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CN111067915A - 老鹳草素在制备用于治疗维生素d不足和/或缺乏疾病的药物中的用途 - Google Patents

老鹳草素在制备用于治疗维生素d不足和/或缺乏疾病的药物中的用途 Download PDF

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CN111067915A
CN111067915A CN202010023284.1A CN202010023284A CN111067915A CN 111067915 A CN111067915 A CN 111067915A CN 202010023284 A CN202010023284 A CN 202010023284A CN 111067915 A CN111067915 A CN 111067915A
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CN
China
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geraniin
vitamin
deficiency
bone
hesperidin
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CN202010023284.1A
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陈鹏
沈志强
张莉
李璠
杨仁华
何波
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Kunming Medical University
Original Assignee
Kunming Medical University
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Abstract

本发明提供老鹤草素在制备用于治疗维生素D不足和/或缺乏疾病的药物中的用途，属于生物医药技术领域，老鹳草素不仅能够提高维生素D不足和/或缺乏机体的血清钙、磷水平，降低碱性磷酸酶水平；而且可通过调节维生素D‑FGF‑23‑Klotho轴因子改善骨代谢指标BAP、TRAP5b、BGP水平，使成骨细胞VDR基因和/或蛋白的表达量上调，从而改善因维生素D不足和/或缺乏所导致的疾病。本发明还提供一种用于治疗维生素D不足和/或缺乏疾病的药物，包含老鹳草素。本发明还提供老鹳草素和橙皮苷在制备用于治疗骨质疏松症合并糖尿病的药物中的用途，老鹳草素和橙皮苷的联和使用能够明显降低患者血糖。

Description

老鹳草素在制备用于治疗维生素D不足和/或缺乏疾病的药物 中的用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及老鹳草素在制备用于治疗维生素D 不足和/或缺乏疾病的药物中的用途。
背景技术
大戟科植物叶下珠(Phyllanthus urinaria L.)又名珍珠草、夜合草、阴阳草、真珠草，为大戟科叶下珠属一年生草本植物。叶下珠具有抗病毒、保肝抗炎、降血糖和胆固醇、抗氧化和抗菌等生物和药理活性，因而被用来治疗腹泻、痢疾、肝炎、水肿、小儿疳积、急性结膜炎、口疮和抗生素耐药化脓性感染。叶下珠的酚类物质是上述生物和药理活性的主要有效物质，老鹳草素(geraniin，Ge)是其中的一种多酚类化合物，化学结构见图1，近年的研究表明老鹳草素具有多种药理活性：(1)抗氧化，体内外的实验均表明老鹳草素可清除氧自由基、羟自由基和超氧自由基等；(2)抗肿瘤：老鹳草素可以抑制转化生长因子等活性，会吓死肿瘤的迁移、侵袭、抗凋亡能力减弱，抑制肿瘤生长，甚至加速肿瘤细胞凋亡； (3)抗病毒及抗菌活性。老鹳草素易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂，用加热回流的方法提取容易被分解为没食子酸、六羟基联苯二甲酸、鞣花酸、柯里拉京、云实酸和云实素，同时光、热不稳定，极易在光热环境中降解，所以老鹳草素的制取工艺中应尽可能避免光和热。
发明内容
本发明的目的在于一种老鹤草素的用途，老鹳草素能够提高维生素D不足和/或缺乏机体的血清钙、磷水平，降低碱性磷酸酶水平；而且可通过调节维生素D-FGF-23-Klotho轴因子改善骨代谢指标BAP、TRAP5b、BGP水平，从而改善因维生素D不足和/或缺乏所导致的疾病。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
老鹳草素在制备用于治疗维生素D不足和/或缺乏疾病的药物中的用途。
维生素D是一种激素而不是维生素，称之为维生素D内分泌系统。维生素 D系统包括维生素D、参与维生素D代谢的酶以及维生素D作用的受体(Vitamin D Receptor，VDR)；当机体内的维生素D不足和/或缺乏后会导致多种疾病的发生，如佝偻病、骨质软化病、骨质疏松症以及手足痉挛症等。老鹳草素不仅能够提高维生素D不足和/或缺乏机体的血清钙、磷水平，降低碱性磷酸酶水平；而且可通过调节维生素D-FGF-23-Klotho轴因子25(OH)VD3、1,25(OH)VD3、 FGF-23、Klotho水平，改善维生素D异常的代谢，从而改善骨代谢指标骨特异性碱性磷酸酶(BAP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)、骨钙素(BGP)水平，从而改善因维生素D不足和/或缺乏所导致的疾病。且机体对老鹳草素不良反应小，本发明充分挖掘传统医学在防治疾病中的重要应用，为维生素D不足和/或缺乏疾病的治疗寻找了一条新途径。
根据本发明一实施方式，老鹳草素为老鹳草素单体和/或老鹳草素盐。
根据本发明一实施方式，老鹳草素通过调节维生素D-FGF-23-Klotho轴因子 25(OH)VD3、1,25(OH)VD3、FGF-23、Klotho水平，改善维生素D异常的代谢。
根据本发明一实施方式，老鹳草素使骨密度增加。
根据本发明一实施方式，老鹳草素使成骨细胞VDR基因和/或蛋白的表达量上调。老鹳草素能够上调成骨细胞维生素D受体(VDR)基因和/或蛋白的表达量，激活VDR信号通路，以实现激活VDR信号通路的目的，从而促进成骨细胞的增殖和分化、抑制破骨细胞的骨吸收或者抑制骨钙释放，促进骨骼的形成。亦即，老鹳草素可能通过调节维生素D轴促进VDR蛋白表达而改善维生素D 缺乏。
根据本发明一实施方式，维生素D不足和/或缺乏疾病为骨质疾病。优选的，骨质疾病包括：骨质疏松、佝偻病、骨质软化病、骨损伤、手足痉挛症、骨钙流失、骨骼发育不全和骨骼异样。
本发明的又一目的，在于提供一种用于治疗维生素D不足和/或缺乏疾病的药物，包含，老鹳草素。
根据本发明一实施方式，药物还包括橙皮苷。老鹳草素和橙皮苷的联和使用能够进一步提高老鹳草素的作用效果。
本发明的又一目的，在于提供老鹳草素和橙皮苷在制备用于治疗维生素D 不足和/或缺乏疾病的药物中的用途。
本发明的又一目的，在于提供老鹳草素和橙皮苷在制备用于治疗骨质疏松症合并糖尿病的药物中的用途。骨质疏松本身难以治愈，合并症糖尿病后对患者健康危害更为严重，老鹳草素和橙皮苷的联和使用能够明显降低患者血糖，提升治疗有效率，值得推广应用。
本发明的有益效果为：本发明中，老鹳草素不仅能够提高维生素D不足和/ 或缺乏机体的血清钙、磷水平，降低碱性磷酸酶水平；而且可通过调节维生素 D-FGF-23-Klotho轴因子水平，改善骨代谢指标BAP、TRAP5b、BGP水平，从而改善因维生素D不足和/或缺乏所导致的疾病。本发明老鹳草素能够上调成骨细胞维生素D受体(VDR)基因和/或蛋白的表达量，激活VDR信号通路，以实现激活VDR信号通路的目的，从而促进成骨细胞的增殖和分化、抑制破骨细胞的骨吸收或者抑制骨钙释放，促进骨骼的形成。本发明老鹳草素和橙皮苷的联和使用能够进一步提高老鹳草素的作用效果，还能明显降低患者血糖，提升骨质疏松症合并糖尿病的治疗有效率，值得推广应用。
附图说明
图1为本发明老鹳草素的化学结构式；
图2为本发明实施例4中成骨细胞VDR基因的表达量；
图3为本发明实施例4中成骨细胞VDR蛋白的表达水平；
图4为本发明实施例4中成骨细胞VDR蛋白的表达量；
图5为本发明实施例8中患者治疗后空腹血糖；
图6为本发明实施例8中患者治疗后骨密度。
具体实施方式
本发明允许各种修改及变形，其特定实施例进行了举例，下面进行详细说明。但并非要把本发明限定于公开的特别形态之意，相反，本发明包括与由权利要求项所定义的本发明思想一致的所有修改、均等及替代。
这些实施例只用于更具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并非限定于这些实施例，这是所属技术领域的技术人员不言而喻的。
本发明一实施方式提供了老鹳草素在制备用于治疗维生素D不足和/或缺乏疾病的药物中的用途。
维生素D是由皮肤在光解阳光中的紫外线后所生成的一种脂溶性物质，在人体中属于一种类固醇类激素；当机体内的维生素D不足和/或缺乏后会导致多种疾病的发生，如佝偻病、骨质软化病、骨质疏松症以及手足痉挛症等。老鹳草素不仅能够提高维生素D不足和/或缺乏机体的血清钙、磷水平，降低碱性磷酸酶水平；而且可通过调节维生素D-FGF-23-Klotho轴因子25(OH)VD3、 1,25(OH)VD3、FGF-23、Klotho水平，改善维生素D异常的代谢，从而改善骨代谢指标骨特异性碱性磷酸酶(BAP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)、骨钙素(BGP)水平，从而改善因维生素D不足和/或缺乏所导致的疾病。且机体对老鹳草素不良反应小，本发明充分挖掘传统医学在防治疾病中的重要应用，为维生素D不足和/或缺乏疾病的治疗寻找了一条新途径。
于本发明一实施方式中，老鹳草素为老鹳草素单体和/或老鹳草素盐。
于本发明一实施方式中，老鹳草素来自大戟科植物叶下珠(Phyllanthusurinaria L.)的活性提取成分。
于本发明一实施方式中，老鹳草素通过如下方法获得：
1)料液比为1:10-20将叶下珠粉中加入含有质量浓度为0.3-1.5％的乳酸、浓度为20-25％的硫酸铵和质量浓度为17-23％的乙醇的提取液中，在150-180W超声波下提取40-50min，以8000-15000r/min离心5-12min，上清液在分液漏斗中静置分层，经0.45μm微孔滤膜滤过，得提取液；老鹳草素为可水解鞣质，用加热回流的方法提取容易被分解为没食子酸、六羟基联苯二甲酸、鞣花酸、柯里拉京、云实酸和云实素，而利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，可加速植物材料中的有效成分进入溶剂，从而增加有效成分的提取率，缩短提取时间，还可避免高温对提取成分的影响；同时，该提取液在较低的乙醇浓度下也能较好地破坏酚类物质与基质的作用力增加，有利于酚类物质的溶出，且该提取液对酚类物质选择性强，利于叶下珠粉中酚类物质的提取，使得叶下珠粉中酚类物质的提取率至少可达8.4％；
2)按体积比0.3-0.7:5-15:0.1-0.3:0.04-0.0.08:18-25将石油醚、乙酸乙酯、甲醇、柠檬酸铵、水配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡 1-4h后，将上相和下相分开，取上相作为固定相，下相作为流动相；
3)将固定相以10-15mL/min的流量灌满高速逆流色谱仪的管柱，然后以 700-800r/min的转速正向运转高速逆流色谱仪的主机，同时以0.5-1.5mL/min的流速泵入流动相，待流动相开始流出色谱柱时，将按1-10mg/mL的质量浓度溶于流动相的提取液由进样阀进样，进入样品分离状态，同时设置紫外检测波长为280nm，然后根据检测器紫外谱图，收集老鹳草素馏分。高速逆流色谱法(HSCCC) 是目前分离性质相近、容易变性的化合物的一种较好的方法，老鹳草素在本实施方式用溶剂系统中分配系数合适，能够实现老鹳草素的较好分离，提高老鹳草素馏分的纯度和回收率，经HPLC检测，老鹳草素馏分的纯度至少可达94％，回收率至少可达90％。老鹳草素馏分进一步提纯可得到99％以上的纯品老鹳草素。
于本发明一实施方式中，老鹳草素通过调节维生素D-FGF-23-Klotho轴因子 25(OH)VD3、1,25(OH)VD3、FGF-23、Klotho水平，改善维生素D异常的代谢。
根据本发明一实施方式，老鹳草素和橙皮苷使成骨细胞VDR基因和/或蛋白的表达量上调，以便激活VDR信号通路，促进成骨细胞的增殖和分化、抑制破骨细胞的骨吸收或者抑制骨钙释放。优选地，老鹳草素和橙皮苷使VDR基因和 /或VDR蛋白表达量至少上调2.5倍。
于本发明一实施方式中，老鹳草素使骨密度增加。
于本发明一实施方式中，老鹳草素使成骨细胞VDR基因和/或蛋白的表达量上调。老鹳草素能够上调成骨细胞维生素D受体(VDR)基因和/或蛋白的表达量，激活VDR信号通路，以实现激活VDR信号通路的目的，从而促进成骨细胞的增殖和分化、抑制破骨细胞的骨吸收或者抑制骨钙释放，促进骨骼的形成。亦即，老鹳草素可能通过调节维生素D轴促进VDR蛋白表达而改善维生素D 缺乏。
于本发明一实施方式中，维生素D不足和/或缺乏疾病为骨质疾病。优选的，骨质疾病包括：骨质疏松、佝偻病、骨质软化病、骨损伤、手足痉挛症、骨钙流失、骨骼发育不全和骨骼异样。
本发明一实施方式还提供了一种用于治疗维生素D不足和/或缺乏疾病的药物，包含，老鹳草素。
根据本发明一实施方式，药物用于调节维生素D-FGF-23-Klotho轴因子 25(OH)VD3、1,25(OH)VD3、FGF-23、Klotho水平。
根据本发明一实施方式，药物还包括橙皮苷。老鹳草素和橙皮苷的联和使用能够进一步提高老鹳草素的作用效果。优选的，老鹳草素和橙皮苷的重量比为 1:0.01-0.5。
于本发明一实施方式中，药物还包含选自以下的一种或多种药剂：维生素C、维生素A、维生素D、维生素B1、维生素B2、维生素B6、泛酸、叶酸、乳酸钙、钙和镁。优选的，药物还包含维生素D和乳酸钙。
于本发明一实施方式中，药物还包含药学上能够接受的载体和/或赋形剂和/ 或稀释剂。可以包含的载体、赋形剂及稀释剂有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
于本发明一实施方式中，药物为经口组合物。药物的形式为粉状、丸状、颗粒状、片状、胶囊状、混悬状、液状、乳状或糖浆状等。固体状药物中混合至少一种以上的赋形剂，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等而制造。而且，除了简单的赋形剂以外，也使用如硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂。液状药物除了常用的简单稀释剂，例如水、液状石蜡以外，可以包含多种赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。
本发明一实施方式还提供了上述药物的用法，按照每日1-200mg老鹳草素的量施用药物。优选，每天1次或分为2-4次施用。
于本发明一实施方式中，药物以摄取9-12周或更久的方式施用。
本发明一实施方式还提供了老鹳草素和橙皮苷在制备用于治疗维生素D不足和/或缺乏疾病的药物中的用途。
本发明一实施方式还提供了老鹳草素和橙皮苷在制备用于治疗骨质疏松症合并糖尿病的药物中的用途。骨质疏松本身难以治愈，合并症糖尿病后对患者健康危害更为严重，老鹳草素和橙皮苷的联和使用能够明显降低患者血糖，提升治疗有效率，值得推广应用。优选的，糖尿病为II型糖尿病。
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
老鹳草素通过如下方法获得：
1)料液比为1:14将叶下珠粉中加入含有质量浓度为22％的硫酸铵和质量浓度为29％的乙醇的提取液中，在160W超声波下提取45min，以10000r/min离心 8min，上清液在分液漏斗中静置分层，经0.45μm微孔滤膜滤过，得提取液；
2)按体积比0.5:10:0.2:0.05:20将石油醚、乙酸乙酯、甲醇、柠檬酸铵、水配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡2h后，将上相和下相分开，取上相作为固定相，下相作为流动相；
3)将固定相以12mL/min的流量灌满高速逆流色谱仪的管柱，然后以 750r/min的转速正向运转高速逆流色谱仪的主机，同时以1.0mL/min的流速泵入流动相，待流动相开始流出色谱柱时，将按3mg/mL的质量浓度溶于流动相的提取液由进样阀进样，进入样品分离状态，同时设置紫外检测波长为280nm，然后根据检测器紫外谱图，收集老鹳草素馏分。经HPLC检测，老鹳草素馏分的纯度为95.2％，回收率为90.8％。
实施例2：
老鹳草素通过如下方法获得：
1)料液比为1:14将叶下珠粉中加入含有质量浓度为22％的硫酸铵和质量浓度为29％的乙醇的提取液中，在160W超声波下提取45min，以10000r/min离心 8min，上清液在分液漏斗中静置分层，经0.45μm微孔滤膜滤过，得提取液；
2)按体积比0.5:10:0.2:20将石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡2h后，将上相和下相分开，取上相作为固定相，下相作为流动相；
3)将固定相以12mL/min的流量灌满高速逆流色谱仪的管柱，然后以 750r/min的转速正向运转高速逆流色谱仪的主机，同时以1.0mL/min的流速泵入流动相，待流动相开始流出色谱柱时，将按3mg/mL的质量浓度溶于流动相的提取液由进样阀进样，进入样品分离状态，同时设置紫外检测波长为280nm，然后根据检测器紫外谱图，收集老鹳草素馏分。经HPLC检测，老鹳草素馏分的纯度为89.7％，回收率为82.5％。
对比实施例1和实施例2可知，老鹳草素在实施例1用溶剂系统中分配系数合适，能够实现老鹳草素的较好分离，提高老鹳草素馏分的纯度和回收率。
实施例3：
老鹳草素对维生素D日本长耳大鼠骨代谢的影响
1.实验动物：
40只3月龄清洁级雄性SD雌性大鼠，体质量(180±20)g，购自上海斯莱克实验动物有限公司[实验动物合格证号：SCXK(沪)2003-0003]。
2.造模与分组
将40只大鼠适应性饲养7天后，随机分为正常对照组、缺乏维生素D模型组、缺乏维生素D+10mg/kg·d老鹳草素治疗组共3组，每组10只。缺乏维生素D模型组、缺乏维生素D+10mg/kg·d老鹳草素治疗1组、缺乏维生素 D+10mg/kg·d老鹳草素+2.5mg/kg·d橙皮苷治疗2组、缺乏维生素D+2.5mg/kg·d 橙皮苷治疗3组使用缺乏维生素D的饲料喂养，自由饮用清洁过滤水，置暗室喂养，建立维生素D缺乏大鼠模型。正常对照组大鼠使用普通饲料喂养，自由饮用清洁过滤水，每日正常光照12h，不做任何处理，为正常健康大鼠。饲养环境为清洁级。药物干预与造模同时进行。喂食10周后进行血清生化指标检测。
3.结果分析
3.1 血清中碱性磷酸酶、血清钙及磷浓度检测
大鼠血清中碱性磷酸酶、血清钙及磷浓度采用全自动生化分析仪测定，结果如表1，可以看出，与正常对照组相比，缺乏维生素D模型组大鼠血清中血清钙及磷含量较低、碱性磷酸酶含量较高；与模型组相比，治疗1组和治疗3组大鼠血清中血清钙及磷含量较高、碱性磷酸酶含量较低，差异具有统计学意义；与模型组相比，治疗2组大鼠血清中血清钙及磷含量和碱性磷酸酶含量变化不大；此外，与模型组相比，治疗1组大鼠血清中血清钙及磷含量较高、碱性磷酸酶含量较低，差异具有统计学意义。以上说明老鹳草素可提高维生素D缺乏大鼠的血清钙、磷水平，降低碱性磷酸酶水平，可有效改善维生素D缺乏大鼠血清中血清钙及磷含量较高、碱性磷酸酶含量较低，调控血清钙、磷及碱性磷酸酶稳态，最终起到增加维生素D含量的作用；橙皮苷对维生素D缺乏大鼠的血清钙、磷水平及磷酸酶水平几乎无影响；而老鹳草素中橙皮苷的加入能够进一步增强老鹳草素对维生素D缺乏大鼠血清中血清钙、磷和碱性磷酸酶的作用效果。
表1 各组动物血清中碱性磷酸酶、血清钙及磷浓度
Figure BDA0002361561850000081
Figure BDA0002361561850000091
注：a表示与正常对照组有统计学差异(P<0.05)，b表示与模型对照组有统计学差异(P<0.05)， c表示与模型对照组有统计学差异(P<0.05)。
3.2 血清中D-FGF-23-Klotho轴因子水平检测
使用电化学发光免疫分析法检测大鼠血清维生素D-FGF-23-Klotho轴因子中 25(OH)VD3、1,25(OH)VD3、FGF-23、Klotho水平。血清中25(OH)VD3、 1,25(OH)VD3、FGF-23、Klotho检测结果如表2，可以看出，与正常对照组相比，缺乏维生素D模型组大鼠血清中25(OH)VD3、1,25(OH)VD3、Klotho含量较低，FGF-23含量较高；与模型组相比，治疗1组和治疗2组大鼠血清中25(OH)VD3、 1,25(OH)VD3、Klotho含量较高，FGF-23含量较低，差异具有统计学意义；与模型组相比，治疗3组大鼠血清中25(OH)VD3、1,25(OH)VD3、Klotho和FGF-23 含量变化较小；且与治疗1组相比，治疗2组大鼠血清中25(OH)VD3、 1,25(OH)VD3、Klotho含量更高，FGF-23含量更低，差异具有统计学意义。以上说明老鹳草素可调节维生素D缺乏大鼠血清中维生素D-FGF-23-Klotho轴因子 25(OH)VD3、1,25(OH)VD3、FGF-23、Klotho水平，改善维生素D异常的代谢橙皮苷对维生素D缺乏大鼠血清中维生素D-FGF-23-Klotho轴因子25(OH)VD3、 1,25(OH)VD3、FGF-23、Klotho水平无明显影响；但是老鹳草素中橙皮苷的加入能够更进一步促进老鹳草素对维生素D缺乏大鼠血清中维生素D-FGF-23-Klotho 轴因子的作用效果。
表2 各组动物血清中D-FGF-23-Klotho轴因子水平
Figure BDA0002361561850000092
注：a表示与正常对照组有统计学差异(P<0.05)，b表示与模型对照组有统计学差异(P<0.05)， c表示与模型对照组有统计学差异(P<0.05)。
3.3 大鼠骨代谢指标检测
使用电化学发光免疫分析法检测大鼠骨代谢指标BAP、TRAP5b、BGP水平。采用断头法处死大鼠，摘取大鼠左侧股骨，采用双能X线骨密度测定仪进行测定大鼠骨密度：包括大转子、干部、骺部，取三者平均值，计算平均骨密度。骨代谢指标BAP、TRAP5b、BGP和骨密度的检测结果如表3，可以看出，与正常对照组相比，缺乏维生素D模型组大鼠BAP和TRAP5b水平上升，BGP和骨密度水平下降；与模型组相比，治疗1组和治疗2组大鼠BAP和TRAP5b水平下降，BGP和骨密度水平上升，差异具有统计学意义；与模型组相比，治疗3组大鼠BAP和TRAP5b水平以及BGP和骨密度水平无明显变化；且与治疗1组相比，治疗2组大鼠血清中BAP和TRAP5b水平稍有上升，BGP和骨密度水平稍有下降，差异具有统计学意义。以上说明老鹳草素可调节维生素D缺乏大鼠骨代谢指标BAP、TRAP5b、BGP以及骨密度水平，从而改善因维生素D不足和/ 或缺乏所导致的疾病，橙皮苷对维生素D缺乏大鼠骨代谢指标BAP、TRAP5b、BGP以及骨密度水平影响不大；但是老鹳草素中橙皮苷的加入能够更进一步促进老鹳草素对维生素D缺乏大鼠对骨代谢指标的作用效果。
表3 大鼠骨代谢指标检测
组别 BAP(U/L) TRAP5b(U/L) BGP(μg/L) 骨密度(g/cm<sup>2</sup>)
正常对照组 58.53±2.37 4.80±0.58 54.37±5.65 1.47±0.05
模型对照组 113.37±9.77 10.04±1.05 27.39±3.11 0.91±0.03
治疗1组 73.63±4.56<sup>ab</sup> 5.47±0.77<sup>ab</sup> 48.55±4.27<sup>ab</sup> 1.24±0.07<sup>ab</sup>
治疗2组 59.43±4.14<sup>abc</sup> 5.01±0.78<sup>abc</sup> 44.01±3.34<sup>abc</sup> 1.42±0.08<sup>abc</sup>
治疗3组 100.12±8.57 8.96±1.11 27.55±3.27 1.02±0.04
注：a表示与正常对照组有统计学差异(P<0.05)，b表示与模型对照组有统计学差异(P<0.05)， c表示与模型对照组有统计学差异(P<0.05)。
实施例4：
老鹳草素对成骨细胞VDR基因和蛋白表达量的影响
1.成骨细胞：MC-3T3-E1小鼠胚胎成骨细胞购买于中国科学院细胞库。
2.成骨细胞培养与分组
将成骨细胞单层贴壁生长在含有10％胎牛血清的DMEM基础培养基中，置于37℃、5％CO2条件下传代培养。将对数生长期的成骨细胞随机分为5组，正常对照组(加入培养基正常培养无其他干预因素)、试验1组(加入的培养基中含有1μg/mL老鹳草)、试验2组(加入的培养基中含有1μg/mL老鹳草和0.25μg/mL 橙皮苷)、试验3组(加入的培养基中含有0.25μg/mL橙皮苷)，将对数生长期的成骨细胞接种于孔板中，加入培养基，培养24h后去掉旧的培养液，PBS漂洗3 次。
3.结果分析
3.1 RT-PCR法检测老鹳草素对成骨细胞VDR基因表达量的影响
分别提取上述漂洗后成骨细胞，Trizol提取细胞总RNA，按照试剂盒(PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒(批号 DRR047S，日本Takara公司))说明书加样进行逆转录反应，ABI 7300型荧光定量PCR仪扩增，扩增条件:预变性:95℃，10min；变性:95℃，15s；退火温度:60℃， 15s；延伸:72℃，35s。循环次数:40个。引物序列见表4，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用仪器自带的分析软件得到各样本、各基因扩增的Ct值，以β-actin为内参照基因，目的基因相对表达量RQ＝2-△△Ct。成骨细胞VDR基因的表达量如图2所示，与正常对照组相比，试验1组和试验2组成骨细胞VDR基因的表达量显著上升(使VDR基因表达量至少上调3倍)，但是试验3组成骨细胞VDR基因的表达量变化不明显。以上结果说明橙皮苷的单独使用对成骨细胞VDR基因的表达量影响不大，而老鹳草素能够显著上调成骨细胞VDR基因的表达量，且老鹳草素和橙皮苷的共同加入能够进一步上调成骨细胞VDR基因的表达量。
表4 RT-PCR法检测用引物序列
组别 引物
β-actin-F 5’-ACTGCTGAGCTTTGGGGAGC-3’
β-actin-R 5’-GCATGCTGCTAATATCACGA-3’
VDR-F 5’-GACCTACGTAATCGATCGAC-3’
VDR-R 5’-GCACAGTCGTACGTATAGCA-3’
3.2 Western Blot法检测老鹳草素和橙皮苷对成骨细胞VDR蛋白表达的影响
分别提取上述漂洗后成骨细胞，按细胞蛋白提取试剂盒说明进行成骨细胞蛋白提取，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，将制备好的蛋白样品加入10％的凝胶中电泳，转至PVDF膜，10％脱脂牛奶封闭2h，加入一抗(1:100)，4℃过夜，TBST 洗膜，10min×3，加入二抗(1:200)，室温孵育2h，TBST洗膜，10min×3，ECL 发光显影。将胶片进行扫描，凝胶成像系统分析结果。目的蛋白相对表达量＝目的蛋白表达量/同一样本内参表达量。各组细胞中VDR蛋白表达水平如图3和图4，可以看出，与正常对照组相比，试验1组和试验2组成骨细胞VDR蛋白的表达量显著上升，而试验3组成骨细胞VDR蛋白的表达量物无显著变化，使 VDR基因蛋白至少上调3倍。以上结果说明橙皮苷的单独使用对成骨细胞VDR 蛋白的表达量影响不大，老鹳草素能够显著上调成骨细胞VDR蛋白的表达量，而老鹳草素和橙皮苷的共同加入能够进一步上调成骨细胞VDR蛋白的表达量。
实施例5：
一种用于治疗维生素D不足和/或缺乏疾病的药物，包含老鹳草素。按照每日30mg老鹳草素的量施用药物，每天分为3次施用。
实施例6：
一种用于治疗维生素D不足和/或缺乏疾病的药物，包含重量比为1:0.25的老鹳草素和橙皮苷。按照每日30mg老鹳草素的量施用药物，每天分为3次施用。
实施例7：
治疗骨质疏松症合并糖尿病的药物，包含重量比为1:0.25的老鹳草素和橙皮苷。
实施例8：
老鹳草素和橙皮苷治疗骨质疏松症合并糖尿病
选择150例骨质疏松症合并糖尿患者根据临床治疗方法不同随机平分为3 组，其中治疗1组：老鹳草素；治疗2组：橙皮苷；治疗3组:使用老鹳草素和橙皮苷。对3组患者性别、年龄、体质量、发病时间、并发症等非处理研究做统计学分析，差异均无统计学意义，P＞0.05，具有可比性。所有患者均进行常规的基础治疗，包括健康教育、量化饮食控制、有规律的运动，并给予降血糖药物或胰岛素注射液进行基础降糖治疗。其中治疗1组患者，老鹳草素，30mg，3 次/d，口服。治疗2组：橙皮苷，7.5mg，3次/d，口服。治疗3组：使用30mg 老鹳草素和7.5mg橙皮苷，3次/d。3组均以2周为1个疗程，观察4个疗程。观察治疗前后空腹血糖和腰椎骨密度，结果分别如图5和图6所示。从图5可以看出，治疗1组和治疗2组患者治疗后空腹血糖稍有降低，但是效果不好；治疗 2组患者治疗后空腹血糖显著降低。从图6可以看出，治疗1组和治疗2组患者治疗后腰椎平均骨密度显著提高，且治疗2组的效果明显优于治疗1组，而治疗 3组提高不明显。以上结果表明，老鹳草素和橙皮苷的共同治疗时能够达到较好的控制血糖的效果，同时能够提高患者的骨密度，可以实现治疗骨质疏松时辅助血糖的控制。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (10)

1.老鹳草素在制备用于治疗维生素D不足和/或缺乏疾病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述老鹳草素为老鹳草素单体和/或老鹳草素盐。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述老鹳草素通过调节维生素D-FGF-23-Klotho轴因子25(OH)VD3、1,25(OH)VD3、FGF-23、Klotho水平，改善维生素D异常的代谢。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述老鹳草素使骨密度增加。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述使成骨细胞VDR基因和/或蛋白的表达量上调。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述维生素D不足和/或缺乏疾病为骨质疾病。优选的，所述骨质疾病包括：骨质疏松、佝偻病、骨质软化病、骨损伤、手足痉挛症、骨钙流失、骨骼发育不全和骨骼异样。
7.一种用于治疗维生素D不足和/或缺乏疾病的药物，包含，权利要求1所述老鹳草素。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于：所述药物还包括橙皮苷。
9.老鹳草素和橙皮苷在制备用于治疗维生素D不足和/或缺乏疾病的药物中的用途。
10.老鹳草素和橙皮苷在制备用于治疗骨质疏松症合并糖尿病的药物中的用途。
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