CN111117966A - 一种利用乳酸的体外细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用乳酸的体外细胞培养方法，包括如下步骤：（1）含乳酸、含葡萄糖、去谷氨酰胺培养基的制备，包括如下具体步骤：（1‑1）取5g乳酸粉末，加10mL高压后的双蒸水溶解，配成500mg/mL乳酸溶液；（1‑2）取50mL胎牛血清与5mL双抗溶液加入450mL高糖、去谷氨酰胺、去丙酮酸钠DMEM培养基配置为500mL去谷氨酰胺DMEM完全培养基；（1‑3）取80μL步骤（1‑1）制备的500mg/mL乳酸溶液加入500mL步骤（1‑2）制备的去谷氨酰胺完全培养基，配置为含乳酸、去谷氨酰胺DMEM完全培养基；（2）检测细胞凋亡率或增值率。本发明提供的体外细胞培养方法不仅适用于多种细胞系，而且细胞活力保持较好，更适于需要长期体外培养的研究。
Description
技术领域
本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种利用乳酸的体外细胞培养方法。
背景技术
肿瘤细胞的能量代谢方式非常复杂，此前，Warburg效应认为相对于正常的体细胞，肿瘤细胞会更主要利用糖酵解作为其体内能量代谢的主要方式，而三羧酸循环和氧化磷酸化在一定程度上受到抑制。但最近的一些研究发现肿瘤细胞不仅会大量利用葡萄糖进行糖酵解，同时会增加三羧酸循环和氧化磷酸化。已知乳酸是糖酵解的终末产物之一，最近的研究发现乳酸能够作为肿瘤细胞的主要能量来源之一被利用，其对于肿瘤细胞增殖的重要性不亚于葡萄糖，而且和肿瘤的发生发展密切相关。
阐述肿瘤细胞利用的乳酸的机制需要可靠的细胞模型，然而在一般体外培养条件下，由于培养基中含有大量其他营养物质，肿瘤细胞并不利用乳酸进行增值。此前有研究提示肿瘤细胞能够在葡萄糖剥夺的条件下利用乳酸，但我们发现在这种条件下，即使乳酸能被利用，并一定程度上恢复肿瘤细胞的增值，但细胞会在24小时内大量凋亡，这对于研究肿瘤利用乳酸的机制研究带来了一定困难。因此，需要建立一种新的体外细胞培养方法，用于检测和分析肿瘤细胞对乳酸的代谢。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用乳酸的体外细胞培养方法，不仅适用于多种细胞系，而且细胞活力保持较好，更适于需要长期体外培养的研究。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种利用乳酸的体外细胞培养方法，包括如下步骤：
（1）含乳酸、含葡萄糖、去谷氨酰胺培养基的制备，包括如下具体步骤：
（1-1）取5g乳酸粉末，加10mL高压后的双蒸水溶解，配成500mg/mL乳酸溶液；
（1-2）取50mL胎牛血清与5mL双抗溶液加入450mL高糖、去谷氨酰胺、去丙酮酸钠DMEM培养基配置为500mL去谷氨酰胺DMEM完全培养基；
（1-3）取80μL步骤（1-1）制备的500mg/mL乳酸溶液加入500mL步骤（1-2）制备的去谷氨酰胺完全培养基，配置为含乳酸、去谷氨酰胺DMEM完全培养基；
（2）检测细胞凋亡率或增值率，包括如下具体步骤：
（2-1）在孔板中加入细胞悬液，贴壁4-24h后待细胞量达到40%-60%时，撤去原有培养基，加入步骤（1）制备的含乳酸、去谷氨酰胺DMEM完全培养基；
（2-2）培养24-96h后，检测细胞凋亡率或细胞增值率。
其中，步骤（1）所用原料包括：高葡萄糖、去谷氨酰胺、去丙酮酸钠DMEM培养基450mL，胎牛血清50mL，双抗溶液5mL，乳酸粉末400mg。
其中，步骤（2-1）中所用孔板为6孔板或96孔板。
其中，步骤（2-1）中所用细胞悬液为人肺癌细胞株A549或人支气管上皮细胞株BEAS-2B的细胞悬液。
优选的，步骤（2-2）中，利用流式细胞术检测细胞凋亡率或利用CCK8检测细胞增殖率。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明提供的体外细胞培养方法不仅适用于多种细胞系，而且细胞活力保持较好，更适于需要长期体外培养的研究。
附图说明
图1为本发明中不同浓度梯度的乳酸对A549细胞增殖的影响图；
图2为本发明中CCK8检测A549细胞在含乳酸的DMEM培养基中与不含乳酸的培养基中的72h增值率示意图；
图3为本发明中CCK8检测BEAS-2B细胞在含乳酸的DMEM培养基中与不含乳酸的培养基中的72h增值率示意图；
图4为本发明中利用流式细胞术检测BEAS-2B细胞在含乳酸的DMEM培养基中与不含乳酸的培养基中的24h凋亡率结果图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明提供了一种利用乳酸的体外细胞培养方法，包括如下步骤：
（1）取高葡萄糖、去谷氨酰胺、去丙酮酸钠DMEM培养基450mL，胎牛血清50mL，双抗溶液5mL，乳酸粉末400mg制备含乳酸、含葡萄糖、去谷氨酰胺培养基，包括如下具体步骤：
（1-1）取5g乳酸粉末，加10mL高压后的双蒸水溶解，配成500mg/mL乳酸溶液；
（1-2）取50mL胎牛血清与5mL双抗溶液加入450mL高糖、去谷氨酰胺、去丙酮酸钠DMEM培养基配置为500mL去谷氨酰胺DMEM完全培养基；
（1-3）取80μL步骤（1-1）制备的500mg/mL乳酸溶液加入500mL步骤（1-2）制备的去谷氨酰胺完全培养基，配置为含乳酸（8mM）、去谷氨酰胺DMEM完全培养基；
（2）检测细胞凋亡率或增值率，包括如下具体步骤：
（2-1）在6孔板或96孔板中加入人肺癌细胞株A549或人支气管上皮细胞株BEAS-2B的细胞悬液，贴壁4-24h后待细胞量达到40%-60%时，撤去原有培养基，加入步骤（1）制备的含乳酸、去谷氨酰胺DMEM完全培养基；
（2-2）培养24-96h后，利用流式细胞术检测细胞凋亡率或利用CCK8检测细胞增殖率。
下面以两个实施例进一步阐述本发明的技术方案。
实施例1
本实施例以人肺癌细胞株A549为例，阐述含在乳酸、去谷氨酰胺的培养基中培养人肺癌细胞株A549的使用方案和效果分析；同时比较了乳酸在三种培养条件中（①含葡萄糖，不含谷氨酰胺；②含谷氨酰胺，不含葡萄糖；③不含葡萄糖，不含谷氨酰胺）对细胞增殖的影响，具体包括如下步骤：
S101、收集2×105 A549细胞，加入2mL DMEM完全培养基重悬后，加入18mL DMEM完全培养基重悬，100μL细胞悬液/孔加入至96孔板；
S102、细胞贴壁后撤去DMEM完全培养基，加入去谷氨酰胺DMEM完全培养基和加入含不同浓度的乳酸、去谷氨酰胺DMEM完全培养基；
S103、处理72h后弃去培养基，加入10% CCK8溶液，待1-4h后检测OD值，发现4-8mM乳酸对细胞增殖起明显促进作用（如图1所示）；至此，我们确定8mM的是乳酸的最佳浓度。
S104、为了进一步比较在乳酸在不同培养基中对细胞增殖的促进作用，我们收集2×105 A549细胞，加入2mL DMEM完全培养基重悬后，加入18mL DMEM完全培养基重悬，100μL细胞悬液/孔加入至96孔板；
S105、细胞贴壁后撤去DMEM完全培养基，加入三种不同的DMEM完全培养基（①含葡萄糖，不含谷氨酰胺；②含谷氨酰胺，不含葡萄糖；③不含葡萄糖，不含谷氨酰胺），三种培养基中含或不含8mM的乳酸。
S106、处理72h后弃去培养基，加入10% CCK8溶液，待1-4h后检测OD值，发现在含葡萄糖，不含谷氨酰胺的培养基中，细胞活力保持良好，增殖明显，而且乳酸能进一步促进细胞增殖。在含谷氨酰胺，不含葡萄糖的培养基中，细胞增殖显著降低，但乳酸对其仍有一定的促进作用。最后，在不含葡萄糖，不含谷氨酰胺的培养基中细胞不能增殖，乳酸也没有促增殖的作用。（如图2所示）。
实施例2
本实施例以人支气管上皮细胞株BEAS-2B为例，阐述含乳酸、去谷氨酰胺的培养基中培养人支气管上皮细胞株BEAS-2B的使用方案和效果分析，同时比较了乳酸在三种DMEM完全培养条件中（①含葡萄糖，不含谷氨酰胺；②含谷氨酰胺，不含葡萄糖；③不含葡萄糖，不含谷氨酰胺）对细胞增殖的影响，具体包括如下步骤：
S201、收集2×105 BEAS-2B细胞，加入2mL DMEM完全培养基重悬后，加入8mL DMEM完全培养基重悬，100μL细胞悬液/孔加入至96孔板；
S202、细胞贴壁后，撤去DMEM完全培养基，加入三种不同的DMEM完全培养基（①含葡萄糖，不含谷氨酰胺；②含谷氨酰胺，不含葡萄糖；③不含葡萄糖，不含谷氨酰胺），三种培养基中含或不含8mM的乳酸；
S203、处理72h后弃去培养基，加入10% CCK8溶液，待1-4h后检测OD值，发现在含葡萄糖，不含谷氨酰胺的培养基中，细胞活力保持良好，增殖明显，而且乳酸能进一步促进细胞增殖。在含谷氨酰胺，不含葡萄糖的培养基中，细胞增殖显著降低，但乳酸对其仍有一定的促进作用。最后，在不含葡萄糖，不含谷氨酰胺的培养基中细胞不能增殖，乳酸也没有促增殖的作用。（如图3所示）。
S204、为了检测细胞凋亡，收集0.5×106-1.5×106 BEAS-2B细胞，加入2mL DMEM完全培养基重悬后，加入18mL DMEM完全培养基重悬，200μL细胞悬液/孔加入至6孔板，加2mLDMEM完全培养基，贴壁6-24h；
S205、待细胞融合度达到40-60%左右时，撤去DMEM完全培养基，分别加入去谷氨酰胺DMEM完全培养基和含乳酸去谷氨酰胺DMEM完全培养基，处理24h-48h；
S206、撤去培养基，PBS洗涤后使用胰酶消化，10% FPBS吹打收集细胞，1000rpm离心后，PBS洗涤沉淀2-3遍，流式细胞术检测细胞凋亡。
S207、发现24-48h后，经过去谷氨酰胺DMEM完全培养基处理后的BEAS-2B细胞凋亡率明显增加，而乳酸能够明显地抑制去谷氨酰胺后的BEAS-2B细胞凋亡率（如图4所示）。
本发明发现去除培养基中的谷氨酰胺，但保留葡萄糖时，加入乳酸有促进增殖和抑制凋亡的作用。另外，我们通过测试不同浓度的乳酸，确立了一个体外研究肿瘤细胞乳酸代谢的新方法，该方法不仅适用于多种细胞系，而且细胞活力保持较好，更适于需要长期体外培养的研究。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种利用乳酸的体外细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）含乳酸、含葡萄糖、去谷氨酰胺培养基的制备，包括如下具体步骤：
（1-1）取5g乳酸粉末，加10mL高压后的双蒸水溶解，配成500mg/mL乳酸溶液；
（1-2）取50mL胎牛血清与5mL双抗溶液加入450mL高糖、去谷氨酰胺、去丙酮酸钠DMEM培养基配置为500mL去谷氨酰胺DMEM完全培养基；
（1-3）取80μL步骤（1-1）制备的500mg/mL乳酸溶液加入500mL步骤（1-2）制备的去谷氨酰胺完全培养基，配置为含乳酸、去谷氨酰胺DMEM完全培养基；
（2）检测细胞凋亡率或增值率，包括如下具体步骤：
（2-1）在孔板中加入细胞悬液，贴壁4-24h后待细胞量达到40%-60%时，撤去原有培养基，加入步骤（1）制备的含乳酸、去谷氨酰胺DMEM完全培养基；
（2-2）培养24-96h后，检测细胞凋亡率或细胞增值率。
2.根据权利要求1所述的体外细胞培养方法，其特征在于，步骤（1）所用原料包括：高葡萄糖、去谷氨酰胺、去丙酮酸钠DMEM培养基450mL，胎牛血清50mL，双抗溶液5mL，乳酸粉末400mg。
3.根据权利要求1所述的体外细胞培养方法，其特征在于，步骤（2-1）中所用孔板为6孔板或96孔板。
4.根据权利要求1所述的体外细胞培养方法，其特征在于，步骤（2-1）中所用细胞悬液为人肺癌细胞株A549或人支气管上皮细胞株BEAS-2B的细胞悬液。
5.根据权利要求1所述的体外细胞培养方法，其特征在于，步骤（2-2）中，利用流式细胞术检测细胞凋亡率。
6.根据权利要求1所述的体外细胞培养方法，其特征在于，步骤（2-2）中，利用CCK8检测细胞增殖率。
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| CN101018567A (zh) * | 2004-07-20 | 2007-08-15 | 先灵公司 | 表达Toll样受体的肿瘤细胞凋亡的诱导 |
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2020
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