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CN111122878B - 一种佐剂生物活性的检测方法 - Google Patents

一种佐剂生物活性的检测方法 Download PDF

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CN111122878B CN202010115594.6A CN202010115594A CN111122878B CN 111122878 B CN111122878 B CN 111122878B CN 202010115594 A CN202010115594 A CN 202010115594A CN 111122878 B CN111122878 B CN 111122878B
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Abstract

本发明提供了一种佐剂生物活性的检测方法。其包括以下步骤：将佐剂与共刺激物混合，得到佐剂/共刺激物混合物；将佐剂/共刺激物混合物作用于细胞模型；检测细胞模型分泌的蛋白因子量，用以表征佐剂的生物学活性。本发明提供的佐剂生物活性的检测方法及检测试剂能精确鉴别不同佐剂的生物学活性，从而简化了佐剂的评价手段，可应用于含佐剂疫苗质量的快速评价中。本发明提供的检测方法易操作、实用性强、应用面广，是佐剂质量控制和评价上的重大创新。

Description

一种佐剂生物活性的检测方法
技术领域
本发明属于佐剂检测领域，具体涉及一种佐剂生物活性的检测方法。
背景技术
佐剂是一类能够非特异性地改变或增强机体对抗原的免疫应答的物质，可活化NLRP3(Nucleotide binding oligomerization domain like receptorprotein 3，NLRP3)炎性体。NLRP3作为NOD(Nucleotide binding oligomerization domain)样受体家族的成员之一，可以通过Caspase激活和募集结构域(Caspase activation and recruitmentdomain,CARD)进行寡聚化，CARD与天冬氨酸蛋白酶1相互作用形成炎性体，并修饰促炎性蛋白因子IL-1β和IL-18的前体分子使之为成熟的IL-1β和IL-18。上述作用机理已在铝佐剂上得到证实。
在体外细胞系上的实验表明佐剂可以激活细胞内的Caspase-1及其下游蛋白因子如IL-1，IL-18，IL-33等的分泌。随着佐剂颗粒以内吞形式进入细胞内后产生活性氧，在这一过程中溶酶体膜也遭受一定的损伤。活性氧和溶酶体损伤都是NLRP3炎性体的上游激活信号从而促进该炎性小体的激活；除此之外佐剂还能够进一步诱导小范围注射部位的细胞凋亡，释放尿酸。组织间隙局部高浓度的尿酸形式尿酸盐晶体形成内源性危险信号及损伤相关分子模式(Damage-associated molecular patterns，DAMPs)间接激活NLRP3炎性体的形成。这种佐剂直接或间接地形成的NLRP3炎性小体，可以刺激炎性树突状细胞，从而促进抗原的摄取、加工和递呈，调节先天性免疫应答和获得性免疫应答，以此发挥非特异性激活活性。
因此，佐剂不但能诱发机体产生长期、高效的免疫应答，同时还能减少抗原用量、降低生产成本以及减少免疫接种次数。佐剂的质量评价是疫苗质量标准中重要的指标。目前，国家质量标准中对于佐剂的检测项目包括化学成分、理化特性、生物化学特性和纯度检测，其中的生物化学特性检测也是从物理特性如鉴别、吸附率等考察佐剂，检测过程中使用设备较多，步骤较为复杂，不利于快速得知其结果从而对含佐剂的疫苗的质量进行评估。且由于佐剂作为一种非特异性地免疫刺激剂，因此有必要深入开展佐剂的生物学活性的检测方法。
基于佐剂对抗原免疫应答的增强作用，传统方法中检测佐剂的生物活性常采用佐剂结合抗原来免疫小鼠，通过检测小鼠血清中抗体的分泌量来评价佐剂的生物活性，虽然考察结果较为直观，但时间较长，且结果不稳定，不利于对佐剂生物活性的准确、快速评价。
根据前期工作的系统性研究及科学实践，对各种哺乳动物原代细胞及细胞系系统、共刺激物、靶标检测物等进行系统筛选，能解决原代细胞、细胞系体外检测系统及靶标检测物不稳定、响应值低、批间差异大等问题。通过优化细胞系统、探索合适共刺激物浓度、响应度高的靶标检测物筛选等，能建立佐剂体外准确、快速评价方法。本发明完善了现行佐剂质量控制和评价方法与标准，并为佐剂生物活性的评价提供新的技术途径，易操作、实用性强、应用面广，是佐剂质量控制和评价上的重大创新。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的问题，提出了一种利用细胞模型评价佐剂生物活性的方法。本发明提供的检测方法及检测试剂能够精确鉴别不同佐剂的生物学活性，从而简化了佐剂的评价手段，可应用于含佐剂疫苗质量的快速评价中。
术语
共刺激物：表示能够发挥协助或者协同作用的物质。
LPS：脂多糖。
Poly I:C：聚肌苷酸-聚胞苷酸。
Lipid A：脂质A。
MPL：单磷酸脂质A。
PAM3：合成三酰脂蛋白。
R848：瑞喹莫德。
CpG：寡聚胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤。
DC细胞：树突状细胞。
一方面，本发明提供了一种佐剂生物活性的检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：
步骤1，将佐剂作用于细胞模型；
步骤2，检测步骤1中细胞模型分泌的蛋白因子量，用以表征佐剂的生物活性。
在一些实施例中，同一细胞模型实验中，分泌的同一种蛋白因子量越多，代表佐剂的生物活性越强；
进一步地，所述的步骤1中的佐剂选自氢氧化铝、硫酸铝、磷酸铝、铵明矾、钾明矾、TLRs配基、ATP和无机矿物盐中的一种或几种；
可选择地，所述的步骤1中的的佐剂可以和共刺激物混合共同作用于细胞模型。
进一步地，所述的共刺激物选自微生物提取物、化学合成分子或天然提取或者利用基因工程技术重组表达产物等；
优选地，所述微生物提取物为LPS；
优选地，所述化学合成分子选自Poly I:C、Lipid A、MPL、PAM3、R848和CpG中的一种或多种；
优选地，所述天然提取或者利用基因工程技术重组表达产物为鞭毛蛋白；
进一步地，所述共刺激物选自所述的微生物提取物、化学合成分子和天然提取或者利用基因工程技术重组表达产物中的一种或多种；
优选地，所述步骤1中佐剂/共刺激物混合物中包括0.24-240μg/mL的佐剂和0.3-300ng/mL的共刺激物；
所述佐剂/共刺激物混合物中佐剂的含量进一步优选为40-240μg/mL；更优选为60-220μg/mL；更优选为100-200μg/mL；
所述佐剂/共刺激物混合物中共刺激物的含量进一步优选为40-240ng/mL；更优选为60-220ng/mL；更优选为100-200ng/mL；
进一步地，所述步骤1中细胞模型中的细胞来源于哺乳动物；
优选地，所述哺乳动物可以是人、小鼠、兔子或狗等；
优选地，所述细胞为哺乳动物的抗原递呈细胞；
进一步地，所述抗原递呈细胞来源于人或小鼠；
优选地，所述细胞选自哺乳动物的巨噬细胞、DC细胞或单核细胞；
优选地，所述细胞可以来源于人外周血、小鼠腹腔、小鼠脾脏、小鼠淋巴结、小鼠外周血或小鼠骨髓；
优选地，所述细胞可以是人THP或人CAL-1单核细胞；
优选地，所述细胞可以是小鼠DC细胞系JAWSII；
优选地，所述细胞可以是小鼠巨噬细胞系RAW264.7；
优选地，所述细胞可以是DC细胞系DC2.4；
优选地，所述细胞可以是哺乳动物报告基因细胞系；
优选地，所述步骤1中作用的时间为0.5-72h；进一步优选为20-26h；更优选为21-25h；
进一步地，所述步骤2中蛋白因子选自细胞因子类(IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-31、IL-33、TNFα、IFNα、IFNβ、IFNγ)和趋化因子类(MCP-1/CCL2、MIP-1α/CCL3、MIP-1β/CCL4、RANTES/CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL12)中的一种或几种；
优选地，所述步骤2中生物模型分泌的蛋白因子量的检测方法为ELISA检测法；
另一方面，本发明提供了前述检测方法在含佐剂疫苗的质量评价中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明公开了一种佐剂生物活性的检测方法，相对于现有技术所述从吸附率、纯度等物理特性方面考察佐剂，本发明的方法能够更加直接、客观、快速和精确地从佐剂的生物学特性进行考察，从而简化了佐剂的评价手段，可应用于含佐剂疫苗质量的快速评价中。
(2)相对于传统方法中采用佐剂结合抗原来免疫小鼠，通过检测小鼠血清中抗体的分泌量推断出佐剂的生物活性的评价方法，本发明提供的细胞模型检测法减少了时间消耗，所呈现的结果可以用精确的数字及范围定量检测佐剂的生物学活性，从而使得不同批次结果可以纵向比较且结果更准确。
具体实施方式
以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明作出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。
下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。
本发明提供了一种检测佐剂生物活性的方法，通过检测细胞模型中蛋白因子的分泌量，可以用来评价佐剂的生物活性，即：在同样的实验条件下，同一种细胞模型分泌的同一种蛋白因子的量越多，代表作用于此种细胞模型的佐剂的生物活性越强。
以下将采用传统方法和本发明提供的方法对佐剂的生物活性的检测进行对比，对比实验的结果表明，本发明提供的检测方法能够快速、精确地对佐剂的生物活性进行检测，相对于传统的方法，优势明显。
术语：
MEM培养基：低限基本培养基。
FBS：胎牛血清。
rmGM-CSF：重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
TMB：3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
在本发明的实施例中，“Alum”代指氢氧化铝佐剂，Alum 1、Alum 2和Alum 3为不同的氢氧化铝佐剂，且Alum 1各方面的性能均优于Alum 2，Alum 2各方面的性能均优于Alum3。
Alum 1购自Invivogen，货号为VAC-ALU-250。
Alum 2购自ThermoFisher，货号为77161。
Alum 3为按照标准方法配制。
Poly I:C购自Invivogen，货号为tlrl-picw。
R848购自Invivogen，货号为tlrl-r848。
CpG购自Invivogen，货号为tlrl-1826。
实施例1采用传统方法检测铝佐剂的生物活性
(1)实验材料准备
6-8周龄雌性C57BL/c小鼠，购自北京华阜康，每组6只。实验期间使用纯净水及食物喂养，光照周期为12h。各刺激物按照每只小鼠使用卵清蛋白OVA(10μg)、铝佐剂(200μg)、LPS(100ng)的量相互配伍并在室温旋转混匀30min后，于第1天通过腹腔注射方式免疫小鼠(200μL/小鼠)，初免后14天进行加强免疫，分别于加强免疫后3h和7d采集小鼠血清备用；实验分组和具体的刺激物添加量如下表所示：
表1疫苗抗原与铝佐剂、LPS分组及添加量
Figure BDA0002391401910000061
(2)特异性抗体检测：
将小鼠血清室温静置2h后，4000rpm 4℃离心30min分离小鼠血清；利用定量ELISA法测定血清中卵清蛋白OVA特异性抗体的含量，具体检测步骤如下：
抗原包被：用ELISA包被液稀释标准品捕获抗体至0.5μg/mL；OVA抗原至2μg/mL，用稀释后的抗原包被96孔板，100μL/孔，4℃过夜；
封闭：PBST(0.05％Tween20溶于PBS)洗涤3次，每次5min，5％脱脂奶粉，100μL/孔，37℃封闭1h；
IgG标准品及血清孵育：PBST洗涤3次，每次5min，将IgG标准品用2％脱脂奶粉做2倍梯度稀释，小鼠血清用2％脱脂奶粉稀释200倍，100μL/孔，37℃孵育1h；
二抗孵育：PBST洗涤5次，每次5min，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1:4000)，100μL/孔，37℃孵育1h；其中HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自金斯瑞公司，货号为A00160。
显色：PBST洗涤5次，每次5min，加底物TMB显色，100μL/孔，37℃避光显色15min；
终止：加入2mol/L硫酸终止显色，50μL/孔；
读数：OD 450nm/620nm处测光密度值。根据标准品含量及OD值做出标准曲线，计算血清样本中的抗体含量。
结果如表2所示，当使用铝佐剂/LPS混合物结合OVA抗原免疫小鼠后，和对照组相比，OVA-Alum 1+LPS、OVA-Alum 2+LPS和OVA-Alum 3+LPS均能激活机体产生更多抗原特异性抗体，同时不同活性的铝佐剂对于促进抗体产生方面有着显著的不同。
特异性抗体产生的量越多，代表铝佐剂的生物活性越强。因此根据实验结果，3种铝佐剂生物活性的强弱关系为：Alum 1>Alum 2>Alum 3，以上实验结果符合理论范围，采用传统方法能够直观考察铝佐剂的生物活性。
但小鼠刺激培养的时间较长，且由于是活体系统，存在系统偏差较大等问题，在本实验中，OVA-Alum 1+LPS实验组的偏差为60％，OVA-Alum 2+LPS实验组的偏差为82％，OVA-Alum 2+LPS实验组的偏差为77％，各实验组的偏差都较大，不利于对铝佐剂生物活性的快速准确评价。
表2小鼠模型内抗原特异性抗体的产生量
Figure BDA0002391401910000071
实施例2采用本发明的方法检测铝佐剂的生物活性
本实施例采用小鼠DC细胞检测系统作为铝佐剂生物活性检测的生物模型，具体操作步骤如下：
(1)细胞复苏
从-196℃液氮中取出冻存的小鼠DC细胞JAWSII细胞株(来源于复旦大学医学分子病毒学教育部/卫健委重点实验室王宾教授课题组)，迅速放入37℃水浴锅中，快速解冻，用培养基(MEM培养基)洗涤2次，再用10mL MEM完全培养基(MEM培养基+20％FBS+5ng/mLrmGM-CSF)重悬，然后按1×106细胞/皿铺于10cm细胞培养皿中，培养5-7天，待细胞铺满皿底后，用0.25％胰蛋白酶消化后收集细胞传代，传1-2代后继续后续试验。
(2)细胞刺激
调整收集到的JAWSII细胞的浓度，按5×105细胞/孔铺于24孔板贴壁培养24h后，添加不同的刺激物，37℃、5％CO2条件下培养24h。刺激物为LPS(3ng/mL)、Alum(200μg/mL)、Alum+LPS混合物(3ng/mL LPS+200μg/mL Alum)，LPS、Alum为阳性对照，培养基(Medium)作为阴性对照。
(3)蛋白因子检测
培养后收集细胞上清，12000rpm 4℃离心5min去除细胞碎片及铝佐剂颗粒，利用IL-1βELISA试剂盒(购自联科生物，货号70-EK201B4/2)对细胞上清液中的IL-1β含量进行检测。
蛋白因子IL-1βELISA试剂盒检测步骤按试剂盒的说明书操作如下：将所有的试剂、样本平衡至室温。在预包被板中加入300μL 1×洗液静置浸泡30s。弃掉洗液之后，在吸水纸上将微孔板拍干。复孔加入100μL 2倍倍比稀释的标准品。空白孔复孔加入100μL标准品稀释液。样本孔加入100μL细胞培养上清样本。每孔加入50μL稀释的检测抗体，加样过程在15min内完成。使用封板膜封板。300r/min振荡，室温孵育1.5h。弃掉液体，每孔加入300μL洗液洗板，洗涤6次。每次洗板，在吸水纸上拍干。每孔加入100μL稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。使用新的封板膜封板300r/min振荡，室温孵育30min。弃掉液体，每孔加入300μL洗液洗板，洗涤6次。每次洗板，在吸水纸上拍干。每孔加入100μL显色底物TMB，避光，室温孵育5-30min。每孔加入50μL终止液。颜色由蓝色变为黄色。在30min之内，使用酶标仪检测OD 450nm/620nm处测光密度值。根据标准品含量及OD值做出标准曲线，计算样本中待测物含量。
如表3中结果所示，当使用铝佐剂/LPS混合物刺激JAWSII细胞时，Alum 1+LPS、Alum 2+LPS和Alum 3+LPS都能够刺激分泌更多的IL-1β，与单独Alum，LPS刺激相比，Alum+LPS有着典型的协同效应；同时不同的铝佐剂刺激细胞系分泌IL-1β能力有着显著的不同。
理论上和实施例1中的实验结果都表明各铝佐剂生物活性的强弱关系为：Alum 1>Alum 2>Alum 3。本实施例的结果中，各实验组刺激分泌蛋白因子IL-1β的量的关系为：Alum1+LPS>Alum 2+LPS>Alum 3+LPS，符合理论和实施例1所述的趋势，因此蛋白因子分泌的量越多，对应的佐剂的生物活性越强，本发明提供的方法可以用于描述铝佐剂生物活性的强弱。
表3细胞模型中IL-1β产生量
Figure BDA0002391401910000091
实施例3本发明检测方法准确度的验证
按照实施例2所述的检测方法连续检测3次，其中刺激物仅选择Alum+LPS混合物(3ng/mL LPS+200μg/mL Alum)的配伍，考察该方法对铝佐剂生物活性检测的适应性。可接受标准：3次检测结果之间的偏差≤5％，均满足理论范围，且符合实施例1中所述传统检测方法得到的不同铝佐剂的生物活性趋势。实验结果如表4所示，3次检测结果均在理论范围内，且符合实施例1中所述传统检测方法得到的不同铝佐剂的生物活性趋势，同时3次检测结果的偏差不超过5％，表明本发明的检测方法具有较好的准确度。
表4准确度实验中细胞模型的IL-1β产生量
Figure BDA0002391401910000101
实施例4本发明方法重复性的验证
对同批次Alum按照实施例2所述的检测方法连续检测6次，其中刺激物仅选择Alum+LPS混合物(3ng/mL LPS+200μg/mL Alum)的配伍，批次编号分别为Alum 1：Alum 1-1、Alum1-2和Alum 1-3；以及Alum 2：Alum 2-1、Alum 2-2和Alum 2-3，以及Alum 3：Alum 3-1、Alum3-2和Alum 3-3；分别和LPS结合后刺激细胞，检测上清液中IL-1β的产生量。可接受标准：6次检测结果之间的偏差≤5％，同批次间检测结果≤5％。实验结果如表5所示，6次检测结果均在理论范围内，且符合实施例1中所述传统检测方法得到的不同铝佐剂的生物活性趋势，同时6次检测结果的偏差以及同批次间检测结果不超过5％，表明本发明的检测方法具有较好的重复性。
表5重复性实验中细胞模型的IL-1β产生量
Figure BDA0002391401910000102
Figure BDA0002391401910000111
对比实施例1、2、3和4的检测结果，可见本发明提供的检测佐剂生物活性的方法精确度高，且重复性良好，时间短，能够快速准确的应用于佐剂产品的生物学活性的评价。
实施例5采用本发明的方法(TLR4 Ligand系统)通过IL-6生物标志物检测铝佐剂的生物活性
本实施例采用小鼠DC细胞检测系统作为铝佐剂生物活性检测的生物模型，具体操作步骤如下：
(1)细胞复苏参考实施例2。
(2)细胞刺激
调整收集到的JAWSII细胞的浓度，按5×105细胞/孔铺于24孔板贴壁培养24h后，添加不同的刺激物，37℃、5％CO2条件下培养24h。刺激物为LPS(30ng/mL)、Alum 1(60μg/mL)、Alum 1+LPS混合物(30ng/mL LPS+60μg/mL Alum 1)，LPS、Alum 1为阳性对照，培养基(Medium)作为阴性对照。
(3)蛋白因子检测
培养后收集细胞上清，12000rpm 4℃离心5min去除细胞碎片及铝佐剂颗粒，利用IL-1βELISA试剂盒对细胞上清液中的IL-6含量进行检测。
蛋白因子IL-6ELISA试剂盒检测步骤按试剂盒的说明书操作参考实施例2。
如表6中结果所示，当使用铝佐剂/LPS混合物刺激JAWSII细胞时，Alum 1+LPS能够刺激分泌更多的IL-6，与单独Alum 1，LPS刺激相比，Alum 1+LPS有着典型的协同效应。
表6细胞模型中IL-6产生量
Figure BDA0002391401910000112
Figure BDA0002391401910000121
实施例6采用本发明的方法(TLR4 Ligand系统)通过IL-18生物标志物检测铝佐剂的生物活性
本实施例采用小鼠DC细胞检测系统作为铝佐剂生物活性检测的生物模型，具体操作步骤如下：
(1)细胞复苏参考实施例2。
(2)细胞刺激参考实施例5。
(3)蛋白因子检测
培养后收集细胞上清，12000rpm 4℃离心5min去除细胞碎片及铝佐剂颗粒，利用IL-1βELISA试剂盒对细胞上清液中的IL-18含量进行检测。
蛋白因子IL-18ELISA试剂盒检测步骤按试剂盒的说明书操作参考实施例2。
如表7中结果所示，当使用铝佐剂/LPS混合物刺激JAWSII细胞时，Alum 1+LPS能够刺激分泌更多的IL-18，与单独Alum 1，LPS刺激相比，Alum 1+LPS有着典型的协同效应。
表7细胞模型中IL-18产生量
Figure BDA0002391401910000122
实施例7采用本发明的方法(TLR4 Ligand系统)通过TNF-α生物标志物检测铝佐剂的生物活性
本实施例采用小鼠DC细胞检测系统作为铝佐剂生物活性检测的生物模型，具体操作步骤如下：
(1)细胞复苏参考实施例2。
(2)细胞刺激参考实施例5。
(3)蛋白因子检测
培养后收集细胞上清，12000rpm 4℃离心5min去除细胞碎片及铝佐剂颗粒，利用IL-1βELISA试剂盒对细胞上清液中的TNF-α含量进行检测。
蛋白因子TNF-αELISA试剂盒检测步骤按试剂盒的说明书操作参考实施例2。
如表8中结果所示，当使用铝佐剂/LPS混合物刺激JAWSII细胞时，Alum 1+LPS能够刺激分泌更多的TNF-α，与单独Alum 1，LPS刺激相比，Alum 1+LPS有着典型的协同效应。
表8细胞模型中TNF-α产生量
Figure BDA0002391401910000131
实施例8采用本发明的方法(TLR3 Ligand系统)通过IL-1β生物标志物检测铝佐剂的生物活性
本实施例采用小鼠DC细胞检测系统作为铝佐剂生物活性检测的生物模型，具体操作步骤如下：
(1)细胞复苏参考实施例2。
(2)细胞刺激
调整收集到的JAWSII细胞的浓度，按5×105细胞/孔铺于24孔板贴壁培养24h后，添加不同的刺激物，37℃、5％CO2条件下培养24h。刺激物为Poly I:C(0.3、3、30ng/mL)、Alum 1(60μg/mL)、Alum 1+Poly I:C混合物(0.3、3、30ng/mL Poly I:C+60μg/mL Alum 1)，Poly I:C、Alum 1为阳性对照，培养基(Medium)作为阴性对照。
(3)蛋白因子检测
培养后收集细胞上清，12000rpm 4℃离心5min去除细胞碎片及铝佐剂颗粒，利用IL-1βELISA试剂盒对细胞上清液中的IL-1β含量进行检测。
蛋白因子IL-1βELISA试剂盒检测步骤按试剂盒的说明书操作参考实施例2。
如表9中结果所示，当使用铝佐剂/Poly I:C混合物刺激JAWSII细胞时，Alum 1+Poly I:C能够刺激分泌更多的IL-1β，与单独Alum 1，Poly I:C刺激相比，Alum 1+Poly I:C有着典型的协同效应,且该协同作用存在剂量依赖性。
表9细胞模型中IL-1β产生量
Figure BDA0002391401910000141
实施例9采用本发明的方法(TLR3 Ligand系统)通过IL-6生物标志物检测铝佐剂的生物活性
本实施例采用小鼠DC细胞检测系统作为铝佐剂生物活性检测的生物模型，具体操作步骤如下：
(1)细胞复苏参考实施例2。
(2)细胞刺激
调整收集到的JAWSII细胞的浓度，按5×105细胞/孔铺于24孔板贴壁培养24h后，添加不同的刺激物，37℃、5％CO2条件下培养24h。刺激物为Poly I:C(30ng/mL)、Alum 1(60μg/mL)、Alum 1+Poly I:C混合物(30ng/mL Poly I:C+60μg/mL Alum 1)，Poly I:C、Alum 1为阳性对照，培养基(Medium)作为阴性对照。
(3)蛋白因子检测
培养后收集细胞上清，12000rpm 4℃离心5min去除细胞碎片及铝佐剂颗粒，利用IL-1βELISA试剂盒对细胞上清液中的IL-6含量进行检测。
蛋白因子IL-6ELISA试剂盒检测步骤按试剂盒的说明书操作参考实施例2。
如表10中结果所示，当使用铝佐剂/Poly I:C混合物刺激JAWSII细胞时，Alum 1+Poly I:C能够刺激分泌更多的IL-6，与单独Alum 1，Poly I:C刺激相比，Alum 1+Poly I:C有着典型的协同效应。
表10细胞模型中IL-6产生量
Figure BDA0002391401910000151
实施例10采用本发明的方法(TLR3 Ligand系统)通过IL-18生物标志物检测铝佐剂的生物活性
本实施例采用小鼠DC细胞检测系统作为铝佐剂生物活性检测的生物模型，具体操作步骤如下：
(1)细胞复苏参考实施例2。
(2)细胞刺激参考实施例9。
(3)蛋白因子检测
培养后收集细胞上清，12000rpm 4℃离心5min去除细胞碎片及铝佐剂颗粒，利用IL-1βELISA试剂盒对细胞上清液中的IL-18含量进行检测。
蛋白因子IL-18ELISA试剂盒检测步骤按试剂盒的说明书操作参考实施例2。
如表11中结果所示，当使用铝佐剂/Poly I:C混合物刺激JAWSII细胞时，Alum 1+Poly I:C能够刺激分泌更多的IL-18，与单独Alum 1，Poly I:C刺激相比，Alum 1+Poly I:C有着典型的协同效应。
表11细胞模型中IL-18产生量
Figure BDA0002391401910000161
实施例11采用本发明的方法(TLR3 Ligand系统)通过TNF-α生物标志物检测铝佐剂的生物活性
本实施例采用小鼠DC细胞检测系统作为铝佐剂生物活性检测的生物模型，具体操作步骤如下：
(1)细胞复苏参考实施例2。
(2)细胞刺激参考实施例9。
(3)蛋白因子检测
培养后收集细胞上清，12000rpm 4℃离心5min去除细胞碎片及铝佐剂颗粒，利用IL-1βELISA试剂盒对细胞上清液中的TNF-α含量进行检测。
蛋白因子TNF-αELISA试剂盒检测步骤按试剂盒的说明书操作参考实施例2。
如表12中结果所示，当使用铝佐剂/Poly I:C混合物刺激JAWSII细胞时，Alum 1+Poly I:C能够刺激分泌更多的TNF-α，与单独Alum 1，Poly I:C刺激相比，Alum 1+Poly I:C有着典型的协同效应。
表12细胞模型中TNF-α产生量
Figure BDA0002391401910000162
实施例12采用本发明的方法(TLR7/8Ligand系统)通过IL-1β生物标志物检测铝佐剂的生物活性
本实施例采用小鼠DC细胞检测系统作为铝佐剂生物活性检测的生物模型，具体操作步骤如下：
(1)细胞复苏参考实施例2。
(2)细胞刺激
调整收集到的JAWSII细胞的浓度，按5×105细胞/孔铺于24孔板贴壁培养24h后，添加不同的刺激物，37℃、5％CO2条件下培养24h。刺激物为R848(0.3，3，30ng/mL)、Alum 1(60μg/mL)、Alum 1+R848混合物(0.3，3，30ng/mL R848+60μg/mL Alum 1)，R848、Alum 1为阳性对照，培养基(Medium)作为阴性对照。
(3)蛋白因子检测
培养后收集细胞上清，12000rpm 4℃离心5min去除细胞碎片及铝佐剂颗粒，利用IL-1βELISA试剂盒对细胞上清液中的IL-1β含量进行检测。
蛋白因子IL-1βELISA试剂盒检测步骤按试剂盒的说明书操作参考实施例2。
如表13中结果所示，当使用铝佐剂/R848混合物刺激JAWSII细胞时，Alum 1+R848能够刺激分泌更多的IL-1β，与单独Alum 1，R848刺激相比，Alum 1+R848有着典型的协同效应,且该协同作用存在剂量依赖性。
表13细胞模型中IL-1β产生量
Figure BDA0002391401910000171
实施例13采用本发明的方法(TLR7/8Ligand系统)通过IL-6生物标志物检测铝佐剂的生物活性
本实施例采用小鼠DC细胞检测系统作为铝佐剂生物活性检测的生物模型，具体操作步骤如下：
(1)细胞复苏参考实施例2。
(2)细胞刺激
调整收集到的JAWSII细胞的浓度，按5×105细胞/孔铺于24孔板贴壁培养24h后，添加不同的刺激物，37℃、5％CO2条件下培养24h。刺激物为R848(30ng/mL)、Alum 1(60μg/mL)、Alum 1+R848混合物(30ng/mL R848+60μg/mL Alum 1)，R848、Alum 1为阳性对照，培养基(Medium)作为阴性对照。
(3)蛋白因子检测
培养后收集细胞上清，12000rpm 4℃离心5min去除细胞碎片及铝佐剂颗粒，利用IL-1βELISA试剂盒对细胞上清液中的IL-6含量进行检测。
蛋白因子IL-6ELISA试剂盒检测步骤按试剂盒的说明书操作参考实施例2。
如表14中结果所示，当使用铝佐剂/R848混合物刺激JAWSII细胞时，Alum1+R848能够刺激分泌更多的IL-6，与单独Alum 1，R848刺激相比，Alum 1+R848有着典型的协同效应。
表14细胞模型中IL-6产生量
Figure BDA0002391401910000181
实施例14采用本发明的方法(TLR7/8Ligand系统)通过IL-18生物标志物检测铝佐剂的生物活性
本实施例采用小鼠DC细胞检测系统作为铝佐剂生物活性检测的生物模型，具体操作步骤如下：
(1)细胞复苏参考实施例2。
(2)细胞刺激参考实施例13。
(3)蛋白因子检测
培养后收集细胞上清，12000rpm 4℃离心5min去除细胞碎片及铝佐剂颗粒，利用IL-1βELISA试剂盒对细胞上清液中的IL-18含量进行检测。
蛋白因子IL-18ELISA试剂盒检测步骤按试剂盒的说明书操作参考实施例2。
如表15中结果所示，当使用铝佐剂/R848混合物刺激JAWSII细胞时，Alum 1+R848能够刺激分泌更多的IL-18，与单独Alum 1，R848刺激相比，Alum 1+R848有着典型的协同效应。
表15细胞模型中IL-18产生量
Figure BDA0002391401910000191
实施例15采用本发明的方法(TLR7/8Ligand系统)通过TNF-α生物标志物检测铝佐剂的生物活性
本实施例采用小鼠DC细胞检测系统作为铝佐剂生物活性检测的生物模型，具体操作步骤如下：
(1)细胞复苏参考实施例2。
(2)细胞刺激参考实施例13。
(3)蛋白因子检测
培养后收集细胞上清，12000rpm 4℃离心5min去除细胞碎片及铝佐剂颗粒，利用IL-1βELISA试剂盒对细胞上清液中的TNF-α含量进行检测。
蛋白因子TNF-αELISA试剂盒检测步骤按试剂盒的说明书操作参考实施例2。
如表16中结果所示，当使用铝佐剂/R848混合物刺激JAWSII细胞时，Alum 1+R848能够刺激分泌更多的TNF-α，与单独Alum 1，R848刺激相比，Alum 1+R848有着典型的协同效应。
表16细胞模型中TNF-α产生量
Figure BDA0002391401910000201
实施例16采用本发明的方法(TLR9 Ligand系统)通过IL-1β生物标志物检测铝佐剂的生物活性
本实施例采用小鼠DC细胞检测系统作为铝佐剂生物活性检测的生物模型，具体操作步骤如下：
(1)细胞复苏参考实施例2。
(2)细胞刺激
调整收集到的JAWSII细胞的浓度，按5×105细胞/孔铺于24孔板贴壁培养24h后，添加不同的刺激物，37℃、5％CO2条件下培养24h。刺激物为CpG(0.3，3，30ng/mL)、Alum 1(60μg/mL)、Alum 1+CpG混合物(0.3，3，30ng/mL CpG+60μg/mL Alum 1)，CpG、Alum 1为阳性对照，培养基(Medium)作为阴性对照。
(3)蛋白因子检测
培养后收集细胞上清，12000rpm 4℃离心5min去除细胞碎片及铝佐剂颗粒，利用IL-1βELISA试剂盒对细胞上清液中的IL-1β含量进行检测。
蛋白因子IL-1βELISA试剂盒检测步骤按试剂盒的说明书操作参考实施例2。
如表17中结果所示，当使用铝佐剂/CpG混合物刺激JAWSII细胞时，Alum 1+CpG能够刺激分泌更多的IL-1β，与单独Alum 1，CpG刺激相比，Alum 1+CpG有着典型的协同效应,且该协同作用存在剂量依赖性。
表17细胞模型中IL-1β产生量
Figure BDA0002391401910000211
实施例17采用本发明的方法(TLR9 Ligand系统)通过IL-6生物标志物检测铝佐剂的生物活性
本实施例采用小鼠DC细胞检测系统作为铝佐剂生物活性检测的生物模型，具体操作步骤如下：
(1)细胞复苏参考实施例2。
(2)细胞刺激
调整收集到的JAWSII细胞的浓度，按5×105细胞/孔铺于24孔板贴壁培养24h后，添加不同的刺激物，37℃、5％CO2条件下培养24h。刺激物为CpG(30ng/mL)、Alum 1(60μg/mL)、Alum 1+CpG混合物(30ng/mL CpG+60μg/mL Alum 1)，CpG、Alum 1为阳性对照，培养基(Medium)作为阴性对照。
(3)蛋白因子检测
培养后收集细胞上清，12000rpm 4℃离心5min去除细胞碎片及铝佐剂颗粒，利用IL-1βELISA试剂盒对细胞上清液中的IL-6含量进行检测。
蛋白因子IL-6ELISA试剂盒检测步骤按试剂盒的说明书操作参考实施例2。
如表18中结果所示，当使用铝佐剂/CpG混合物刺激JAWSII细胞时，Alum 1+CpG能够刺激分泌更多的IL-6，与单独Alum 1，CpG刺激相比，Alum 1+CpG有着典型的协同效应。
表18细胞模型中IL-6产生量
Figure BDA0002391401910000212
Figure BDA0002391401910000221
实施例18采用本发明的方法(TLR9 Ligand系统)通过IL-18生物标志物检测铝佐剂的生物活性
本实施例采用小鼠DC细胞检测系统作为铝佐剂生物活性检测的生物模型，具体操作步骤如下：
(1)细胞复苏参考实施例2。
(2)细胞刺激参考实施例17。
(3)蛋白因子检测
培养后收集细胞上清，12000rpm 4℃离心5min去除细胞碎片及铝佐剂颗粒，利用IL-1βELISA试剂盒对细胞上清液中的IL-18含量进行检测。
蛋白因子IL-18ELISA试剂盒检测步骤按试剂盒的说明书操作参考实施例2。
如表19中结果所示，当使用铝佐剂/CpG混合物刺激JAWSII细胞时，Alum 1+CpG能够刺激分泌更多的IL-18，与单独Alum 1，CpG刺激相比，Alum 1+CpG有着典型的协同效应。
表19细胞模型中IL-18产生量
Figure BDA0002391401910000222
实施例19采用本发明的方法(TLR9 Ligand系统)通过TNF-α生物标志物检测铝佐剂的生物活性
本实施例采用小鼠DC细胞检测系统作为铝佐剂生物活性检测的生物模型，具体操作步骤如下：
(1)细胞复苏参考实施例2。
(2)细胞刺激参考实施例17。
(3)蛋白因子检测
培养后收集细胞上清，12000rpm 4℃离心5min去除细胞碎片及铝佐剂颗粒，利用IL-1βELISA试剂盒对细胞上清液中的TNF-α含量进行检测。
蛋白因子TNF-αELISA试剂盒检测步骤按试剂盒的说明书操作参考实施例2。
如表20中结果所示，当使用铝佐剂/CpG混合物刺激JAWSII细胞时，Alum 1+CpG能够刺激分泌更多的TNF-α，与单独Alum 1，CpG刺激相比，Alum 1+CpG有着典型的协同效应。
表20细胞模型中TNF-α产生量
Figure BDA0002391401910000231
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，本发明权利要求所述的范围内，实验效果均与以上实施例所述效果等效。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改，等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种佐剂生物活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将佐剂作用于细胞模型；
步骤2，检测步骤1中细胞模型分泌的蛋白因子量，用以表征佐剂的生物活性；
所述步骤1中的佐剂选自氢氧化铝；
所述步骤1中的佐剂和共刺激物混合后共同作用于细胞模型；其中共刺激物为LPS；
所述的佐剂和共刺激物混合物中包括0.24-240μg/mL的佐剂和0.3-300ng/mL的共刺激物；
所述的细胞为JAWSII细胞。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1中的作用时间为0.5-72h。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2中蛋白因子选自IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-31、IL-33、MCP-1/CCL2、MIP-1α/CCL3、MIP-1β/CCL4、RANTES/CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL12、TNFα、IFNα、IFNβ和IFNγ中的一种或多种。
4.权利要求1-3中任一项所述的检测方法在含佐剂疫苗的质量评价中的应用。
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