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CN111041033A - 重组人生长激素及其真核系统表达方法 - Google Patents

重组人生长激素及其真核系统表达方法 Download PDF

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CN111041033A
CN111041033A CN201811186317.3A CN201811186317A CN111041033A CN 111041033 A CN111041033 A CN 111041033A CN 201811186317 A CN201811186317 A CN 201811186317A CN 111041033 A CN111041033 A CN 111041033A
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hgh
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human growth
expression
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范宇
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ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
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Abstract

本发明涉及一种重组人生长激素及其真核系统表达方法，尤其涉及一种针对毕赤酵母表达系统进行了基因优化的重组人生长激素编码基因序列，该序列更利于hGH在毕赤酵母中表达；同时，在所述基因序列前依次有专为hGH在毕赤酵母中表达所设计的间隔短肽序列及信号肽序列。本发明通过对hGH基因、信号肽和间隔短肽的优化使得在毕赤酵母中表达的hGH比优化前表达量有明显提高，所述信号肽和短肽在设计和使用时可以加在载体上也可以加在目的蛋白的核苷酸序列上；同时制备得到的hGH原蛋白活性与市售商品相比具有一致的生物学活性，从而使本发明的hGH具有了产业化的应用前景。

Description

重组人生长激素及其真核系统表达方法
技术领域
本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组人生长激素及其真核系统表达方法。
背景技术
人生长激素(Human Growth Hormone,以下简写为hGH)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素，是人类出生后促进生长的最重要的激素，具有调节人体生长代谢等多重功能。hGH含有191个氨基酸残基，分子量为22kDa左右，分子中无糖基化，分子在Cys53-Cys165和Cys182-Cys189之间各由一对硫键连接，这两个二硫键对形成正确的蛋白质分子的构象十分重要。hGH具有广泛的生理功能，几乎能影响所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组织、脑组织及造血系统；在人体生长发育过程中起着重要作用，能够促进骨骼、内脏和全身生长，还能促进蛋白质合成，加快脂肪和矿物质代谢。hGH基因工程产品问世以来，适应症范围扩大到成人生长激素缺乏、Turner氏综合症、艾滋病消瘦、大面积创伤恢复等症状。随着临床研究的不断深入，生长激素在抗衰老、骨质疏松症、心血管疾病治疗方面也有很好的疗效。
全球生长激素市场非常巨大，目前欧美生长激素市场成熟，包括诺和诺德、辉瑞、礼来、默克雪兰诺和罗氏在内的5家巨头，在2013年就占据了全球95％的市场。而国内生长激素正处于爆发期。数据显示，目前国内生长激素市场2007-2013年的复合增长率高达31％，终端市场销售到目前已经超过12亿元。预计到2020年全球市场为80亿美元。目前利用DNA重组技术在大肠杆菌中表达的重组人生长激素，一种是生产胞内型的重组人生长激素；另一种是生产分泌型的重组人生长激素。生长激素在大肠杆菌宿主内部一般以包涵体形式进行表达，表达量通常可以达到1g/L以上。但是大肠杆菌重组表达外源蛋白一般会在蛋白的N端加入起始密码子，与天然蛋白相比多了起始氨基酸-蛋氨酸，应用该生长激素后易产生抗体；另一种方法是在大肠杆菌中进行分泌表达，但由于大肠杆菌无翻译后修饰的功能，得到的蛋白结构上与天然蛋白有一定差异。在酵母系统中hGH的表达也有许多研究，如上海新生源(中国专利号： CN101139583A)，王鹏等(2008年)，朱振洪等(2009年)均在酵母系统中进行了成功表达，但表达量均较低，难以实现产业化。
发明内容
为了克服以上缺点，发明人对hGH基因在毕赤酵母表达系统中进行了优化，并对其信号肽及间隔短肽进行了优化，发明人惊喜地发现，优化后hGH具有更高的表达量。具体如下：
本发明的第一个目的是重组人生长激素，其由如SEQ ID NO.5所示的基因序列编码表达。该序列针对毕赤酵母表达系统进行了密码子优化，其更利于hGH在毕赤酵母中表达。
优选的，在如SEQ ID NO.5所示的基因序列前依次有如SEQ ID NO.2所示的间隔短肽序列及SEQ ID NO.4所示的信号肽序列。
一种含有上述基因序列的载体。
所述载体优选为pPICZαA载体。
一种包含上述所述载体的毕赤酵母菌株，优选的，所述毕赤酵母菌株为X-33菌株。
本发明的另一个目的是提供一种hGH蛋白的表达方法，所述方法包含下述步骤：
A.构建含有上述编码hGH基因的pPICZαA载体；
B.将步骤A的载体线性化后转入X-33毕赤酵母菌株中，并在合适的条件下培养；
C.回收纯化蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种重组hGH蛋白纯化方法，所述纯化方法如下：
A.将hGH摇瓶培养液进行超滤；
B.首先用平衡缓冲液平衡柱子，接着运用纯化系统将步骤A中预处理获得的hGH发酵液通过预装柱或者分离填料，然后运用洗脱缓冲液线性洗脱，收集洗脱峰，所述平衡缓冲液为 50mM NaAc，pH4.5，洗脱缓冲液为50mM NaAc，1.0M NaCl，pH4.5；
C.将B中收集到的hGH蛋白加入磷酸二氢钠和硫酸铵，使其终浓度分别为20mM和1.0M， pH7.5，然后用洗脱缓冲液线性洗脱，收集洗脱峰，即获得了纯化的hGH蛋白。所述平衡缓冲液为1.0M(NH4)2SO4，20mM NaH2PO4，pH7.5，洗脱缓冲液为20mM NaH2PO4，pH7.5。
上述纯化工艺为阳离子、疏水两步层析方法，填料优选为Hitrap SP HP和HitrapPhenyl HP。
本发明的技术效果主要有：
本发明通过对hGH基因、信号肽和间隔短肽的优化使得在毕赤酵母中表达的hGH比优化前表达量有明显提高，所述信号肽和短肽在设计和使用时可以加在载体上也可以加在目的蛋白的核苷酸序列上；同时制备得到的hGH原蛋白活性与市售商品相比具有一致的生物学活性。
附图说明
图1为重组hGH不同表达质粒构建过程图，
其中图1-a为含酿酒酵母α-factor信号肽和间隔短肽的hGH表达质粒pPICZα-hGH构建过程图；其中图1-b为含hGH自身信号肽和间隔短肽的hGH表达质粒pPICZ-sp-hGH(sp表示hGH自身信号肽)构建过程图。
图2为不同重组hGH表达载体毕赤酵母X-33菌株小量诱导SDS-PAGE凝胶电泳鉴定图，图中箭头所指即为重组hGH蛋白，
其中图2-a为pPICZα-1EA-hGH表达载体不同X-33单克隆菌株表达一周后上清SDS-PAGE 电泳图；其中，泳道1-2,4-10为不同单克隆上清，泳道3为非预染蛋白marker。
其中图2-b为pPICZα-3EA-hGH表达载体不同X-33单克隆菌株表达一周后上清SDS-PAGE 电泳图；其中，泳道1-3,5-10为不同单克隆上清，泳道4为非预染蛋白marker。
其中图2-c为pPICZα-5EA-hGH表达载体不同X-33单克隆菌株表达一周后上清SDS-PAGE 电泳图；其中，泳道1-2,4-10为不同单克隆上清，泳道3为非预染蛋白marker。
其中图2-d为pPICZ-sp-1EA-hGH表达载体不同X-33单克隆菌株表达一周后上清SDS-PAGE电泳图；其中，泳道1为非预染蛋白marker，泳道2-10为不同单克隆上清。
其中图2-e为pPICZ-sp-3EA-hGH表达载体不同X-33单克隆菌株表达一周后上清SDS-PAGE电泳图；其中，泳道2为非预染蛋白marker，泳道1,3-10为不同单克隆上清。
其中图2-f为pPICZ-sp-5EA-hGH表达载体不同X-33单克隆菌株表达一周后上清SDS-PAGE电泳图；其中，泳道3为非预染蛋白marker，泳道1-2,4-10为不同单克隆上清。
图3-a，3-b为hGH蛋白第一步阳离子层析纯化图。
其中图3-a为hGH蛋白阳离子层析纯化色谱图；图3-b为hGH蛋白经阳离子层析纯化后 SDS-PAGE电泳图，泳道1为15-100KD非预染蛋白Marker，泳道2hGH蛋白摇瓶样品，泳道3为纯化穿透样品，泳道4-6为洗脱峰1，泳道7为洗脱峰2。
图4-a，4-b为hGH蛋白第二步疏水层析纯化图。
其中图4-a为hGH蛋白疏水层析纯化色谱图；图4-b为hGH蛋白经疏水层析纯化后SDS-PAGE电泳图，泳道1为11-100KD非预染蛋白Marker，泳道2hGH蛋白疏水纯化前样品，泳道3为纯化穿透样品，泳道4-8为洗脱峰1，泳9-10为洗脱峰2。
图5为hGH样品与对照安苏萌连续给药9天大鼠体重增加结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：不同重组hGH表达载体构建
1.含酿酒酵母α-factor信号肽、间隔短肽的重组hGH表达载体构建
发明人根据GenBank已公开的hGHcDNA序列(GenBank登录号：E00141)，对该基因进行密码子优化后得到本发明的不含hGH自身信号肽的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，构建到pUC57质粒(由南京金斯瑞科技有限公司提供)中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-hGH质粒。
以pUC57-hGH质粒为模板，在Xho I酶切位点后插入不同间隔短肽EA，进行PCR扩增，所用引物如下：
含有如SEQ ID NO.1所示的间隔短肽的重组hGH上游扩增引物(SEQ ID NO.9)
P1:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTTTTCCAACTATTCCATTG
含有如SEQ ID NO.2所示的间隔短肽的重组hGH上游扩增引物(SEQ ID NO.10)
P2:CCGCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCTGAGGCTTTTCCAACTATTCCATTG
含有如SEQ ID NO.3所示的间隔短肽的重组hGH上游扩增引物(SEQ ID NO.11)
P3:CCGCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCTGAGGCTGAAGCTGAGGCTTTTCCAAC TATTCCATTG
通用下游扩增引物：(SEQ ID NO.12)
P4:AAGGAAAAAATCTAGATCAGAAACCACAAGAACC
反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶为Q5(购自New England Biolabs公司)，2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃5 秒、55℃45秒、72℃30秒，25个循环后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期大小(576bp)一致。分别用Xba I(R0145S，购自New England Biolabs公司)和Xho I(R0189S，购自New England Biolabs公司)双酶切后，1％琼脂糖电泳，得到的基因产物用 DNA凝胶回收试剂盒(DP214，北京天根生化科技有限公司)纯化。用T4连接酶(M0202S，购自New England Biolabs)连接到pPICZαA质粒(V173-20，购自Invitrogen公司)中，转化到DH5α感受态细胞(CB101，购自北京天根生化科技有限公司)中，在含有博来霉素(购自Invitrogen公司)的LB固体培养基中37℃培养过夜。第二天挑取阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到含酿酒酵母α-factor信号肽和不同个数间隔短肽的重组hGH表达质粒，分别记为pPICZα-1EA-hGH，pPICZα-3EA-hGH，pPICZα-5EA-hGH。(质粒构建如图1-a所示)。
2.hGH自身信号肽和不同间隔短肽的重组hGH表达载体构建
发明人根据GenBank已公开的hGHcDNA序列(GenBank登录号：E00141)，对该基因进行密码子优化后得到本发明的含有hGH自身信号肽的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，构建到pUC57质粒(由南京金斯瑞科技有限公司提供)中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-sp-hGH质粒。以pUC57-sp-hGH质粒为模板，通过PCR引入Xho I 和Not I酶切位点，在Xho I酶切位点后插入不同间隔短肽EA，进行PCR扩增，所用引物如下：
含有1个间隔短肽EA的重组hGH上游扩增引物(SEQ ID NO.15)
P5:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTATGGCTACTGGTTCCAGA
含有3个间隔短肽EA的重组hGH上游扩增引物(SEQ ID NO.16)
P6:CCGCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCTGAGGCTATGGCTACTGGTTCCAGA
含有5个间隔短肽EA的重组hGH上游扩增引物(SEQ ID NO.17)
P7:CCGCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCTGAGGCTGAAGCTGAGGCTATGGCTAC TGGTTCCAGA
通用下游扩增引物：(SEQ ID NO.18)
P8:AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCAGAAACCACAAGAACC
构建过程与1.1基本相同；第二天挑取阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到含hGH自身信号肽和不同间隔短肽的重组hGH表达质粒，分别记为pPICZ-sp-1EA-hGH(质粒构建如图1-b所示)，pPICZ-sp-3EA-hGH，pPICZ-sp-5EA-hGH。
实施例2：不同重组hGH工程菌株的诱导表达
2.1重组hGH宿主工程菌株的筛选：
按照Invitrogen公司Easy SelectPichia Expression Kit说明书的方法将X-33毕赤酵母菌株制备成电感受态细胞。将实施例1得到6种质粒，用Sac I限制性内切酶(R0156S，购自New England Biolabs)酶切线性化，乙醇沉淀后将线性化载体，电转化进入到毕赤酵母感受态细胞中，涂布于YPDS固体培养基，30℃培养直到转化子长出后。
YPDS固体培养基配制：Invitrogen公司Easy SelectPichia Expression Kit说明书提供，其中酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂糖15g/L，182g/L。
2.2重组hGH工程菌株甲醇诱导表达
挑取2.1获得的宿主单克隆工程菌于5mL BMGY培养基中，于50mL无菌离心管中30℃， 220rpm培养，至OD600＝1.0-2.0时，取1mL保存菌种，并将剩余菌液重悬后转移到BMMY中小量诱导表达，每隔24h补加甲醇至终浓度为1％。一周后，离心收集菌液上清，SDS-PAGE凝胶电泳鉴定表达量，观察表达产物条带亮度，图2为hGH基因密码子优化后、含不同间隔短肽及信号肽的重组hGH工程菌株诱导表达鉴定图；经Quantity One软件灰度扫描，以BSA为对照计算表达量，各重组hGH菌株单克隆最大表达量图表1所示；表1结果所示加入间隔短肽后均可以提高hGH蛋白表达量，采用α-factor和3EA的组合得到的hGH蛋白表达量最高。此外，相比密码子优化前，hGH基因在优化后表达量明显高于优化前，例如同为含有如SEQ IDNO.2所示的间隔短肽及α-factor信号肽，密码子优化前hGH表达量仅有10mg/L左右，密码子优化后hGH表达量为50-60mg/L。
表1.不同重组hGH菌株最高表达量
Figure RE-GDA0001866474940000061
BMGY培养基配制：Invitrogen公司Easy SelectPichia Expression Kit说明书提供，其中酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO43g/L，KH2PO411.8g/L，YNB 13.4g/L，生物素4×10-4g/L，甘油10g/L。
BMMY培养基配制：Invitrogen公司Easy SelectPichia Expression Kit说明书提供，其中酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO43g/L，KH2PO411.8g/L，YNB13.4g/L，生物素4×10-4g/L，甲醇5mL/L。
实施例3：hGH重组蛋白的纯化
本专利主要采用两步法对hGH蛋白进行纯化，第一步采用阳离子层析对hGH进行富集和去除色素，第二步采用疏水换层析去除其他杂蛋白。具体步骤如下：
1.发酵液的预处理
按实施例2中方法得到的摇瓶上清用pH4.5，50mM NaAc缓冲液超滤稀释至电导<5mS/cm， 0.45μm滤膜过滤即得处理后纯化样品，可进行阳离子层析纯化。
2.阳离子层析纯化
将上述处理后的纯化样品上5ml Hitrap SP HP预装柱，平衡缓冲液为50mM NaAc，pH4.5，洗脱缓冲液为50mM NaAc，1.0M NaCl，pH4.5，按照0-100％线性洗脱，hGH蛋白主要集中在洗脱峰，图3-a为hGH阳离子层析纯化色谱图，图3-b为hGH阳离子层析SDS-PAGE分析图。
3.疏水层析纯化
2中收集的hGH蛋白样品加入磷酸二氢钠和硫酸铵，使其终浓度分别为20mM和1.0M，pH7.5， 0.45μm滤膜过滤即得纯化样品，样品上5ml HitrapPhenyl HP层析柱，平衡缓冲液为20mM PB， 1.0M(NH4)2SO4，pH7.5，洗脱缓冲液为20mM PB，pH7.5，按照0-100％线性洗脱，hGH蛋白主要集中在洗脱峰1，图4-a为hGH疏水层析纯化色谱图，图4-b为hGH疏水层析SDS-PAGE分析图。
实施例4：hGH蛋白活性测定
取同一来源、品系、性别，体重60-80g的健康大鼠，试验前2周手术摘除垂体，术后于屏障环境饲养恢复。去垂体后大鼠按体重随机分成4组，每组8只，每只编号并记录体重。分别皮下注射对照品溶液(安苏萌，安科生物)或本供试品溶液0.5ml，每日一次，连续6日。于最后一次给药后24h处死大鼠，每日称量体重。每只动物给药后体重增加的克数作为反应值对给药天数作图，如图5所示，本供试品与对照品所致反应的平均值基本一致，说明与市售产品相比，活性基本一致，详细数据见表2。
对照品溶液按标示效价用含0.1％牛血清白蛋白的0.9％氯化钠溶液制成1ml含0.2IU；供试品按照与对照品等质量估算效价，制成与对照品同等效价，溶液制备方法与对照品相同。对照品与供试品制备好后分装每日剂量并密封冻存于-20℃保存，临用前融化。
表2.hGH与安苏萌连续给药9天后大鼠体重增加值
Figure RE-GDA0001866474940000071
序列表
<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司
<120> 重组人生长激素及其真核系统表达方法
<130> 重组人生长激素及其真核系统表达方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gaagct 6
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gaagctgagg ctgaagct 18
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gaagctgagg ctgaagctga ggctgaagct 30
<210> 4
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tcttct 246
<210> 5
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
tttccaacta ttccattgtc cagattgttc gataacgcta tgttgagagc ccatagattg 60
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aagtactctt tcttgcaaaa ccctcaaact tctttgtgtt tctctgaatc tattccaact 180
ccttctaaca gagaagaaac tcaacaaaag tctaatttgg aattgttgag aatttctttg 240
ttgttgatcc aatcttggtt ggagccagtt caatttttga gatctgtttt cgctaactct 300
ttggtttatg gtgcttctga ttctaacgtt tacgatttgt tgaaggattt ggaagagggt 360
attcaaactt tgatgggtag attggaagat ggttctccta gaactggtca aatttttaag 420
caaacttact ctaagttcga tactaactct cataacgatg atgctttgtt gaaaaactac 480
ggtttgttgt actgtttcag aaaggatatg gataaggttg aaactttctt gagaatcgtt 540
caatgtagat ctgttgaggg ttcttgtggt ttctga 576
<210> 6
<211> 191
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
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130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
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<213> 人工序列()
<400> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
<210> 9
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
<210> 11
<211> 654
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
atggctactg gttccagaac ttctttgttg ttggcttttg gtttgttgtg tttgccttgg 60
ttgcaagaag gttctgcttt tccaactatt ccattgtcca gattgttcga taacgctatg 120
ttgagagccc atagattgca ccaattggct tttgatactt accaagaatt tgaagaggct 180
tatatcccaa aggagcaaaa gtactctttc ttgcaaaacc ctcaaacttc tttgtgtttc 240
tctgaatcta ttccaactcc ttctaacaga gaagaaactc aacaaaagtc taatttggaa 300
ttgttgagaa tttctttgtt gttgatccaa tcttggttgg agccagttca atttttgaga 360
tctgttttcg ctaactcttt ggtttatggt gcttctgatt ctaacgttta cgatttgttg 420
aaggatttgg aagagggtat tcaaactttg atgggtagat tggaagatgg ttctcctaga 480
actggtcaaa tttttaagca aacttactct aagttcgata ctaactctca taacgatgat 540
gctttgttga aaaactacgg tttgttgtac tgtttcagaa aggatatgga taaggttgaa 600
actttcttga gaatcgttca atgtagatct gttgagggtt cttgtggttt ctga 654
<210> 12
<211> 217
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
20 25 30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
35 40 45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
50 55 60
Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65 70 75 80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
100 105 110
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
115 120 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
130 135 140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145 150 155 160
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
165 170 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
180 185 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
195 200 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
210 215
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
<210> 14
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
<210> 15
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16

Claims (9)

1.编码重组人生长激素的基因序列，如SEQ ID NO.5所示。
2.一种重组人生长激素，其特征在于：其由如SEQ ID NO.5所示的基因序列编码表达。
3.根据权利要求1所述的重组人生长激素，其特征在于：在如SEQ ID NO.5所示的基因序列前依次有如SEQ ID NO.2所示的间隔短肽序列及SEQ ID NO.4所示的信号肽序列。
4.一种载体，其特征在于：含有如权利要求1所述的基因序列。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于：所述载体为pPICZαA载体。
6.一种毕赤酵母菌株，其特征在于：所述菌株包含权利要求3所述的载体，所述毕赤酵母菌株为X-33菌株。
7.一种重组人生长激素的表达方法，其特征在于：所述方法包含下述步骤：
A.构建如权利要求4所述的载体；
B.将步骤A的载体线性化后转入X-33毕赤酵母菌株中，并在合适的条件下培养；
C.回收纯化蛋白质。
8.一种重组人生长激素的纯化方法，所述纯化方法如下：
A.将权利要求7中培养液进行超滤；
B.首先用平衡缓冲液平衡柱子，接着运用纯化系统将步骤A中预处理获得的重组人生长激素发酵液通过预装柱或者分离填料，然后运用洗脱缓冲液线性洗脱，收集洗脱峰，所述平衡缓冲液为50mM NaAc，pH4.5，洗脱缓冲液为50mM NaAc，1.0M NaCl，pH4.5；
C.将B中收集到的重组人生长激素蛋白加入磷酸二氢钠和硫酸铵，使其终浓度分别为20mM和1.0M，pH7.5，然后用洗脱缓冲液线性洗脱，收集洗脱峰，即获得了纯化的重组人生长激素蛋白。所述平衡缓冲液为1.0M(NH4)2SO4，20mM NaH2PO4，pH7.5，洗脱缓冲液为20mMNaH2PO4，pH7.5。
9.根据权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化工艺为阳离子、疏水两步层析方法，填料为Hitrap SP HP和Hitrap Phenyl HP。
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