CN112029807A - 一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，该方法将鼠李糖乳杆菌接种于脱脂乳培养基发酵，然后经沸水浴离心除菌体，三氯乙酸除蛋白，乙醇沉淀，真空冷冻干燥，制备鼠李糖乳杆菌胞外多糖。该方法胞外多糖产量为625mg/L。在不改变多糖物理和化学性质及营养成分的基础上，通过利用蒸发浓缩的方法，大大降低了三氯乙酸及乙醇的用量，并提高了除蛋白和沉淀多糖的效率。该方法获得的胞外多糖具有抗氧化活性，对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基有清除能力，对亚铁离子具有螯合能力。
Description
技术领域
本发明涉及乳酸菌胞外多糖领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法。
背景技术
乳酸菌是可以发酵碳水化合物并产生大量乳酸的微生物的总称。主要包括：乳酸杆菌属，双歧杆菌属，乳酸乳球菌属和链球菌属。由于其在食品生产中的安全使用历史悠久，所以通常被认为是安全的微生物(GRAS)。在机体内，LAB除了可以调节肠道菌群，促进肠道蠕动，保护肠道生态平衡，改善肠道功能外，还能提高机体免疫能力，抑制腐败菌滋生等。胞外多糖是乳酸菌在其生长和代谢过程中产生和分泌的水溶性长链多糖，分子量介于4.0×104～6.0×106u之间。乳酸菌产生的胞外多糖具有多种潜在的生物活性，包括抗氧化、抗炎、调节肠道菌群、抗肿瘤、免疫调节和抗菌等。
在正常情况下，体内活性氧物质是有氧代谢的副产物，其中包括羟基自由基，超氧阴离子和过氧化氢等，活性氧物质的产生和消除维持着氧化-抗氧化平衡，并在调节信号通路的传导和细胞增殖中起着重要作用。当平衡被破坏时，活性氧物质水平升高，导致自由基的产生，这些自由基可能对蛋白质、脂质和DNA造成有害影响,致使机体产生氧化应激反应，引起细胞氧化损伤并发展为多系统疾病。虽然人工合成的抗氧化剂能够有效减缓氧化过程，但它们也会对机体产生很多副作用，因此，天然物质中的安全抗氧化剂越来越多受到重视。胞外多糖具有高抗氧化活性和低细胞毒性，因此受到了研究人员的广泛关注。现有的鼠李糖乳杆菌培养发酵胞外多糖的方法产量低，无法达到胞外多糖在生产中的应用。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，解决现有的鼠李糖乳杆菌培养发酵胞外多糖的方法产量低的问题，该方法胞外多糖产量为625mg/L。
1、本发明所述的胞外多糖制备方法，具体操作按以下步骤进行：一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、将鼠李糖乳杆菌接种于含葡萄糖的脱脂乳液体培养基中，在恒温培养箱静置发酵；
(2)、将发酵好的培养基进行沸水浴，使其中菌体和酶失活，蛋白质变性，取出冷却至室温，低温离心取上清液；
(3)、对上清液蒸发浓缩至原体积的1/3，得到第一次浓缩液，然后加入质量浓度80％的三氯乙酸到第一次浓缩液中，三氯乙酸最终质量浓度为4％，静置使蛋白质充分沉淀，低温离心取上清液；
(4)、对上清液蒸发浓缩至原体积的1/3，得到第二次浓缩液，然后加入预冷的质量浓度95％乙醇，乙醇与第二次浓缩液体积比3:1，静置使多糖充分沉淀，然后低温离心弃上清液取沉淀；
(5)、将沉淀转移至透析袋在4℃环境中用去离子水透析3天，每隔12小时换一次水；
(6)、将透析好的胞外多糖进行真空冷冻干燥，最终得到白色絮状物即为粗多糖。
本发明还具有如下特征：
1、鼠李糖乳杆菌的接种量为3％。
2、步骤(1)中，脱脂乳液体培养基每升含有：脱脂奶粉100g和葡萄糖10g。
3、步骤(1)中，静置发酵为在37℃、36小时静置发酵。
4、步骤(2)和(3)中，低温离心条件为：4℃，10000×g离心15分钟。
5、步骤(3)和(4)中，蒸发浓缩条件为：60～65℃，减压浓缩。
6、步骤(3)和(4)中，4℃静置12小时。
7、步骤(4)中，所述低温离心条件为：4℃，10000×g离心20分钟。
8、步骤(5)中，透析袋使用前于沸水中煮10分钟，规格为8000–14000Da。
9、步骤(5)中，在4℃环境中用去离子水透析3天，每隔12小时换一次水。
本发明的优点及有益效果：本发明所述的胞外多糖的制备方法，以葡萄糖为碳源，用脱脂乳培养基对鼠李糖乳杆菌进行发酵，提高了胞外多糖产量，该方法胞外多糖产量为625mg/L。在不改变多糖物理和化学性质及营养成分的基础上，通过利用蒸发浓缩的方法，大大降低了三氯乙酸及乙醇的用量，并提高了除蛋白和沉淀多糖的效率。通过验证，该方法获得的胞外多糖具有抗氧化活性，对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基有清除能力，对亚铁离子具有螯合能力，为胞外多糖在工业生产中的应用提供参考。
附图说明
图1为鼠李糖乳杆菌胞外多糖对DPPH自由基的清除能力；
图2为鼠李糖乳杆菌胞外多糖对羟基自由基的清除能力；
图3为鼠李糖乳杆菌胞外多糖对超氧阴离子自由基的清除能力；
图4为鼠李糖乳杆菌胞外多糖对亚铁离子的螯合能力。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到
实施例1：鼠李糖乳杆菌发酵培养
1.鼠李糖乳杆菌活化
将发明所需的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus ATCC53103)从-80℃保藏的甘油管中划线至MRS平板活化，置于37℃恒温培养箱中培养24h后，用接种环挑取单菌落至5mL MRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱培养12h后，转接至100mL MRS液体培养基，置于37℃恒温培养箱培养12h，备用。
2.脱脂乳培养基配制
脱脂奶粉200g，葡萄糖20g，去离子水2000mL，115℃高压灭菌15min，冷却后置于常温备用。
3.鼠李糖乳杆菌发酵培养
将MRS液体培养基中活化好的鼠李糖乳杆菌以3％(v/v)的接种量接种至2L脱脂乳培养基中，置于37℃恒温培养箱中静置培养36h。
实施例2：鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提取
1.将发酵好的脱脂乳培养基放于沸水浴中10min，使其中菌体和酶失活，蛋白质变性。然后取出冷却至室温，4℃10000×g离心15min，取上清。
2.对上清液进行蒸发浓缩60～65℃至原体积的1/3，加入质量分数为80％的三氯乙酸至终浓度为质量分数4％，放于4℃冰箱中静置12h，4℃10000×g离心15min，取上清。
3.对上清液进行蒸发浓缩60～65℃至原体积的1/3，加入预冷的95％乙醇于浓缩的上清液中，充分振荡至有部分絮状物析出，放于4℃冰箱中静置12h。待多糖呈絮状物充分析出后，4℃10000×g离心20min收集多糖沉淀。
4.将收集到的多糖转移至透析袋(8000–14000Da)中，放4℃冰箱用去离子水透析3d，每隔12小时换一次水。透析完成后对多糖进行真空冷冻干燥，最终获得干燥的白色絮状蓬松的粗多糖。
实施例3：鼠李糖乳杆菌胞外多糖抗氧化活性测定
1.对DPPH自由基的清除能力
将1.0mL胞外多糖溶液(0.25-3.0mg/mL)与2.0mL的0.2mM新制备的DPPH乙醇溶液混合，剧烈振荡混匀后在室温下避光孵育1h。然后，在517nm处测量混合物的吸光度值A1，用抗坏血酸作阳性对照。通过下列公式计算DPPH自由基清除能力：
清除能力(％)＝[1-(A1-Ai)/A0]×100
其中Ai是与醇混合的样品的吸光度值，A0是不含样品的混合溶液的吸光度值。
2.对羟基自由基的清除能力；
将1.0mL胞外多糖样品溶液(0.25-3.0mg/mL)，1.0mL亮绿溶液(0.435mM)，2.0mLFeSO4(0.5mM)和1.5mL H2O2(3.0％，w/v)加入试管中混合均匀。将试管在37℃下孵育30min。然后，在624nm处测量吸光度值A1，用抗坏血酸作阳性对照。通过下列公式计算羟基自由基清除能力：
清除率(％)＝[(A0–A1)/(A0-A)]×100
其中A0是等体积去离子水替代样品的混合溶液的吸光度值，A是等体积去离子水替代样品和H2O2的混合溶液的吸光度值。
3.对超氧阴离子自由基的清除能力；
将胞外多糖溶液(0.25-3.0mg/mL)，20μM的PMS，156μM的NaDH和52μM的NBT各1.0mL混合均匀，将混合物在室温下孵育10min。然后，在560nm处测量混合物的吸光度值A1，用抗坏血酸作阳性对照。通过下列公式计算超氧阴离子自由基清除能力：
清除率(％)＝(A0–A1)/A0×100
其中A0是不含样品的混合溶液的吸光度值。
4.对亚铁离子的螯合能力。
将2.75mL去离子水，1mL胞外多糖溶液(0.25-3.0mg/mL)，0.2mL菲洛嗪溶液(5mM)和0.05mL FeCl2溶液(4mM)混合均匀，剧烈振荡，并在室温下孵育10min。然后，在562nm处测量混合物的吸光度值A1，用乙二胺四乙酸作阳性对照。通过下列公式计算亚铁离子的螯合能力。
螯合能力(％)＝[A0-(A1-Ai)/A0]×100
其中A0是不含样品的混合溶液的吸光度值，Ai是不含FeCl2的混合溶液的吸光度值。
通过本发明所述方法获得的鼠李糖乳杆菌胞外多糖体外抗氧化活性分析表明，胞外多糖具有清除DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基和螯合亚铁离子的能力，当胞外多糖浓度为3.0mg/mL时，对DPPH自由基的清除率为66.83％，对羟基自由基的清除率为83.93％,亚铁离子螯合能力高达98.62％，当胞外多糖浓度为2.0mg/mL时，超氧阴离子清除率为50.70％。
因此，该鼠李糖乳杆菌胞外多糖可以被当成一种潜在的抗氧化剂，在医药、食品及畜牧领域有广阔的应用前景，本研究可为鼠李糖乳杆菌胞外多糖在抗氧化食品、药品和饲料添加剂中的应用提供参考。
Claims (10)
1.一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、将鼠李糖乳杆菌接种于含葡萄糖的脱脂乳液体培养基中，在恒温培养箱静置发酵；
(2)、将发酵好的培养基进行沸水浴，使其中菌体和酶失活，蛋白质变性，取出冷却至室温，低温离心取上清液；
(3)、对上清液蒸发浓缩至原体积的1/3，得到第一次浓缩液，然后加入质量浓度80％的三氯乙酸到第一次浓缩液中，三氯乙酸最终质量浓度为4％，静置使蛋白质充分沉淀，低温离心取上清液；
(4)、对上清液蒸发浓缩至原体积的1/3，得到第二次浓缩液，然后加入预冷的质量浓度95％乙醇，乙醇与第二次浓缩液体积比3:1，静置使多糖充分沉淀，然后低温离心弃上清液取沉淀；
(5)、将沉淀转移至透析袋，用去离子水透析；
(6)、将透析好的胞外多糖进行真空冷冻干燥，最终得到白色絮状物即为粗多糖。
2.根据权利要求1所述的一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖的制备方法，其特征在于：鼠李糖乳杆菌的接种量为3％。
3.根据权利要求1或2所述的一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，脱脂乳液体培养基每升含有：脱脂奶粉100g和葡萄糖10g。
4.根据权利要求3所述的一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，静置发酵为在37℃、36小时静置发酵。
5.根据权利要求3所述的一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖的制备方法，其特征在于：步骤(2)和(3)中，低温离心条件为：4℃，10000×g离心15分钟。
6.根据权利要求3所述的一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖的制备方法，其特征在于：步骤(3)和(4)中，蒸发浓缩条件为：60～65℃，减压浓缩。
7.根据权利要求3所述的一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖的制备方法，其特征在于：步骤(3)和(4)中，4℃静置12小时。
8.根据权利要求3所述的一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述低温离心条件为：4℃，10000×g离心20分钟。
9.根据权利要求3所述的一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，透析袋使用前于沸水中煮10分钟，规格为8000–14000Da。
10.根据权利要求3所述的一种鼠李糖乳杆菌的胞外多糖的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，将沉淀转移至透析袋在4℃环境中用去离子水透析3天，每隔12小时换一次水。
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