CN110997711A

CN110997711A - 用于鉴定表位的方法和组合物

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Publication number: CN110997711A
Application number: CN201880051295.1A
Authority: CN
Inventors: M·哈吉·徳兹夫立安; S·埃利奇; T·库拉
Original assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Current assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Priority date: 2017-06-08
Filing date: 2018-06-08
Publication date: 2020-04-10
Also published as: WO2018227091A1; US20240318168A1; CA3066645A1; EP3634992A1; AU2018279728A1; US20200102553A1; EP3634992B1; EP4414704A2; JP7682955B2; EP3634992A4; US11834653B2; JP2023153809A; AU2023248207A1; WO2018227091A9; EP4414704A3; JP7315478B2; JP2020523012A; AU2018279728B2

Abstract

一方面，本文描述一种抗原呈递细胞(APC)，其包含编码一种或多种候选抗原的外源核酸，其中所述一种或多种候选抗原与MHC I类或MHC II类分子一起表达并呈递；粒酶B(GzB)活性的分子报告子；和c)胱天蛋白酶激活的脱氧核糖核酸酶(CAD)介导的DNA降解、CAD敲除或胱天蛋白酶敲除(例如胱天蛋白酶3敲除)的外源抑制剂。另一方面，本文描述一种检测由抗原呈递细胞向细胞毒性淋巴细胞或NK细胞呈递已识别抗原的系统。

Description

用于鉴定表位的方法和组合物

优先权声明

本申请要求2017年6月8日提交的美国临时专利申请系列号62/516,977的权益。前述文献的完整内容因而通过引用的方式并入。

政府权利

本发明借助美国政府支持在美国国立卫生研究院资助的基金编号AI116833下做出。美国政府在本发明中享有某些权利。

技术领域

本文描述用于鉴定对T细胞如细胞毒性T细胞特异的靶抗原的方法和试剂。

背景技术

基于细胞介导免疫应答的免疫治疗方案可有效治疗疾病如癌症、自身免疫性疾病、传染性疾病等。但是，难以鉴定由致病细胞表达并在调节免疫应答中发挥作用的抗原。因此，需要鉴定对T细胞特异的靶抗原的方法，从而开发对抗疾病的疗法和疫苗。

发明内容

一方面，本文描述一种抗原呈递细胞(APC)，其包含a)编码一种或多种候选抗原的外源核酸，其中所述一种或多种候选抗原被表达并用MHC I类或MHC II类分子呈递；b)粒酶B(GzB)活性的分子报告子(molecular reporter)；和c)胱天蛋白酶(caspase)激活的脱氧核糖核酸酶(CAD)介导的DNA降解的外源抑制剂、CAD敲除或胱天蛋白酶敲除(例如，胱天蛋白酶3敲除)。

进一步提供众多实施方案，其中所述实施方案可以适用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合。例如，在多种实施方案中，将外源核酸稳定引入APC的基因组，任选地通过慢病毒载体、逆转录病毒载体或转座子稳定引入。在多种实施方案中，外源核酸在每侧上旁侧分布有(flanked by)预定的引物识别序列。在多种实施方案中，GzB活性的分子报告子包含融合多肽，所述融合多肽包含与检测分子连接的GzB切割位点(VGPD,SEQ ID NO:1)，如其中分子报告子包括修饰的红外荧光蛋白、膜系留的CRE重组酶(membrane tethered CRE recombinase)、基于抗体的GzB活性报告子、基于ER滞留的GzB活性报告子、基于细胞表面可检出的GzB活性报告子或其组合。在多种实施方案中，分子报告子包括膜系留的CRE重组酶，并且APC还包含旁侧分布有LoxP位点的反向CRE报告子，任选地其中外源核酸位于CRE激活的引物识别序列的近端。在多种实施方案中，CAD介导的DNA降解的外源抑制剂是以可表达形式编码胱天蛋白酶激活的脱氧核糖核酸酶的抑制剂(inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease,ICAD)基因的核酸；靶向CAD或胱天蛋白酶3的抑制性核酸；胱天蛋白酶3的小分子抑制剂；DNA酶化学抑制剂；或胱天蛋白酶3的肽或蛋白质抑制剂，或者胱天蛋白酶敲除是胱天蛋白酶3敲除。在多种实施方案中，APCi)不表达内源MHC分子并且经工程化以表达外源MHC分子和/或ii)选自由K 562细胞、HEK293细胞、HEK 293T细胞、U2OS细胞、MelJuso细胞、MDA-MB231细胞、MCF7细胞、NTERA2细胞、LN229细胞、树突状细胞和原代自体B细胞组成的组。在多种实施方案中，候选抗原的长度小于或等于8、9、10、11、20、30、50、100、200或300个氨基酸。在多种实施方案中，候选抗原的长度大于300个氨基酸。在多种实施方案中，编码候选抗原的外源核酸衍生自传染性生物或人DNA。在多种实施方案中，人DNA从癌细胞获得。在多种实施方案中，传染性生物选自由病毒、细菌、真菌、原虫和多细胞寄生性生物组成的组。

另一方面，本文描述一种APC的文库，所述APC例如如上文描述的APC，其中各个APC包含编码候选抗原的不同外源核酸，从而代表被表达并用MHC I类和/或MHC II类分子呈递的候选抗原的文库。

如前所述，进一步提供众多实施方案，其中所述实施方案可以适用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合。例如，在多种实施方案中，外源核酸衍生自传染因子(infectious agent)或人DNA。在多种实施方案中，文库包含约10²种至约10¹⁴种独立候选抗原。

另一方面，本文描述一种粒酶B活性的分子报告子，其包含融合多肽，所述融合多肽包含与检测分子连接的GzB切割位点(VGPD，SEQ ID NO:1)。

如前所述，进一步提供众多实施方案，其中所述实施方案可以适用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合。例如，在多种实施方案中，报告子不包括形成FRET对的一对荧光染料，或其中荧光团之一猝灭；不是完整的荧光团，例如，不是能够依赖自身发荧光的完整蛋白质；和/或不是隐色染料，例如，不是可以在两种化学形式之间切换的染料；其中之一为无色。在多种实施方案中，检测分子是酶、可检出标记物、抗体结合性抗原或亲和标签。在多种实施方案中，可检出标记物在GzB切割后可检出，其选自由红外荧光蛋白(IFP)、核酸扩增靶、抗体识别的组合物、从ER释放的组合物和在细胞表面存在的组合物组成的组。在多种实施方案中，IFP包含由GzB切割位点功能地分隔的N-片段(N-IFP)和C-片段(C-IFP)，并且还旁侧分布有位于C-IFP N末端的绿色荧光蛋白N-片段(N-GFP)、和位于N-IFP C末端的绿色荧光蛋白C-片段(C-GFP)，从而N-GFP和C-GFP有组成型活性。在多种实施方案中，酶是CRE重组酶，并且融合多肽包含功能性连接由GzB切割位点分隔的质膜附着肽的CRE重组酶。在多种实施方案中，亲和标签是相对于GzB切割位点的C末端存在的Flag表位，从而使所述表位仅在切割GzB位点时由M1 Flag抗体识别，并且任选地还包含相对于flag表位的C末端存在的GFP。在多种实施方案中，分子报告子包含内质网(ER)滞留信号和抗体结合性质膜蛋白，其中GzB位点的切割移除ER滞留信号，任选地其中抗原是CD40、CD4、CD19、CD20或加标签的蛋白质，任选地其中标签是Myc标签、Flag标签、HA标签或组氨酸标签。

另一方面，提供编码本文所述的分子报告子的核酸。

另一方面，本文描述一种检测抗原呈递细胞中粒酶B活性的系统，所述系统包含a)融合多肽，其包含功能性连接质膜附着肽的CRE重组酶，其中CRE重组酶和膜附着肽由GzB切割位点分隔；b)CRE活性报告子，其包含旁侧分布有LoxP位点的按头-对-头取向编码GFP和RFP的核酸序列；和/或c)以可表达形式编码候选抗原的核酸序列，其位于包含无活性引物的CRE激活的引物识别序列的近端，所述引物识别序列旁侧分布有LoxP位点，其中CRE诱导的LoxP位点重排产生有功能的引物识别序列。

类似地，另一方面，本文描述一种检测由抗原呈递细胞向细胞毒性淋巴细胞或NK细胞呈递已识别抗原的系统，所述系统包含a)抗原呈递细胞(APC)，其包含：i)编码候选抗原的外源核酸，其中候选抗原是被表达并用MHC I类和/或MHC II类分子呈递细胞毒性淋巴细胞和/或NK细胞；ii)本文所述的粒酶B(GzB)活性的分子报告子或用于检测本文所述的粒酶B活性的系统；和iii)CAD介导的降解的抑制剂；和b)细胞毒性淋巴细胞和/或NK细胞。

如前所述，进一步提供众多实施方案，其中所述实施方案可以适用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合。例如，在多种实施方案中，CAD介导的降解的抑制剂是CAD介导的DNA降解的外源抑制剂、CAD敲除或胱天蛋白酶敲除(例如，胱天蛋白酶3敲除)，任选地其中胱天蛋白酶敲除是胱天蛋白酶3敲除或者其中CAD介导的DNA降解的外源抑制剂是以可表达形式编码胱天蛋白酶激活的脱氧核糖核酸酶的抑制剂(ICAD)基因的核酸；靶向CAD或胱天蛋白酶3的抑制性核酸；胱天蛋白酶3的小分子抑制剂；或胱天蛋白酶3的肽或蛋白质抑制剂。在多种实施方案中，抗原呈递细胞选自由K 562细胞、HEK 293细胞、HEK 293 T细胞、U2OS细胞、MelJuso细胞、MDA-MB231细胞、MCF7细胞、NTERA2a细胞、树突状细胞和原代自体B细胞组成的组。在多种实施方案中，细胞毒性淋巴细胞选自由细胞毒性CD4T细胞和细胞毒性CD8 T细胞组成的组。在多种实施方案中，细胞毒性淋巴细胞和/或NK细胞经修饰以表达目的抗原受体。在多种实施方案中，细胞毒性淋巴细胞和/或NK细胞是已经过修饰以表达来自非细胞毒性CD4 T细胞的T细胞受体的细胞毒性T细胞和/或NK细胞。

另一方面，本文描述一种用于鉴定由细胞毒性T细胞和/或NK细胞识别的抗原的方法，所述方法包括a)使如本文所述的抗原呈递细胞(APC)或APC的文库与一种或多种细胞毒性T细胞(CTL)和/或NK细胞在适于抗原识别的条件下接触；b)通过分析APC中的粒酶B活性来鉴定表达已识别抗原的APC，其中如与适宜的对照相比，增加的粒酶B活性表示APC表达由细胞毒性T细胞和/或NK细胞识别的抗原；和c)从步骤b)中鉴定的APC分离出编码已识别抗原的核酸。

类似地，另一方面，本文描述一种用于鉴定由细胞毒性T细胞和/或NK细胞识别的抗原的方法，所述方法包括a)使如本文所述的抗原呈递细胞(APC)或APC的文库与一种或多种细胞毒性T细胞(CTL)和/或NK细胞在适于抗原识别的条件下接触，其中GzB位点的切割移除ER滞留信号并从ER释放质膜蛋白以运输至质膜；b)通过使APC与结合质膜蛋白的抗体接触来分离出表达已识别抗原的APC，并纯化结合抗体的APC；和c)从步骤b)中分离的APC分离出编码已识别抗原的核酸。

如前所述，进一步提供众多实施方案，其中所述实施方案可以适用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合。例如，在多种实施方案中，该方法还包括对分离的核酸测序。在多种实施方案中，细胞毒性T细胞和/或NK细胞从受试者的生物样品获得。在多种实施方案中，生物样品选自由血液、肿瘤、健康组织、腹水、自身免疫性部位、肿瘤浸润物、病毒感染部位、病灶、口腔粘膜和皮肤组成的组。在多种实施方案中，生物样品从受试者中的感染或自身免疫性反应性部位获得。在多种实施方案中，细胞毒性T细胞是CD4细胞或CD8细胞。在多种实施方案中，细胞毒性T细胞和/或NK细胞经修饰以表达目的抗原受体。在多种实施方案中，细胞毒性T细胞和/或NK细胞已经过修饰以表达来自非细胞毒性CD4 T细胞的T细胞受体。在多种实施方案中，鉴定步骤b)通过相对于对照的荧光信号，检出APC中增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多倍的荧光信号来进行。在多种实施方案中，使用流式细胞术或亲和纯化法进行鉴定步骤。在多种实施方案中，使用荧光激活细胞分选法(FACS)或亲和纯化法进行鉴定步骤。在多种实施方案中，通过PCR扩增进行分离步骤。在多种实施方案中，通过焦磷酸测序法或下一代测序法进行测序。在多种实施方案中，APC的文库包含至少5,000个不同的候选抗原。

定义

冠词“一个(a)”和“一种(an)”在本文中用来指该冠词的一个或多于一个(即，至少一个)的语法对象。例如，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。

“分离的(isolated)”意指不同程度地不含如其天然状态存下时通常伴随它的组分的材料。“分离(isolate)”指与原始来源或周围环境分离的程度。例如，分离的细胞可以从动物移出并置于培养皿或另一个动物中。“分离的”不一定要从全部其他细胞中移出。

对于如本文所用的分离的细胞群体，术语“分离的群体”指已经取自其天然环境(例如，身体内)并且已经移出并与混合或不均一的细胞群体分离的细胞群体(例如，在从天然环境移出的过程中，或其移出过程的子顺序或二者的组合)。在一些实施方案中，如与从中分离或富集细胞的不均一群体相比，分离的群体是基本上纯的细胞群体。在一些实施方案中，分离的群体是分离的细胞群体，其中如与包含所需细胞(例如，细胞毒性淋巴细胞)和掺杂性细胞(contaminating cell)的不均一细胞群体相比，所述细胞群体是基本上纯的细胞群体。这类细胞可以最初分离自成体或分离自不成熟的受试者(例如，自出生或从胚胎或正在发育的胎儿起≤18岁、或≤1岁、或≤1月龄或≤1天)。

对于具体细胞群体，术语“基本上纯的”指如下细胞群体，其相对于构成总细胞群体的细胞，是至少约50％、60％、70％、或75％、优选地至少约85％、更优选地至少约90％和最优选地至少约95％纯的。类似地，就细胞群体而言，术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”指如下的细胞群体，其含有少于约20％、更优选地少于约15％、10％、8％、7％、最优选地少于约5％、4％、3％、2％、1％或小于1％的掺杂性细胞。

抗原呈递细胞(APC)是可以通过MHC I类和/或MHC II类向免疫细胞(例如，细胞毒性免疫细胞)呈递抗原的任何细胞。APC在本文也称作APC靶、靶细胞或靶APC。通过表达稳定插入APC基因组中的外源核酸，修饰如本文所述那样使用的APC以呈递候选抗原。在一些实施方案中，APC是适于制备文库的细胞，所述文库编码如本文所述的候选抗原(例如，HEK293、HEK293T、U20S、K562、MelJuso、MDA-MB231、MCF7、NTERA2a、树突状细胞和原代(自体)B细胞)。

作为本文中使用的术语，细胞和受试者一般属于人。但是，还构思使用作为非人类动物的受试者和源自其中的细胞。术语“非人类动物”包括全部脊椎动物，包括而不限于哺乳动物(例如，羊、犬、牛、马、鸡、啮齿类(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、灵长类、犬、马、牛、猫、猪)和非哺乳动物两栖类、爬行类等。本文所述的细胞可以处于本文所述的任何这种受试者的背景中或否则分离自本文所述的任何这种受试者。非人灵长类也是可能的来源。熟练实施者将认识到，APC和细胞毒性淋巴细胞应当衍生自相同物种的受试者。

如本文所用，术语“抗原”指能够在宿主生物中诱导免疫应答并由T细胞特异性识别的分子。在一些实施方案中，抗原是肽。

如本文所用，术语“候选抗原”指由引入APC靶的外源核酸编码的肽，所述肽意图用于本文所述的筛选方法中。如本文所述，文库包括这样的靶细胞，其包含引入的候选抗原。

当本文中使用该术语时，“外源”指相对于细胞为外部或外来起源的材料(例如，来自细胞外部的插入细胞基因组中的核酸视为外源核酸)。

术语“核酸”、“核酸序列”、“核酸分子”和“多核苷酸”可以在本文互换使用并且指聚合物形式的任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物，并且可以包括天然存在的核苷酸和/或修饰的核苷酸。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、DNA、RNA、cDNA(互补性DNA)、mRNA(信使RNA)、rRNA(核糖体RNA)、shRNA(小发夹RNA)、snRNA(核小RNA)、snoRNA(核仁短RNA)、miRNA(微RNA)、基因组DNA、合成性DNA、合成性RNA和/或tRNA、重组多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、控制区、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。核酸分子可以是线性或环状的。

如本文所用的“载体”、“克隆载体”和“表达载体”指可以借此向宿主细胞引入多核苷酸序列(例如外来基因)，从而转化宿主并促进已引入序列表达(例如转录和翻译)的载具。每个术语指能够运输已经与之连接的另一个核酸的核酸分子。优选的载体是能够自主复制和/或表达与它们连接的核酸的那些载体。本文中将能够指导与它们有效连接的基因表达的载体称作“表达载体”。载体包括质粒、噬菌体、病毒等。

本文中互换使用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”指任何长度的聚合物形式的氨基酸，所述聚合物形式的氨基酸可以包括编码的和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸和具有修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，所述融合蛋白包括但不限于，具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和天然前导序列、有或无N末端甲硫氨酸残基的融合物；加免疫标签的蛋白质；具有可检出融合配偶体的融合蛋白，例如，包含荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、萤光素酶等作为融合配偶体的融合蛋白等。

如本文所用，术语“文库”指遗传物质的集合，如本文所用，编码候选抗原的核酸的集合。术语“文库”还可以指细胞(APC)的集合，其中各细胞总体上含有并可能表达核酸文库。在一些实施方案中，靶APC的文库包含衍生自例如以下任一者的多种肽：病原体、病原体感染的细胞、癌细胞、涉及自身免疫疾病(例如，在其中被靶向)的细胞和/或来自健康受试者的细胞，其中在靶细胞的表面上展示这些肽，从而用MHC I类和/或MHC II类分子呈递它们。

术语“T细胞”和“T-淋巴细胞”是可互换的并在本文中同义使用。实例包括但不限于初始T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞或其组合。

如本文所用的术语“转导”指使用病毒载体向细胞中引入外来核酸。

如本文所用的术语“转染”指使用重组DNA技术向细胞中引入外来核酸。术语“转化”意指引入“外来”(即，外来、外源或胞外)基因、DNA或RNA序列至宿主细胞，从而宿主细胞将表达引入的基因或序列以产生目的物质，如由引入的基因或序列编码的蛋白质或酶。本文所述的这样一种转化细胞的方式是转导。引入的基因或序列也可以称作“克隆的”或“外来的”基因或序列，可以包含调节序列或控制序列，如启动序列、终止序列、启动子序列、信号序列、分泌序列或由细胞的遗传装置使用的其他序列。该基因或序列可以包括无功能序列或无已知功能的序列。接受并表达已引入DNA或RNA的宿主细胞已经被“转化”并且是“转化体”或“克隆”。向宿主细胞引入的DNA或RNA可以来自任何来源，包括与宿主细胞相同的属或种的细胞，或不同属或种的细胞。

术语“检测分子”指能够被检出的分子，所述分子包括但不限于放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、发色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如，生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或半抗原)等。适合用作检测分子的示例性可检出部分包括亲和标签和可检出标记物。可检出标记物的实例是而不限于荧光剂、化学发光剂和发色团。

术语“荧光剂”指能够在可检出范围内显示荧光的物质或其部分。

术语“亲和标签”在本中用来指可以与靶附着的肽区段，其中可以使用结合亲和标签并提供可检出信号的分子(例如，荧光化合物或蛋白质)来检测所述靶。原则上，可获得其抗体或其他特异性结合剂的任何肽或蛋白质可以用作亲和标签。

如本文所用的术语“反应混合物”指一种流体介质，其中包含候选抗原的靶细胞文库与包含细胞毒性淋巴细胞的生物样品接触。这包括例如一种反应混合物，其中包含候选抗原的靶细胞文库起初与包含细胞毒性淋巴细胞的生物样品接触，然后进行任何后续洗涤步骤，所述洗涤步骤设计成移除靶细胞上的候选抗原和样品中的细胞毒性淋巴细胞之间的非特异性或低亲和力结合。若需要，可以调整反应混合物的严格性条件，从而影响候选抗原和样品中细胞毒性淋巴细胞之间复合体的形成。

如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性结合了”等指第一结合分子或部分相对于反应混合物中的其他分子或部分偏好地与第二结合分子或部分(共价或非共价)结合的能力。

如本文所用，除非上下文另外清楚地指明，否则术语“确定”、“测量”、“评估”和“分析”互换使用并且包括定量及定性确定。

如本文所用，术语“样品”或“生物样品”指从其天然环境分离并含有免疫细胞(如，例如，包含细胞毒性淋巴细胞)的生物材料。样品或生物样品可以包含组织样品或生物流体样品。例如，生物流体包括但不限于血液、血浆、痰、尿、脑脊液、灌洗液和白细胞提取法样品。

如本文所用，术语“病原体”指通过直接感染其他生物或通过产生在另一种生物中造成疾病的因子(例如，产生致病毒素的细菌等)，在另一种生物(例如，动物和植物)中造成疾病的生物，包括微生物。如本文所用，病原体包括但不限于细菌、原虫、真菌、线虫、类病毒和病毒或其任意组合，其中每种病原体本身或与另一种病原体配合时能够在脊椎动物中引发疾病，所述脊椎动物包括但不限于哺乳动物，并且包括但不限于人。如本文所用，术语“病原体”还涵盖在非免疫受损宿主中可能通常不是致病性的微生物。

如本文所用的术语“免疫细胞”指哺乳动物免疫系统的细胞，所述细胞包括但不限于抗原呈递细胞、B细胞、嗜碱性粒细胞、细胞毒性T细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、粒细胞、辅助T细胞、白细胞、淋巴细胞(例如，细胞毒性淋巴细胞)、巨噬细胞、肥大细胞、记忆细胞、单核细胞、天然杀伤细胞、中性粒细胞、吞噬细胞、浆细胞和T细胞。

如本文所用的术语“免疫应答”指免疫力，其包括但不限于天然免疫、体液免疫、细胞免疫、免疫性、炎症反应，获得(适应)性免疫、自身免疫性和/或过度活跃的免疫。

如本文所用的术语“哺乳动物”指哺乳纲的任何成员，包括而不限于人类和非人灵长类，如黑猩猩和其他猿和猴物种；家畜如牛、羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物如犬和猫；实验室动物，包括啮齿类如小鼠、大鼠和豚鼠等。该术语不指示具体的年龄或性别。因此，成体和新生受试者，以及胎儿，无论雄性或雌性，意在纳入本术语的范围内。

如本文所用的术语“肿瘤”指全部肿瘤性细胞生长和增殖，无论为恶性或良性，以及全部癌前性和癌性细胞及组织。

如本文所用的术语“癌症”和“癌性的”指或描述哺乳动物中一般以失调的细胞增殖为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于B细胞淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和/或非霍奇金淋巴瘤)、脑肿瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、肾癌、癌(carcinoma)、黑素瘤、头颈癌、脑癌和前列腺癌，包括但不限于雄激素依赖性前列腺癌和雄激素非依赖性前列腺癌。

如本文中使用该术语，“适宜的对照”指除了一个或多个关键因素以外，否则按照与实验反应相同的方式处理的对照反应。对照可以是相同的、但不暴露于活化性分子(例如，活化性细胞毒性淋巴细胞)的细胞。备选地，对照可以是暴露于活化性分子，但缺少报告分子(并且否则可以与实验细胞相同)的细胞。适宜的对照由熟练实施者确定。

附图说明

在提到的附图中说明示例性实施方案。本文公开的实施方案和附图意在视为说明性而非限制性。

图1描述了系统鉴定T细胞抗原的示例性方案的概述。

图2A-2B描述了CTL-靶相互作用的示例性阳性对照。图2A显示CTL识别和杀伤IV9脉冲标记的靶细胞，但不识别和杀伤对照肽，如通过7-AAD染色所确定。图2B显示，从三个不同启动子表达含有IV9肽的56氨基酸肽(也称作56聚物)导致通过IV9 CTL的有效抗原呈递及杀伤作用，如通过LDH释放所测量。

图3描述了GzB活性的示例性生荧光报告子(fluorogenic reporter)。用对照肽或同族(cognate)IV9肽脉冲标记表达生荧光性GzB报告子的GFP标记的靶细胞，之后与IV9CTL共培养。通过测量靶细胞中的红外荧光蛋白信号检测GzB活性。

图4A-4B描述了显示展示同族抗原的靶细胞富集的重建实验。图4A显示重建实验的示意图。图4B显示按多种比例内标入展示对照抗原的靶细胞时，展示同族抗原的靶细胞的富集倍数。

图5A-B描述了筛选中检测CTL抗原。图5A显示筛选示意图。图5B显示相对于输入的文库，依据筛选后对照肽(非靶)和同族肽(靶)的qPCR检测到的富集倍数。重复1(Rep1)和重复2(Rep2)是两个独立的生物学重复。

图6A-6B描述了GzB活性的示例性Cre报告子的开发。图6A显示，表达DNA编码的肽的抗原呈递细胞(APC)在其细胞表面处MHC I分子上呈递衍生自该肽的表位。当T细胞通过其T细胞受体(TCR)识别这种复合体时，该细胞形成免疫突触，其在此分泌穿孔素和粒酶。粒酶进入APC并且切割事先膜结合的Cre重组酶。Cre重组酶逆转3’引物位点的方向，允许编码肽的DNA的生产性PCR扩增。图6B显示检测靶细胞中Cre介导的倒置(Cre活性)的结果，所述靶细胞表达膜系留的Cre并暴露于NK细胞递送的GzB。使用对倒置的报告盒特异的引物，通过qPCR检测Cre活性。纯化来自处理的NK细胞和未处理的对照细胞的基因组DNA并且将倒置频率通过qPCR定量，对每份样品的报告子丰度归一化(使用倒置非依赖性qPCR引物定量)。当递送GzB时，仅表达Cre活性报告子的靶细胞(非Cre对照)不展示可检出的Cre活性。

图7A-7B描述了示例性基于抗体的GzB活性报告子的开发。图7A显示基于抗体的报告子方案的示意图。通常，报告底物含有前置一个GzB切割位点的Flag表位。在GzB切割后，Flag表位是蛋白质N末端处特异性识别Flag表位的M1抗体可及的。图7B显示NK细胞递送或不递送GzB的情况下，使用M1Flag抗体对来自表达GzB报告子的靶细胞的细胞裂解物进行蛋白质印迹分析的结果。在报告子存在下及递送GzB后观察到抗体靶明显增加。

图8是IV9 T细胞筛选结果的图示。每个点代表文库中一种肽的两个生物学重复的每一者的富集倍数。依据与数值标签结合所标识的点均是含有IV9T细胞的已知靶的肽。

图9是列示通过分析所找到的基序的图。通过这种基序分析鉴定IV9表位。通过对100个来自IV9筛选的最富集肽的MEME分析所鉴定的最富集基序含有确切的IV9表位(ILKEPVHGV)。

图10显示在使用具有CD4 TCR的GzB报告子的实验中激活GzB报告子的靶细胞的百分数。通过表达Ob1A.12 TCR或对照TCR的慢病毒修饰原代CD8+T细胞。随后将修饰的T细胞与展示Ob1A.12 TCR的靶抗原或突变体对照抗原的靶细胞混合。表达Ob1A.12 TCR赋予对MHC II背景下同族MBP肽的特异性识别，其中可以使用GzB报告子检出所述特异性识别。

图11是利用IFP的Gzb报告子的线性示意图。报告子含有IFP的两个半侧的部分，所述半侧由含有GzB切割序列的接头分开。完整IFP盒本身旁侧分布有分割型GFP(split-GFP)。

图12是报告子激活机制的示意图。在激活之前，报告子包含IFP的两个半侧，其中用接头序列阻止所述半侧成熟。一旦GzB切割，则释放接头并且IFP的半侧可以聚拢并形成有活性的荧光IFP。在构建体N末端和C末端分割型GFP提供组成型GFP荧光并有助稳定完整的蛋白质。

图13显示示例性GzB IFP报告子的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)和氨基酸序列(SEQID NO:33)

图14显示qPCR引物，所述引物设计成通过qPCR而非通过借助激活GFP和丧失RFP的荧光检测，促进检测用于Cre存在的报告盒(reporter cassette)中的倒置事件。

图15显示用于Cre存在的示例性报告盒的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)和氨基酸序列(SEQ ID NO:34)，所述示例性报告盒使得通过激活GFP和丧失RFP对Cre活性的荧光检测成为可能。

图16显示采用NLV2 TCR的CMV全基因组筛选的结果。用两个迥异DNA条形码编码贯穿CMV基因组每28个氨基酸叠覆(tiled)的两千八百八十二个56氨基酸长度的肽。散点图上的每个点显示与一个肽序列对应的两个条形码的性能。右上角中依据与数值标签结合所标识的两个点均是文库中含有已知的NLV2 TCR靶(NLVPMVATV(SEQ ID NO:4))的仅有的两个表位。

图17显示用患者T细胞进行全病毒组筛选的结果。用已经在NLV肽存在下扩充的患者T细胞筛选贯穿206个病毒物种的基因组每28个氨基酸叠覆的九万三千九百零四个56氨基酸长度的肽。散点图上的每个点显示一种肽在该筛选的两个生物学重复的每者中的性能。依据与数值标签“24741”和“24742”结合所标识的两个点均是文库中含有NLV表位(NLVPMVATV(SEQ ID NO:4))的仅有两个表位。依据与数值标签“32255”和“32256”结合所标识的两个点均编码来自UL123(IE1)蛋白的重叠性56聚物，所述重叠性56聚物由图18中所示的2％样品T细胞靶向。

图18显示验证在全病毒组筛选中找到的新表位。使用载以阴性对照肽、已知的pp65 NLV肽或新找到的IE1(UL123)肽的HLA-A2四聚体对全病毒组筛选所用的T细胞群体染色。输入的群体中27.7％的CD8阳性T细胞识别NLV肽，而2.1％识别IE1表位。

图19显示CMV全基因组文库对比使用多克隆记忆T细胞的文库筛选的结果。使用来自CMV阳性、HLA-A2阳性供体的记忆T细胞来筛选贯穿CMV基因组每28个氨基酸叠覆的2,882个56氨基酸长度的肽的文库。每个点代表编码特定56氨基酸肽的两个独立DNA条形码的性能。依据与数值标签的结合鉴定富集的具有两个重叠性56氨基酸肽的肽。

图20显示TCR结合的叠覆(tiling)诱变表征结果。针对NLV表位及其每侧上两个毗邻氨基酸的全面诱变文库筛选对NLV表位(NLVPMVATV(SEQ ID NO:4))扩充的T细胞。热图中每个框代表一个突变体，其中阴影和值表示与表位的野生型形式相比，这个突变体表现如何。

图21显示用多轮筛选改善TCR靶检测。每个点代表在采用IV9特异性TCR筛选一轮(左小图)或筛选两轮(右小图)后，给定肽的两个DNA条形码的性能。依据与数值标签结合所标识的六个点显示抗原文库中作为已知TCR靶的六个肽。

图22显示肿瘤特异性TCR的信/噪分析结果。向供体CD8 T细胞引入NLV特异性CMVTCR(病毒TCR)和MAGE-A3肿瘤特异性TCR(亲和力未增强，肿瘤TCR)。测量在同族抗原不存在(对照)或存在(+抗原)下对MHC匹配的细胞的识别，并且这种识别展示了TCR的可比性能。

图23显示突变体ICAD的过量表达防止凋亡期间DNA降解。用凋亡诱导剂喜树碱(camptothecin)和星形孢菌素处理无(对照)或有(ICAD)突变体ICAD过量表达的靶细胞。纯化基因组DNA并且在对照细胞中诱导凋亡时，其显示标志性DNA弥散和阶梯分布，但是在突变体ICAD存在下无前述情况。

图24显示突变体ICAD的表达增强筛选设定下的抗原盒恢复(antigen cassetterecovery)。通过测序恢复的抗原盒的数目与分选的细胞的数目比较，以计算抗原恢复效率。每个标度显示在不存在(无ICAD)或存在(ICAD)突变体ICAD过量表达情况下进行的一个筛选重复中的抗原恢复百分数。

图25显示设计和检验工程化蛋白酶报告子的结果。报告蛋白(CD4)与GFP融合并通过添加C末端KKXX基序滞留在ER中。TEV蛋白酶(右小图)的表达通过切割ER滞留基序，导致CD4表面表达增加，如抗CD4 APC抗体染色检出。

具体实施方式

免疫应答是涉及几个“分子玩家”的复杂过程。但是，免疫应答的基础部分之一是通过CTL识别表位/抗原。表位是细胞膜上通过主要组织相容性复合体(MHC)呈递的蛋白质或蛋白质片段。大的蛋白质可以由特化酶分解成数百个短肽片段，但是这些片段中仅数个片段将激发免疫应答。

在T细胞(例如，细胞毒性T细胞)和抗原(如APC呈递的抗原)之间的生产性相互作用相当罕见并且经常按不到一百万靶细胞之一发生。给定T细胞识别的抗原一般按相当低的频率(如1/100,000个抗原或更小的频率)存在。此外，并非每个展示给定抗原的靶细胞将会遇到其同族T细胞，尤其是考虑到混合T细胞群体的特异性。因此，鉴定T细胞受体与抗原及其表位相互作用的工作已经基于直接测量T细胞应答，聚焦于单个或少数成对相互作用，原因在于不能在T细胞受体和表位/抗原的复杂混合物当中检出这类罕见事件(例如，有生理学意义的和/或基因组级分析)。另外，现存方案聚焦于不基于细胞的平台，导致不能允许肽由抗原呈递细胞内源加工并载于MHC上。因此，实际上不太可能在体内功能性展示借助这类不基于细胞的平台鉴定的靶抗原。

为了解决这个问题，本文提供这样的组合物和方法，其使用允许高通量发现T细胞(如细胞毒性T细胞)特异性抗原的要素的组合，以可重复方式鉴定高于背景噪声的相互作用信号的方式和以允许恢复发挥呈递作用的APC和驱动这种相互作用的抗原的方式检测这类罕见相互作用。这类组合物和方法特别有用，因为通过使用复杂抗原文库，在高通量(例如，全基因组)规模并以模块化形式允许灵敏和稳健检测T细胞受体-表位/抗原相互作用，它们克服了低通量和T细胞受体-表位/抗原发现偏倚的问题。

通常，本文提供的组合物和方法用于通过以下方式鉴定由细胞毒性淋巴细胞识别的抗原：使用已识别APC的标志物/读出，从呈递候选抗原的靶APC分离DNA，因而允许鉴定可以从多种类型的可能抗原片段(例如，供试抗原的文库)活化免疫应答的抗原。将遗传物质递送入APC(例如，借助病毒载体)，以编码一种或多种用于表达和呈递在MHC I类和/或MHCII类分子上的候选抗原。递送入多个APC的遗传物质的文库产生靶APC的文库。可以通过本文所述的方法筛选该文库，以鉴定由细胞毒性淋巴细胞有成效识别的抗原。APC或APC的文库因而包含编码一种或多种候选抗原的外源核酸，其中所述候选抗原被表达并用MHC I类或MHC II类分子呈递。可以将外源核酸稳定引入APC的基因组(例如，借助载体(如，病毒载体)或转座子)。在一些实施方案中，插入的外源核酸在上游和下游兼具预定的引物识别序列(在本文中称作侧置性(flanking)引物识别序列)。这些序列促进后续从APC鉴定已识别的抗原。

还可以修饰该APC以含有分子报告子，所述分子报告子提示由细胞毒性淋巴细胞的抗原识别。例如通过检测因抗原识别产生的活性而非直接测量发生响应的T细胞，鉴定有成效的抗原识别。例如，本领域中一般使用细胞毒性T细胞活性的代用指标(如通过ELISPOT测量的IFN-γ分泌)研究T细胞相互作用。但是，这些代用指标对CTL的体内功能具有不确定的意义(Sekaly,JEM 205(1):7(2008))并且不直接鉴定TCR-表位/抗原结合。相反，本文所述的修饰的APC允许通过检测由细胞毒性淋巴细胞介导的APC修饰所引起的有成效抗原识别(如释放含有蛋白酶如粒酶B(GzB)的细胞毒性颗粒)的报告子，鉴定细胞毒性淋巴细胞结合。当APC与表达T细胞受体的细胞毒性淋巴细胞接触，所述T细胞受体能够结合APC呈递的抗原时，并且在适于抗原识别的条件下接触时，这种识别发生。这种识别还鉴定功能有关的T细胞活性，因为APC的检出的T细胞修饰作用包括诱导溶胞。例如，细胞毒性淋巴细胞所致的有成效抗原识别在APC中产生GzB(一种参与溶胞的丝氨酸蛋白酶)活性，这在本文展示为最大限度减少背景噪声以允许鉴定真阳性信号，因为甚至1％的虚假信号水平将足以掩盖真阳性。在一些实施方案中，GzB报告子是GzB的生荧光性报告子。在一些实施方案中，GzB报告子不产生可光学检出的信号，而提供这样的细胞表面信号，其允许分离表达由CTL识别的抗原的APC，例如，通过亲和纯化分离。在一些实施方案中，GzB报告子生成的可检测信号用来富集由细胞毒性淋巴细胞有成效识别其已表达抗原的APC。

有成效抗原识别的标志物允许候选抗原的复杂度(即，可以纳入文库的候选抗原数目，在所述文库中可以成功鉴定单一正确的T细胞靶)增加，原因在于信噪比增强。例如，不同于传统的T细胞受体-抗原相互作用分析法，每1百万靶细胞可以分析的候选抗原的复杂度可以超过5k(即，5,000)、10k、15k、20k、25k、30k、35k、40k、45k、50k、55k、60k、65k、70k、75k、80k、85k、90k、95k、100k、105k、110k、115k、120k、125k、130k、135k、140k、145k、150k、155k、160k、165k、170k、175k、180k、185k、190k、195k、200k、210k、220k、230k、240k、250k、260k、270k、280k、290k、300k、310k、320k、330k、340k、350k、360k、370k、380k、390k、400k、410k、420k、430k、440k、450k、460k、470k、480k、490k、500k、600k、700k、800k、900k、1000k、1100k、1200k、1300k、1400k、1500k、1600k、1700k、1800k、1900k、2000k或更大，或其之间的任何范围(包括(例如，100K至2000K))靶细胞。在一些抗原文库样式中，如其中每个细胞展示独特肽的随机肽文库，可以按1x10⁸(即，亿级)至1x10⁹或更高级别筛选抗原。

除增强可以根据本文所述组合物和方法筛选的抗原的复杂度之外，这些方法和组合物还可以包括这样的APC，其优选地还包含DNA降解(例如，胱天蛋白酶激活的脱氧核糖核酸酶(CAD)介导的DNA降解)抑制剂，以增加抗原恢复效率。仅目的CTL识别的抗原可以从有成效抗原识别所标记(例如，获得编码T细胞受体结合的同族抗原的外源核酸的序列)的修饰的APC恢复时，才可以鉴定这些抗原。但是，由CTL诱导的溶胞启动阻碍有效恢复抗原身份的DNA的降解。在没有包含DNA降解抑制剂的情况下，可以从100个通过有成效抗原识别标记的经修饰的APC鉴定大约一个单一抗原(即，1/100个修饰的APC已经呈递的抗原或1％效率)。如下文进一步所述，包含DNA降解抑制剂，如CAD介导的DNA降解的抑制剂，增加抗原恢复至少5倍(即，5％效率)并且可以是至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更大或其间任何范围(包括(例如，5％-50％))的抗原恢复。因此，本发明方法可以用来实现大于5％，例如，50％或更高的恢复(其中100％是理论限值)。

归因于单个试验中可以筛选的抗原的庞大数目和抗原恢复效率，本文所述的方法需要更少的T细胞并且可以因此适用于完全离体的T细胞数目有限的样品。

本文中还提供如本文所述修饰的多个APC，其中APC包含编码候选抗原的不同外源核酸，从而APC总体上呈递候选抗原文库。在一些实施方案中，每个APC含有并表达单一核酸(可能处于多拷贝下)，因而旨在用MHC I类和/或MHC II类分子呈递单一候选抗原。在其他实施方案中，每个APC含有并表达少许表达不同候选抗原的不同核酸(可能处于多拷贝下)，旨在用MHC I类和/或MHC II类分子呈递数个(例如，2、3、4、5、6个或更多个)候选抗原。

优选地，文库的APC衍生自相同的细胞类型(例如，从而在修饰之前它们是克隆性的)。在本文所述的多种实施方案中，文库由作为分离的群体和/或基本上纯的细胞群体的多个APC组成。合适细胞的实例包括而不限于K 562细胞、HEK 293细胞、HEK 293 T细胞、U2OS细胞、MelJuso细胞、MDA-MB231细胞、MCF7细胞、NTERA2a细胞、树突状细胞和原代自体B细胞。

在本文所述的方法中，通常，在适于抗原识别的条件下通过细胞毒性淋巴细胞接触APC或其多者。在一些实施方案中，将包含APC靶的反应样品与包含目的细胞毒性淋巴细胞的生物样品混合并且温育以允许细胞毒性淋巴细胞识别展示同族抗原的任何靶细胞。一旦识别，细胞毒性淋巴细胞以可检出方式修饰靶细胞(例如，释放其含有丝氨酸蛋白酶粒酶B(GzB)的细胞毒性颗粒，以启动杀伤过程)。鉴定经如此修饰的细胞并且从中分离编码同族抗原的外源核酸。对分离的外源核酸的测序鉴定已识别的抗原。这种方法，配合表达候选抗原文库的多个APC使用，可以用来全面鉴定对给定细胞毒性淋巴细胞特异的靶抗原。下文进一步描述附加详情和代表性实施方案。

组合物和方法的用途

长久以来已经理解CTL识别被胞内病原体感染的细胞并且它们是控制许多传染性疾病(包括HIV)必需的。在另一方面，CTL识别自我抗原异常可能造成自身免疫性疾病，包括1型糖尿病。肿瘤免疫学最新进展已经突出显示CTL的另一个重要功能：它们识别和清除肿瘤的能力。这种功能充当了有前景免疫疗法(如过继T细胞转移和免疫检查点阻断)的基础，所述免疫疗法已经导致持久治愈患有先前顽固性癌症的患者亚群。一个持续存在的重大难题是这些背景下的每个背景中表征抗原驱动型T细胞活性。

理解保护性和致病性T细胞应答对于表征可以改善免疫疗法的生物标记物或辅助干预措施的发现以帮助更广范围患者是至关重要的。本文公开的技术可以用来鉴定目的T细胞的靶抗原以及用于表征保护性或致病性T细胞应答的无偏剖析。

鉴定目的TCR的靶抗原

如本文中展示，这项技术可以直接用于鉴定分离的T细胞克隆的靶。此外，它可以用来鉴定通过DNA测序鉴定的目的TCR的靶。该方案可以适用于来自CD4或CD8 T细胞的TCR。可以合成这些TCR序列并引入原代T细胞，随后在我们的平台中筛选所述细胞。值得注意地，TCR测序技术正在大幅度改善并且有望为这个平台发现许多其他应用。

自身免疫疾病

高通量测序法的进展已经使得鉴定潜在致病的T细胞克隆或TCR成为可能，所述T细胞克隆或TCR在患者体内扩充或在患有诸如I型糖尿病、多发性硬化、强直性脊柱炎、再生障碍性贫血、大颗粒淋巴细胞白血病、多发性肌炎、甲状腺炎和心肌病等疾病的患者中保守。鉴定这些T细胞识别的抗原的现有方法缺少使得无偏发现抗原成为可能的通量，即便在TCR序列已知的情况下也是如此。这些T细胞和/或TCR可以用于本文所述的方法以鉴定它们的靶抗原。这将深入了解疾病发病机制、提供生物标记物并打开特异性抑制致病性自身免疫反应的定向治疗之门。

癌症免疫治疗

癌症免疫治疗领域的重大突出难题是鉴定可以介导有成效抗肿瘤免疫力的肿瘤抗原。已经从肿瘤浸润物分离T细胞克隆并且对肿瘤浸润物的TCR测序已经展示肿瘤特异性T细胞发生寡克隆扩充。可以生成患者特异性新生抗原文库，其含有源自患者肿瘤中体细胞突变的新蛋白质片段。随后可以系统地筛选肿瘤特异性T细胞，以识别这些新表位，并进行全基因组筛选以识别非突变的肿瘤抗原。理解有成效抗肿瘤免疫力可以导致开发增强免疫疗法取得成功的标记物和辅助干预措施。

保护性或致病性T细胞应答的无偏剖析

本文中所述的技术可以用于鉴定混合T细胞群体的特异性。这允许表征保护性或致病性T细胞应答，甚至在尚未鉴定特异性克隆或目的TCR的情况下也是如此。

该平台可以用于上述背景的每种背景下的T细胞群体。例如，它可以用来筛选从1型糖尿病患者分离的大体积T细胞以鉴定患者T细胞识别的整套胰腺自体抗原。类似地，可以筛选多克隆肿瘤浸润性T细胞以剖析抗肿瘤免疫力中识别的突变和未突变的肿瘤抗原的范围。

防传染性疾病

T细胞被认为介导对广泛类型的传染性疾病的保护。例如，在MHC I类等位基因HLA-B57和HIV精英控制(elite control)之间存在强关联，提示CD8 T细胞和特异性靶抗原作为可能病毒控制的决定因素。本文公开的技术可以在具有特定临床结果的患者中用来系统剖析CTL特异性，例如针对受控疟疾暴露或HIV精英控制的免疫力，以鉴定保护作用的相关物和提供疫苗设计信息。

该平台还可以通过鉴定有效T细胞表位的特征，有助于改善疫苗设计。尽管存在一些预测肽对MHC分子的亲和力的算法，但不理解使特定肽更可能由T细胞有成效识别的其他特征。本文公开的技术使得发现大量既被靶细胞有成效展示，又被患者T细胞识别的T细胞表位成为可能。可以研究这些表位以揭示有效T细胞表位的属性。这种知识随后可以用于在癌症和传染性疾病(例如，HIV、巨细胞病毒感染和疟疾)中产生优化的疫苗和T细胞疗法。

细胞毒性淋巴细胞和NK细胞

在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是细胞毒性T细胞。这些细胞可以是CD4或CD8型的。细胞毒性T细胞可以表达它们的内源受体，或可以经修饰以表达外源目的抗原受体。在一些实施方案中，外源受体来自没有细胞毒活性的T细胞(例如，非细胞毒性CD4 T细胞)。T细胞的特异性蕴含于其T细胞受体的序列中。已经展示，源于一个T细胞的TCR引入另一个T细胞，可以保留受体细胞的效应子功能，同时转移新TCR的特异性。通常，这是TCR治疗的基础。另外，当引入供体CD4细胞时，来自CD8 T细胞的TCR可以驱动CD4 T细胞的效应子功能(Ghorashi等人,J Immunol,194(3):1080-1089(2015))。如本文中展示，来自CD4 T细胞的TCR转移入供体CD8细胞可以针对呈递在MHC II类上并由CD4 TCR识别的抗原赋予GzB介导的细胞毒活性(参见本文图10)。在一些实施方案中，外源T细胞受体来自辅助T细胞(Th1或Th2)或调节性T细胞。可以在测定法中使用其他类型的细胞毒性细胞，如天然杀伤细胞，以鉴定这些细胞识别的因素。该方法中所用的细胞毒性淋巴细胞可以是克隆群体或混合群体。可选地，或另外地，对于CTL，可以使用已经过工程化以表达T细胞受体的天然杀伤(NK)细胞。

细胞毒性淋巴细胞或NK细胞可以从多种来源获得。一般，细胞毒性淋巴细胞从生物样品获得。

样品

在一些实施方案中，“反应样品”包括包含候选抗原的靶细胞或靶细胞的文库。反应样品还可以包含促进靶细胞表面上的候选抗原和目的样品中的T细胞之间形成复合体的附加缓冲剂、盐、渗透压调节剂等。

“生物样品”指包含目的细胞如细胞毒性淋巴细胞或抗原呈递细胞的目的流体样品或组织样品。在示例性实施方案中，生物样品包含细胞毒性T细胞(CTL)和/或天然杀伤细胞。生物样品可以从个体中的任何器官或组织获得，前提是生物样品包含目的细胞。器官或组织可以是健康的或可以是患病的。在一些实施方案中，生物样品来自自身免疫性部位、自身免疫反应部位、肿瘤浸润物、病毒感染部位或病灶。

在一些实施方案中，处理生物样品以移除生物颗粒物或不想要的细胞。从血液或其他生物样品移除细胞的方法是本领域熟知的并且可以例如包括离心、超滤、免疫选择或沉降等。生物样品的一些非限制性实例包括血液样品、尿样、精液样品、淋巴液样品、脑脊液样品、血浆样品、血清样品、脓样品、羊水样品、体液样品、粪便样品、活检样品、针抽吸活检样品、棉拭子样品、漱口样品、口腔粘膜样品、癌样品、肿瘤样品、肿瘤浸润物、组织样品(例如，皮肤)、细胞样品、滑液样品或这类样品的组合。对于本文所述的方法，生物样品优选是血液样品或组织活检样品(例如肿瘤、自身免疫性或其他病理学部位)。

修饰APC

APC经工程化，如通过转染或基因修饰，以表达编码候选抗原的外源核酸。可以进一步修饰APC以下调和/或上调目的组合物(如基因，蛋白质、化学标记物、编码报告子分子的外源核酸等)的表达。

如前所述，还可以修饰APC以含有分子报告子，所述分子报告子提示由细胞毒性淋巴细胞和/或NK细胞识别的抗原。例如通过检测因抗原识别产生的活性而非直接测量发生响应的T细胞，鉴定有成效的抗原识别。在一些实施方案中，使用GzB活性报告子，如本文中进一步描述的一种或多种基于GazB的报告子。

在本文所述的方法和组合物中，APC可以进一步包含DNA降解抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂直接阻断CAD所致的DNA降解。GzB在靶细胞中启动胱天蛋白酶激活，这导致胱天蛋白酶激活的脱氧核糖核酸酶(CAD)对基因组DNA的核小体间降解。可通过提供CAD介导的DNA降解的抑制剂，按照众多构思的方式减慢或抑制基因组DNA的这种降解。例如，可以使用蛋白质胱天蛋白酶激活的脱氧核糖核酸酶的抑制剂(ICAD)，其阻断凋亡期间DNA的降解。例如，在一些实施方案中，可以修饰细胞，以表达蛋白质胱天蛋白酶激活的脱氧核糖核酸酶的抑制剂(ICAD)，旨在抑制活性GzB介导的基因组DNA降解。在一些实施方案中，操作APC靶以过量表达ICAD，或以表达具有增加活性的突变体ICAD。

在一些实施方案中，ICAD含有赋予胱天蛋白酶切割抗性的突变(例如，D117E和/或D224E)，其在本文中另称作胱天蛋白酶抗性突变体(参见akahira等人,Arch BiochemBiophys.2001 Apr 1；388(1):91-9；Enari等人,Nature.1998Jan 1；391(6662):43-50；Sakahira等人,Nature.1998 Jan 1；391(6662):96-9)。ICAD前体(也称作DNA片段化因子亚单位α或DFFA)的示例性序列获自GenBank登录号：编码NP_004392.1(同工型1)的NM_004401.2(转录物变体1)；和编码NP_998731.1(同工型2)的NM_213566.1(转录物变体2)。示例性成熟ICAD序列如下；D117和D224处的残基大写：

可选地或另外地，细胞可以包含CAD敲除(例如，使用CRISPR破坏CAD基因；示例性参比基因序列在RefSeqGene NG_029098.1处，范围5001-17026)或敲减(例如，使用抑制性核酸如shRNA、siRNA、LNA或反义核酸)。也可以使用化学性或小分子DNA酶抑制剂，例如，Mirin(MRE11核酸酶的细胞可透过性抑制剂)或抑制与核酸相互作用的蛋白质的嵌入性染料如溴化乙锭。

胱天蛋白酶抑制也可以用来阻止凋亡期间对ICAD的切割及所致的CAD激活。胱天蛋白酶3通过切割DFF45(DNA片段化因子-45)/ICAD(胱天蛋白酶激活的DNA酶的抑制剂)以释放活性酶CAD，启动DNA降解(Wolf等人,J Biol Chem.1999 Oct 22；274(43):30651-6)。因此，细胞可以包含胱天蛋白酶3敲除(例如，使用CRISPR破坏胱天蛋白酶3基因；示例性参比基因序列在RefSeqGene ID NC_000004.12处，范围184627696-184649475互补链)或敲减(例如，使用抑制性核酸如shRNA、siRNA、LNA或反义核酸)。人胱天蛋白酶3的示例性序列见GenBank中编码NP_004337.2(胱天蛋白酶-3同工型前原蛋白)的NM_004346.3(转录物变体1)；也可以使用其他同工型。也可以使用化学性或小分子胱天蛋白酶抑制剂(例如，Z-VAD-FMK(苄氧羰基-Val-Ala-Asp(OMe)-氟甲基酮)；Z-DEVD-FMK；Ac-DEVD-CHO；Q-VD-Oph(喹啉基-Val-Asp-OPh)；M826(Han等人,The Journal of Biological Chemistry(277):30128-30136(2002))；如Chu等人,J.Med.Chem.,2005,48(24),第7637–7647页中所述的N-苄基靛红磺酰胺类似物；如Chen等人,J.Med.Chem.,2006,49(5),第1613–1623页中所述的异喹啉-1,3,4-三酮衍生物)；以及胱天蛋白酶的蛋白质或肽抑制剂(例如，哺乳动物XIAP(GenBankRefseq：NP_001158.2)或牛痘CrmA(GenBank Refseq：NP_001158.2)。尽管胱天蛋白酶3是对于这个目的关键的胱天蛋白酶并且已经发表一份报告，其表明在胱天蛋白酶3不存在的情况下，凋亡期间CAD未激活(Tang等人,J Biol Chem.1998 Oct 30；273(44):28549-52)，并且例举了胱天蛋白酶3的抑制剂，但其他报告已经确定其他胱天蛋白酶可以切割ICAD。因此，也可以使用其他胱天蛋白酶的抑制剂，例如，泛胱天蛋白酶抑制剂，或执行者胱天蛋白酶(胱天蛋白酶6或7)或启动者胱天蛋白酶(胱天蛋白酶2、8、9或10)的抑制剂。在一些实施方案中，胱天蛋白酶抑制剂将抑制胱天蛋白酶3并也将抑制其他胱天蛋白酶，例如，胱天蛋白酶6、7、2、8、和/或9。

多种方法可用于产生所需的修饰。一般，载体用来向细胞引入核酸。

可用于向靶哺乳动物细胞转移(例如，通过转化)外源性基因的许多这类载体可用于本文所述的生成APC和文库。载体可以是附加体性的，例如，质粒、病毒(如巨细胞病毒、腺病毒等)衍生的载体，或可以整合入靶细胞基因组，通过同源重组或随机整合，例如，逆转录病毒(如MMLV、HIV-1、ALV等)衍生的载体。慢病毒载体，如基于HIV或FIV gag序列的那些载体，可以用来转染非分裂性细胞，如静息期人类干细胞(参见Uchid等人(1998)P.N.A.S.95(20):11939-44)。在一些实施方案中，还可以使用逆转录病毒和适宜包装细胞系的组合，其中衣壳蛋白将起到感染靶细胞的作用。通常，将细胞和病毒在培养介质中温育至少约24小时。随后在一些应用中允许细胞在培养介质中短时间生长，例如24-73小时，或至少两周，并且可以允许其生长五周或更长时间，之后分析。常用的逆转录病毒载体是“有缺陷的”，即不能产生生产性感染所需的病毒蛋白。载体的复制需要在包装细胞系中生长。

本领域已知许多病毒载体或病毒相关的载体。这类载体可以用作核酸构建体进入细胞的运载体。构建体可以整合并包装入非复制型、缺陷性病毒基因组如腺病毒、腺联病毒(AAV)、或单纯疱疹病毒(HSV)或其他病毒，包括逆转录病毒载体和慢病毒载体，用于感染或转导入细胞。载体可以并入或可以不并入细胞基因组中。可以使用的病毒载体包括但不限于SIN慢病毒载体、逆转录病毒载体、泡沫状病毒载体、腺联病毒(AAV)载体、杂合载体和/或质粒转座子(例如睡美人转座子转座子系统)或基于整合酶的载体系统。本领域技术人员将显而易见可以联系替代性实施方案使用的其他载体。

如果需要，构建体可以包含用于转染的病毒序列。备选地，可以将构建体并入能够发生附加体复制的载体，例如，EPV载体和EBV载体。

当表达控制序列控制和调节该核苷酸序列的转录和翻译时，本文所述的载体的已插入材料可以有效连接至表达控制序列。术语“有效连接”包括在待表达的多核苷酸序列前方具有适宜的起始信号(例如，ATG)，和维持正确的可读框，以允许多核苷酸序列在表达控制序列的控制下表达和产生由多核苷酸序列编码的所需多肽。在一些实例中，已插入材料的转录处于启动子序列(或其他转录调节序列)的控制下，所述启动子序列在其中希望表达的细胞类型中控制重组基因的表达。也将理解，已插入的材料可以处于转录调节序列控制下，所述转录调节序列与控制天然存在形式的蛋白质转录的那些序列相同或不同。在一些情况下，启动子序列由细胞的为启动特定基因转录所要求的合成装置或引入的合成性装置识别。

启动子序列可以是“组织特异性启动子”，这意指这样的核酸序列，其充当启动子，即，调节与启动子有效连接的选定核酸序列的表达并且影响特定细胞中选定核酸序列的表达。该术语还涵盖所谓的“泄漏性”启动子，其主要在一种组织中调节选定核酸的表达，但也在其他组织中引起表达。

不具体地限制APC的细胞类型。基本的要求是，APC能够内源加工抗原并呈递在MHCI上(例如，包括表达蛋白酶体、表达TAP转运蛋白和MHC分子正确折叠及运输)。认为对于几乎全部人细胞和其他哺乳动物细胞也是如此。本发明的系统也可以配合绕过必要内源抗原加工的单链MHC-肽融合物使用(Yu等人,Immunol 168(7):3145-3149(2002))。但是，这将需要增加文库尺寸并且可能丧失是否将内源代表肽的信息。APC应当还具备有效向细胞引入外源DNA的能力，例如，通过慢病毒/逆转录病毒转导或转染(本领域熟知的方法)引入。

就本文所述的基于IFP的GzB报告子系统而言，APC是其中IFP蛋白能够成熟并发出荧光的那些。因此，细胞表达足够水平的胆绿素，后者是这些细胞系中IFP成熟的关键辅因子。也可以外源补充胆绿素(例如，通过增加内源胆绿素表达或通过添加胆绿素至细胞)，以使得利用额外的细胞成为可能。适于基于IFP报告子的表达过程的细胞是本领域熟知并且包括而不限于HEK 293 T、MelJuso、MDA-MB231、MCF7、和NTERA2。已经在文献中报告，它还在LN229细胞、原代神经元和肝细胞中发挥作用(Yu等人,Nature Communications 5:3626(2014))。

原代树突状细胞和原代B细胞可以用于自体筛选。在使用基于IFP的报告子系统的情况下，可以按需要使用补充性胆绿素。可以根据需要使用本领域熟知的方法，向细胞供应胆绿素。

在一些实施方案中，本文所述组合物和方法的APC是MHC缺陷的，即，不表达内源MHC。这允许剖析受限于专门选择的MHC等位基因的T细胞应答，所述等位基因经工程化由APC待表达。例如，引入单一MHC等位基因确保，检出的任何应答对这一个等位基因呈现；因此，可以在无需任何进一步反卷积的情况下解读结果。如果存在内源MHC等位基因集合，不易获得这种结果。通过在新的目的MHC中引入，这还允许以下可能性：再利用相同的靶细胞解析来自不同患者或具有不同MHC等位基因的T细胞。本文中也已经确定，如此操作还降低因T细胞识别其他抗原所致的背景杀伤活性。靶细胞上的MHC表达水平影响T细胞背景活化率。用MHC缺陷性靶细胞开始，使得精细调节表面上MHC的量以优化信噪比成为可能。在一些实施方案中，使用K 562细胞、HEK 293细胞、HEK 293 T细胞、U2OS细胞、MelJuso细胞、MDA-MB231细胞、MCF7细胞、NTERA2a细胞、树突状细胞和原代自体B细胞。

因此，本文所述的组合物和方法可以应用于T细胞、NK细胞和当细胞识别递送蛋白酶的任何其他细胞。本文实施例部分中详述的实验展示了鉴定引起天然杀伤细胞识别的CD8+T细胞抗原及因子的方法的可行性。可以通过以下方式表征CD4+T细胞抗原：直接筛选细胞毒性CD4 T细胞或向细胞毒性CTL(例如，CD8 T细胞)引入来自非毒性CD4 T细胞的TCR，可能配合CD4共表达。

APC靶的文库

熟练技术人员已知用于构建庞大、基因组级别序列文库以(如在产生待引入MHC靶细胞的候选抗原文库时)表达已编码多肽的一般方法。在以下文献中找到这类方法的一些实例：Xu GJ,Kula T,Xu Q,Li MZ,Vernon SD,Ndung’u T等人Comprehensive serologicalprofiling of human populations using a synthetic human virome.Science.2015；348(6239)；Larman HB,Zhao Z,Laserson U,Li MZ,Ciccia A,Gakidis MA等人Autoantigen discovery with a synthetic human peptidome.Nat Biotechnol.2011；29(6):535–41.Epub2011/05/24.doi:10.1038/nbt.1856.pmid:21602805；Zhu J,Larman HB,Gao G,Somwar R,Zhang Z,Laserson U,Ciccia A,Pavlova N,Church G,Zhang W,KesariS,Elledge SJ.Protein interaction discovery using parallel analysis oftranslated ORFs(PLATO).Nat Biotechnol.2013 Apr；31(4):331-4.doi:10.1038/nbt.2539，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。

本文中还提供包含多个候选抗原的APC靶细胞文库。在一些实施方案中，靶细胞还包含一个或多个可用于鉴定活化的APC的报告子构建体，如本文所述的那些。在一些实施方案中，报告子对粒酶B活性敏感。在一些实施方案中，APC靶细胞还包含CAD介导的DNA降解的抑制剂。本文中描述了众多代表性实例。例如，在一些实施方案中，靶细胞还包含由GzB激活从而抑制基因组DNA降解的胱天蛋白酶外源抑制剂，或CAD或胱天蛋白酶敲除，如本文所述的那些。例如，在一些实施方案中，由GzB激活的胱天蛋白酶激活的DNA酶(CAD)受胱天蛋白酶激活的脱氧核糖核酸酶的抑制剂(ICAD)或其突变体抑制。在一些实施方案中，ICAD突变是D117E，其中位置117处的天冬氨酸由谷氨酸置换。在一些实施方案中，ICAD还包含突变D224E，其中位置224处的天冬氨酸由谷氨酸置换。在一些实施方案中，ICAD的同工型具有GenBank登录号O00273-2中公开的序列。ICAD的其他同工型也将在本文所述的组合物和方法中产生可接受的结果。在一些实施方案中，外源抑制剂是野生型的。

在一些实施方案中，候选抗原由基因组DNA编码。基因组DNA可以分离自受试者(例如，人)或分离自传染性生物或其组合。在一些实施方案中，受试者是健康的。在一些实施方案中，受试者患有疾病。在一些实施方案中，传染性生物是病原体，包括但不限于细菌、病毒、细菌、真菌、原虫和多细胞寄生性生物。在一些实施方案中，从中生成文库的多种候选抗原代表基本上整套来自健康受试者或患病受试者(例如，疾病包括但不限于癌症、自身免疫疾病、心血管疾病、传染性疾病等)的基因组的抗原。在一些实施方案中，多种候选抗原代表基本上整套来自某病原体或成组病原体、病毒、细菌或真菌(例如，全部致病性病毒、细菌或真菌)的肽。

在一些实施方案中，可以使用抗原文库，如，而不限于，可读框(ORF)集合、全基因组肽文库和应用特异性定制文库。在一些实施方案中，使用候选抗原的全基因组检测。在一些实施方案中，文库是人类全基因组肽文库，如一个叠覆人蛋白质组的肽文库(例如，一个包含259,345个肽的肽文库，所述肽按90氨基酸片段以45氨基酸重叠贯穿完整人蛋白质组来叠覆)。在一些实施方案中，文库是全病毒组文库，如一个病毒组的文库(例如，一个包含93,904个肽的文库，所述肽按56氨基酸片段以28氨基酸重叠贯穿注释为感染人类的全部病毒的蛋白质组来叠覆)。在一些实施方案中，文库是CMV全基因组肽文库，如一个叠覆CMV蛋白质组的肽文库(例如，一个包含5764个肽的肽文库，所述肽按56氨基酸片段以28氨基酸重叠贯穿全部确认和预测的人巨细胞病毒蛋白来叠覆)。

抗原将最经常在DNA水平按单拷贝编码。其将按每个细胞数十至数千个分子产生、加工并呈递在MHC上。然而，甚至细胞表面上的单个肽可以由细胞毒性淋巴细胞有成效地识别，所以该体系对甚至很低拷贝的表面表达的抗原有功能。

在多种实施方案中，包含候选抗原的靶细胞文库包含约10²个至约10¹⁴个靶细胞。

在一些实施方案中，每个靶细胞编码独特的候选抗原。备选地，在一些实施方案中，靶细胞可以编码多于一种独特候选抗原，如每个细胞2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100种或更多种或其间任何范围(包括(例如，5-10种))种候选抗原。如果使用每细胞多抗原时，筛选产生较高背景，则这些方法可以包括仅用每细胞一抗原执行第二轮筛选(优选地，来自第一轮的再克隆的抗原)。

在示例性实施方案中，文库包含以下任一者或多者：约1x10²至约10¹⁴靶细胞、约1x10³至约10¹⁴靶细胞、约1x10⁴至约10¹⁴靶细胞、约1x10⁵至约10¹⁴靶细胞、约1x10⁶至约10¹⁴靶细胞、约1x10⁷至约10¹⁴靶细胞、约1x10⁸至约10¹⁴靶细胞、约1x10⁹至约10¹⁴靶细胞、约1x10¹⁰至约10¹⁴靶细胞、约1x10¹¹至约10¹⁴靶细胞、约1x10¹²至约10¹⁴靶细胞、约1x10¹³至约10¹⁴靶细胞或约1x10¹⁴靶细胞。本文所述的靶细胞文库提供至少约10²至约10¹⁴个候选抗原，其中足够量的靶细胞包含有效筛选文库的独特候选抗原。在一些实施方案中，使用10和10,000之间的表示，意指每个候选抗原由10-10,000个细胞呈递。

在多种实施方案中，每个靶细胞包含约10²个至约10¹⁴个候选抗原分子。在示例性实施方案中，每个靶细胞包含约1x10²至约10¹⁴个拷贝的候选抗原、约1x10³至约10¹⁴个拷贝的候选抗原、约1x10⁴至约10¹⁴个拷贝的候选抗原、约1x10⁵至约10¹⁴个拷贝的候选抗原、约1x10⁶至约10¹⁴个拷贝的候选抗原、约1x10⁷至约10¹⁴个拷贝的候选抗原、约1x10⁸至约10¹⁴个拷贝的候选抗原、约1x10⁹至约10¹⁴个拷贝的候选抗原、约1x10¹⁰至约10¹⁴个拷贝的候选抗原、约1x10¹¹至约10¹⁴个拷贝的候选抗原、约1x10¹²至约10¹⁴个拷贝的候选抗原、约1x10¹³至约10¹⁴个拷贝的候选抗原或约1x10¹⁴个拷贝的候选抗原。

在多种实施方案中，候选抗原由具有约21个至约150个核苷酸长度的核酸编码。在其他实施方案中，候选抗原由具有约24至约150个核苷酸长度、约30至约150个核苷酸长度、约40至约150个核苷酸长度、约50至约150个核苷酸长度、约60至约150个核苷酸长度、约70至约150个核苷酸长度、约80至约150个核苷酸长度、约90至约150个核苷酸长度、约100至约150个核苷酸长度、约110至约150个核苷酸长度、约120至约150个核苷酸长度、约130至约150个核苷酸长度、约140至约150个核苷酸长度或约150个核苷酸长度的核酸编码。在一些实施方案中，编码候选抗原的ORF或核酸长超过150nt。

在一些实施方案中，靶细胞表面上展示的候选抗原长至少8、9、10或11个氨基酸；在其他实施方案中，候选抗原具有至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450个或更多个氨基酸长度。一旦表达，较长的抗原(例如，数百个氨基酸)被加工成靶细胞表面上展示的8-11个氨基酸的短肽。

在一些实施方案中，候选抗原是完整ORF(例如，数百个氨基酸长度)。全长候选抗原并不必要完整展示在APC的表面上。相反，这类抗原由细胞表达并内源加工成展示在细胞表面上的较短的肽。鉴定具有编码这种长候选抗原的核酸的APC可以接续进一步筛选已鉴定候选物的各种片段。

在多种实施方案中，候选抗原与淋巴细胞以约1fM至约100μM、约1pM至约100μM、约100nM至约100μM、约1μM至约100μM、约1μM至约10μM、约1pM至约100nM、约1pM至约10nM、约1pM至约5nM的K_d结合。在一些实施方案中，候选抗原与以1mM的K_d结合淋巴细胞。

筛选靶细胞文库以鉴定抗原

在APC的文库中表达候选抗原以呈递在细胞毒性淋巴细胞的MHC I类或II类分子上。随后在适于识别展示其同族抗原的任何靶细胞的条件下，如在反应混合物中，将这种文库与目的细胞毒性淋巴细胞(例如，CTL)的样品混合。一旦识别，细胞毒性淋巴细胞启动靶细胞杀伤过程(例如，对于CTL，释放其含有丝氨酸蛋白酶粒酶B(GzB)的细胞毒性颗粒)。靶细胞中已启动的杀伤过程的报告子(例如，胞内GzB活性)用来从已识别的靶细胞分离基因组DNA。随后鉴定编码被展示并识别的抗原的核酸(例如，通过PCR扩增和下一代测序法鉴定)。

此外，本文描述了用于筛选靶细胞文库的方法，所述靶细胞文库包含用于鉴定T细胞(例如，CTL)特异性抗原的候选抗原。这些方法包括(i)制备如本文所述的靶细胞文库，(ii)使靶细胞文库与包含细胞毒性T细胞(CTL)的生物样品接触，(iii)分离与CTL结合的靶细胞，其中候选抗原在靶细胞上结合产生所需的特性和(iv)从分离的靶细胞分离DNA，所述分离的靶细胞包含与CTL特异性结合并产生所需作用的抗原。在一些实施方案中，这些方法还包括富集(例如，借助PCR扩增)和鉴定(例如，借助测序)样品中对CTL特异的候选抗原。在一些实施方案中，如本文所述的筛选方法是迭代的。按照这种方式，可以鉴定对靶CTL特异的候选抗原。

在多种实施方案中，所需的特性包括但不限于以下任一者或多者：物理可检测变化、化学可检测变化、光学可检测变化或其组合。在一些实施方案中，所需的特性可以是靶结合活性或靶结合诱导的活性，例如，催化活性或修饰的催化活性；抑制活性、活化活性、或对抑制活性或活化活性的修饰；结构切换活性或修饰的结构切换活性；或合作活性。

鉴定已识别的APC

在一些实施方案中，使用GzB蛋白酶活性作为已识别APC的标记。GzB是由细胞毒性淋巴细胞向已识别APC中分泌的细胞毒性蛋白酶。GzB在APC中触发胱天蛋白酶激活和凋亡。先前的工作显示，在溶胞杀伤期间释放入靶细胞中的GzB导致GzB靶的完全蛋白酶解，显示充当报告子基础的稳健酶活性。为了检测GzB活性，可以使用GzB活性的分子报告子，如本文所述的那些。这类GzB报告子一般不由通用凋亡通路激活。本领域技术人员会认识到，可以使用已识别APC的其他标记，如由细胞毒T淋巴细胞分泌的其他蛋白酶(粒酶A、K、M)或被工程化入T细胞待分泌进入靶细胞的其他酶或蛋白酶如TEV蛋白酶。

本文所述的报告子可以用来指示增加的粒酶B活性。在一些实施方案中，该方法包括步骤：定量来自报告子的可检测标记物的信号。在一些实施方案中，该方法包括步骤：基于定量的信号富集靶细胞群体。在一些实施方案中，该方法包括步骤：向一个或多个具有所需特性的候选抗原引入一个或多个突变。

在一些实施方案中，该方法包括迭代重复上文描述的一个或多个接触步骤、分离步骤和鉴定步骤。该方法可以例如包括总计1、2、3、4轮或更多轮筛选。

粒酶B活性的报告子

另外，本文提供粒酶B活性的分子报告子，本文中描述其实例，并且还提供编码分子报告子的核酸，及还提供包含核酸和/或分子报告子的细胞(例如，APC)。

粒酶B(GzB)是由CTL分泌入靶细胞中的蛋白酶。GzB切割一套底物，包括效应子胱天蛋白酶和下游胱天蛋白酶底物，以在靶细胞中触发凋亡。

粒酶B活性的分子报告子，包含融合多肽，所述融合多肽包含与检测分子连接的GzB切割位点(例如，VGPD,SEQ ID NO:1)。当本文中提及这类Gzb的报告子而使用术语时，“检测分子”是通过切割GzB切割位点所释放的分子，所述分子具有活性如酶活性、结合活性或光发射。一旦通过切割作用激活，可以通过某测定法检测该活性，如本文所述的那些测定法(例如，检测可检测标记物、检测酶活性如CRE或检测亲和标签)。GzB偏好含有P4至P1氨基酸Ile/Val、Glu/Met/Gln、Pro/Xaa的底物，其中天冬氨酸位于蛋白酶切割的N末端。在P1′处优选不带电荷的氨基酸，并且P2′处优选Ser、Ala或Gly。优选地，所用的GzB切割序列是GzB切割、但胱天蛋白酶不切割切割序列，例如，VGPD(SEQ ID NO:1；Choi和Mitchison,PNAS,110(16):6488-6493(2013)。在一些实施方案中，使用其他的GzB切割序列，例如，如Casciola-Rosen等人,Journal of Biological Chemistry,282(7):4545-4552(2007)中所述的IETD(SEQ ID NO:6)。

通常，仅在GzB介导的报告子切割后，报告子才提供可检测信号，如荧光信号。这允许分离已经由CTL识别并接收GzB的细胞。

在一些实施方案中，检测分子是红外荧光蛋白(IFP)。在一些实施方案中，IFP包含由GzB切割位点功能地分隔的N-片段(N-IFP)和C-片段(C-IFP)，并且还旁侧分布有位于C-IFP N末端的绿色荧光蛋白N-片段(N-GFP)和位于N-IFP C末端的绿色荧光蛋白C-片段(C-GFP)，从而N-GFP和C-GFP形成有组成型活性的(荧光)分子。图11-13中显示前者的一个实施方案。特别地，图11和图12是显示报告子和其发挥作用的机理的简图。图13是报告子构建体的核酸序列和编码的氨基酸序列。我们的报告子中的无活性IFP本身与分割型GFP融合(图11)。分割型GFP具有组成型荧光并提供报告子存在的标记。它还起到活化性切割作用之前和之后稳定IFP的作用。但是，GFP本身不受切割并且对GzB的存在无响应。通过以下方式产生这种无活性IFP：分割野生型IFP，倒置N端半侧和C端半侧并用接头分隔N端半侧和C端半侧，如To等人PNAS112(11):3338-3343(2015)所描述。接头阻止蛋白质的两个半侧恰当折叠成有活性的荧光IFP。但是，当切割接头区时，IFP的半侧能够聚拢并成熟，产生发荧光的蛋白质。

在这种GzB报告子中，将IFP的半侧之间的接头用GzB特异性切割且其他蛋白酶不切割的氨基酸序列替换。结果，可以通过定量每个细胞中的成熟IFP信号，检测GzB活性。GzB是由CTL递送并且可以通过切割无活性IFP蛋白的接头分隔部分来激活报告子的外部蛋白酶。报告子中GFP未切割并提供组成性荧光信号。

本中术语“功能性分隔的”用来指GzB切割位点时，这指用切割位点分隔某分子的各部分，从而使该分子失活，其中切割过程促进或恢复功能(荧光)。通常，报告子不包括形成FRET对的一对荧光染料，或其中荧光团之一猝灭。

构思了多种备选性GzB报告子，它们起到允许在CTL已经有成效识别的靶细胞中检测GzB活性的目的。这些报告子可以独立地或与上文描述的生荧光性蛋白酶报告子组合用来分离CTL识别的靶细胞。例如，一种来自GFP或mCHerry的16氨基酸小肽(GFP11)可以用来激活缺少该肽的GFP或mCHerry。该肽与其中无活性、但通过粒酶切割作用释放时激活的蛋白质融合。例如，参见Kamiyama等人,Nat Commun.2016；7:11046。

在一些实施方案中，分子报告子是亲和标签(例如，Flag表位)。检测基于对于仅在GzB切割充当GzB底物的报告子后才露出的抗体靶的染色。亲和标签可以相对于GzB切割位点的C末端存在，从而使该标签仅在切割GzB位点时有功能(例如，由M1 flag抗体识别的Flag表位)。在图7A中图示一个实施方案。在切割之前，仅识别N末端Flag表位的M1 Flag抗体并不识别内部标签(例如，Flag表位)。但是，在GzB切割后，该标签暴露在C端切割片段的N末端并且可以使用适宜的结合配偶体(例如，M1抗体)染色。在一些实施方案中，分子报告子还具有贴近内部标签存在的GFP。在一些实施方案中，GFP相对于标签的C末端存在。

在一些实施方案中，分子报告子是借助包含GzB切割位点的接头与内质网(ER)滞留序列连接的质膜蛋白。当完整时，报告子滞留在ER中。对接头的切割导致ER滞留序列释放及运输蛋白质至质膜，在此处，蛋白质可以被胞外施加的抗体(或其抗原结合片段)识别。这种抗体可以用来分离或纯化表达已识别表位的APC。这种方法将蛋白酶解信号转换成可及性表位，例如，细胞表面上报告蛋白的存在。通过粒酶切割作用，抗原变成抗体或其他结合部分可及的，原因在于抗原生成独特的结合位点或改变其位置(细胞，或在蛋白质中)。可以使用变得能够结合的任何结合蛋白，例如，可以使用相互作用的成对蛋白质，其中它们之一与干扰缔合过程的蛋白质融合。粒酶切割阻断性区段将允许蛋白质被其结合配偶体检出。也可以使用核酸适配子替代抗体。

这使得用亲和试剂(如针对报告蛋白的荧光抗体)分离GzB阳性细胞(与FACS联合)或通过在亲和柱(如MACS细胞分离柱)中直接捕获GzB阳性细胞成为可能。结果，可以使用并不在细胞表面上内源存在的任何报告蛋白，包括CD4、CD19、CD20、CD40或加标签的其他蛋白质形式，如，但不限于，Myc标签、Flag标签、HA标签和组氨酸标签)。例如，参见M.E.,Brill,A.L.,Pasker,R.L.(2013)Overview of Affinity Tags for Protein Purification.CurrProtoc Protein Sci.73:第9.9单元。

在一些实施方案中，检测分子是酶。融合多肽包含酶(例如，CRE重组酶)，所述酶功能性连接于质膜附着肽(例如，

MGVKVLFALICIAVAEASSGSSGDYKDDDDKPVQPMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRCRHRRRQ(SEQ ID NO:7))，从而当表达融合蛋白时，蛋白质仅存在于发生表达的细胞的质膜处。酶和膜附着蛋白由GzB切割位点分隔，从而当切割时，酶从质膜释放。这种酶的一个实例是本文实施例部分中描述的Cre重组酶蛋白酶报告子。由膜附着肽系留于膜时，Cre重组酶无活性，但被GzB切割作用激活，所述切割作用释放Cre以进入胞核并在其中激活Cre活性报告子。在一些实施方案中，报告子在APC胞核内部利用Cre-介导的LoxP报告子重组以指示活性。在一些实施方案中，通过激活细胞报告子检测Cre活性。在这种方案中，已识别靶细胞中的Cre活性开启报告基因(GFP、嘌呤霉素，等)，所述报告基因使得例如通过FACS或借助抗生素选择分离细胞成为可能。随后，可以恰好从这些细胞分离基因组DNA。GFP/RFP倒置盒是响应于Cre活性产生荧光信号的细胞报告子的实例。在一些实施方案中，Lox P报告子的重组产生允许已识别细胞中抗原盒发生PCR扩增的引物布局。用细胞毒性细胞处理后，可以通过对靶细胞的PCR产物进行Illumina测序，鉴定被有成效识别的抗原。图6A中图示这种方法。本文组合物和方法中用作检测分子的其他有用酶是TEV蛋白酶和转录因子。在一些实施方案中，膜附着信号肽是MALPVTALLLPLALLLHAARPSQ(SEQ ID NO:8)。

此外，本文描述检测APC中粒酶B活性的系统。这类系统可以利用两个独立的报告构建体，所述报告构建体相互作用以指示粒酶B活性。该系统优选地含有融合多肽，所述融合多肽包含与本文所述的质膜附着肽连接的CRE重组酶，其中CRE重组酶和膜附着肽由GzB切割位点分隔。这些系统还可以含有如本文所述的CRE活性报告子。CRE活性报告子可以是旁侧分布有LoxP位点的按头对头取向编码GFP和RFP的核酸序列。该系统可以可选地或进一步含有以可表达形式编码候选抗原的核酸序列，所述核酸序列位于包含无活性引物的CRE激活的引物识别序列的近端，所述引物识别序列旁侧分布有LoxP位点，其中CRE诱导的LoxP位点重排产生有功能的引物识别序列。可以通过PCR和测序在基因组DNA中直接检测CRE介导的这种倒置事件。对于这种方法，Cre介导的倒置事件可以产生正确的引物取向，以使得PCR扩增抗原呈递盒成为可能。可以从全部靶细胞(不作任何分选情况下)提取基因组DNA，并且从这种大量gDNA中PCR将仅从接收GzB、激活Cre并使抗原呈递盒周围的引物倒置的靶细胞扩增抗原呈递盒。在图6的概念验证实验中，这种方法配合qPCR用来定量倒置事件频率。这两个方案可以独立地或组合使用。

标记物

可以掺入本文所述的报告子中的合适检测分子包括而不限于放射性同位素、荧光剂、化学发光物、发色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、金属溶胶。

任何荧光多肽(本文也称作荧光标记物)可以适合用作可检测标记物。合适的荧光多肽将是会轻易提供可检测信号的多肽，其中可以定性(阳性/阴性)和定量(荧光的对比度)评估所述可检测信号。

示例性荧光多肽包括但不限于黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、GFP、mRFP、RFP(tdimer2)、HCRED等或其任何突变体(例如，经修饰以提供增强的荧光或位移的发射光谱的荧光蛋白)、类似物或衍生物。本领域中提供且熟知其他的合适荧光多肽以及本文所列那些荧光多肽的具体实例。

基于生物素的标记物也用于本文所公开的方法中。靶分子的生物素酰化是熟知的，例如，已知多种生物素酰化剂，包括胺反应剂和巯基反应剂，用于蛋白质、核酸、糖、羧酸的生物素酰化；例如，参见第4章,Molecular Probes Catalog,Haugland,第6版1996，所述文献因而通过引用的方式并入。可以通过可检测标记的生物素结合配偶体(如抗生物素蛋白或链霉亲和素)的结合，检出生物素酰化的底物。类似地，还已知多种半抗原化试剂。

适用的示例性亲和标签包括但不限于单核细胞性衔接子蛋白(MONA)结合肽、T7结合肽、链霉亲和素结合肽、多组氨酸串、蛋白A(Nilsson等人,EMBO J.4:1075(1985)；Nilsson等人,Methods Enzymol.198:3(1991))、谷胱甘肽S转移酶(Smith和Johnson,Gene67:31(1988))、Glu-Glu亲和标签(Grussenmeyer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:7952(1985))、P物质，FLAG肽(Hopp等人Biotechnology 6:1204(1988))或其他抗原表位或结合结构域。通常，参见Ford等人,Protein Expression and Purification 2:95(1991).DNAmolecules encoding affinity tags are available from commercial suppliers(例如，Pharmacia Biotech,Piscataway,N.J)。

鉴定已活化APC中的抗原

另外，本文提供用于检测由抗原呈递细胞向细胞毒性淋巴细胞呈递已识别抗原的系统。这些系统含有抗原呈递细胞或多个抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞含有如本文所述的编码候选抗原的外源核酸，其中所述候选抗原被表达并用MHC I类和/或MHC II类分子呈递至细胞毒性淋巴细胞。这些系统还含有如本文所述的粒酶B活性的分子报告子，或如本文所述的用于检测粒酶B活性的系统。在一些实施方案中，如本文所述，这些系统还含有细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞系统还以可表达形式包含CAD介导的DNA降解的抑制剂，如ICAD基因。

如本文所述，细胞毒性淋巴细胞对已识别靶APC上呈递抗原的有成效识别导致APC内部可识别的变化。对这类变化的检测配合鉴定APC和最终确定它表达的抗原使用。可以通过使用检测其中报告子的高通量系统，实现，中已识别靶细胞和已鉴定抗原的鉴定，因而分离和/或分选鉴定的细胞。

可以使用本领域已知的多种方法和/或装置实施如本文所述的分离和/或分选，例如，流式细胞术(例如，荧光激活的细胞分选法(FACS)或Ramen流式细胞术)、荧光显微术、光镊子、微量移液器、亲和纯化和微流体磁性分离装置和方法。在一些实施方案中，其中可检测标记的靶细胞是荧光标记的靶细胞，可以使用FACS基于一个或多个荧光信号定量地分选细胞。在一个示例性实施方案中，当靶细胞包含特异性结合其同族T细胞的候选抗原时，靶细胞将发射红外荧光信号(例如，从靶细胞编码的激活的IFP-GFP融合蛋白发射)。FACS可以用来基于红外荧光信号，分选结合的细胞与未结合细胞。可以联系一种或多种检测分子使用一种或多种分选门或阈水平，以涵盖广泛类型的靶细胞-T细胞相互作用提供定量分选。此外，例如，通过调节靶浓度和设定分选门的位置，可以定量地控制筛选严格性。

例如在荧光信号与候选抗原对细胞毒性淋巴细胞(如CTL)的结合亲和力有关时，可以调节分选门和/或严格性条件，以选择对靶具有所需亲和力或所需亲和力范围的抗原。在一些情况下，可能想要从具体候选抗原序列文库分离最高亲和力抗原。但是，在其他情况下，可以分离落在特定结合亲和力范围范围内的候选抗原。

可以加工经鉴定具有已识别抗原的细胞以分离外源核酸。在一些实施方案中，使用已知的引物序列(例如，从核酸转染入APC中已知)，通过PCR扩增分离外源核酸。备选地，RT-PCR可以用来扩增已转录形式的抗原盒的。如果抗原按附加体方式表达(作为病毒基因组或质粒的部分)，则可以捕获附加体DNA作为分离抗原呈递盒的方式。可以通过使用高通量系统如DNA测序实现对其中已识别具体抗原的确定。

本领域已知多种DNA测序技术，包括基于荧光的测序方法(例如，参见Birren等人,Genome Analysis:Analyzing DNA,1,Cold Spring Harbor,N.Y.)。在一些实施方案中，利用本领域了解的自动化测序技术。在一些实施方案中，本文所述的高通量系统使用提供已分配扩增子并行测序的方法(例如，PCT公开号WO 2006/084132)。在一些实施方案中，通过寡核苷酸并行延伸实现DNA测序(例如，参见美国专利号5,750,341和美国专利号6,306,597)。额外的测序技术实例包括Church聚合酶克隆技术(Mitr等人,2003,AnalyticalBiochemistry 320,55-65；Shendure等人,2005 Science 309,1728-1732；美国专利号6,432,360、美国专利号6,485,944、美国专利号6,511,803)、454 picotiter焦磷酸测序技术(Margulies等人,2005 Nature 437,376-380；US 20050130173)、Solex单碱基添加技术(Bennett等人,2005,Pharmacogenomics,6,373-382；美国专利号6,787,308；美国专利号6,833,246)、Lynx大规模并行特征标识测序技术(Brenner等人(2000).Nat.Biotechnol.18:630-634；美国专利号5,695,934；美国专利号5,714,330)和Adessi PCR集落技术(Adessi等人(2000).Nucleic Acid Res.28,E87；WO 00018957)。

下一代测序(NGS)方法共有大规模并行高通量策略的共同特征，目的在于相比较早的测序方法，成本更低(例如，参见Voelkerd等人,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean等人,Nature Rev.Microbiol.,7:287-296)。NGS方法可以广义地分成一般使用模板扩增的那些方法和不使用模板扩增的那些方法。需要扩增的方法包括由Roche作为454技术平台商业化的焦磷酸测序法(例如，GS20和GS FLX)、由ILLUMINA^TM商业化的Solex平台和由APPLIED BIOSYSTEMS^TM商业化的Supported Oligonucleotide Ligation andDetection^TM(SOLiD)(支持寡核苷酸连接和检测)平台。非扩增方案，也称作单分子测序，由以下例举：由HELICOS BIOSYSTEMS^TM商业化的HELISCOPE^TM平台和分别由VISIGEN^TM、OXFORDNANOPORE TECHNOLOGIES LTD和PACIFIC BIOSCIENCES^TM商业化的新兴平台。

在焦磷酸测序法(Voelkerding等人,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean等人,Nature Rev.Microbial.,7:287-296；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568)中，将模板DNA片段化、末端修复、与接头连接并通过用携带与接头互补的寡核苷酸的珠捕获单个模板分子，原位克隆性扩增。将携带单个模板类型的每个珠区室化入油包水微泡，并且使用称作乳液PCR的技术，将模板克隆性扩增。在扩增后破坏乳液并使珠沉积入微量滴定平板的各个孔，所述各个孔充当测序反应期间的流动池。在测序酶和发光报告子如萤光素酶存在下，在流动池中有序、迭代性引入四种dNTP试剂的每一者。在适宜dNTP添加至测序引物3’末端的情况下，所得的ATP产生造成孔内发光骤增，使用CCD照相机记录所述骤增。可以实现大于或等于400个碱基的读段长度，并且可以实现10⁶个序列读段，产生高达500百万碱基对(Mb)的序列。

在SOLEXA/ILLUMINA平台中(Voelkerding等人,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean等人,Nature Rev.Microbial.,7:287-296；美国专利号6,833,246；美国专利号7,115,400；美国专利号6,969,488)，测序数据以较短长度的读段形式产生。在这种方法中，末端修复单链片段化的DNA以产生5'-磷酸化平末端，随后Klenow介导向片段的3’末端添加单个A碱基。A添加促进添加T-突出端接头寡核苷酸，后者接着用来捕获流动池的表面上用寡核苷酸锚形体镶嵌的模板-接头分子。使用锚形体作为PCR引物，但是因为模板的长度及其接近于其他的附近锚形体寡核苷酸，通过PCR延伸导致与毗邻的锚形体寡核苷酸杂交的分子“拱起”，以在流动池的表面上形成桥结构。将这些DNA环变性并切下。随后用可逆性染料终止物对正向链测序。通过检测掺入后荧光确定已掺入核苷酸的顺序，在下一个dNTP添加循环之前移除每个荧光团和挡块。序列读段长度范围从36个核苷酸至超过50个核苷酸，总输出量超过每个分析运行10亿核苷酸对。

使用SOLID^TM技术对核酸分子测序(Voelkerding等人,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean等人,Nature Rev.Microbial.,7:287-296；美国专利号5,912,148；美国专利号6,130,073)还包括模板片段化、连接至寡核苷酸接头、与珠接合和通过乳液PCR克隆性扩增。此后，将携带模板的珠固定在玻璃流动池的衍生化表面上，并且使互补于接头寡核苷酸的引物复性。但是，并非利用这种引物进行3'延伸，反而利用它提供5'磷酸酯基团以连接至探查探针，所述检查探针含有两个探针特异性碱基，后接6个简并碱基和一个至四个荧光标记物。在SOLID^TM系统中，探查探针在每个探针的3'端具有两个碱基的16种可能组合并且在5'端具有一个至四个荧光团。荧光颜色并且因此每个探针的身份对应于指定的颜色空间编码方案。多轮(通常7轮)探针复性、连接和荧光检测后进行变性，并且随后使用相对于初始引物而偏离一个碱基的引物进行第二轮测序。按这种方式，模板序列可以按计算方式重建，并且探查模板碱基两次，导致准确度增加。序列读段长度平均为35个核苷酸，并且总输出量超过每测序运行40亿碱基。

在某些实施方案中，使用纳米孔测序法(例如，参见Astier等人,J.Am.Chem.Soc.2006 Feb.8；128(5)1705-10).纳米孔测序法背后的理论必须处理当纳米孔浸没入导电性流体并跨纳米孔施加电势(电压)时所发生的事情。在这些条件下，可以观察到因离子穿过纳米孔传到所致的轻微电流，并且电流的量对纳米孔的大小极度敏感。随着核酸的每个碱基穿过纳米孔，这造成通过纳米孔的电流的振幅变化，所述变化对四种碱基的每一者而言迥异，因而允许确定DNA分子的序列。

在某些实施方案中，使用HELICOS BIOSCIENCES^TM的HELISCOPE^TM(Voelkerding等人,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean等人,Nature Rev.Microbial.,7:287-296；美国专利号7,169,560；美国专利号7,282,337；美国专利号7,482,120；美国专利号7,501,245；美国专利号6,818,395；美国专利号6,911,345；美国专利号7,501,245)。将模板DNA片段化并在3'端聚腺苷酸化，同时最末腺苷携带荧光标记物。将变性的聚腺苷酸化模板片段连接至流动池表面上的聚(dT)寡核苷酸。用CCD照相机记录已捕获模板分子的初始物理位置，并且随后切除并洗去标记物。通过添加聚合酶和一系列添加荧光标记的dNTP试剂，实现测序。掺入事件产生与dNTP相对应的荧光信号，并且在添加每轮dNTP之前，通过CCD照相机捕获信号。序列读段长度范围从25-50个核苷酸，总输出量超过每分析运行10亿核苷酸对。

Ion Torrent技术是一种基于检测DNA聚合期间释放的氢离子的DNA测序方法(例如，参见Science 327(5970):1190(2010)；美国专利公开号20090026082、20090127589、20100301398、20100197507、20100188073和20100137143)。微孔含有待测序的模板DNA链。微孔层下方是超灵敏ISFET离子传感器。全部层均包含于类似于电子产业中所用的CMOS半导体芯片内部。当dNTP掺入正在增长的互补链时，氢离子释放，触发超灵敏离子传感器。如果模板序列中存在均聚物重复序列，则将在单个循环掺入多个dNTP分子。这导致相应数目的释放的氢和按比例更高的电子信号。这项技术不同于其他测序技术，在于不适用修饰的核苷酸或光学器件。Ion Torrent测序仪的每碱基准确度是50碱基读段约99.6％，每个运行生成约100Mb。读出长度是100碱基对。5次重复长度的均聚物重复序列的准确度是约98％。

另一个可以适应于配套用于本文所述方法的示例性核酸测序方法由STRATOSGENOMICS,Inc.开发并涉及使用XPANDOMERS^TM。这种测序方法一般包括提供通过模板指导的合成所产生的子代链。子代链通常在与靶核酸的全部或部分的连续核苷酸序列对应的序列中包含成双的多个亚单位，其中单个亚单位包含系索、至少一个探针或核碱基残基和至少一个可选择性切割键。切割可选择性切割键以产生长度比子代链的多个亚单位更长的XPANDOMER^TM。XPANDOMER^TM一般包含系索和用于解析序列中遗传信息的报告元件，所述序列与靶核酸的全部或部分的连续核苷酸序列对应。随后检测XPANDOMER^TM的报告元件。例如2008年6月19日提交的名为“通过扩充的高通量核酸测序”的美国专利公开号20090035777中描述了与基于XPANDOMER^TM的方案有关的额外详情，所述文献完整并入本文。

其他新兴的单分子测序方法包括使用VISIGEN^TM平台(Voelkerding等人,ClinicalChem.,55:641-58,2009；美国专利号7,329,492；美国专利申请系列号11/671,956；美国专利申请系列号11/781,166)的实时并行合成测序，其中使用荧修饰的聚合酶和荧光接纳分子，使固定化、引发的DNA模板经历链延伸，从而一旦添加核苷酸，就产生可检出的荧光共振能量转移(FRET)。

除非本文另外定义，否则与本发明联系使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。Allen等人,Remington:The Science and Practice ofPharmacy第22版,Pharmaceutical Press(2012年9月15日)；Hornyak等人,Introductionto Nanoscience and Nanotechnology,CRC Press(2008)；Singleton and Sainsbury,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第3版,修订版,J.Wiley&Sons(NewYork,NY 2006)；Smith,March’s Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanismsand Structure第7版,J.Wiley&Sons(New York,NY 2013)；Singleton,Dictionary of DNAand Genome Technology第3版,Wiley-Blackwell(2012年11月28日)；和Green与Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第4版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(Cold Spring Harbor,NY 2012)，为本领域技术人员提供了本申请中所用多个术语的一般指南。关于如何制备抗体的参考文献，参见Greenfield,Antibodies A LaboratoryManual第2版,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor NY,2013)；

andMilstein,Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumorlines by cell fusion,Eur.J.Immunol.1976Jul,6(7):511-9；Queen和Selick,人源化免疫球蛋白,美国专利号5,585,089(1996年12月)；和Riechmann等人,Reshaping humanantibodies for therapy,Nature 1988年3月24日,332(6162):323-7。另外，除非上下文所要求，单数术语应当包括复数并且复数术语应当包括单数。

除了在工作实施例中或其中另外说明，否则表述本文所用成分或反应条件的量的全部数字在全部情况下均应理解为受术语“约”修饰。用来描述本发明时，与百分数联系的术语“约”意指±5％。

在一个方面，本文中所述的组合物、方法及其相应组分是必需的，然而对纳入必需或非必需的未指明要素开放(“包含”)。在一些实施方案中，在描述组合物、方法及其相应组分时待纳入的其他要素限于并不实质影响其基本特征和新特征的那些(“基本上由……组成”)。这同等地适用于所述方法内部的步骤以及其中组合物和组分。在一些实施方案中，本文所述的组合物、方法及其相应组分意在排除这样的任何要素，其中未认定所述任何要素是对该组分、组合物或方法必需的要素(“由……组成”)。

标识的全部专利、专利申请和出版物明确地通过引用方式并入本文，目的在于描述并且公开例如此类出版物中所述的可能联系本发明使用的方法。这些出版物仅因它们的公开先于本申请的提交日而提供。就这一方面而言任何内容均不得解释为承认发明人由于在先发明或由于其他任何原因而无权早于这种公开。就这些文献的日期而言的全部叙述或就这些文献的日期而言的描述基于申请人可获得的信息并且不构成对这些文献的日期或内容正确性的任何承认。

本发明由以下实施例进一步说明，所述实施例不应当解释为进一步起限制作用。

实施例

材料和方法

本文实施例中使用以下材料和方法。

T细胞的制备

Bruce Walker友情提供识别IV9表位(HIV Pol的氨基酸309-317，ILKEPVHGV)的克隆性T细胞。在含有10％FBS(Gibco)、1％青霉素-链霉素(Gibco)和50U/ml人重组IL-2(Roche)的RPMI中培养T细胞。通过将1E6个T细胞与20E6个照射(50Gy)的同种异体PMBC在抗CD3(OKT3，0.1ug/ml)存在下培养，扩充T细胞。

为了复活TCR，使用RosetteSep CD8 T细胞纯化试剂盒(StemCell)从供体血液纯化原代CD8 T细胞。使用抗CD3/抗CD28磁珠(Invitrogen)，激活1E6个T细胞并同时用编码目的TCR和Zesty Green(Zsg)荧光标记的慢病毒载体转导。5天后，基于Zsg信号(FITC通道)通过FACS(BD FACSAria^TMII)分选转导的细胞。

使用RosetteSep NK细胞纯化试剂盒(StemCell)从供体血液纯化NK细胞，并在RPMI中的100U/ml IL-2和10％FBS中激活24小时。

细胞毒测定法

将Hmy2.CIR-HLA-A2靶细胞用CFSE(Invitrogen)根据生产商的操作方案标记，并且用10ug/ml IV9肽(NeoBioLab)或对照肽(NeoBioLab)脉冲标记1小时。将细胞用PBS洗涤3次。在96孔板中，每孔铺种5E4个靶细胞并与10倍过量的IV9 T细胞混合，以300g离心2分钟并且在37℃温育4小时。将细胞通过抽吸重悬并且与1:20稀释度的7-AAD(BD Biosciences)温育10分钟。通过CFSE染色(FITC)鉴定靶细胞并且在PerCP-Cy5.5通道(BD FACSAria^TMII)中检测死细胞。对于LDH测定法，在4小时温育后收集上清液并根据生产商的操作方案(Pierce)加工。

生荧光性GzB报告子

通过将iTEV-HO1载体中的TEV切割位点(To等人.PNAS 112(11):3338-3343(2015))替换为GzB切割序列(VGPDFGR(SEQ ID NO:9),Choi,P.J.and Mitchison,T.J.(2013)PNAS 110(15):6488-6493)，生成生荧光性GzB报告子。将新的报告子克隆入pHAGETRex潮霉素慢病毒表达载体并按约1的MOI转导入HEK293T细胞。将细胞用200ug/ml潮霉素选择4天。靶细胞基于GFP信号与T细胞区分，并且依据APC-Cy7通道(BD FACSAri^TMa II)中荧光增加，检测报告子的激活。

GzB活性的Cre报告子

生成编码膜系留的Cre融合物的构建体，所述融合物含有信号肽(MALPVTALLLPLALLLHAARPSQ(SEQ ID NO:8))、flag标签(DYKDDDDK(SEQ ID NO:10))、CD8跨膜结构域，GzB切割位点(VGPDFGR(SEQ ID NO:9))和Cre重组酶。合成这种构建体(IDT)并克隆入pENTR载体(ThermoFisher)并且随后克隆入慢病毒pHAGE CMV hygro目的载体并且通过慢病毒转导引入K562靶细胞。作为Cre活性报告子，使用含有旁侧分布有loxP位点的头-对-头取向的GFP和RFP的载体。这是用于Cre存在的报告盒，所述报告盒使得通过激活GFP和丧失RFP对Cre活性的荧光检测成为可能。此外，设计了允许通过qPCR而非通过荧光检测法检测这个相同倒置事件的qPCR引物(图14中图示，图15中显示序列)。将这种报告盒克隆入pHAGE CMV慢病毒载体并通过慢病毒转导，引入报告细胞(200ug/ml潮霉素选择4天)。最后，将胱天蛋白酶抗性D117E ICAD基因通过慢病毒转导引入靶细胞(40ug/ml杀稻瘟素选择5天)。靶细胞与2:1过量的活化的原代NK细胞混合4小时。使用GeneJET^TM纯化试剂盒，纯化基因组DNA，并且通过使用倒置特异性引物的qPCR对PCR扩增产物定量，定量Cre报告子的倒置。倒置盒本身含有RFP和GFP用于其他背景下荧光检测Cre活性，但这个实验中根本不使用荧光信号。将信号对无论方向均定量报告盒的一套引物归一化。

基于抗体的GzB报告子

将编码HA标签(YPYDVPDYA(SEQ ID NO:11))、GzB切割位点(VGPD(SEQ ID NO:1))、Flag标签(DYKDDDDK(SEQ ID NO:10))和GFP的融合物的构建体合成(IDT)并克隆入pENTR载体(ThermoFisher)，并且随后通过Gateway克隆法克隆入pHAGE Trex neo表达载体。将HEK293T细胞用该表达载体或对照空载体转染并且随后与原代NK细胞共培养2小时。收获细胞裂解物并在4-12％Bis-Tris凝胶上解析并用M1抗Flag抗体(Sigma Aldrich)印迹。

CD4 TCR试验

将P2A序列分隔的(MBP肽特异性)OB1a.12 TCR的α和β链克隆入pHAGE EF1a-PGK-Zsg载体。作为对照，将靶向IV9肽(Kolowos,W.等人(1999)Journal of Immunology,162:7525-7533)的TCR的α和β链克隆入相同的载体。用表达OB1a.12或对照TCR的慢病毒转导抗CD3/抗CD28磁珠(Invitrogen)再刺激过的原代CD8 T细胞。5天后，通过FACS分选Zsg-阳性T细胞。将OB1a.12或对照T细胞与表达单一生荧光性GzB报告子的HEK293T细胞或与具有MBP肽或MBP肽突变体的单链MHC II构建体共培养。4小时后通过FACS检测到GzB报告子的激活。

混合实验

含有IV9表位(GAKALTDIVPLTREAELELAENKEILKEPVHGVYYDSAKELIAEVQKQGLDQWTYQ；SEQ ID NO:12)的56氨基酸片段克隆入pHAGE CMV puro慢病毒表达载体。将表达生荧光性GzB报告子的HEK293T细胞用表达这个IV9表位的慢病毒或对照慢病毒(MOI约1)转导并用1ug/ml嘌呤霉素选择3天。将表达IV9构建体的细胞用CellTrace^TMViolet细胞染料，根据生产商的方案(Invitrogen)标记并且与未标记的对照细胞按各种比率混合并铺种在96孔板中。在12小时生长后，添加10:1比率的IV9 T细胞并将细胞共培养4小时。通过抽吸重悬细胞并通过流式细胞术(BD FACSAria^TMII)对其分析GFP、APC-Cy7和DAPI(紫染料)。

IV9 T细胞筛选

合成含2494个寡聚物的文库，所述寡聚物编码贯穿10个HIV株的完整蛋白质组来叠覆的56氨基酸片段(Agilent)。使用以下引物扩增文库：

HIV_lib_F 5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaAGAATTCTCCGTGGC(SEQ ID NO:13)

HIV_lib_R 5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcagctagttaCACTCGAGAGCTCAC(SEQ ID NO:14)

并将其克隆入pDONR221载体。大写部分表示完全与我们的抗原盒互补的区域(小写是通过PCR加上的突出端)。随后使用LR克隆酶，将该文库克隆入pHAGE CMV N-FlagHAIRES puro目的载体。将30E6个靶细胞(表达GzB报告子和ICAD的HEK293T)的两个重复用MOI约0.2的HIV肽文库转导并且用1ug/ml嘌呤霉素选择3天。来自每个重复的3E6个靶细胞与10E6个活化的IV9T细胞共培养12小时。通过抽吸重悬细胞并且通过FACS分选激活GzB报告子的靶细胞。使用GeneJET^TM试剂盒(Thermo)，从分选的细胞和3E6个分选前的对照中纯化基因组DNA。使用以下引物扩增肽盒：

T_细胞_PCR1_F 5’

CCAGTCAGGTGTGATGCTCGGGGATCCAGGAATTCAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCA(SEQ IDNO:15)；T_细胞_PCR1_R 5’

CGAGCTTATCGTCGTCATCCCCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCA(SEQ ID NO:16)，并使用1ul PCR1产物作为两轮如前述的文库制备PCR(Xu等人,(2015)Science,348(6239)、aaa0698)的模板，并且将产物汇集，进行凝胶提取，并提交用于Illumina MiSeq上单端300bp测序。使用BWA对齐读段并且计算分选的群体中每个肽相对于输入频率的丰度。

CMV子文库筛选

这种筛选如上文描述的IV9 T细胞筛选那样进行，伴随以下修改。简而言之，将NLV2 TCR(Schub等人,J Immunol,183:6819-6830(2009))作为gBlock片段合成(IDT)，克隆入pHAGE EF1a Zsg DEST慢病毒载体，包装入慢病毒并转导至原代CD8 T细胞中。将一个编码CMV Merlin毒株完整蛋白质组的含5,784个寡聚物的文库一式两份在可释放微阵列(Twist Biosciences)上合成、克隆入pHAGE CMV NFlagHA puro DEST慢病毒载体，包装入慢病毒，并按约0.5的MOI转导入HLA-A2靶细胞(MHC无效HEK293T/dmICAD-bsd/iGzB-hyg/HLA-A2)(1ug/ml嘌呤霉素选择3天)。

将10E6个CMV靶细胞一式三份与50E6个NLV2 T细胞共培养12小时，此后，分选IFP-阳性靶细胞(FACSAria^TMII)。将分选的细胞按500g离心5分钟，并且使用GeneJET^TM基因组DNA纯化试剂盒(Thermo)提取gDNA。如上文对IV9 T细胞筛选所述那样，在三轮PCR中添加测序接头和多重反应索引物，并提交样品用于Illumina MiSeq上高通量测序。使用BWA对齐读段并且计算分选的群体中每个肽相对于输入频率的丰度。

全病毒组筛选

这种筛选如上文描述的IV9 T细胞筛选那样进行，伴随以下修改。简而言之，KimLyerly友情提供pp65特异性原代T细胞。将VirScan文库(Xu等人Science,348(6239),aaa0698(2015))克隆入pHAGE CMV NFlagHA puro DEST慢病毒载体，包装入慢病毒，并按约0.5的MOI转导入HLA-A2靶细胞(MHC无效HEK293T/dmICAD-bsd/iGzB-hyg/HLA-A2)(1ug/ml嘌呤霉素选择3天)。

将120E6个靶细胞一式四份与120E6个T细胞共培养12小时，此后，分选IFP-阳性靶细胞(FacsAria^TMII)。将分选的细胞按500g离心5分钟，并且使用GeneJET^TM基因组DNA纯化试剂盒(Thermo)提取gDNA。如上文对IV9 T细胞筛选所述那样，在三轮PCR中添加测序接头和多重反应索引物，并提交样品用于Illumina MiSeq上高通量测序。使用BWA对齐读段并且计算分选的群体中每个肽相对于输入频率的丰度。

CMV文库与文库筛选

这种筛选如上文描述的CMV子文库筛选那样进行，伴随以下修改。从供体#224PBMC(76E6个起始细胞，Astarte Biologicals)纯化记忆T细胞并且如前述扩充。

将30E6个CMV靶细胞一式四份与约25E6个T细胞共培养8小时，此后，分选IFP-阳性靶细胞(FacsAria^TMII)并如上文所述加工。

叠覆诱变筛选(tiling mutagenesis screen)

这种筛选如前文描述的IV9 T细胞筛选那样进行，伴随以下修改。简而言之，KimLyerly友情提供pp65特异性原代T细胞。将编码四个T细胞表位的整套单氨基酸突变体的含有3,376个寡聚物的文库(CTL_mut文库)(包含pp65表位：NLVPMVATV)一式两份在可释放微阵列(Twist Biosciences)上合成、克隆入pHAGE CMV NFlagHA puro DEST慢病毒载体，包装入慢病毒，并按约0.2的MOI转导入HLA-A2靶细胞(MHC无效HEK293T/dmICAD-bsd/iGzB-hyg/HLA-A2)(1ug/ml嘌呤霉素选择3天)。

将25E6个CTL_mut靶细胞一式三份与25E6个T细胞共培养12小时，此后，分选IFP-阳性靶细胞(FacsAria^TMII)并如上文所述加工。

两轮选择筛选

这种筛选如上文描述的IV9 T细胞筛选那样进行，伴随以下修改。简而言之，将IV9特异性“HA”TCR(Kolowos等人,J Immunol 162:7525-7533 1999)作为gBlock片段合成(IDT)，克隆入pHAGE EF1a Zsg DEST慢病毒载体，包装入慢病毒并转导至原代CD8 T细胞中。

将5E6个靶细胞一式三份与40E6个“HA”T细胞共培养10小时，此后，分选IFP-阳性靶细胞(FacsAria^TMII)并如上文所述加工。

为了进行第二轮选择，来自三个筛选重复中每者的PCR1产物被复克隆入pHAGECMV NFlagHA puro DEST载体、包装入慢病毒并按约0.2的MOI转导入HLA-A2靶细胞。将5E6个表达三个再克隆的文库中每个文库的靶细胞一式一份与25E6个“HA”T细胞共培养10小时，此后，分选IFP-阳性靶细胞(FacsAria^TMII)并如上文所述加工。在测序和读段对齐后，一轮或两轮选择后已恢复肽的丰度与预先选定的输入文库比较。

筛选优化详情

为了在分离IFP-阳性细胞后保护基因组DNA，将分选的细胞总是保持在冰上，离心并在四小时分选以内冷冻。

为了提供靶检测的最佳信噪比，紧邻每次筛选进行优化实验。简而言之，在已知的T细胞抗原(脉冲标记的肽，终浓度10ug/ml)存在或不存在下，将MHC-匹配的靶细胞(表达iGzB报告子)与用于筛选的T细胞的连续稀释物共培养4小时。在每种条件下通过流式细胞术确定报告子激活，并且计算背景激活率(不存在脉冲标记的抗原)和中靶激活率(存在脉冲标记的抗原)。选择最佳T细胞:靶细胞比率用于文库筛选。

为了减少展示多个抗原的细胞的数目，用慢病毒文库按0.2-0.5的感染复数(MOI)转导靶细胞。

为了稳健检测抗原序列，对样品测序至的深度至少2倍已分选细胞的数目(即，对于其中100,000个细胞由FACS分选的样品，200,000个读段)。

为了通过FACS实现T细胞和靶细胞的更明确分离，与T细胞共培养之前，将靶细胞用CellTrace^TMViolet染料(Invitrogen)染色。

实施例1.通过高通量测序从复杂文库鉴定T细胞抗原的组合物和方法

本文中公开了对T细胞靶抗原全面全基因组鉴定的组合物和方法。该方案使用慢病毒递送候选抗原以呈递在靶细胞中的MHC I类分子上。随后将这种靶细胞文库与目的细胞毒T淋巴细胞(CTL)的样品混合，并给予CTL时间识别展示其同族抗原的任何靶细胞。一旦识别，CTL释放其含有丝氨酸蛋白酶粒酶B(GzB)的细胞毒性颗粒，以启动杀伤过程。胞内GzB活性的报告子用来从已识别的靶细胞分离基因组DNA。最后，PCR扩增和下一代测序法(NGS)使得全面鉴定这些细胞已经展示的抗原成为可能。这提供由输入CTL群体识别的抗原的定量性测序用读段。图1中显示该方案。

进行概念验证实验，以显示用于鉴定细胞毒性T细胞特异性候选抗原的方法可以稳健富集展示CTL同族抗原的靶细胞。出于开发和测试目的，获得充分表征的对HLA A*0201限制的HIV pol肽IV9(Pol残基476-484)特异的CTL克隆。在用同族肽脉冲标记但未用对照肽脉冲标记的MHC匹配的靶细胞中，该CTL克隆能够诱导凋亡，如通过膜渗透性的7-AAD染色检出(图2A)。

遗传编码的候选抗原可以由靶细胞高效呈递在MHC I分子上，从而使得生成靶细胞文库成为可能。进行一项测试，以确定单拷贝慢病毒表达HIV pol的含有同族IV9序列的56氨基酸片段是否允许高效加工和呈递IV9肽。观察到，这个片段的表达足以引起IV9 CTL识别靶细胞，如通过LDH-放细胞毒性测定法所确定(图2B)。这表明了生成靶细胞文库的可行性。

为了从已经被CTL有成效识别的靶细胞分离DNA，开发了一种针对靶细胞中有成效抗原识别的报告子测定法。使用GzB蛋白酶活性作为已识别靶细胞的读出/标记。GzB是由CTL分泌入已识别靶细胞的细胞毒性蛋白酶，其触发胱天蛋白酶激活和凋亡。GzB的报告子不由通用凋亡通路激活，这意味着仅分离遭CTL杀伤的靶细胞。这在本文所述的方法中减少抗原非依赖性背景噪声。先前的工作显示，在溶胞杀伤期间释放入靶细胞中的GzB导致GzB靶的完全蛋白酶解，提示充当报告子基础的稳健酶活性。

为了检测GzB活性，基于To等人PNAS 112(11):3338-3343(2015)中描述的工作，开发了一种新的生荧光性GzB报告蛋白，生成了一种因两个结构域之间的约束性肽接头而不能成熟的修饰的红外荧光蛋白。对这种接头的蛋白酶切割允许蛋白质正确折叠并导致荧光增加高达1000倍。To等人PNAS112(11):3338-3343(2015)已经成功地使用这种报告子检测了胱天蛋白酶和TEV蛋白酶的活性。如本文所述那样修饰该报告子以检测GzB切割作用。作为这种报告子的测试，产生稳定表达生荧光性GzB报告子的靶细胞。与IV9CTL的共培养在IV9-脉冲标记的靶细胞中导致红外荧光蛋白信号增加，但对照脉冲标记的靶细胞中不导致红外荧光蛋白信号增加(图3)，与高效检出GzB活性相符。

为了验证本文所述的平台可以富集展示CTL同族抗原的靶细胞，进行了一项重建实验。用紫色细胞染液标记表达GzB报告子和展示IV9肽的靶细胞。随后将这些细胞与未染色的靶细胞混合，所述靶细胞也表达GzB报告子，但展示对照肽。各种比率的展示IV9的对照细胞用来模拟复杂性递增的抗原文库。将混合的细胞与IV9 CTL共培养，并分离已经激活GzB报告子的靶细胞。紫色染液用来计算已经激活GzB报告子的全部靶细胞当中展示IV9肽的靶细胞的富集。图4A中显示这个实验。

实验的结果于4B图中展示并且说明强烈富集展示同族IV9抗原的靶细胞。使用1:1000(我们测试的最低稀释度)的初始稀释度时，观察到展示同族抗原的靶细胞富集21倍。这种状况模拟了含1,000个不同抗原的文库并且验证该平台可以用来从非常复杂的候选物文库鉴定靶抗原。

通向应用这种方法的最终步骤是使得从已识别靶细胞的基因组DNA恢复完整抗原文库成为可能。然而，GzB在靶细胞中启动胱天蛋白酶激活，这导致胱天蛋白酶激活的脱氧核糖核酸酶(CAD)对基因组DNA的核小体间降解。正常情况下，CAD由CAD的蛋白质抑制剂(ICAD)失活，所述蛋白质抑制剂是胱天蛋白酶底物，但是已经显示抵抗胱天蛋白酶的(D117E)ICAD的过量表达阻断凋亡期间DNA的降解(Sakahir等人,Nature.1:391(6662):96-9.1998)。使用已经通过慢病毒转导和选择被修饰以表达抵抗胱天蛋白酶的D117E ICAD基因的靶细胞。获得的结果显示，这种策略允许从凋亡细胞恢复完整的基因组DNA。

为了验证这个平台可以从复杂抗原文库成功富集CTL靶，对T细胞克隆的靶进行筛选。生成含2,494个肽片段的文库，所述肽片段贯穿十个HIV毒株的完整蛋白质组以56氨基酸进阶(amino acid step)叠覆。将这个文库克隆入慢病毒载体并引入靶细胞，所述靶细胞表达我们的GzB报告子和具有D117E和D224E突变的突变体ICAD。将靶细胞文库与IV9 CTL克隆共培养过夜，并通过FACS分离已经激活GzB报告子的靶细胞。进行PCR，以从输入和分选的细胞的基因组DNA扩增抗原盒，并进行qPCR以定量分选的细胞中选定肽的富集情况。图5A中显示这个实验并且图5B中显示结果。观察到编码IV9 CTL抗原的肽明显且可重复地富集，而对照抗原并未明显富集。这表明，该平台可以用来筛选CTL靶的复杂抗原文库并且可以通过使用下一代测序法全面检测这些靶。

实施例2.通过高通量测序从复杂文库鉴定T细胞抗原

为了显示该平台可以用来从复杂抗原文库发现CTL靶，对目的T细胞克隆的靶进行重建筛选。生成编码2,494个肽片段的文库，所述肽片段贯穿十个HIV毒株的完整蛋白质组以56氨基酸进阶叠覆。将这个文库克隆入慢病毒载体并引入靶细胞，所述靶细胞表达我们的GzB报告子和具有D117E和D224E突变的突变体ICAD。将靶细胞文库与IV9 CTL克隆共培养过夜，并通过荧光激活细胞分选法(FACS)分离已经激活GzB报告子的靶细胞。PCR用来从输入和分选的细胞的基因组DNA扩增抗原盒，并Illumina测序法用来表征由T细胞克隆识别的细胞中富集的抗原。

图8标出了这个实验的两个生物学重复之间，分选我们的文库中每个肽后的富集倍数。用数值注释标出的肽含有所用IV9 CTL克隆的已知靶表位。含有IV9表位的肽最强烈和可重复地富集性，并且几乎每个这类肽至少中度富集。另外，对筛选中最富集的肽的无偏基序分析揭示精确的IV9表位作为复现最多的基序(图9)。总之，这些数据显示，这些组合物和方法可以用来从高度复杂的抗原汇集物准确鉴定T细胞靶。

实施例3.GzB报告子应用于CD4 T细胞

还已经采取步骤显示，该方案可以用来鉴定CD4 T细胞或本身没有细胞毒活性的其他T细胞的靶。可以通过向原代细胞毒性CD8 T细胞引入目的T细胞受体(TCR)，实现这点。随后使细胞毒性T细胞重定向以识别并杀伤已引入TCR的靶细胞。随后可以使用如本文所述的GzB的报告子，鉴定由目的TCR识别的靶细胞。

进行一项实验以显示这种方法可以用来成功产生呈现CD4 TCR特异性的CTL。慢病毒感染用来向原代细胞毒性CD8 T细胞引入识别MHC II类分子背景下MBP肽的CD4 TCR(Ob1A.12)。用Ob1A.12 TCR修饰、但未用对照TCR修饰的CD8 T细胞能够在靶细胞中特异性激活GzB报告子，所述靶细胞在正确的MHC II分子中展示MBP肽(图10)。这个结果表明，GzB报告子可以鉴定靶CD4 T细胞并且使得传染性疾病、癌症和自身免疫性背景下鉴定Th1、Th2和Treg CD4 T细胞的靶成为可能。

实施例4.替代性粒酶B报告子

如本文所述，构思了许多基于GzB的报告子，所述报告子允许在已经被CTL有成效识别的靶细胞中检测GzB活性。例如，已经产生几种替代性GzB活性报告子。这些报告子可以独立地或与上文描述的生荧光性蛋白酶报告子组合用来分离CTL识别的靶细胞。

例如，开发一种检测GzB活性的方法，所述方法使用无活性、膜系留的Cre重组酶，其中通过GzB切割其系索激活所述重组酶。这释放Cre以响应于T细胞识别进入胞核并激活报告子。Cre介导的LoxP报告子重组产生了允许已识别细胞中抗原盒发生PCR扩增的引物布局用细胞毒性细胞处理后，可以通过对靶细胞的PCR产物进行Illumina测序，鉴定被有成效识别的抗原。图6A中图示这种方法。

为了说明这种方法的可行性，进行了一项试验。修饰靶细胞以表达：1)膜系留的在系索上有GzB切割序列的Cre重组酶，2)含有可以由Cre重组酶倒置的两个loxP位点的报告盒，和3)在凋亡期间保护基因组DNA的D117E突变体形式的ICAD。通过天然杀伤细胞向这些靶细胞引入GzB导致切割Cre重组酶和报告子倒置增加大约3倍，如通过qPCR检出(图6B)。这种报告子将以类似细胞毒性T细胞的方式发挥作用，使用与NK细胞相同的穿孔素介导和粒酶介导的溶胞机制。这说明了使用Cre重组检测GzB活性的可行性并且突出显示我们的从靶向杀伤的细胞中恢复完整DNA的能力。

另一个备选项将是使用胱天蛋白酶报告子，而非GzB。但是，不同于胱天蛋白酶报告子，粒酶报告子在胱天蛋白酶介导的凋亡期间不激活，并且在我们的T细胞杀伤测定法环境下具有较低水平的背景活化(不影响正信号，背景降低大约3倍)。

另一个为检测GzB活性所开发的方法基于针对抗体靶的染色(胞内或胞外，取决于报告子是否在细胞质中表达或导引至膜)，其中所述抗体靶仅在GzB切割充当GzB的底物的报告子后才露出。该报告子含有GzB切割基序紧邻前置的Flag表位。在切割之前，仅识别N末端Flag表位的M1 Flag抗体并不识别内部Flag表位。但是，在GzB切割后，Flag表位暴露在C端切割片段的N末端并且可以使用M1抗体着染。图7A中显示该方案。

这种方法导致在NK细胞(这个概念验证实验中当细胞毒性淋巴细胞)递送或不递送GzB的情况下，报告子暴露于NK细胞递送的GzB后M1抗体靶的丰度明显增加，如通过使用M1 Flag抗体对来自表达GzB报告子的靶细胞的细胞裂解物的蛋白质印迹分析检出(图7B)。还可以通过服务于本文所述筛选方法的抗体染色和流式细胞术检出切割的底物。

靶细胞中另一个GzB活性报告子仍基于用ER滞留基序隔绝于细胞内部的报告蛋白。一旦GzB切割ER滞留基序，则可以释放并检出报告蛋白，如通过转移至细胞表面，在这里，它可以用于分离靶细胞。为了显示这种方法成功地检测蛋白酶解，使用CD4作为报告蛋白，其在ER滞留基序之前包含TEV切割位点。对于ER滞留，使用C端KKXX基序，其中X是任何氨基酸，例如，KKYL(SEQ ID NO:17)，其中先前已经所述基序使蛋白质隔绝于ER中(参见Nilsson等人,Cell,58(4):707-718(1989))。该报告子与GFP融合，以追踪报告子表达。下文呈献完整的构建体和序列。TEV与该构建体共表达导致细胞表面上CD4明显增加(图25)。

所用KKXX报告子的序列如下：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAGGAATTCTCACCATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGCGCTCCTCCCAGCAGCCACTCAGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAAATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGCTGACTCAAGAAGAAGCCTTTGGGACCAAGGAAACTTCCCCCTGATCATCAAGAATCTTAAGATAGAAGACTCAGATACTTACATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAGGAGGAGGTGCAATTGCTAGTGTTCGGATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCAGGGGCAGAGCCTGACCCTGACCTTGGAGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGTAAAAACATACAGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAGCTCCAGGATAGTGGCACCTGGACATGCACTGTCTTGCAGAACCAGAAGAAGGTGGAGTTCAAAATAGACATCGTGGTGCTAGCTTTCCAGAAGGCCTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAGGGGGAACAGGTGGAGTTCTCCTTCCCACTCGCCTTTACAGTTGAAAAGCTGACGGGCAGTGGCGAGCTGTGGTGGCAGGCGGAGAGGGCTTCCTCCTCCAAGTCTTGGATCACCTTTGACCTGAAGAACAAGGAAGTGTCTGTAAAACGGGTTACCCAGGACCCTAAGCTCCAGATGGGCAAGAAGCTCCCGCTCCACCTCACCCTGCCCCAGGCCTTGCCTCAGTATGCTGGCTCTGGAAACCTCACCCTGGCCCTTGAAGCGAAAACAGGAAAGTTGCATCAGGAAGTGAACCTGGTGGTGATGAGAGCCACTCAGCTCCAGAAAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGGACCCACCTCCCCTAAGCTGATGCTGAGCTTGAAACTGGAGAACAAGGAGGCAAAGGTCTCGAAGCGGGAGAAGGCGGTGTGGGTGCTGAACCCTGAGGCGGGGATGTGGCAGTGTCTGCTGAGTGACTCGGGACAGGTCCTGCTGGAATCCAACATCAAGGTTCTGCCCACATGGTCCACCCCGGTGCAGCCAATGGCCCTGATTGTGCTGGGGGGCGTCGCCGGCCTCCTGCTTTTCATTGGGCTAGGCATCTTCTTCTGTGTCAGGTGCCGGCACCGAAGGCGCCAAGCAGAGCGGATGTCTCAGATCAAGAGACTCCTCAGTGAGAAGAAGACCTGCCAGTGCCCTCACCGGTTTCAGAAGACATGTAGCCCCATTGGCGGCCGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGCTTGTAGGACCAGACTTCGGGCGCGAGAACCTGTACTTCCAGTCTAGAACTCTGGCCAGCTCCCTGACTTTCAAGAAGTATCTGTAACTAGCTGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTCCCC(SEQ IDNO:18)

实施例5.全基因组筛选鉴定已知的和新的T细胞靶

向各种T细胞群体应用所述组合物和方法进行一套筛选。这些筛选显示，这些组合物和方法鉴定了先前已表征TCR的正确靶抗原，并且重要地，在全基因组级别发现新的有生物学意义的T细胞群体抗原。

为了说明可以正确鉴定已知TCR的靶，合成了识别CMV PP65的NLV表位的TCR。通过慢病毒转导，将这种TCR引入原代供体CD8 T细胞，并且这些细胞用来筛选贯穿CMV基因组叠覆的2882个候选56聚物的文库。文库中仅两个含有NLV表位的56氨基酸肽是文库中居前两位的评分肽，富集7倍至20倍(图16和表1)。值得注意地，无其他肽可重复地富集超过4倍。这个实验显示，该平台成功地鉴定向供体CD8 T细胞引入的“复活”TCR的靶。

表1

为了说明该平台可以筛选甚至更复杂的含成百上千个抗原的集合，进行全病毒组筛选。在这种筛选中，使用已经在NLV肽存在下扩充的来自HLA-A2阳性、CMV-阳性供体的原代T细胞。针对具有超过93,000个候选抗原的文库筛选这些细胞，所述候选抗原贯穿206个病毒物种的全基因组以56氨基酸进阶在28个氨基酸重叠时叠覆。文库中仅两个含有NLV表位的56聚物是居前两位的富集肽，富集25倍至100倍(图17和表2)。两个额外的重叠性56聚物富集15倍至40倍，并且验证这两种56聚物共有的28氨基酸区域中的一个表位由大约2％的输入的CD8 T细胞识别(图18)。这个实验说明该平台在全基因组级别鉴定新的T细胞靶。值得注意地，筛选的含93,000个候选抗原的文库比完整人ORF组集合(约20,000个全长ORF)更复杂。另外，这个实验显示，可以一次性表征多个T细胞群体，原因是鉴定并验证了仅由2％的T细胞亚群识别的新靶。

表2

接下来，进行全基因组文库与文库筛选，以显示可以在全基因组级别鉴定多克隆T细胞的新颖免疫优势靶。从HLA-A2阳性、CMV-阳性供体纯化大量记忆T细胞。对含2,882表位的CMV级文库筛选这些T细胞。鉴定到反复富集的六组重叠性56聚物(表3)。全部这六种候选抗原均在28氨基酸重叠区含有预测的高亲和力HLA-A2结合物(图20)。相反，预测仅10％的28氨基酸段含有高亲和力HLA-A2结合物。富集表位的之一是已知的免疫优势PP65表位，验证该表位被0.3％的T细胞识别。先前尚未报告剩余的五个已鉴定表位。这个实验说明，相对于文库环境，可以在文库中，在基因组级别鉴定多克隆T细胞的新T细胞靶。

表3.相对于文库筛选，CMV文库中发现的免疫优势表位。

表3显示图19中描述的在筛选中反复富集的六组重叠性56聚物。在6/6事例中，28氨基酸重叠区(粗体)存在预测的高亲和力HLA-A2结合表位。相反，预期仅10％的28聚物具有高亲和力HLA-A2结合表位。表位1336-1337是一个充分确立的免疫优势表位，而先前尚未报告剩余五个表位。

为了说明该平台可以阐释TCR-表位相互作用场景，进行全面诱变筛选。使用上文所述的NLV扩充的原代T细胞。筛选含已知靶表位的除两个上游和下游残基之外的全部单氨基酸突变体的文库。对上游或下游氨基酸的突变不消除T细胞识别作用，而表位本身中的大部分突变减少表位识别作用(图6)。这种方法在较大的已识别抗原背景下准确定位确切的已识别T细胞表位。另外，这种方法可以用来通过定位关键和允许的TCR-相互作用残基，鉴定T细胞的潜在脱靶，这可以用来检索有关的脱靶肽序列。

该平台允许通过多轮筛选连续富集靶表位。合成了编码识别HIV聚合酶IV9表位的TCR的基因并通过慢病毒转导引入原代供体CD8 T细胞。所得的细胞用来筛选贯穿十个HIV毒株的基因组叠覆的1,247个候选56聚物的文库。为了进行第二轮选择，将分离的抗原扩增并再克隆入慢病毒表达载体。随后将它们通过病毒转导引入靶细胞。筛用相同的IV9 T细胞重复选。随第二轮选择观察到IV9 TCR的已知靶的富集增加(图21)。因此，该平台可以用于多轮选择以改善抗原鉴定性能。

实施例6.平台应用于肿瘤衍生的TCR

为了说明该平台可以鉴定肿瘤衍生的TCR的靶，实施信噪比分析。T细胞活性的信噪比分析定量了T细胞在其已知抗原存在下相对于不存在，以多高的效率激活物。对于全部病毒筛选，这个信噪比指标对实际筛选中观察到的靶富集非常有预示性。我们研究的识别肿瘤抗原的T细胞给出与我们先前使用过的抗病毒T细胞相当的信噪比，这进一步提供筛选过程良好运作的可信度(图22)。这允许多种全基因组人类筛选鉴定已知的和新的TCR靶，如肿瘤衍生的TCR。

实施例7.抑制CAD介导的DNA降解

基于粒酶检测T细胞活性的关键难题是当进入靶细胞时，粒酶启动凋亡，包括核酸酶CAD对基因组DNA的标志性核小体内降解。在凋亡前，CAD借助其抑制剂蛋白ICAD保持无活性。ICAD是直接的胱天蛋白酶底物，其在凋亡期间降解，释放CAD降解DNA。该平台允许从已经收到粒酶的细胞恢复完整抗原盒DNA。因此，早期凋亡期间出现的DNA降解限制了鉴定已经驱动T细胞识别的抗原的能力。本文中已经确定，可以通过抑制CAD介导的DNA降解，克服这个难题。例如，它已经确定递送粒酶后，在靶细胞中过量表达突变体，抵抗胱天蛋白酶形式的ICAD蛋白，阻止CAD核酸酶活性。核实诱导凋亡后，这种突变体ICAD的过量表达防止基因组DNA梯带化(图23)。

确定抑制CAD介导的DNA降解以恢复抗原信息在筛选环境下重要。在已经采用或未采用ICAD过量表达进行的独立筛选背景下，计算了抗原恢复效率。简而言之，相对于已计数细胞数目的预期泊松分布，定位读段/抗原的观测分布，并且该拟合用来评估每个筛选重复中表征的细胞总数。通过测序恢复的细胞的这个数目随后与通过FACS分离的细胞的已知数目比较，以确定净抗原恢复效率。在ICAD不存在下实施的筛选的六个重复之间，从仅1-2％分选的细胞恢复抗原信息(图24)。相反，用突变体ICAD过量表达进行的筛选产生大约10倍更高的抗原恢复效率(图24)。值得注意地，筛选之间不存在基因组DNA制备、PCR和测序步骤的差异。这些结果表明例如，通过过量表达突变体ICAD，抑制DNA降解使得检测性能改善大约十倍成为可能并且使得筛选明显更复杂的抗原文库成为可能。

参考文献

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其他实施方案

尽管本申请已经在某些实施方案和实施例的背景下公开，但本领域技术人员将理解，本申请的实施方案超出具体公开的实施方案延伸至其他备选实施方案和/或用途和修改及其等同物。

本文参考的全部专利、专利申请、专利申请公开和其他资料，如论文、书籍、质量标准、出版物、文件、事物和/或其他，因而通过这种引用并入完整本文用于所有目的，例外是与前者相关的任何申请文件(prosecution file)史、与本文件不一致或冲突的前者任一项或目前或后续与本文件相关的可能对最广泛权利要求范围具有限制性影响的前者任一项。以举例方式，如若某术语与任何已并入资料相关的描述、定义和/或用途和与本文件相关的描述、定义和/或用途之间存在任何不一致或冲突，则该术语在本文件中的描述、定义和/或的用途应当优先。

应当理解，本文中公开的本申请的实施方案说明本申请的实施方案的原理。可以使用的其他修改形式可以处于本申请的范围内。因此，以举例方式，但不以限制方式，可以根据本文的教导内容使用本申请的实施方案的替代性布局。因此，本申请的实施方案限于如精确显示和描述的那种实施方案。

Claims

1.一种抗原呈递细胞(APC)，其包含：

a)编码一种或多种候选抗原的外源核酸，其中所述一种或多种候选抗原被表达并用MHC I类或MHC II类分子呈递；

b)粒酶B(GzB)活性的分子报告子；和

c)胱天蛋白酶激活的脱氧核糖核酸酶(CAD)介导的DNA降解的外源抑制剂、CAD敲除或胱天蛋白酶敲除。

2.根据权利要求1所述的APC，其中将所述外源核酸稳定引入所述APC的基因组，任选地通过慢病毒载体、逆转录病毒载体或转座子稳定引入。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的APC，其中所述外源核酸在每侧上旁侧分布有预定的引物识别序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的APC，其中所述GzB活性的分子报告子包含融合多肽，所述融合多肽包含与检测分子连接的GzB切割位点(VGPD,SEQ ID NO:1)。

5.根据权利要求4所述的APC，其中所述分子报告子包括修饰的红外荧光蛋白、膜系留的CRE重组酶、基于抗体的GzB活性报告子、基于ER滞留的GzB活性报告子、基于细胞表面可检出的GzB活性报告子或其组合。

6.根据权利要求4或5中任一项所述的APC，其中所述分子报告子包括膜系留的CRE重组酶，并且所述APC还包含旁侧分布有LoxP位点的反向CRE报告子，任选地其中所述外源核酸位于CRE激活的引物识别序列的近端。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的APC，其中所述CAD介导的DNA降解的外源抑制剂是以可表达形式编码胱天蛋白酶激活的脱氧核糖核酸酶的抑制剂(ICAD)基因的核酸；靶向CAD或胱天蛋白酶3的抑制性核酸；胱天蛋白酶3的小分子抑制剂；DNA酶化学抑制剂；或胱天蛋白酶3的肽或蛋白质抑制剂，或者其中所述胱天蛋白酶敲除是胱天蛋白酶3敲除。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的APC，其中所述APC i)不表达内源MHC分子并且经工程化以表达外源MHC分子和/或ii)选自由K 562细胞、HEK 293细胞、HEK 293T细胞、U2OS细胞、MelJuso细胞、MDA-MB231细胞、MCF7细胞、NTERA2细胞、LN229细胞、树突状细胞和原代自体B细胞组成的组。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的APC，其中所述候选抗原的长度小于或等于8、9、10、11、20、30、50、100、200或300个氨基酸。

10.根据权利要求1-8中任一项所述的APC，其中所述候选抗原的长度大于300个氨基酸。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的APC，其中编码候选抗原的外源核酸衍生自传染性生物或人DNA。

12.根据权利要求11所述的APC，其中所述人DNA从癌细胞获得。

13.根据权利要求11所述的APC，其中所述传染性生物选自由病毒、细菌、真菌、原虫和多细胞寄生性生物组成的组。

14.一种根据权利要求1-13中任一项所述的APC的文库，其中各个APC包含编码候选抗原的不同外源核酸，从而代表被表达并用MHC I类和/或MHC II类分子呈递的候选抗原的文库。

15.根据权利要求14所述的文库，其中所述外源核酸衍生自传染因子或人DNA。

16.根据权利要求14-15中任一项所述的文库，其包含约10²个至约10¹⁴个独立候选抗原。

17.一种粒酶B活性的分子报告子，其包含融合多肽，所述融合多肽包含与检测分子连接的GzB切割位点(VGPD,SEQ ID NO:1)。

18.根据权利要求17所述的分子报告子，其中所述检测分子是酶、可检出标记物、抗体结合性抗原或亲和标签。

19.根据权利要求18所述的分子报告子，其中所述可检出标记物在GzB切割后可检出，所述可检出标记物选自由红外荧光蛋白(IFP)、核酸扩增靶、抗体识别的组合物、从ER释放的组合物和在细胞表面存在的组合物组成的组。

20.根据权利要求13所述的分子报告子，其中所述IFP包含由所述GzB切割位点功能地分隔的N-片段(N-IFP)和C-片段(C-IFP)，并且还旁侧分布有位于C-IFP N末端的绿色荧光蛋白N-片段(N-GFP)、和位于N-IFPC末端的绿色荧光蛋白C-片段(C-GFP)，从而N-GFP和C-GFP有组成型活性。

21.根据权利要求18所述的分子报告子，其中所述酶是CRE重组酶，并且所述融合多肽包含功能性连接由所述GzB切割位点分隔的质膜附着肽的CRE重组酶。

22.根据权利要求17所述的分子报告子，其中所述亲和标签是相对于所述GzB切割位点的C末端存在的Flag表位，从而使所述表位仅在切割GzB位点时由M1 Flag抗体识别，并且任选地还包含相对于flag表位的C末端存在的GFP。

23.根据权利要求18所述的分子报告子，其包含内质网(ER)滞留信号和抗体结合性质膜蛋白，其中GzB位点的切割移除ER滞留信号，任选地其中所述抗原是CD40、CD4、CD19、CD20或加标签的蛋白质，任选地其中所述标签是Myc标签、Flag标签、HA标签或组氨酸标签。

24.一种核酸，其编码根据权利要求17-23中任一项所述的分子报告子。

25.一种检测抗原呈递细胞中粒酶B活性的系统，其包含：

a)融合多肽，其包含功能性连接质膜附着肽的CRE重组酶，其中CRE重组酶和膜附着肽由GzB切割位点分隔；

b)CRE活性报告子，其包含旁侧分布有LoxP位点的按头-对-头取向编码GFP和RFP的核酸序列；和/或

c)以可表达形式编码候选抗原的核酸序列，其位于包含无活性引物的CRE激活的引物识别序列的近端，所述引物识别序列旁侧分布有LoxP位点，其中CRE诱导的LoxP位点重排产生有功能的引物识别序列。

26.一种检测由抗原呈递细胞向细胞毒性淋巴细胞或NK细胞呈递已识别抗原的系统，其包含：

a)抗原呈递细胞(APC)，其包含：

i.编码候选抗原的外源核酸，其中所述候选抗原被表达并用MHCI类和/或MHC II类分子呈递至细胞毒性淋巴细胞和/或NK细胞；

ii.根据权利要求17-24中任一项所述的粒酶B(GzB)活性的分子报告子或根据权利要求25所述的检测粒酶B活性的系统；和

iii.CAD介导的降解的抑制剂；和

b)细胞毒性淋巴细胞和/或NK细胞。

27.根据权利要求26所述的系统，其中所述CAD介导的降解的抑制剂是CAD介导的DNA降解的外源抑制剂、CAD敲除或胱天蛋白酶敲除，任选地其中所述胱天蛋白酶敲除是胱天蛋白酶3敲除或者其中所述CAD介导的DNA降解的外源抑制剂是以可表达形式编码胱天蛋白酶激活的脱氧核糖核酸酶的抑制剂(ICAD)基因的核酸；靶向CAD或胱天蛋白酶3的抑制性核酸；胱天蛋白酶3的小分子抑制剂；或胱天蛋白酶3的肽或蛋白质抑制剂。

28.根据权利要求27所述的系统，其中所述抗原呈递细胞选自由K 562细胞、HEK 293细胞、HEK 293T细胞、U2OS细胞、MelJuso细胞、MDA-MB231细胞、MCF7细胞、NTERA2a细胞、树突状细胞和原代自体B细胞组成的组。

29.根据权利要求26所述的系统，其中所述细胞毒性淋巴细胞选自由细胞毒性CD4 T细胞和细胞毒性CD8 T细胞组成的组。

30.根据权利要求26-29中任一项所述的系统，其中所述细胞毒性淋巴细胞和/或NK细胞经修饰以表达目的抗原受体。

31.根据权利要求30所述的系统，其中所述细胞毒性淋巴细胞和/或NK细胞是已经过修饰以表达来自非细胞毒性CD4 T细胞的T细胞受体的细胞毒性T细胞和/或NK细胞。

32.一种用于鉴定由细胞毒性T细胞和/或NK细胞识别的抗原的方法，其包括：

a)使根据权利要求1-16中任一项所述的抗原呈递细胞(APC)或APC的文库与一种或多种细胞毒性T细胞(CTL)和/或NK细胞在适于抗原识别的条件下接触；

b)通过分析APC中的粒酶B活性来鉴定表达已识别抗原的APC，其中如与适宜的对照相比，增加的粒酶B活性表示所述APC表达由所述细胞毒性T细胞和/或NK细胞识别的抗原；和

c)从步骤b)中鉴定的APC分离出编码所述已识别抗原的核酸。

33.一种用于鉴定由细胞毒性T细胞和/或NK细胞识别的抗原的方法，其包括：

a)使根据权利要求23所述的抗原呈递细胞(APC)或APC的文库与一种或多种CTL在适于抗原识别的条件下接触，其中GzB位点的切割移除ER滞留信号并且从ER释放质膜蛋白以运输至质膜；

b)通过使APC与结合质膜蛋白的抗体接触来分离出表达已识别抗原的APC，并纯化结合抗体的APC；和

c)从步骤b)中分离的APC分离出编码所述已识别抗原的核酸。

34.根据权利要求32或33所述的方法，其还包括对步骤c)中分离的核酸测序。

35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性T细胞和/或NK细胞从受试者的生物样品获得。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述生物样品选自由血液、肿瘤、健康组织、腹水、自身免疫性部位、肿瘤浸润物、病毒感染部位、病灶、口腔粘膜和皮肤组成的组。

37.根据权利要求35-36中任一项所述的方法，其中所述生物样品从受试者中的感染或自身免疫性反应性部位获得。

38.根据权利要求30-37中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性T细胞是CD4细胞或CD8细胞。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述细胞毒性T细胞和/或NK细胞经修饰以表达目的抗原受体。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述细胞毒性T细胞和/或NK细胞已经过修饰以表达来自非细胞毒性CD4 T细胞的T细胞受体。

41.根据权利要求32-40中任一项所述的方法，其中鉴定步骤b)通过相对于对照的荧光信号，检出APC中增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多倍的荧光信号来进行。

42.根据权利要求32-41中任一项所述的方法，其中鉴定步骤b)通过流式细胞术或亲和纯化来进行。

43.根据权利要求32-42中任一项所述的方法，其中鉴定步骤b)通过荧光激活细胞分选法(FACS)或亲和纯化来进行。

44.根据权利要求32-43中任一项所述的方法，其中分离步骤c)通过PCR扩增来进行。

45.根据权利要求33-44中任一项所述的方法，其中测序通过焦磷酸测序或下一代测序来进行。

46.根据权利要求32-45中任一项所述的方法，其中所述APC的文库包含至少5,000个不同的候选抗原。