，用20mM硫酸钠溶液溶解，0.22μm过滤。以普兰多糖标准品在HPGPC中的保留时间为横坐标，标准品分子量的对数值为纵坐标绘制普兰多糖标准曲线。

用硫酸钠溶液配制1mg/mL的鼠李糖乳杆菌胞外多糖溶液，过滤后进行HPGPC分析，将多糖样品对应的出峰时间代入标准曲线计算EPS的分子量。各组分的出峰时间分别为：17.602、17.898、17.587、17.084分钟，代入普兰多糖标准曲线回归方程：y＝-0.4785X+12.568中，得知EPS-0M,EPS-0.1M,EPS-0.3M和EPS-0.5M的分子量分别为1.40×10⁴,1.01×10⁴,1.42×10⁴,和2.47×10⁴Da。

实验、多糖及各组分的药效试验及结果：

一、体外抗氧化实验

1.铁还原能力测定：利用铁氰化钾法对EPS及各纯化组分进行还原力测定。铁还原力的测定常用于样品总抗氧化能力的评价，还原力越强，抗氧化活性越强。在样品的抗氧化作用下，铁氰化钾([K3Fe(CN)6])被还原成亚铁氰化钾([K4Fe(CN)6])，溶液呈黄色。亚铁氰化钾再与氯化铁中的Fe3+进一步反应，生成亚铁氰化铁，溶液由黄色变为不同程度的蓝绿色，且在700nm处具有强吸收峰，还原力大小与吸光度值大小成正相关，吸光度值越大，生成的Fe²⁺越多，样品的还原力越好。结果见图2。

2.DPPH清除能力测定：在避光条件下，分别取1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL的EPS及纯化后的四种多糖溶液各2mL于试管中，加入0.1mM DPPH-乙醇溶液2mL，充分摇匀后37℃水浴反应30min，在517nm处测定吸光度值记为A1组。将A1组各管中DPPH溶液换成2mL乙醇，再加入2mL多糖样品溶液测定吸光度值记为A2。以2mL DPPH溶液和2mL水的吸光度值记为A0。以Vc作为阳性对照，517nm处测定吸光度值，每个实验平行三次。结果见图2。

3.羟基自由基清除能力测定：采用水杨酸法，取不同浓度的EPS及纯化组分多糖溶液0.5mL，加入0.5mL 9mM FeSO4溶液和0.5mL 9mM水杨酸-乙醇溶液，摇匀后加入0.5mL9mMH2O2溶液，37℃水浴反应30min，在510nm处测定吸光度值记为A1组。将A1组中水杨酸-乙醇溶液换成乙醇，其余不变，测定值记为A2组。将A1中样品换成水的测定值记为A0。以Vc作为阳性对照，510nm处测定吸光度值，每个实验平行三次。结果见图2。

4.超氧阴离子自由基清除能力测定：取不同浓度的样品各0.2mL，加入1mL Tris-HCl缓冲液，25℃水浴20min，然后加1mL 7mM邻苯三酚溶液，反应5min，加0.2mL 10M盐酸终止反应，420nm处测吸光度值为A1。将邻苯三酚溶液换成水，测定值记为A2。将样品换成水测定值记为A0。以Vc作为阳性对照，420nm处测定吸光度值，每个实验平行三次。结果见图2。

5.金属离子螯合能力测定：取不同浓度的多糖样品各1mL，加入0.1mL 2mM FeCl2溶液、0.2mL 5mM的菲洛嗪溶液和3.7mL的蒸馏水，30℃水浴10min，562nm处测定吸光度值为A1。将菲洛嗪溶液换成水，测定值记为A2。将样品溶液换成水，将测定值记为A0。以EDTA(乙二胺四乙酸)作为阳性对照，562nm处测定吸光度值，每个实验平行三次。结果见图2。

由图2可以看出，各组分均显示出较强的抗氧化能力，且EPS及各组分的抗氧化能力呈现明显的浓度依赖性。多糖组分在浓度为5mg/mL时，对DPPH最大清除率为86％，且与其他组分相比，EPS-0.5M组分的羟基自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力和金属离子螯合能力更强。

二、胞外多糖抑制脂肪酶活性分析：

用酚酞指示剂滴定法测定鼠李糖乳杆菌EPS各纯化组分对脂肪酶活性的抑制率。脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，水解所释放的脂肪酸可以用标准碱NaOH溶液进行中和滴定，用酚酞指示液指示反应终点，根据消耗的碱量，计算样品的酶活力。结果见图3。

由图3可以看出，鼠李糖乳杆菌胞外多糖分离纯化后的各组分对脂肪酶有明显的抑制作用，5mg/mL的各纯化多糖组分对脂肪酶的抑制率分别为20.93％、25.37％、34.67％和35.94％。表明这些多糖可通过对脂肪酶的抑制起到降血脂作用。

三、HepG2细胞实验

1.EPS对HepG2细胞内胆固醇浓度的影响

(1)细胞胆固醇造模浓度

将传代好的细胞胰酶消化、悬浮、计数，按照终浓度为2×104个/mL接种于96孔板中，每孔200μL。37℃培养24h，当细胞贴壁达60％-70％且细胞单层贴满孔板底部时，吸去培养基。更换含浓度为20μg/mL胆固醇溶液的无血清培养基，37℃作用24h后，根据试剂盒测定细胞内胆固醇浓度。

(2)不同多糖组分降胆固醇的治疗效果

实验分组：对照组(造模前的正常细胞)、空白组(模型细胞无血清DMEM)、阳性对照组(1μg/mL Sim溶液)、模型细胞无药物治疗组(0μg/mL)、纯化组分(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL)。将上述高胆固醇模型细胞中的上清液吸去，换成加有不同浓度治疗药物的无血清培养基，每个样品每个浓度各5个复孔。作用24h，根据试剂盒测定细胞内胆固醇浓度。

(3)细胞内总胆固醇含量的测定

培养结束，弃去培养基；PBS清洗3遍，弃上清；加100μL、0.25％胰酶消化2-3min；加100μL完全培养基终止消化，悬浮细胞。将各孔所有悬浮液转入1.5mL离心管中，多次轻轻吹打孔板底部，尽可能全部吹打下来。1500r/min，离心5min。弃上清，加1mL PBS清洗，1500r/min，离心5min。加500μL PBS悬浮细胞，超声裂解，300w，然后按照试剂盒测定细胞内胆固醇浓度。结果见图4。

2.EPS对HepG2细胞内甘油三酯浓度的影响

(1)细胞甘油三酯造模浓度

将传代好的处于生长对数期的细胞胰酶消化、悬浮、计数，按照终浓度为2×104个/mL接种于96孔板中，每孔200μL。37℃培养24h，当细胞汇合度达60％-70％且细胞单层贴满孔板底部时，吸去培养基。更换含浓度为50％的无血清培养基，37℃作用24h。

(2)不同多糖组分降甘油三酯的治疗效果

实验分组：对照组(造模前的正常细胞)、空白组(模型细胞无血清DMEM)、阳性对照组(1μg/mL Sim溶液)、模型细胞无药物治疗组(0μg/mL)、纯化组分(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL)。换加有不同浓度治疗药物的无血清培养基治疗上述HTG模型细胞，每个样品每个浓度各5个复孔，作用24h。

(3)细胞内TG含量按照试剂盒测定。结果见图4。

由图4可以看出，低浓度(100μg/mL)的各纯化组分的EPS就表现出一定的降低胆固醇浓度的效果，且效果随着EPS浓度的增大而逐渐提高，经400μg/mL多糖干预后胆固醇水平显著降低。各组间差距较明显，中性多糖EPS-0M效果最弱，EPS-0.5M效果最好。24h后无药物治疗的细胞内甘油三酯浓度几乎不变，低浓度(100μg/mL)的EPS纯化组分表现出较低的降甘油三酯的效果，随着EPS浓度增大，降低TG水平的效果增强。

四、人体肠道菌群实验

1.人体粪便悬液的批量发酵

(1)YCFA培养基的配制：胰蛋白胨3g、酵母提取物0.25g、L-半胱氨酸0.1g、血红素溶液(5mg/mL的氢氧化钠溶液)200μL、氯化钠0.09g、六水氯化钙0.009g、磷酸二氢钾0.045g、磷酸氢二钾0.045g、七水硫酸镁0.009g、维生素I溶液20μL。准确称取适量葡萄糖和EPS，将其作为唯一的碳源分别加入YCFA培养基中，使其终浓度为8.0g/L。

(2)5mg/mL血红素溶液的配制：配制1mol/mL的NaOH溶液；精确称取5mg血红素，用1mol/mL的NaOH溶液溶解，定容至1mL。40mL维生素溶液的配制：生物素(VH)0.002g、钴胺素(VB12)0.002g、对氨基苯甲酸0.006g、叶酸0.01g、吡哆胺(VB6)0.03g。

(3)YCFA培养基加葡萄糖：用量筒量取100mL配制好的YCFA培养基，加入葡萄糖800mg使其终浓度为8g/L，充分溶解后分装到小密封玻璃瓶中，各瓶5mL，121℃，20min高压灭菌，冷却至80℃时放入厌氧工作站中。

(4)YCFA培养基加EPS纯化组分：用量筒量取100mL配制好的YCFA培养基量取4份，四份100mL培养基中每份分别加入EPS-0、EPS-0.1M、EPS-0.3M、EPS-0.5M 800mg使其终浓度为8g/L，充分溶解后分装到小密封玻璃瓶中，各瓶5mL，121℃，20min高压灭菌，冷却至80℃时放入厌氧工作站中。

2.粪便样品采集

粪便样品由12名志愿者提供，其中7名男性、5名女性，年龄介于20岁至60岁。这些志愿者身体素质较好，无慢性疾病，在采样前至少三个月未服用益生元、抗生素或其他药物。本章研究由浙江省农业科学院批准。

3.粪便样品的处理及粪便悬液发酵

称取12名志愿者的粪便样品，每个样品各5g溶于50mL PBS(高压灭菌、0.1M、pH为7)中，配成10％(W/V)的粪便匀浆悬液。待其溶解后，用过滤网过滤粪菌悬液，分装上清液于15mL离心管中并放入厌氧工作站中备用。

将过滤所得的样品上清液放入厌氧工作站中，迅速将12组粪便溶液分别接入含葡萄糖(Glc)的YCFA培养基、含EPS-0M的YCFA培养基、加EPS-0.1M的YCFA培养基、加EPS-0.3M的YCFA培养基、加EPS-0.5M的YCFA培养基中，每5mL培养基中接种500μL(10％)的粪菌悬液。剩余粪便悬液分装于1.5mL无菌离心管中，-80℃保存备用。

在发酵24h后，于无菌超净台中使用注射器分别从各管中吸取0.5mL发酵液于1.5mL离心管中，-80℃冻存用于保样。再各取1.5mL于无菌离心管中，10000r/min，离心5min，分离沉淀和上清液。沉淀为粪便与菌体，用于DNA测序，于-80℃冻存；上清液中取500μL用于短链脂肪酸含量测定，于-30℃保存；其余上清液用离心管分装，用于TLC分析，于-30℃保存。

4.胞外多糖对产气量影响的测定

通过气压的测量可知胞外多糖对不同肠道菌群的产气作用。在接种完粪便悬液后，测量各瓶内气压值并记录为0小时的气压。发酵24h后，不要放出气体，及时测量此时的瓶内气压并记录为24小时的气压。结果见5。

根据图5，可得知：通过发酵24h后，产气量在不同碳源的组间及组内差距较小。Glc、EPS-0M、EPS-0.1M、EPS-0.3M和EPS-0.5M组的产气量分别为21.2％、23.7％、17.4％、17.3％、26.1％。EPS-0.1M组和EPS-0.3M组的产气量低于Glc组，EPS-0.5M组最高，都属于正常范围。这也说明胞外多糖对肠道菌群在产气量上有良好的调节作用。

5.胞外多糖的降解率的测定

使用薄层层析法(TLC)对不同培养基中多糖的降解情况进行分析。

(1)点样：准备10cm×5cm TLC铝板，离板底1cm进行点样。左右空出5mm，每个样品间隔5mm，各点2个点。吸取于-30℃保存的发酵上清液2μL于铝板上，确保各样本点保持在同一水平，热风吹干。

(2)展开：样品靠下侧放置在展开剂中，使展开剂从板底向板顶浸润展开。8min后，展开剂将TLC板全部浸润，用镊子小心取出热风吹干所有液体。

(3)显色：将吹干后的TLC板放入染色剂中充分浸润5s，迅速取出后热风吹干直至完全显色。

(4)扫描：通过扫描仪将多糖的降解情况转成图像，然后通过扫描分析TLC图谱，对每个多糖样品中的多糖残留量和降解率定量计算。

6.气相色谱检测短链脂肪酸

以巴豆酸为溶剂对发酵液进行酸处理，采用气相色谱法以色谱级短链脂肪酸标准品在气相色谱柱的保留时间为参照，分析鼠李糖乳杆菌各纯化多糖组分作用于肠道微生物后短链脂肪酸含量的影响。结果见图6。

(1)发酵液前处理

取-30℃保存的发酵液上清液，每个样品发酵液各500μL，加入100μL巴豆酸充分混合均匀后，-30℃隔夜保存。第二天上样时提前取出巴豆酸-发酵液的混合溶液，待其融化后，13000rpm，4℃，离心10min，然后于超净台无菌环境下将上清液用1mL注射器吸取并用0.22μm水膜过滤，将滤液收集于无菌1.5mL离心管中。再分别从各管中吸取80μL滤液于气相样品瓶中，盖紧盖子后轻轻在桌面敲打以除去气泡，放置在气相仪槽中待测。

(2)气相色谱检测短链脂肪酸浓度

GC条件参数：使用DB-FFAP型气相色谱柱(0.32mm×30m×0.5um)和H₂火焰离子化检测器，将巴豆酸作为内标物。气相色谱的进样口参数为：进样量1μL、温度250℃、载气类型是N₂、吹扫流量3.0ml/L、压力54.2kPa、分流比为8：1。线速的控制模式：线速度28.1cm/s、总流量16.1mL/min、色谱柱流量1.46mL/min。

由图6可以看出，发酵24h后，碳源被肠道菌群分解利用，四种多糖组样品中总的SCFAs浓度为18～40mmol/L，其中EPS-0.5M组最高，各组均高于对照组Glc组的15mmol/L。乙酸和丙酸的含量在总SCFAs占比最大。各组在乙酸浓度上差别不大，EPS组含量均高于Glc组，且组内差距较小，数据较平稳，也充分说明年龄、性别等个体差异对SCFAs含量无直接关系。丙酸含量在组间差距不大，EPS组优于Glc组，EPS-0M及EPS-0.5M中含量最高。值得注意的是，EPS-0.1M组和EPS-0.5M组的丁酸浓度远高于EPS-0M组、EPS-0.3M组和Glc组。

7.胞外多糖对肠道菌群结构的影响

取-80℃冻存的粪便及菌体沉淀，用混菌指示盒对粪便发酵样本沉淀提取基因组DNA。本章实验中所有样品的16S rDNA测序由上海美吉生物科技有限公司负责。16S rDNA测序采用Illumina系统，扩增引物为338F_806R，F端序列ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，R端序列GGACTACHVGGGTWTCTAAT，最低单样本数据量30000。结果见图7。

由图7可以看出，Coverage指数说明此次测序中各组样本中序列被测出的概率较高，可以代表样本中微生物的真实情况。Sobs、Chao、Ace指数均显示肠道菌群中各样本的Alpha多样性的丰富度较高，各组之间相似。其中以EPS-0.5M为碳源的Shannon指数最大，说明此类样本中的群落多样性最高。Simpson指数的趋势与Shannon指数呈负相关，以EPS-0.5M为碳源的Simpson指数最小，其次是EPS-0M，充分说明这两组中各样本中的群落多样性最高。

根据上述结果，可得知：中性多糖EPS-0、酸性多糖EPS-0.1、EPS-0.3、EPS-0.5中EPS-0.5的体外抗氧化能力、脂肪酶抑制率、胆固醇甘油三酯降解率及对肠道菌群影响均高于其他组分，活性相对更好。

对比例、目前现有的鼠李糖乳杆菌(如下表3所述)，按照本发明的上述方法进行实验，其抗氧化活性与本发明的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ZFM231结果的对比如下表3所述。

表3

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江工商大学

<120> 鼠李糖乳杆菌胞外多糖及其制备方法和所用菌

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actcctacgg gaggcagcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggactachvg ggtwtctaat 20

Claims (5)

1.鼠李糖乳杆菌(Lactobacilus rhamnosus)菌株，其特征是：为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ZFM231，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019883。

2.鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征是包括以下步骤：

1)、将保藏编号为CCTCC NO:M 2019883的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ZFM231按照1％体积比的接种量接种于M RS液体培养基，于(37±0.5)℃恒温培养发酵12～48h；得发酵培养液；

2)、发酵培养液经离心取上清，除去蛋白，得到除蛋白质的上清液；

3)、将除蛋白质的上清液采用水提醇沉法提取多糖，得粗多糖溶液；

4)、粗多糖溶液透析后浓缩、冷冻干燥，得鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS。

3.根据权利要求2所述的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征是：

所述步骤2)中除去蛋白的方法为：在离心所得的上清中加入三氯乙酸水溶液，使三氯乙酸终浓度为(4±0.5)g/100ml，于3～5℃静置10～14h；离心除去沉淀，得到除蛋白质的上清液；

所述步骤3)的水提醇沉法为：将除蛋白质的上清液浓缩至为原体积的20～30％，然后加入为浓缩液4.5～5.5体积倍的3～5℃的冷乙醇，于3～5℃静置10～14h，离心，将离心所得的沉淀干燥至乙醇挥发，加无菌水复溶，得粗多糖溶液；

所述步骤4)为：于去离子水中，将粗多糖溶液用3500Da的透析袋透析70～74h，期间每2h换一次去离子水；透析液浓缩后冷冻干燥，得鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS。

4.根据权利要求3所述的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征是：

所述步骤1)为：于37℃恒温培养发酵24h，得发酵培养液。

5.根据权利要求2～4任一所述的鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征是：将所得的鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS进行分离纯化，依次进行以下步骤：

①、DEAE Cellulose-52层析柱粗分：

按照300mg/5～8ml的料液比，将鼠李糖乳杆菌胞外多糖EPS溶于去离子水中，离心，取上清液；

将上清液上样至DEAE Cellulose-52层析柱，依次用去离子水、以及浓度分别为0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L的NaCl溶液作为洗脱剂分别进行洗脱，流速为1mL/min；

分别收集去离子水、以及浓度分别为0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L的NaCl溶液这4种洗脱剂各自对应的洗脱液，经透析、浓缩、冷冻干燥，分别对应得到四种初步纯化多糖，所述四种初步纯化多糖分别为EPS-0、EPS-0.1、EPS-0.3、EPS-0.5；

②、Sephadex G-100凝胶色谱柱纯化：

将步骤①所得四种初步纯化多糖分别进行以下操作：

按照250mg/4.8～5.2ml的料液比，将初步纯化多糖溶于去离子水中，离心，取上清液；

将上清液过0.45μm滤膜后，加样于Sephadex G-100凝胶色谱柱中，用去离子水作为洗脱剂进行洗脱，流速为0.25mL/min，获得洗脱液；

将所得洗脱液经浓缩、冷冻干燥后，获得相应纯化多糖组分，所述纯化多糖组分分别为EPS-0M,EPS-0.1M,EPS-0.3M和EPS-0.5M。

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