CN110914435B

CN110914435B - 产依克多因酵母

Info

Publication number: CN110914435B
Application number: CN201880046773.XA
Authority: CN
Inventors: 多米尼克·路易斯; 卡琳·杰尔拉尔登; 多米尼克·托马斯
Original assignee: Givaudan SA
Current assignee: Givaudan SA
Priority date: 2017-07-11
Filing date: 2018-07-10
Publication date: 2023-10-17
Anticipated expiration: 2038-07-10
Also published as: EP3652323B1; EP3428282A1; US20210222136A1; RU2745157C1; ES2963640T3; EP3652323A1; KR20200026261A; WO2019011947A1; JP6942878B2; US11781122B2; KR102727729B1; JP2020526213A; CN110914435A; BR112020000660A2

Abstract

本发明涉及依克多因的生物产生领域。本领域需要允许依克多因的高效合成和分泌的依克多因产生方法。本发明中提出的技术方案是如本文所述的包含许多修饰的经遗传修饰的酵母的用途。

Description

产依克多因酵母

技术领域

本发明涉及依克多因的生物产生领域。

背景技术

依克多因(1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸)是由自然界中的嗜盐生物自然产生的杂环氨基酸。实际上，为了在含盐环境中存活，这些生物产生依克多因作为相容性溶质，用作渗透平衡物。

依克多因确实也能够保护核酸、蛋白质、细胞膜以及整个细胞免受来自外界环境(诸如紫外线辐射、加热、冷冻或化学剂)的大量侵害所引起的变性，也能够免受由于干燥引起的变性(参见例如Lentzen G等人.Appl Microbiol Biot.2006；72:623-34，和Graf R等人.Clin Dermatol.2008；26:326-33)。因此，它用于护肤的化妆品中。

此外，已发现依克多因作为蛋白质稳定剂、化妆品添加剂、PCR增强剂和微生物干燥保护剂是令人关注的。

由于这些有利的性质，依克多因越来越多地通过细菌过程使用特别是嗜盐细菌、诸如伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)产生。然而，这些方法需要高盐浓度，这使工艺复杂化并且导致考虑到设备的重要腐蚀所涉及的成本增加。

此外，通过细菌和酵母菌的生物合成途径产生必需氨基酸(诸如依克多因)需要大量的NADPH形式的还原力。然而，在这些微生物中、特别是在酵母中，葡萄糖代谢的主要途径是糖酵解，接着是仅产生NADH的发酵。因此，尽管在微生物中维持可接受的NADPH/NADH平衡是很复杂的，但其对于优化依克多因的生物产生同时维持可存活的重组微生物因此是至关重要的。

因此，在本领域中仍需要另外的允许依克多因的高效合成和分泌的依克多因产生方法。

发明内容

因此，本发明涉及产依克多因重组酵母，在其基因组中：

(A)(i)编码天冬氨酸激酶(aspartokinase)的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；和/或

(ii)编码天冬氨酸激酶(aspartate kinase)的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；

(B)编码天冬氨酸半醛脱氢酶的至少一种核酸和/或编码可以用作辅酶NAD和NADP两者的天冬氨酸半醛脱氢酶的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；

(C)编码二氨基丁酸氨基转移酶的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；

(D)(i)编码高丝氨酸-O-乙酰转移酶MET2的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；

(ii)编码高丝氨酸-O-乙酰转移酶METX的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下，和/或

(iii)编码二氨基丁酸乙酰转移酶的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；

(E)编码依克多因合酶的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；

(F)(i)编码高丝氨酸脱氢酶的至少一种内源核酸、优选所有内源核酸已经缺失和/或中断，和/或

(ii)编码高丝氨酸脱氢酶的至少一种核酸、优选所有核酸独立地：

-在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；

-在弱启动子的控制下；和/或

-呈非稳定形式。

如所附示例所示，本发明的重组酵母具有增加的依克多因产生。

还通过将酵母与下文所述的其他修饰物重新组合，可以进一步提高所述有利的性质。

因此，产依克多因重组酵母可以有利地用于如下文所述的用于产生依克多因的方法中或用于产生依克多因。

本发明还涉及用于产生依克多因的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在培养基中培养本发明的重组酵母；和

(b)从所述培养基回收依克多因。

优选地，培养基至少包含碳源，优选选自由葡萄糖和蔗糖组成的组的碳源。

本发明还涉及根据本发明的重组酵母用于产生依克多因的用途。

具体实施方式

本发明人已经构想出经遗传修饰的微生物、特别是经遗传修饰的酵母，其具有与亲本微生物相比、特别是与亲本酵母相比增加的产生依克多因的能力。

在整个说明书中对这些经遗传修饰的微生物、包括这些经遗传修饰的酵母进行了描述。

定义

如本文所用的术语“微生物”是指未经人工修饰的酵母。如果微生物提供将整合到将表达外来遗传元件的微生物“受体”中的该遗传元件，或者如果微生物用作遗传构建或蛋白质表达的工具，则该微生物可以是“供体”。本发明的微生物选自表达用于依克多因的生物合成的基因的酵母。

如本文所用的术语“重组微生物”或“经遗传修饰的微生物”或“重组酵母”或“经遗传修饰的酵母”是指经遗传修饰的或经遗传工程化的酵母。根据这些术语的通常含义，这意味着本发明的微生物不是在自然界中发现的，并且通过引入或缺失或通过修饰自然界中发现的等效微生物的遗传元件而被修饰。也可以通过结合在特定选择压力下的定向诱变和进化来迫使新的代谢途径的发展和进化来对其进行修饰(参见例如WO 2004/076659)。

如果将外源基因引入具有所有允许它们在宿主微生物中表达的所有元件的微生物中，则可以修饰微生物以表达这些基因。可以修饰微生物以调控内源基因的表达水平。用外源DNA将微生物(如酵母)修饰或“转化”是本领域技术人员的常规任务。特别地，根据本发明的微生物的遗传修饰、更特别是本文定义的一种或多种遗传修饰可以通过使用CRISPR-Cas系统进行，如DiCarlo等人所述(Nucl.Acids Res.，第41卷，第7期，2013:4336-4343)。

术语“内源基因”意指该基因在任何遗传修饰之前存在于微生物的野生型菌株中。内源基因可以通过引入除了内源调控元件之外的异源序列或引入异源序列替代内源调控元件而过表达，或通过将一个或多个补充拷贝的基因引入染色体或质粒中而过表达。内源基因也可以被修饰以调控其表达和/或活性。例如，可以将突变引入编码序列以修饰基因产物，或者除了内源调控元件之外可以将异源序列引入，或可以将异源序列引入以替代内源调控元件。内源基因的调控可以导致基因产物活性的上调和/或增强，或可替选地，导致内源基因产物的活性的下调和/或减弱。增强内源基因表达的另一种方式是在染色体或质粒上引入一个或多个补充拷贝的基因。

术语“外源基因”意指该基因通过本领域技术人员熟知的方法被引入微生物中，而该基因在野生型微生物中不是天然存在的。如果将外源基因引入具有所有允许其在宿主微生物中表达的元件的微生物中，则该微生物可以表达这些基因。用外源DNA转化微生物是本领域技术人员的常规任务。外源基因可以被整合到宿主染色体中，或从质粒或载体中以染色体外的方式表达。在复制起点和在细胞中的拷贝数方面不同的各种质粒都是本领域已知的。外源基因的序列可以适合其在宿主微生物中的表达。实际上，本领域技术人员知道密码子使用偏向的概念，以及如何在不修改推导的蛋白质的情况下使核酸序列适应特定的密码子使用偏向。

术语“异源基因”意指该基因来源于不同于表达该基因的接受者微生物的一种微生物。它是指在微生物中不是天然存在的基因。

在本申请中，所有基因均以其通用名称并参考其核苷酸序列以及其氨基酸序列(如果出现的话)进行引用。使用已知基因的登录号中给出的编号，本领域技术人员能够确定其他生物体、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等效基因。该常规工作可以使用可以通过与来源于其他微生物的基因进行序列比对来确定的共有序列并设计简并探针以将相应的基因克隆在另一生物体中来有利地完成。

本领域技术人员知道调控内源基因表达、特别是上调或下调内源基因表达的不同方法。例如，增强内源基因的表达或过表达内源基因的一种方法是在染色体或质粒上引入一个或多个补充拷贝的基因。

另一种方法是用更强的启动子代替基因的内源启动子。这些启动子可以是同源的或异源的。在本说明书的其他地方更详细地描述了本发明中特别感兴趣的启动子。

核酸表达构建体还可以包含5’和/或3’识别序列和/或选择标记。

术语“过表达”意指与未修饰的微生物相比，基因或酶的表达增加。通过增加编码酶的基因的表达获得了所述酶的表达增加。可以通过本领域技术人员已知的所有技术来进行增加基因的表达。在这方面，可以特别引用在旨在过表达的核酸上游的强启动子的实现，或者在启动子、特别是强启动子和终止子之间引入多个拷贝的所述核酸。

术语“低表达”意指与未修饰的微生物相比，酶或基因的表达减少。通过减少编码酶的基因的表达来获得所述酶的表达减少。减少基因的表达可以通过本领域技术人员已知的所有技术来进行。在这方面，可以特别引用在旨在低表达的核酸上游的弱启动子的实现。也可以引用编码比亲本酶活性低的所述酶的变体的核酸或编码在细胞中比亲本酶更快速地降解的所述酶的变体的核酸的实现。与亲本酶相比降解更快的所述亲本酶的变体涵盖了降解决定子标记的酶。也可以引用感兴趣的基因的转录激活子的表达减少。

术语“诱导型启动子”用于限定在以下情况下活性被诱导(即增加)的启动子：

-在一种或多种特定代谢物的存在下。培养基中代谢物浓度越高，启动子活性越强；或者

-在存在低浓度的一种或多种代谢物或不存在一种或多种代谢物的情况下。这些代谢物不同于增加的存在诱导启动子活性的那些代谢物。培养基中的代谢物浓度越低，启动子活性越强。

术语“阻遏型启动子”用于限定在以下情况下活性被阻遏(即降低)的启动子：

-在一种或多种特定代谢物的存在下。培养基中代谢物浓度越高，启动子活性越弱；或者

-在存在低浓度的一种或多种代谢物或不存在一种或多种代谢物的情况下。这些代谢物不同于增加的存在阻遏启动子活性的那些代谢物。培养基中的代谢物浓度越低，启动子活性越弱。

如本文所用，“降解决定子标记的”酶意指包含添加的蛋白质降解信号氨基酸序列的酶，其用作将导致所述酶成为降解的对象的破坏信号，所述降解可以是(i)非泛素依赖性降解或(ii)泛素依赖性降解。所述添加的蛋白质降解信号在本领域中也称为“降解决定子”，涵盖用作破坏信号的氨基酸序列，所述氨基酸序列由引起靶向蛋白质降解的可转移降解信号组成。降解决定子涵盖“N-降解决定子”，其是可转移的N末端氨基酸，按照众所周知的N末端规则引起靶蛋白质降解(Bachmair等人,1986,Science,第234(4773)卷:179-186)。N-降解决定子的不稳定性质归因于其最初的氨基酸，所述氨基酸容易乙酰化修饰或精氨酰化修饰，并最终导致泛素化和降解。通常，降解决定子需要至少两种组分来确保靶向蛋白质降解：(i)靶降解识别标记，诸如聚泛素标记和(ii)与降解识别标记紧邻的非结构化氨基酸序列。为了对蛋白质进行降解决定子标记、特别是在本文中对酶进行降解决定子标记，本领域技术人员可以参考Yu等人(2015,Current Opinion in Biotechnology,第36卷:199-204)、Cho等人(2010,Genes&Development,第24卷:438-442)或Fortmann等人(2015,J MolBiol,第427(17)卷:2748-2756)、Ravid等人(2008,Nat Rev Mol Cell Biol,第9(9)卷:679-690)和Hochstrasser(1996,Annu Rev Genet,第30卷:405-439)。

酶的“活性”与术语“功能”可互换使用，并在本发明的上下文中表示酶催化所期望反应的能力。

术语酶的“降低的活性”或“减弱的活性”意指通过核苷酸序列的突变获得的蛋白质的比催化活性降低和/或通过核苷酸序列的突变或通过同源相应基因的缺失或还通过蛋白质的降解决定子标记获得的细胞中蛋白质浓度降低。

术语酶的“增强的活性”表示例如通过编码该酶的基因的过表达获得的酶的比催化活性增加和/或酶在细胞中的数量/可用性增加。

术语“编码(encoding)”或“编码(coding)”是指多核苷酸通过转录和翻译机制产生氨基酸序列的过程。

编码本发明中考虑的一种或多种酶的一种或多种基因可以是外源的或内源的。

基因的“减弱”意指与未修饰的微生物相比，基因的表达速度较差。减弱可以通过本领域技术人员已知的方式和方法来实现，并且含有通过同源重组获得的基因缺失、通过将外部元件插入基因中获得的基因减弱或在弱启动子下的基因表达。本领域技术人员知道表现出不同强度的多种启动子，以及哪些启动子用于弱遗传表达。

在本发明中实施的方法优选地需要使用一种或多种染色体整合构建体用于将异源核苷酸序列稳定引入染色体上的特定位置中或用于功能性破坏经遗传修饰的微生物细胞中的一个或多个靶基因。在一些实施方式中，靶基因的破坏阻止了相关的功能蛋白质的表达。在一些实施方式中，靶基因的破坏导致由被破坏的基因表达非功能蛋白质。

在本发明的实践中可以改变的染色体整合构建体的参数包括但不限于，同源序列的长度；同源序列的核苷酸序列；整合序列的长度；整合序列的核苷酸序列；以及靶基因座的核苷酸序列。在一些实施方式中，每个同源序列的长度的有效范围是20至5000个碱基对、优选50至100个碱基对。在特定的实施方式中，每个同源序列的长度为约50个碱基对。基因靶向所需的同源性长度的更多信息参见D.Burke等人,Methods in yeast Genetics-Acold spring harbor laboratory course Manual(2000)。

在一些实施方式中，(a)旨在插入上述一种或多种DNA构建体的一种或多种经破坏的基因可以有利地包含一种或多种用于选择转化的微生物细胞的可选标志物。优选地，所述一种或多种可选标志物被包含在根据本发明的一种或多种DNA构建体中。

在一些实施方式中，可选标志物是抗生素抗性标志物。抗生素抗性标志物的说明性实例包括但不限于NAT1、AURl-C、HPH、DSDA、KAN<R>和SH BLE基因产物。来自诺尔丝链霉菌(S.noursei)的NAT 1基因产物赋予了对诺尔丝菌素的抗性；来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的AUR1-C基因产物赋予了对金担子素A(AbA)的抗性；肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)的HPH基因产物赋予对潮霉素B的抗性；大肠杆菌(E.coli)的DSDA基因产物允许细胞在以D-丝氨酸为唯一氮源的板上生长；Tn903转座子的KAN<R>基因赋予对G418的抗性；以及来自印度斯坦链异壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)的SH BLE基因产物赋予对Zeocin(博来霉素)的抗性。

在一些实施方式中，在分离出本发明的经遗传修饰的微生物细胞后，使抗生素抗性标志物缺失。本领域技术人员能够选择在特定的遗传背景下的适合标志物。

在一些实施方式中，可选的标志物拯救了经遗传修饰的微生物细胞中的营养缺陷(例如营养性营养缺陷)。在此类实施方式中，亲本微生物细胞包含在氨基酸或核苷酸生物合成途径中起作用的一种或多种基因产物(诸如例如在酵母中的HIS3、LEU2、LYS1、LYS2、MET 15、TRP1、ADE2和URA3基因产物)中的功能性破坏，使得亲本微生物细胞无法在没有补充一种或多种营养素的培养基中生长(营养缺陷型表型)。然后可以通过用编码破坏的基因产物的功能性拷贝的染色体整合转化亲本微生物细胞来拯救营养缺陷型表型(NB：该基因的功能性拷贝可以源自近缘种(诸如克鲁维酵母菌属(Kluveromyces)、假丝酵母(Candida)等))，并可以根据亲本微生物细胞的营养缺陷型表型的丧失来选择所产生的经遗传修饰的微生物细胞。

对于包含启动子序列、编码序列(例如酶编码序列)或终止子序列的核酸序列中的每一者，本文描述了参考序列。本说明书还涵盖了与参考核酸序列具有特定的核酸同一性百分比的核酸序列。

对于感兴趣的氨基酸序列中的每一者，在本文中描述了参考序列。本说明书还涵盖了与参考氨基酸序列具有特定的氨基酸同一性百分比的氨基酸序列(例如酶氨基酸序列)。

由于明显的原因，在所有本描述中，分别与所考虑的核苷酸同一性或氨基酸同一性相符的特定核酸序列或特定氨基酸序列应进一步导致获得显示所期望的生物活性的蛋白质(或酶)。如本文所用，两个核酸序列之间或两个氨基酸序列之间的“同一性百分比”均是经由通过比较窗比较这两者的最佳比对序列确定的。

因此，与参考序列(不包含添加或缺失)相比，比较窗中的核苷酸序列或氨基酸序列的一部分可以包含这些添加或这些缺失(例如“空位”)，从而均获得这两者的序列之间的最佳比对。

同一性百分比通过以下计算：确定可以注意到的两者比较序列的同一核酸碱基或同一氨基酸残基的位置数，然后将可以在两者核酸碱基之间或在两者氨基酸残基之间观察到同一性的位置数除以比较窗中的位置总数，然后将结果乘以100来得出两个序列之间的核苷酸同一性百分比或两个序列之间的氨基酸同一性百分比。

序列最佳比对的比较可以由计算机使用已知算法来进行。

最优选地，使用CLUSTAL W软件(1.82版)来确定序列同一性百分比，参数设置如下：(1)CPU模式＝ClustalW mp；(2)比对＝“完全”；(3)输出格式＝“aln w/数”；(4)输出指令＝“比对的”；(5)颜色比对＝“无”；(6)KTUP(字长)＝“默认值”；(7)窗口长度＝“默认值”；(8)评分类型＝“百分比”；(9)TOPDIAG＝“默认值”；(10)PAIRGAP＝“默认值”；(11)系统发生树/树类型＝“无”；(12)矩阵＝“默认值”；(13)空位开放＝“默认值”；(14)末端空位＝“默认值”；(15)空位延伸＝“默认值”；(16)空位距离＝“默认值”；(17)树类型＝“进化分枝图”和(18)树GRAP距离＝“隐藏”。

“发酵”或“培养”通常在具有适合于所培养的微生物的适当培养基的发酵罐中进行，该培养基含有至少一种简单的碳源并且如果必需的话具有共底物。

本文公开的微生物可以在发酵培养基中生长以从草酰乙酸中产生产物。为了最大程度地产生依克多因，用作产生宿主的微生物菌株优选具有高的碳水化合物利用率。这些特征可以通过诱变和选择、遗传工程化赋予，或可以是天然的。本细胞的发酵培养基或“培养基”可以含有至少约10g/L的葡萄糖。另外的碳底物可以包括但不限于单糖，诸如果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖；寡糖，诸如乳糖、麦芽糖、半乳糖或蔗糖；多糖，诸如淀粉或纤维素或其混合物，以及来自可再生原料的未纯化混合物，诸如奶酪乳清渗透玉米浸泡液、甜菜糖蜜和大麦麦芽。其他碳底物可以包括甘油。

因此，预期了本发明中使用的碳源可以涵盖各种各样的含碳底物，并且仅受生物体选择的限制。

尽管预期了所有上述碳底物及其混合物在本发明中都是适合的，但是优选的碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖、或这些与C5糖(诸如木糖和/或阿拉伯糖)的混合物用于经修饰的微生物使用C5糖，更特别是葡萄糖。

优选的碳底物是葡萄糖。

除了适当的碳源之外，发酵培养基可以含有本领域技术人员已知的适用于培养物生长和促进产生所期望的产物所必需的酶促途径的合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液和其他组分。

此外，可以考虑适用于根据本发明的重组微生物的生长的另外的遗传修饰。

术语“好氧条件”是指培养基中的足以使好氧微生物或兼性厌氧微生物使用双氧作为末端电子受体的氧浓度。

“微好氧条件”是指其中氧的浓度低于空气中的氧的浓度、即氧浓度最高为6％O₂的培养基。

“适当的培养基”是指包含对细胞的维持和/或生长至关重要或有益的营养素的培养基(例如无菌液体培养基)，所述营养素诸如碳源或碳底物、氮源(例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、脲、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵)；磷源，例如磷酸一钾或磷酸氢二钾；微量元素(例如金属盐)，例如镁盐、钴盐和/或锰盐；以及生长因子，诸如氨基酸、维生素、生长促进剂等。根据本发明的术语“碳源”或“碳底物”或“碳的来源”表示本领域技术人员可以用来支持微生物正常生长的任何碳源，包括己糖(诸如葡萄糖、半乳糖或乳糖)、戊糖、单糖、寡糖、二糖(诸如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)、糖蜜、淀粉或其衍生物、纤维素、半纤维素及其组合。

根据本发明引入的遗传修饰的一般特征

-基因通过两种非互斥的修饰被过表达：

·将该基因置于强启动子的控制下；和/或

·插入多个拷贝的所考虑的基因。

-根据已知的遗传工程化技术，将所有的基因组修饰插入酵母中：

-在根据本发明的酵母基因组中引入的基因构建体中包含的连续基因具有以下结构：

Prom₁-ORF₁-term₁-ORF₂-基因₂-term₂-…/…-Prom_n-ORF_n-term_n，其中：

-Prom1是调控编码序列ORF1的表达的序列，

-ORF1是编码所期望的蛋白质PROT1(特别是所期望的酶PROT1)的核酸序列，

-Term1是转录终止子序列，其通过在新合成的mRNA中提供触发从转录复合物中释放mRNA的过程的信号来介导转录终止，并且

-“1”、“2”、…/…“n”可以描述相同的ORF(开放阅读框)、启动子或终止子或可以不描述相同的ORF、启动子或终止子。基因的顺序无关紧要。“n”是通常5至20的整数。将这些构建体在受控位置处插入酵母染色体中的一者。在一些实施方式中，插入位点对于插入的构建体的功能或所产生的经遗传修饰的酵母的存活力不是必需的。

-当酵母菌是例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)时，通常将引入到酵母菌基因组中且源自酿酒酵母以外的其他生物体的基因进行“转码”(通常是“密码子优化的”)，这意味着这些基因是通过用于在酿酒酵母中表达的最佳密码子使用合成的。还对来自酿酒酵母的一些基因的核苷酸序列(而非蛋白质序列)进行了修饰(“转码”)，以最小化与所述基因的内源拷贝的重组。

-可以通过酵母遗传工程化中使用的标准程序使基因缺失。在一些实施方式中，靶向缺失的基因可以被上述基因构建体中的一者的插入来中断，或者可替选地，靶向缺失的基因被一小段核苷酸替代。

-下调基因表达可以通过破坏基因的内源拷贝并在弱启动子的控制下用ORF拷贝替代来获得。弱启动子的列表和序列在本说明书的其他地方描述。

-通过使基因的内源拷贝缺失(如有必要)并将新拷贝的ORF置于诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下，可以使基因是“诱导型的或阻遏型的”。诱导型启动子或阻遏型启动子是活性受到调控或控制(即随着环境条件或外部刺激的改变而增加或减少)的启动子。诱导或阻遏可以是人为控制的，其涵盖通过非生物因素(诸如在感兴趣的生物体中天然不存在的化学化合物、光、氧水平、热或冷)的诱导或阻遏。本说明书中其他地方描述了诱导型启动子或阻遏型启动子的列表和序列。

-如本文其他地方已指定的，可以通过使用Yu等人2015,(Current Opinion inBiotechnology,第36卷:199-204)描述的“降解决定子”技术去稳定来使蛋白质低表达。简而言之，该技术包括在蛋白质序列中引入靶向降解的修饰。它可以只包括遵循称为N端规则的原则的前两个氨基酸，或将整个蛋白质靶向泛素-蛋白酶体降解途径的较大序列。

根据本发明的重组酵母

本发明人已经构思了具有增加的产生依克多因能力的重组微生物、特别是重组酵母。

本发明涉及具有增加的依克多因产生的重组酵母，并且其中，增加的依克多因产生通过遗传工程化方法经由在其基因组中引入的多种改变而获得。

本发明涉及产依克多因重组酵母，在其基因组中：

(A)(i)编码天冬氨酸激酶HOM3的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；和/或

(ii)编码天冬氨酸激酶AK的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；

(B)编码天冬氨酸半醛脱氢酶HOM2的至少一种核酸和/或编码可以用作辅酶NAD和NADP两者的天冬氨酸半醛脱氢酶HOM2的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；

(C)编码二氨基丁酸氨基转移酶EctB的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；

(iii)编码二氨基丁酸乙酰转移酶EctA的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；

(E)编码依克多因合酶EctC的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；

(F)(i)编码高丝氨酸脱氢酶HOM6的至少一种内源核酸、优选所有内源核酸已经缺失，和/或

(ii)编码高丝氨酸脱氢酶HOM6的至少一种核酸、优选所有核酸独立地：

-在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；

-在弱启动子的控制下；和/或

-呈非稳定形式。

本发明人发现，通过在酵母细胞的基因组中引入多种遗传改变，可以实现这些酵母细胞的依克多因产生增加。如本文中充分描述的，所述多个遗传改变涵盖某些基因的过表达、某些其他基因的受控表达、以及另外其他基因的阻遏或缺失。

通过优化草酰乙酸和乙酰-CoA的代谢，本发明人已经实现了酵母细胞的依克多因产生增加，使得将随后的人工修饰的代谢途径主要导向了依克多因产生，而同时保持产生的经遗传修饰的酵母细胞的最佳存活力。

在漫长的研究时期之后，本发明人已经确定，通过增加草酰乙酸转化为依次的中间代谢物磷酸-天冬氨酰基-半醛和天冬氨酰基-半醛并且另外增强天冬氨酰基-半醛转化为依克多因，获得了酵母细胞的高依克多因产生，同时显著维持氧化还原状态并且更特别维持适合的NADH/NADPH平衡，使所得的重组酵母细胞具有良好的存活力。最后一点很重要，并且对本发明人在整个研究工作中构成了重大挑战。

根据本发明的提出的技术方案出乎意料地允许通过消耗较少的还原力、消耗呈NADH而不是NADPH的形式的还原力和/或产生NADH而不是NADPH来维持整个依克多因产生途径中酵母细胞中可行的NADH/NADPH平衡。

如本说明书中详细公开的，对所得的重组酵母细胞进行遗传修饰，以实现(i)天冬氨酸激酶编码基因(HOM3)和/或(ii)天冬氨酸激酶编码基因(AK)、特别是天冬氨酸激酶编码基因(AK)的过表达和/或受控表达，优选是天冬氨酸激酶基因(AK)的过表达。

此外，根据本发明的重组酵母包含另外的遗传修饰，以最佳使用中间代谢物磷酸-天冬氨酰基用于天冬氨酰基-半醛产生，所述另外的遗传修饰包含天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因(HOM2)的过表达和/或受控表达和/或编码可以用作辅酶NADH和NADPH两者的天冬氨酸半醛脱氢酶的基因的过表达和/或受控表达。

此外，根据本发明的重组酵母还包含遗传修饰以最佳使用中间代谢物天冬氨酰基-半醛用于依克多因产生，所述另外的遗传修饰包含(i)二氨基丁酸氨基转移酶基因(EctB)的过表达和/或受控表达，(ii)高丝氨酸O-乙酰转移酶编码基因(MET2；METX)的过表达和/或受控表达和/或二氨基丁酸乙酰转移酶基因(EctA)的过表达和/或受控表达，(iii)依克多因合酶基因(EctC)的过表达和/或受控表达和(iv)高丝氨酸脱氢酶基因(HOM6)的低表达和/或受控表达。

在根据本发明的重组酵母的一些实施方式中，所述酵母包含另外的遗传修饰以用于最佳使用中间代谢物草酰乙酸用于天冬氨酸产生，所述另外的遗传修饰包含(i)天冬氨酸转氨酶基因(AAT2)的过表达和/或受控表达和/或(ii)将氧化戊二酸转化为谷氨酸的谷氨酸脱氢酶基因(GDH)的过表达和/或受控表达。

在根据本发明的重组酵母的一些实施方式中，所述酵母包含另外的遗传修饰以用于最佳分泌所产生的依克多因，所述另外的遗传修饰包含(i)一般氨基酸通透酶基因(AGP3)的低表达和/或受控表达，(ii)支链氨基酸通透酶3基因(BAP3)的低表达和/或受控表达，(iii)支链氨基酸通透酶2基因(BAP2)的低表达和/或受控表达，(iv)一般氨基酸通透酶基因(GAP1)的低表达和/或受控表达，(v)高亲和力谷氨酰胺通透酶基因(GNP1)的低表达和/或受控表达，(vi)一般氨基酸通透酶基因(AGP1)的低表达和/或受控表达，(vii)低亲和力甲硫氨酸通透酶基因(MUP3；MUP1)的低表达和/或受控表达，(viii)可能的转运蛋白基因(AQR1)的过表达和/或受控表达和/或(ix)多胺转运蛋白1基因(TPO1)的过表达和/或受控表达。

在特定的实施方式中，编码一般氨基酸通透酶、支链氨基酸通透酶3、支链氨基酸通透酶2、一般氨基酸通透酶GAP1、高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1、一般氨基酸通透酶AGP1、低亲和力甲硫氨酸通透酶MUP3和高亲和力甲硫氨酸通透酶MUP1的至少一种核酸独立地为来自酵母、优选来自酿酒酵母的核酸。

根据本发明的重组酵母以比不含上述遗传修饰的亲本酵母高的产量产生依克多因。

根据本发明的重组酵母已经遗传工程化以促进利用NADH而非NADPH的酶的表达，诸如适当的谷氨酸脱氢酶或适当的天冬氨酸半醛脱氢酶。

在根据本发明的重组酵母的一些实施方式中，过表达的天冬氨酸半醛脱氢酶由置于强启动子和/或诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下的酿酒酵母内源基因组成。

在一些实施方式中，天冬氨酸半醛脱氢酶优选由酿酒酵母HOM2基因编码。

在一些实施方式中，天冬氨酸半醛脱氢酶最优选由酿酒酵母HOM2基因的变体编码，所述基因编码使用NAD和NADP两者的经突变的HOM2蛋白质，如本文示例中所示。此类基因变体例如在示例中说明并且被称为HOM2-2。其对应于如下文讨论所突变的酿酒酵母HOM2基因。

目标是天冬氨酸半醛脱氢酶变体中多个氨基酸残基的突变以放松HOM2对作为辅酶的NADP的高选择性并增强该酶对NAD的亲和力的性质是本领域技术人员已知的，并且可以例如见于Faehnle,C.R.等人,Journal of Molecular Biology 1055-1068(2005)。特别地，可以提及对应于用核苷酸GAG替换核苷酸序列的位置115至117中的核苷酸TCT的突变S39至E39。

根据本领域技术人员众所周知的氨基酸的命名法，S表示丝氨酸，并且E表示谷氨酸。

在一些实施方式中，天冬氨酸激酶最优选由酿酒酵母HOM3基因编码，如本文的示例中所示。

天冬氨酸激酶编码基因过表达和/或受控表达

在根据本发明的重组酵母的一些实施方式中，天冬氨酸激酶编码基因的过表达通过在酵母基因组的一个或多个选定位置处插入一个或多个拷贝的包含天冬氨酸激酶编码序列的表达盒来获得。本发明涵盖的天冬氨酸激酶和天冬氨酸激酶编码基因在本说明书的其他地方详述。

在这些实施方式的一些实施方式中，包含天冬氨酸激酶编码序列的所述一个或多个拷贝的表达盒包含允许天冬氨酸激酶强表达的调控序列，诸如在酵母细胞中有功能的强启动子。

除了根据本发明的重组酵母的这些实施方式之外或作为根据本发明的重组酵母的这些实施方式的替选方式，至少一种天冬氨酸激酶编码基因可以在在酵母细胞中有功能的诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

在这些实施方式中，天冬氨酸激酶编码基因的受控表达可以通过在天然酵母天冬氨酸激酶开放阅读框的位置处插入替换酵母基因组中在该基因组位置处最初存在的内源启动子的诱导型调控序列、诸如诱导型启动子或阻遏型启动子来获得。

在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本发明人相信，获得了天冬氨酸激酶编码基因的过表达、天冬氨酸至天冬氨酰基磷酸(天冬氨酰基-P，也称为磷酸-天冬氨酰基)的受控转化水平，这应有助于根据本发明的重组酵母的高水平的存活力。当至少一种天冬氨酸激酶编码序列在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下时，也同样适用。

在一些优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶编码基因是来自酿酒酵母的HOM3基因，如本文示例所示。

在优选的实施方式中，将所述天冬氨酸激酶编码基因置于强启动子pCCW12或诱导型启动子或阻遏型启动子pCUP-1-1的控制下。

说明性地，可以将天冬氨酸激酶基因插入HOM6基因内和/或SAM3基因内，如本文示例所示。

天冬氨酸激酶编码基因过表达和/或受控表达

可替选地、或者作为如上文所讨论的天冬氨酸激酶的过表达和/或受控表达的补充，根据本发明的重组酵母还可以使得其包含天冬氨酸激酶编码基因的过表达和/或受控表达。

因此，在根据本发明的重组酵母的优选实施方式中，天冬氨酸激酶编码基因的过表达通过在酵母基因组的一个或多个选定位置处插入一个或多个拷贝的包含天冬氨酸激酶编码序列的表达盒来获得。本发明涵盖的天冬氨酸激酶和天冬氨酸激酶编码基因在本说明书中的其他地方详述。

在这些实施方式的一些实施方式中，所述一个或多个拷贝的包含天冬氨酸激酶编码序列的表达盒包含允许天冬氨酸激酶的强表达的调控序列，诸如在酵母细胞中有功能的强启动子。

在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本发明人相信，在天冬氨酸激酶编码基因的受控表达的情况下，获得天冬氨酸至天冬氨酰基磷酸(天冬氨酰基-P)的受控转化水平，这将有助于根据本发明的重组酵母的高水平的存活力。

在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶编码基因是来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的AK基因，如本文示例中所示。

在优选的实施方式中，将所述天冬氨酸激酶编码基因置于诱导型启动子或阻遏型启动子pACU7的控制下。

说明性地，可以将天冬氨酸激酶基因插入TRP1基因内，如本文示例中所示。

天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因过表达和/或受控表达

在根据本发明的重组酵母的优选实施方式中，天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因的过表达通过在酵母基因组的一个或多个选定位置处插入一个或多个拷贝的包含天冬氨酸半醛脱氢酶编码序列的表达盒来获得。本发明涵盖的天冬氨酸半醛脱氢酶和天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因在本说明书中的其他地方详述。

在这些实施方式的一些实施方式中，所述一个或多个拷贝的包含天冬氨酸半醛脱氢酶编码序列的表达盒包含允许天冬氨酸半醛脱氢酶强表达的调控序列，诸如在酵母细胞中有功能的强启动子。

除了根据本发明的重组酵母的这些实施方式之外或作为根据本发明的重组酵母的这些实施方式的替选方式，至少一种天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因可以在在酵母细胞中有功能的诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本发明人相信，天冬氨酸半醛脱氢酶的过表达可以增强中间代谢物天冬氨酰基磷酸(天冬氨酰基-P)转化为天冬氨酰基半醛。当至少一种天冬氨酸半醛脱氢酶编码序列在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下时，也同样适用。

在一些实施方式中，天冬氨酸半醛脱氢酶可以是使用NADH或NADPH两者催化天冬氨酰基磷酸(天冬氨酰基-P)转化为天冬氨酰基半醛的酶变体。

在一些优选的实施方式中，所述天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因是来自酿酒酵母的HOM2基因，或可替选地，是利用NADH和NADPH两者的HOM2的变体，如本文示例中所示和之前所讨论。

在优选的实施方式中，将所述天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因置于诱导型启动子或阻遏型启动子pACU5或强启动子pCCW12的控制下。

说明性地，可以将天冬氨酸半醛脱氢酶基因插入HIS3基因内和/或MUP3基因内，如本文示例中所示。

二氨基丁酸氨基转移酶编码基因过表达和/或受控表达

在根据本发明的重组酵母的优选实施方式中，二氨基丁酸氨基转移酶编码基因的过表达通过在酵母基因组的一个或多个选定位置处插入一个或多个拷贝的包含二氨基丁酸氨基转移酶编码序列的表达盒来获得。本发明涵盖的二氨基丁酸氨基转移酶和二氨基丁酸氨基转移酶编码基因在本说明书中的其他地方详述。

在这些实施方式的一些实施方式中，所述一个或多个拷贝的包含二氨基丁酸氨基转移酶编码序列的表达盒包含允许二氨基丁酸氨基转移酶强表达的调控序列，诸如在酵母细胞中有功能的强启动子。

除了根据本发明的重组酵母的这些实施方式之外或作为根据本发明的重组酵母的这些实施方式的替选方式，至少一种二氨基丁酸氨基转移酶编码基因可以在在酵母细胞中有功能的诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本发明人相信，二氨基丁酸氨基转移酶的过表达可以增强中间代谢物天冬氨酰基半醛转化为2,4-二氨基丁酸。当至少一种二氨基丁酸氨基转移酶编码序列在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下时，也同样适用。

在优选的实施方式中，所述二氨基丁酸氨基转移酶编码基因是来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的EctB基因或来自伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)(有时也称为需盐色盐杆菌(Chromohalobacter salexigens))的EctB基因，如本文示例中所示。

在优选的实施方式中，将所述二氨基丁酸氨基转移酶编码基因置于强启动子pCCW12和/或强启动子pTDH3的控制下。

说明性地，可以将二氨基丁酸氨基转移酶基因插入HOM6基因内和/或SAM3基因内和/或MUP3基因内和/或URA3基因内，如本文示例中所示。

高丝氨酸-O-乙酰转移酶编码基因过表达和/或受控表达

在根据本发明的重组酵母的优选实施方式中，高丝氨酸-O-乙酰转移酶编码基因的过表达通过在酵母基因组的一个或多个选定位置处插入一个或多个拷贝的包含高丝氨酸-O-乙酰转移酶编码序列的表达盒来获得。本发明涵盖的高丝氨酸-O-乙酰转移酶和高丝氨酸-O-乙酰转移酶编码基因在本说明书中的其他地方详述。

在这些实施方式的一些实施方式中，所述一个或多个拷贝的包含高丝氨酸-O-乙酰转移酶编码序列的表达盒包含允许高丝氨酸-O-乙酰转移酶的强表达的调控序列，诸如在酵母细胞中有功能的强启动子。

除了根据本发明的重组酵母的这些实施方式之外或作为根据本发明的重组酵母的这些实施方式的替选方式，至少一种高丝氨酸-O-乙酰转移酶编码基因可以在在酵母细胞中有功能的诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本发明人相信，高丝氨酸-O-乙酰转移酶的过表达在乙酰-CoA存在下允许并因此提高中间代谢物2,4-二氨基丁酸至乙酰-2,4-二氨基丁酸的转化水平。当至少一种高丝氨酸-O-乙酰转移酶编码序列在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下时，也同样适用。

在优选的实施方式中，所述高丝氨酸-O-乙酰转移酶编码基因是来自酿酒酵母的MET2基因，如本文示例中所示。

在优选的实施方式中，所述高丝氨酸-O-乙酰转移酶编码基因是来自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的METX基因，如本文示例中所示。

在特别优选的实施方式中，根据本发明的重组酵母包含至少一种高丝氨酸-O-乙酰转移酶编码基因(其是来自酿酒酵母的MET2基因)和至少一种高丝氨酸-O-乙酰转移酶编码基因(其是来自谷氨酸棒状杆菌的METX基因)。

在优选的实施方式中，如果存在多个拷贝，则对于每个拷贝的所述高丝氨酸-O-乙酰转移酶编码基因，将所述基因独立地置于强启动子pPDC1或诱导型启动子或阻遏型启动子pACU6的控制下。

说明性地，可以将高丝氨酸-O-乙酰转移酶基因插入SAM3基因内和/或HIS3基因内，如本文示例中所示。

二氨基丁酸乙酰转移酶编码基因过表达和/或受控表达

在根据本发明的重组酵母的优选实施方式中，二氨基丁酸乙酰转移酶编码基因的过表达通过在酵母基因组的一个或多个选定位置处插入一个或多个拷贝的包含二氨基丁酸乙酰转移酶编码序列的表达盒来获得。本发明涵盖的二氨基丁酸乙酰转移酶和二氨基丁酸乙酰转移酶编码基因在本说明书中的其他地方详述。

在这些实施方式的一些实施方式中，所述一个或多个拷贝的包含二氨基丁酸乙酰转移酶编码序列的表达盒包含允许二氨基丁酸乙酰转移酶的强表达的调控序列，诸如在酵母细胞中有功能的强启动子。

除了根据本发明的重组酵母的这些实施方式之外或作为根据本发明的重组酵母的这些实施方式的替选方式，至少一种二氨基丁酸乙酰转移酶编码基因可以在在酵母细胞中有功能的诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本发明人相信，二氨基丁酸乙酰转移酶的过表达在乙酰-CoA存在下允许并因此提高中间代谢物2,4-二氨基丁酸至乙酰-2,4-二氨基丁酸的转化水平。当至少一种二氨基丁酸乙酰转移酶编码序列在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下时，也同样适用。

在优选的实施方式中，所述二氨基丁酸乙酰转移酶编码基因是来自伸长盐单胞菌(有时也称为需盐色盐杆菌)的EctA基因，如本文示例中所示。

在优选的实施方式中，将所述二氨基丁酸乙酰转移酶编码基因置于强启动子pPDC1的控制下。

说明性地，可以将二氨基丁酸乙酰转移酶基因插入LYP1基因内和/或MUP3基因内，如本文示例中所示。

在特定的实施方式中，根据本发明的重组酵母使得其基因组包含：

-过表达的和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下并优选在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下的编码高丝氨酸-O-乙酰转移酶METX的至少一种核酸；和

-过表达的和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下并优选在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下的编码二氨基丁酸乙酰转移酶EctA的至少一种核酸。

依克多因合酶编码基因过表达和/或受控表达

在根据本发明的重组酵母的优选实施方式中，依克多因合酶编码基因的过表达通过在酵母基因组的一个或多个选定位置处插入一个或多个拷贝的包含依克多因合酶编码序列的表达盒来获得。本发明涵盖的依克多因合酶和依克多因合酶编码基因在本说明书中的其他地方详述。

在这些实施方式的一些实施方式中，所述一个或多个拷贝的包含依克多因合酶编码序列的表达盒包含允许依克多因合酶的强表达的调控序列，诸如在酵母细胞中有功能的强启动子。

除了根据本发明的重组酵母的这些实施方式之外或作为根据本发明的重组酵母的这些实施方式的替选方式，至少一种依克多因合酶编码基因可以在在酵母细胞中有功能的诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本发明人相信，依克多因合酶的过表达允许并因此提高中间代谢物乙酰-2,4-二氨基丁酸至依克多因的转化水平。当至少一种依克多因合酶编码序列在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下时，也同样适用。

在优选的实施方式中，所述依克多因合酶编码基因是来自伸长盐单胞菌的EctC基因，如本文示例中所示。

在优选的实施方式中，将所述依克多因合酶编码基因置于强启动子pTDH3和/或强启动子pTEF1的控制下。

说明性地，可以将依克多因合酶基因插入LYP1基因内和/或MUP3基因内和/或URA3基因内，如本文示例中所示。

高丝氨酸脱氢酶的缺失或低表达

根据本发明的重组酵母还被定义为具有基因组，其中：

(i)编码高丝氨酸脱氢酶HOM6的至少一种内源核酸、优选所有内源核酸已经缺失和/或中断，和/或

-在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；

-在弱启动子的控制下；和/或

-呈非稳定形式。

在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本发明人相信，高丝氨酸脱氢酶基因的低表达应通过减少产生的天冬氨酰基半醛的由于其转化为高丝氨酸而导致的消耗来增加重组酵母的2,4-二氨基丁酸产生。

在一些实施方式中，例如通过将该基因的表达置于阻遏型调控序列(诸如诱导型启动子或阻遏型启动子)的控制下，可以使高丝氨酸脱氢酶的低表达成为条件性的。

用于阻遏基因表达、用于中断靶基因或用于缺失靶基因的方法是本领域技术人员熟知的。

高丝氨酸脱氢酶低表达还涵盖了编码非稳定的高丝氨酸脱氢酶的核酸的插入。非稳定的高丝氨酸脱氢酶是比亲本高丝氨酸脱氢酶在酵母细胞内更快降解的高丝氨酸脱氢酶变体。

在优选的实施方式中，非稳定的高丝氨酸脱氢酶由降解决定子标记的高丝氨酸脱氢酶蛋白质组成。

例如，高丝氨酸脱氢酶基因可以由loxP中断，或例如由URA3.Kl-loxP中断，并因此缺失(还可以被称为失活)。

如提交的示例中所示，它可以可替选地被包含感兴趣的基因的盒中断。

天冬氨酸激酶(HOM3)

天冬氨酸激酶是本文描述用于催化L-天冬氨酸在ATP的存在下转化为4-磷酸-L-天冬氨酸的蛋白质。由酿酒酵母的基因组编码的天冬氨酸激酶可以被称为HOM3。

为测量天冬氨酸激酶的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域的技术人员可以有利地参考由Stadtman等人(1961,J BiolChem,第236(7)卷:2033-2038)所述的方法。

本说明书中优选的天冬氨酸激酶是EC编号为NO.EC 2.7.2.4的酶。

根据优选的实施方式，编码天冬氨酸激酶的一种或多种核酸可以是源自优选选自包括原核生物体和真核生物体的组的生物体的一种或多种核酸。在一些实施方式中，编码天冬氨酸激酶的一种或多种核酸可以为源自古细菌的一种或多种核酸。在一些实施方式中，编码天冬氨酸激酶的一种或多种核酸可以是源自优选选自枯草芽孢杆菌和酵母的生物体的一种或多种核酸。在一些其他优选的实施方式中，编码天冬氨酸激酶的一种或多种核酸可以是源自酵母、特别是源自酿酒酵母的一种或多种核酸。

根据又一个优选的实施方式，编码天冬氨酸激酶的一种或多种核酸可以是选自由以下组成的组的一种或多种核酸：与SEQ ID NO:1的核酸具有至少25％、有利地至少65％、优选至少80％的核酸同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO:1的核酸编码也可以被称为HOM3的源自酿酒酵母的天冬氨酸激酶。

关于该序列的相同性质的生物活性是编码催化L-天冬氨酸在ATP的存在下转化为4-磷酸-L-天冬氨酸的酶的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％的核苷酸同一性的核酸序列涵盖了与所述参考核酸序列具有至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的核苷酸同一性并且还有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％的核苷酸同一性的核酸序列涵盖了与所述参考核酸序列具有至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的核苷酸同一性并且还有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％的核苷酸同一性的核酸序列涵盖了与所述参考核酸序列具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的核苷酸同一性并且还有相同性质的生物活性的核酸序列。

对于来自酿酒酵母的天冬氨酸激酶的氨基酸序列，本领域的技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP010972或本文所述的SEQ ID NO.2。

根据另一个特定的实施方式，编码天冬氨酸激酶的一种或多种核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的一种或多种核酸：与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少25％、有利地至少65％、优选至少80％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自Aquamarina atlantica的天冬氨酸激酶与SEQ ID NO.2的天冬氨酸激酶具有25％的氨基酸同一性。

关于该序列的相同性质的生物活性如前所述，即催化L-天冬氨酸在ATP的存在下转化为4-磷酸-L-天冬氨酸的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖了与所述参考核酸序列具有至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的氨基酸同一性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％的氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖了与所述参考氨基酸序列具有至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的氨基酸同一性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖了与所述参考氨基酸序列具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的氨基酸同一性的氨基酸序列。

如上所述，本发明中天冬氨酸激酶的表达水平受诸如在下文中更详细地定义的至少一种启动子和至少一种终止子的调控，其分别存在于编码所述天冬氨酸激酶的核酸序列的5’和3’位置中。

如在本说明书中其他地方指定，天冬氨酸激酶在根据本发明的重组酵母中过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

在一些实施方式中，天冬氨酸激酶的过表达可以由于所述重组酵母内强启动子对相应的基因的控制导致。

在一些其他的实施方式中，天冬氨酸激酶的过表达可以由于在所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的天冬氨酸激酶编码序列导致。

在仍然另外的实施方式中，天冬氨酸激酶的过表达可以由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应的基因的控制和(ii)在所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的天冬氨酸激酶编码序列两者导致。

天冬氨酸激酶(AK)

天冬氨酸激酶是本领域中描述的用于催化L-天冬氨酸在ATP存在下转化为4-磷酸-L-天冬氨酸的蛋白质。由枯草芽孢杆菌基因组编码的天冬氨酸激酶可以被称为AK。

为测量天冬氨酸激酶的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识，并且与先前针对天冬氨酸激酶所指示的方法相同。

根据优选的实施方式，编码天冬氨酸激酶的一种或多种核酸可以是源自优选选自包括原核生物体和真核生物体的组的生物体的一种或多种核酸。在一些实施方式中，编码天冬氨酸激酶的一种或多种核酸可以是源自古细菌的一种或多种核酸。在一些实施方式中，编码天冬氨酸激酶的一种或多种核酸可以是源自优选选自枯草芽孢杆菌和酵母的生物体的一种或多种核酸。在一些其他优选的实施方式中，编码天冬氨酸激酶的一种或多种核酸可以是源自酵母、特别是源自酿酒酵母的一种或多种核酸。

对于核酸序列，其可以被称为在NCBI数据库中在登录号NC_000964.3中公开的核酸序列。

根据又一个优选的实施方式，编码天冬氨酸激酶的一种或多种核酸可以是选自由以下组成的组的一种或多种核酸：与SEQ ID NO.3的核酸具有至少25％、有利地至少65％、优选至少80％的核酸同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO.3的核酸编码还可以称为AK的源自枯草芽孢杆菌的天冬氨酸激酶。

关于该序列的相同性质的生物活性是编码催化在ATP的存在下L-天冬氨酸转化为4-磷酸-L-天冬氨酸的酶的能力。

对于来自枯草芽孢杆菌的天冬氨酸激酶的氨基酸序列，本领域的技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP_389558.2或本文所述的SEQ ID NO.4。

根据另一个特定的实施方式，编码天冬氨酸激酶的一种或多种核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的一种或多种核酸：与SEQ ID NO.4的氨基酸序列具有至少25％、有利地至少65％、优选至少80％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自Aquamarina atlantica的天冬氨酸激酶与SEQ ID NO.4的天冬氨酸激酶具有25％的氨基酸同一性。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％的氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖了与所述参考核酸序列具有至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％的氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖了与所述参考氨基酸序列具有至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖了与所述参考氨基酸序列具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

天冬氨酸半醛脱氢酶(HOM2)

天冬氨酸半醛脱氢酶是本领域已知的通过L-天冬氨酰基-4-磷酸的还原脱磷酸化来催化NADPH-依赖性L-天冬氨酸半醛形成的蛋白质。由酿酒酵母的基因组编码的天冬氨酸半醛脱氢酶可以被称为HOM2。

为测量天冬氨酸半醛脱氢酶的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

本说明书中优选的天冬氨酸半醛脱氢酶是EC编号为1.2.1.11的酶。

根据优选的实施方式，编码天冬氨酸半醛脱氢酶的一种或多种核酸可以是源自优选选自包括原核生物体和真核生物体的组的生物体的一种或多种核酸。在一些实施方式中，编码天冬氨酸半醛脱氢酶的一种或多种核酸可以是源自古细菌的一种或多种核酸。在一些优选的实施方式中，编码天冬氨酸半醛脱氢酶的一种或多种核酸可以是源自酵母、特别是源自酿酒酵母的一种或多种核酸。

根据其他优选的实施方式，编码天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸可以是来自酿酒酵母的天冬氨酸半醛脱氢酶的变体或突变体，其中，所述变体酶或所述突变体酶使用NADH或NADPH两者用于催化反应。此类变体酶或突变体酶是本领域中已知的并且之前在本文中讨论。

根据又一个优选的实施方式，编码天冬氨酸半醛脱氢酶的一种或多种核酸可以是选自由以下组成的组的一种或多种核酸：与选自由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO.6的参考核酸序列组成的组的核酸具有至少27％、有利地至少65％、优选至少80％的核酸同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO:5和SEQ ID NO.6的核酸编码源自酿酒酵母的天冬氨酸半醛脱氢酶，其还可以在本文中被统称为HOM2。

关于该序列的相同性质的生物活性是编码通过L-天冬氨酰基-4-磷酸的还原脱磷酸化来催化NADPH-依赖性L-天冬氨酸半醛形成的酶的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少27％的核苷酸同一性的核酸序列涵盖了与所述参考核酸序列具有至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的核苷酸同一性并且还有相同性质的生物活性的核酸序列。

对于来自酿酒酵母的天冬氨酸半醛脱氢酶的氨基酸序列，本领域的技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP010442或本文所述的SEQ ID NO.7。

根据另一个特定的实施方式，编码天冬氨酸半醛脱氢酶的一种或多种核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的一种或多种核酸：与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少27％、有利地至少65％、优选至少80％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自Lactobacillus wasatchensis的天冬氨酸半醛脱氢酶与SEQID NO.7的天冬氨酸半醛脱氢酶具有27％的氨基酸同一性。

关于该序列的相同性质的生物活性如前所述，即通过L-天冬氨酰基-4-磷酸的还原脱磷酸化来催化NADPH依赖性L-天冬氨酸半醛形成的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少27％的氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖了与所述参考核酸序列具有至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如上所述，本发明中天冬氨酸半醛脱氢酶的表达水平受诸如在下文中更详细地定义的至少一种启动子和至少一种终止子的调控，其分别存在于编码所述天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸序列的5’和3’位置中。

如在本说明书中其他地方指定，天冬氨酸半醛脱氢酶在根据本发明的重组酵母中过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

在一些实施方式中，天冬氨酸半醛脱氢酶的过表达可以由于在所述重组酵母的基因组内强启动子对相应的基因的控制导致。

在一些其他的实施方式中，天冬氨酸半醛脱氢酶的过表达可以由于在所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的天冬氨酸半醛脱氢酶编码序列导致。

在仍然另外的实施方式中，天冬氨酸半醛脱氢酶的过表达可以由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应的基因的控制和(ii)在所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的天冬氨酸半醛脱氢酶编码序列两者导致。

二氨基丁酸氨基转移酶(EctB)

二氨基丁酸氨基转移酶是在本领域中描述的用于催化天冬氨酰基半醛在谷氨酸的存在下转化为2,4-二氨基丁酸的蛋白质。由伸长盐单胞菌的基因组编码的二氨基丁酸氨基转移酶可以被称为EctB或EctB.He。

为测量二氨基丁酸氨基转移酶的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域的技术人员可以有利地参考由Ono H等人,1999,Journal ofBacteriology,第91-99页所述的方法。

本说明书中优选的二氨基丁酸氨基转移酶是EC编号为NO.2.6.1.76的酶。

根据优选的实施方式，编码二氨基丁酸氨基转移酶的一种或多种核酸可以是源自优选选自包括原核生物体和真核生物体的组的生物体的一种或多种核酸。在一些实施方式中，编码二氨基丁酸氨基转移酶的一种或多种核酸可以是源自古细菌的一种或多种核酸。在一些实施方式中，编码二氨基丁酸氨基转移酶的一种或多种核酸可以是源自优选选自细菌，特别选自铜绿假单胞菌、伸长盐单胞菌或Sporocarcina newyorkensisn，优选选自铜绿假单胞菌或伸长盐单胞菌的生物体的一种或多种核酸。

根据又一个优选的实施方式，编码二氨基丁酸氨基转移酶的一种或多种核酸可以是选自由以下组成的组的一种或多种核酸：与SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9的核酸具有至少35％、有利地至少65％、优选至少80％的核酸同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。

关于该序列的相同性质的生物活性是编码催化天冬氨酰基半醛在谷氨酸的存在下转化为2,4-二氨基丁酸的酶的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少35％的核苷酸同一性的核酸序列涵盖了与所述参考核酸序列具有至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的核苷酸同一性并且还有相同性质的生物活性的核酸序列。

对于来自伸长盐单胞菌的二氨基丁酸氨基转移酶的氨基酸序列，本领域的技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号WP_013332345.1或本文所述的SEQ ID NO.10或SEQID NO.11。

根据另一个特定的实施方式，编码二氨基丁酸氨基转移酶的一种或多种核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的一种或多种核酸：与SEQ ID NO.10或SEQ IDNO.11的氨基酸序列具有至少35％、有利地至少65％、优选至少80％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。

关于该序列的相同性质的生物活性如前所述，即催化天冬氨酰基半醛在谷氨酸的存在下转化为2,4-二氨基丁酸的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少35％的氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖了与所述参考核酸序列具有至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如上所述，本发明中二氨基丁酸氨基转移酶的表达水平受诸如在下文中更详细地定义的至少一种启动子和至少一种终止子的调控，其分别存在于编码所述二氨基丁酸氨基转移酶的核酸序列的5’和3’位置中。

如在本说明书中其他地方指定，二氨基丁酸氨基转移酶在根据本发明的重组酵母中过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

在一些实施方式中，二氨基丁酸氨基转移酶的过表达可以由于所述重组酵母内强启动子对相应的基因的控制导致。

在一些其他的实施方式中，二氨基丁酸氨基转移酶的过表达可以由于在所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的二氨基丁酸氨基转移酶编码序列。

在仍然另外的实施方式中，二氨基丁酸氨基转移酶的过表达可以由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应的基因的控制和(ii)在所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的二氨基丁酸氨基转移酶编码序列两者导致。

高丝氨酸O-乙酰转移酶(MET2；METX)

高丝氨酸O-乙酰转移酶是本领域描述的用于催化乙酰-CoA和2,4-二氨基丁酸之间反应为CoA和乙酰-2,4-二氨基丁酸的蛋白质。由酿酒酵母的基因组编码的高丝氨酸O-乙酰转移酶可以被称为MET2。

为测量高丝氨酸O-乙酰转移酶的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域的技术人员可以有利地参考由Shuzo Yamagata(1987,TheJournal of Bacteriology,第169(8)卷:3458-3463)所述的方法。

本说明书中优选的高丝氨酸O-乙酰转移酶是EC编号为NO.EC 2.3.1.31的酶。

根据优选的实施方式，编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的一种或多种核酸可以是源自优选选自包括原核生物体和真核生物体的组的生物体的一种或多种核酸。在一些实施方式中，编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的一种或多种核酸核酸可以是源自古细菌的一种或多种核酸。在一些实施方式中，编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的一种或多种核酸可以是源自优选选自谷氨酸棒状杆菌和酵母的生物体的一种或多种核酸。在一些其他优选的实施方式中，编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的一种或多种核酸可以是源自酵母、特别是源自酿酒酵母的一种或多种核酸。

根据特定的实施方式，编码高丝氨酸-O-乙酰转移酶METX的核酸是来自细菌、特别是来自独立地选自由以下组成的组的细菌的核酸：谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌(Haemophilius influenza)、淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)、肾脏钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。

根据又一个优选的实施方式，编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的一种或多种核酸可以是选自由以下组成的组的一种或多种核酸：与SEQ ID NO:12的核酸具有至少27％、有利地至少65％、优选至少80％的核酸同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO:12的核酸编码源自酿酒酵母的高丝氨酸O-乙酰转移酶，其还可以被称为MET2。源自谷氨酸棒状杆菌的高丝氨酸O-乙酰转移酶通常被称为METX。

关于该序列的相同性质的生物活性是编码催化乙酰-CoA和2,4-二氨基丁酸之间反应为CoA和乙酰-2,4-二氨基丁酸的酶的能力。

对于来自酿酒酵母的高丝氨酸O-乙酰转移酶的氨基酸序列，本领域的技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP014122或本文所述的SEQ ID NO.13。

根据另一个特定的实施方式，编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的一种或多种核酸可以为编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的一种或多种核酸：与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少27％、有利地至少65％、优选至少80％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自Aquamarina atlantica的高丝氨酸O-乙酰转移酶与SEQ IDNO.13的高丝氨酸O-乙酰转移酶具有27％的氨基酸同一性。

关于该序列的相同性质的生物活性如前所述，即催化乙酰-CoA和2,4-二氨基丁酸之间反应为CoA和乙酰-2,4-二氨基丁酸的能力。

如上所述，本发明中高丝氨酸O-乙酰转移酶的表达水平受诸如在下文中更详细地定义的至少一种启动子和至少一种终止子的调控，其分别存在于编码所述高丝氨酸O-乙酰转移酶的核酸序列的5’和3’位置中。

如在本说明书中其他地方指定，在本发明的一些实施方式中，高丝氨酸O-乙酰转移酶在根据本发明的重组酵母中过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

在一些实施方式中，高丝氨酸O-乙酰转移酶的过表达可以由于所述重组酵母内强启动子对相应的基因的控制导致。

在一些其他的实施方式中，高丝氨酸O-乙酰转移酶的过表达可以由于在所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的高丝氨酸O-乙酰转移酶编码序列导致。

在仍然另外的实施方式中，高丝氨酸O-乙酰转移酶的过表达可以由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应的基因的控制和(ii)在所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的高丝氨酸O-乙酰转移酶编码序列两者导致。

二氨基丁酸乙酰转移酶(EctA)

二氨基丁酸乙酰转移酶是本领域中描述的用于催化2,4-二氨基丁酸在乙酰-CoA的存在下转化为乙酰-2,4-二氨基丁酸的蛋白质。由伸长盐单胞菌的基因组编码的二氨基丁酸乙酰转移酶可以被称为EctA或EctA.He。

为测量二氨基丁酸乙酰转移酶的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

本说明书中优选的二氨基丁酸乙酰转移酶是EC编号为NO.2.3.1.178的酶。

根据优选的实施方式，编码二氨基丁酸乙酰转移酶的一种或多种核酸可以是源自优选选自包括原核生物体和真核生物体的组的生物体的一种或多种核酸。在一些实施方式中，编码二氨基丁酸乙酰转移酶的一种或多种核酸可以是源自古细菌的一种或多种核酸。在一些实施方式中，编码二氨基丁酸乙酰转移酶的一种或多种核酸可以是源自优选选自细菌、特别选自需盐色盐杆菌、铜绿假单胞菌、索氏菌(Thaurea)sp.28或伸长盐单胞菌的生物体的一种或多种核酸。

根据又一个优选的实施方式，编码二氨基丁酸乙酰转移酶的一种或多种核酸可以是选自由以下组成的组的一种或多种核酸：与SEQ ID NO.14的核酸具有至少30％、有利地至少65％、优选至少80％的核酸同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。

关于该序列的相同性质的生物活性是编码催化2,4-二氨基丁酸在乙酰-CoA的存在下转化为乙酰-2,4-二氨基丁酸的酶的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少30％的核苷酸同一性的核酸序列涵盖了与所述参考核酸序列具有至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的核苷酸同一性并且还有相同性质的生物活性的核酸序列。

对于来自伸长盐单胞菌的二氨基丁酸乙酰转移酶的氨基酸序列，本领域的技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号WP_035409657.1或本文所述的SEQ ID NO.15。

根据另一个特定的实施方式，编码二氨基丁酸乙酰转移酶的一种或多种核酸可以为编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的一种或多种核酸：与SEQ ID NO.15的氨基酸序列具有至少30％、有利地至少65％、优选至少80％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。

关于该序列的相同性质的生物活性如前所述，即催化2,4-二氨基丁酸在乙酰-CoA的存在下转化为乙酰-2,4-二氨基丁酸的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少30％的氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖了与所述参考核酸序列具有至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如上所述，本发明中二氨基丁酸乙酰转移酶的表达水平受诸如在下文中更详细地定义的至少一种启动子和至少一种终止子的调控，其分别存在于编码所述二氨基丁酸乙酰转移酶的核酸序列的5’和3’位置中。

如在本说明书中其他地方指定，二氨基丁酸乙酰转移酶在根据本发明的重组酵母中过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

在一些实施方式中，二氨基丁酸乙酰转移酶的过表达可以由于所述重组酵母内强启动子对相应的基因的控制导致。

在一些其他的实施方式中，二氨基丁酸乙酰转移酶的过表达可以由于在所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的二氨基丁酸乙酰转移酶编码序列导致。

在仍然另外的实施方式中，二氨基丁酸乙酰转移酶的过表达可以由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应的基因的控制和(ii)在所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的二氨基丁酸乙酰转移酶编码序列两者导致。

依克多因合酶(EctC)

依克多因合酶是在本领域中描述的用于催化乙酰-2,4-二氨基丁酸转化为依克多因的蛋白质。由伸长盐单胞菌的基因组编码的依克多因合酶可以被称为EctC或EctC.He。

为测量依克多因合酶的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

本说明书中优选的依克多因合酶是EC编号为NO.4.2.1.108的酶。

根据优选的实施方式，编码依克多因合酶的一种或多种核酸可以是源自优选选自包括原核生物体和真核生物体的组的生物体的一种或多种核酸。在一些实施方式中，编码依克多因合酶的一种或多种核酸可以是源自古细菌的一种或多种核酸。在一些实施方式中，编码依克多因合酶的一种或多种核酸可以是源自优选选自细菌，特别选自铜绿假单胞菌、伸长盐单胞菌或藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的生物体的一种或多种核酸。

根据又一个优选的实施方式，编码依克多因合酶的一种或多种核酸可以是选自由以下组成的组的一种或多种核酸：与SEQ ID NO.16的核酸具有至少35％、有利地至少65％、优选至少80％的核酸同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。

关于该序列的相同性质的生物活性是编码催化乙酰-2,4-二氨基丁酸转化为依克多因的酶的能力。

对于来自伸长盐单胞菌的依克多因合酶的氨基酸序列，本领域的技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号WP_013332346或本文所述的SEQ ID NO.17。

根据另一个特定的实施方式，编码依克多因合酶的一种或多种核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的一种或多种核酸：与SEQ ID NO.17的氨基酸序列具有至少35％、有利地至少65％、优选至少80％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。

关于该序列的相同性质的生物活性如前所述，即催化乙酰-2,4-二氨基丁酸转化为依克多因的能力。

如上所述，本发明中依克多因合酶的表达水平受诸如在下文中更详细地定义的至少一种启动子和至少一种终止子的调控，其分别存在于编码所述依克多因合酶的核酸序列的5’和3’位置中。

如在本说明书中其他地方指定，依克多因合酶在根据本发明的重组酵母中过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

在一些实施方式中，依克多因合酶的过表达可以由于所述重组酵母内强启动子对相应的基因的控制导致。

在一些其他的实施方式中，依克多因合酶的过表达可以由于在所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的依克多因合酶编码序列导致。

在仍然另外的实施方式中，依克多因合酶的过表达可以由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应的基因的控制和(ii)在所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的依克多因合酶编码序列两者导致。

高丝氨酸脱氢酶(HOM6)

高丝氨酸脱氢酶是在本领域中描述的用于催化L-高丝氨酸在NAD或NADP的存在下转化为L-天冬氨酸4-半醛的蛋白质。由酿酒酵母的基因组编码的高丝氨酸脱氢酶可以被称为HOM6。

为测量高丝氨酸脱氢酶的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域的技术人员可以有利地参考由Calnyanto等人(2006,Microbiology,第152卷:105-112)所述的方法。

本说明书中优选的高丝氨酸脱氢酶是EC编号为NO.1.1.1.3的酶。

根据优选的实施方式，编码高丝氨酸脱氢酶的一种或多种核酸可以是源自优选选自包括原核生物体和真核生物体的组的生物体的一种或多种核酸。在一些优选的实施方式中，编码高丝氨酸脱氢酶的一种或多种核酸可以是源自酵母、特别是源自酿酒酵母的一种或多种核酸。

根据特定的实施方式，编码高丝氨酸脱氢酶的一种或多种核酸可以是SEQ ID NO:18的核酸。SEQ ID NO:18的核酸编码源自酵母菌(Saccharomyces)的高丝氨酸脱氢酶，其还可以被称为HOM6。

对于来自酿酒酵母的高丝氨酸脱氢酶的氨基酸序列，本领域的技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号AJR75529或NP012673或本文所述的SEQ ID NO.19。

如上所述，本发明中高丝氨酸脱氢酶的表达水平受诸如在下文中更详细地定义的至少一种启动子和至少一种终止子的调控，其分别存在于编码所述高丝氨酸脱氢酶的核酸序列的5’和3’位置中。

如在本说明书中其他地方指定，在本发明的一些实施方式中，高丝氨酸脱氢酶在根据本发明的重组酵母中(a)完全缺失或部分缺失或中断，或(b)在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；在弱启动子的控制下；和/或呈非稳定形式。

产依克多因重组酵母的具体实施方式

天冬氨酸转氨酶过表达和/或受控表达

在根据本发明的重组酵母的优选实施方式中，编码天冬氨酸转氨酶的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

天冬氨酸转氨酶(也被称为天冬氨酸氨基转移酶)是本领域所述的用于催化L-天冬氨酸和2-氧化戊二酸反应以产生草酰乙酸和L-谷氨酸的蛋白质。由酿酒酵母的基因组编码的天冬氨酸转氨酶可以被称为AAT2。

根据这些实施方式，天冬氨酸转氨酶编码基因的过表达通过在酵母基因组的一个或多个选定位置处插入一个或多个拷贝的包含天冬氨酸转氨酶编码序列的表达盒来获得。本发明涵盖的天冬氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶编码基因在本说明书中的其他地方详述。

在这些实施方式的一些实施方式中，所述一个或多个拷贝的包含天冬氨酸转氨酶编码序列的表达盒包含允许天冬氨酸转氨酶的强表达的调控序列，诸如在酵母细胞中有功能的强启动子。

除了根据本发明的重组酵母的这些实施方式之外或作为根据本发明的重组酵母的这些实施方式的替代方式，至少一种天冬氨酸转氨酶编码基因可以在在酵母细胞中有功能的诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本发明人相信，天冬氨酸转氨酶的过表达可以诱导草酰乙酸至天冬氨酸的高水平转化。当至少一种天冬氨酸转氨酶编码序列在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下时，也同样适用。

为测量天冬氨酸转氨酶的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域的技术人员可以有利地参考Yagi等人(1982,Biochem,第92卷:35-43)中所述的方法。

在一些实施方式中，所述天冬氨酸转氨酶编码基因是来自酿酒酵母的AAT2基因，如本文示例中所示。

在优选的实施方式中，天冬氨酸氨基转移酶由拟南芥(A.Thaliana)AAT2基因编码。

在优选的实施方式中，将所述天冬氨酸转氨酶编码基因置于诱导型启动子或阻遏型启动子pACU1或强启动子pADH1或强启动子pPGK1的控制下。

说明性地，可以将AAT2基因插入CAN1基因内和/或GNP1基因内和/或MUP3基因内，如在本文示例中所示。

本说明书中的优选天冬氨酸转氨酶由EC编号2.6.1.1已知。

编码天冬氨酸转氨酶的一种或多种核酸可以是源自优选选自包括原核生物体和真核生物体的组的生物体的一种或多种核酸。在一些实施方式中，编码天冬氨酸转氨酶的一种或多种核酸可以是源自古细菌的一种或多种核酸。在一些优选的实施方式中，编码天冬氨酸转氨酶的一种或多种核酸可以是源自酵母生物体、最优选酿酒酵母的一种或多种核酸。

根据又一个优选的实施方式，编码天冬氨酸转氨酶或AAT2的一种或多种核酸可以是选自由以下组成的组的一种或多种核酸：与SEQ ID NO:20的核酸序列具有至少39％、有利地至少65％和优选至少80％的核酸同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。

关于该序列的相同性质的生物活性是编码催化L-天冬氨酸和2-氧化戊二酸反应以产生草酰乙酸和L-谷氨酸的酶的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少39％的核苷酸同一性的核酸序列涵盖了与SEQ ID NO:20的核酸序列具有至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的核苷酸同一性并且还有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％的核苷酸同一性的核酸序列涵盖了与SEQ ID NO:20的核酸序列具有至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的核苷酸同一性并且还有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％的核苷酸同一性的核酸序列涵盖了与SEQ ID NO:20的核酸序列具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的核苷酸同一性并且还有相同性质的生物活性的核酸序列。

对于来自酿酒酵母的天冬氨酸转氨酶AAT2的氨基酸序列，本领域的技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP013127或本文所述的SEQ ID NO.21。说明性地，源自大肠杆菌的天冬氨酸转氨酶与SEQ ID NO.21的天冬氨酸转氨酶AAT2具有39％的氨基酸同一性。

根据另一个特定的实施方式，编码天冬氨酸转氨酶的一种或多种核酸可以为编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的一种或多种核酸：与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少39％、有利地至少65％、优选至少80％的同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。

关于该序列的相同性质的生物活性如前所述，即催化L-天冬氨酸和2-氧化戊二酸反应以产生草酰乙酸和L-谷氨酸的能力。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少39％的氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖了与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖了与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖了与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如上所述，本发明中天冬氨酸转氨酶的表达水平受诸如在下文中更详细地定义的至少一种启动子和至少一种终止子的调控，其分别存在于编码所述天冬氨酸转氨酶的核酸序列的5’和3’位置中。

如在本说明书中其他地方指定，天冬氨酸转氨酶在根据本发明的重组酵母中过表达。

在一些实施方式中，天冬氨酸转氨酶的过表达可以由于所述重组酵母内强启动子对相应的基因的控制导致。

在一些其他的实施方式中，天冬氨酸转氨酶的过表达可以由于在所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的天冬氨酸转氨酶编码序列导致。

在仍然另外的实施方式中，天冬氨酸转氨酶的过表达可以由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应的基因的控制和(ii)在所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的天冬氨酸转氨酶编码序列两者导致。

谷氨酸脱氢酶过表达和/或受控表达

在根据本发明的重组酵母的优选实施方式中，编码将氧化戊二酸转化为谷氨酸编码基因的谷氨酸脱氢酶的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

因此，在具体的实施方式中，本发明的重组酵母的基因组使得编码将氧化戊二酸转化为谷氨酸的谷氨酸脱氢酶的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

谷氨酸脱氢酶(也被称为NAD特异性谷氨酸脱氢酶)是本领域中描述的用于催化2-氧化戊二酸转化以产生L-谷氨酸的蛋白质。因此，谷氨酸脱氢酶是特异性地参与将2-氧化戊二酸在NADH的存在下转化为L-谷氨酸的化学反应的酶。

根据这些实施方式，谷氨酸脱氢酶编码基因的过表达通过在酵母基因组的一个或多个选定位置处插入一个或多个拷贝的包含谷氨酸脱氢酶编码序列的表达盒来获得。本发明涵盖的谷氨酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶编码基因在本说明书中的其他地方详述。

在这些实施方式的一些实施方式中，所述一个或多个拷贝的包含谷氨酸脱氢酶编码序列的表达盒包含允许谷氨酸脱氢酶强表达的调控序列，诸如在酵母细胞中有功能的强启动子。

除了根据本发明的重组酵母的这些实施方式之外或作为根据本发明的重组酵母的这些实施方式的替代方式，至少一种谷氨酸脱氢酶编码基因可以在在酵母细胞中有功能的诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本发明人相信，谷氨酸脱氢酶的过表达通过将氧化戊二酸转化为谷氨酸同时生成了NAD。当至少一种谷氨酸脱氢酶编码序列在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下时，也同样适用。

为测量谷氨酸脱氢酶的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域的技术人员可以有利地参考在Noor和Punekar(2005,Microbiology,第151卷:1409-1419)中所述的方法。

在优选的实施方式中，所述谷氨酸脱氢酶编码基因编码使用NADH替代NADPH的谷氨酸脱氢酶，更特别地是来自有尾内毛虫(Entodinium caudatum)(表示为GDH.Eca或GDH2.Eca)或酿酒酵母(表示为GDH2)的GDH基因，如本文示例中所示。在特定的实施方式中，所述谷氨酸脱氢酶编码基因编码来自有尾内毛虫的谷氨酸脱氢酶。

本说明书中优选的谷氨酸脱氢酶可以特别是EC编号为NO.EC 1.4.1.2的酶。

在优选的实施方式中，将所述谷氨酸脱氢酶编码基因置于强启动子pTDH3或诱导型启动子或阻遏型启动子pCUP1-1的控制下。

说明性地，可以将谷氨酸脱氢酶基因插入HIS3基因内和/或MUP3基因内，如在本文的示例中所示。

根据优选的实施方式，编码谷氨酸脱氢酶的一种或多种核酸可以是源自优选选自包括原核生物体和真核生物体的组的生物体的一种或多种核酸。在一些实施方式中，编码谷氨酸脱氢酶的一种或多种核酸可以是源自古细菌的一种或多种核酸。在一些实施方式中，编码谷氨酸脱氢酶的一种或多种核酸可以是源自优选选自有尾内毛虫、枯草芽孢杆菌、共生梭菌(Clostridium symbiosium)的生物体的一种或多种核酸。

根据又一个优选的实施方式，编码谷氨酸脱氢酶的一种或多种核酸可以是选自由以下组成的组的一种或多种核酸：与SEQ ID NO:22的核酸序列具有至少49％、有利地至少65％、优选至少80％的核酸同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO.22的核酸编码源自有尾内毛虫的谷氨酸脱氢酶，所述核酸序列经密码子优化以在酵母、特别是在酿酒酵母中表达。

关于该序列的相同性质的生物活性是编码催化2-氧化戊二酸转化以产生L-谷氨酸的酶的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少49％的核苷酸同一性的核酸序列涵盖了与SEQ ID NO:22的核酸序列具有至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的核苷酸同一性并且还有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％的核苷酸同一性的核酸序列涵盖了与SEQ ID NO:22的核酸序列具有至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的核苷酸同一性并且还有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％的核苷酸同一性的核酸序列涵盖了与SEQ ID NO:22的核酸序列具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的核苷酸同一性并且还有相同性质的生物活性的核酸序列。

对于来自有尾内毛虫的谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列，本领域的技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号AAF15393或本文所述的SEQ ID NO.23。说明性地，源自肠贾第虫(Giardia intestinalis)的谷氨酸脱氢酶与SEQ ID NO.23的谷氨酸脱氢酶具有49％的氨基酸同一性。

根据另一个特定的实施方式，编码谷氨酸脱氢酶的一种或多种核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的一种或多种核酸：与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少49％、有利地至少65％、优选至少80％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的序列。

关于该序列的相同性质的生物活性如前所述，即催化2-氧化戊二酸转化以产生L-谷氨酸的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少49％的氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖了与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％的氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖了与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖了与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的氨基酸同一性并且还有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如上所述，本发明中谷氨酸脱氢酶的表达水平受诸如在下文中更详细地定义的至少一种启动子和至少一种终止子的调控，其分别存在于编码所述谷氨酸脱氢酶的核酸序列的5’和3’位置中。

如在本说明书中其他地方指定，谷氨酸脱氢酶在根据本发明的重组酵母中过表达。

在一些实施方式中，谷氨酸脱氢酶的过表达可以由于在所述重组酵母内强启动子对相应的基因的控制导致。

在一些其他的实施方式中，谷氨酸脱氢酶的过表达可以由于在所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的谷氨酸脱氢酶编码序列导致。

在仍然另外的实施方式中，谷氨酸脱氢酶的过表达可以由于(i)在所述重组酵母内强启动子对相应的基因的控制和(ii)在所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的谷氨酸脱氢酶编码序列两者导致。

感兴趣的化合物的输出

在根据本发明的重组酵母的另外实施方式中，通过(i)编码酵母通透酶的基因的低表达，通过(ii)编码氨基酸输出蛋白的基因的低表达，或通过(iii)编码酵母通透酶的基因的低表达和编码氨基酸输出蛋白的基因的低表达两者，可以增强所产生的依克多因输出酵母细胞外部。

一种或多种通透酶编码基因的低表达

如在下文中所述，可以在根据本发明的重组酵母中低表达的通透酶编码基因涵盖了AGP1、AGP3、BAP3、BAP2、GAP1、GNP1、MUP3和MUP1。

AGP1是来自酿酒酵母的一般氨基酸通透酶1。对于AGP1的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_009905。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001178671。

AGP3是来自酿酒酵母的一般氨基酸通透酶3。对于AGP3的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_116600。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001179912。

BAP3是来自酿酒酵母的缬氨酸氨基酸通透酶。对于BAP3的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_010331。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001180354。

BAP2是来自酿酒酵母的Leu/Val/Ile氨基酸通透酶。对于BAP2的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_009624。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001178416。

GAP1是来自酿酒酵母的一般氨基酸通透酶。对于GAP1的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_012965.3。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001179829。

GNP1是来自酿酒酵母的高亲和力谷氨酰胺通透酶。对于GNP1的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_010796。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001180816。

MUP3是来自酿酒酵母的低亲和力甲硫氨酸通透酶。对于MUP3的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_011827。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001179116。

MUP1是来自酿酒酵母的低亲和力甲硫氨酸通透酶。对于MUP的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_011569。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001181184。

在根据本发明的重组酵母的一些实施方式中，所述重组酵母还被定义为具有编码涵盖AGP1通透酶、AGP3通透酶、BAP3通透酶、BAP2通透酶、GAP1通透酶、GNP1通透酶、MUP3通透酶和MUP1通透酶的通透酶的一种或多种基因的低表达。

因此，在特定的实施方式中，本发明的重组酵母的基因组使得可以进行以下修饰中的至少一者：

(A)编码一般氨基酸通透酶AGP3的至少一种内源核酸、优选所有内源核酸已从所述酵母的基因组中缺失，以及任选地：

(i)编码一般氨基酸通透酶AGP3的至少一种核酸已经插入并在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下，和/或

(ii)编码非稳定的一般氨基酸通透酶AGP3的至少一种核酸已经插入；

(B)编码支链氨基酸通透酶3的至少一种内源核酸、优选所有内源核酸已从所述酵母的基因组中缺失，以及任选地：

(i)编码支链氨基酸通透酶3的至少一种核酸已经插入并在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下，和/或

(ii)编码非稳定的支链氨基酸通透酶3的至少一种核酸已经插入；

(C)编码支链氨基酸通透酶2的至少一种内源核酸、优选所有内源核酸已从所述酵母的基因组中缺失，以及任选地：

(i)编码支链氨基酸通透酶2的至少一种核酸已经插入并在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下，和/或

(ii)编码非稳定的支链氨基酸通透酶2的至少一种核酸已经插入；

(D)编码一般氨基酸通透酶GAP1的至少一种内源核酸、优选所有内源核酸已从所述酵母的基因组中缺失，以及任选地：

(i)编码一般氨基酸通透酶GAP1的至少一种核酸已经插入并在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下，和/或

(ii)编码非稳定的一般氨基酸通透酶GAP1的至少一种核酸已经插入；

(E)编码高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的至少一种内源核酸、优选所有内源核酸已从所述酵母的基因组中缺失，以及任选地：

(i)编码高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的至少一种核酸已经插入并在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下，和/或

(ii)编码非稳定的高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的至少一种核酸已经插入；

(F)编码一般氨基酸通透酶AGP1的至少一种内源核酸、优选所有内源核酸已从所述酵母的基因组中缺失，以及任选地：

(i)编码一般氨基酸通透酶AGP1的至少一种核酸已经插入并在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下，和/或

(ii)编码非稳定的一般氨基酸通透酶AGP1的至少一种核酸已经插入；

(G)编码低亲和力甲硫氨酸通透酶MUP3的至少一种内源核酸、优选所有内源核酸已从所述酵母的基因组中缺失，以及任选地：

(i)编码低亲和力甲硫氨酸通透酶MUP3的至少一种核酸已经插入并在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下，和/或

(ii)编码非稳定的低亲和力甲硫氨酸通透酶MUP3的至少一种核酸已经插入；

(H)编码高亲和力甲硫氨酸通透酶MUP1的至少一种内源核酸、优选所有内源核酸已从所述酵母的基因组中缺失，以及任选地：

(i)编码高亲和力甲硫氨酸通透酶MUP1的至少一种核酸已经插入并在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下，和/或

(ii)编码非稳定的高亲和力甲硫氨酸通透酶MUP1的至少一种核酸已经插入；

(I)编码可能的转运蛋白AQR1的至少一种核酸过表达；和/或

(J)编码多胺转运蛋白1的至少一种核酸过表达。

在特定的实施方式中，可以进行这些修饰中的至少两者、特别是至少三者。

在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本发明人相信，通透酶基因中的任一者的低表达应增加所产生的依克多因在酵母细胞外部(例如在培养基中)的分泌。

关于通透酶，这些基因中的一种或多种的低表达涵盖了它们的表达的完全阻遏，例如通过所述一种或多种通透酶基因的中断或缺失。

在一些实施方式中，例如通过将通透酶编码基因的表达置于阻遏型调控序列(诸如诱导型启动子或阻遏型启动子)的控制下，可以使该基因的低表达是有条件的。

关于通透酶基因，低表达还涵盖了插入编码非稳定的通透酶蛋白质的核酸或插入编码非稳定的通透酶蛋白质的核酸或两者。

非稳定的通透酶是在酵母细胞内比亲本通透酶更快降解的通透酶的变体。

在优选的实施方式中，非稳定的通透酶由降解决定子标记的通透酶蛋白质组成。

如示例中说明，AGP3基因、BAP3基因、GAP1基因、GNP1基因和MUP3基因可以被loxP中断并因此缺失。

一种或多种氨基酸输出蛋白编码基因的过表达

如下所述，可以在根据本发明的重组酵母中过表达的输出蛋白编码基因涵盖了AQR1和TPO1。

AQR1是来自酿酒酵母的转运蛋白。对于AQR1的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_014334。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001182903。

TPO1是来自酿酒酵母的多胺转运蛋白。对于TPO1的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_013072。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001181848。

在根据本发明的重组酵母的优选实施方式中，转运蛋白编码基因的过表达通过在酵母基因组的一个或多个选定位置处插入一个或多个另外拷贝的包含所述转运蛋白编码序列的表达盒来获得。

在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本发明人相信，转运蛋白编码基因的过表达应增加所产生的依克多因在酵母细胞外(例如在培养基中)的分泌。

在一些实施方式中，转运蛋白编码基因的过表达通过在酵母基因组的一个或多个选定位置处插入一个或多个另外拷贝的包含转运蛋白基因编码序列的表达盒来获得。在这些实施方式的一些实施方式中，所述一个或多个拷贝的包含转运蛋白编码序列的表达盒包含允许所述转运蛋白的强表达的调控序列，诸如在酵母细胞中有功能的强启动子。

在一些其他的实施方式中，将一个拷贝的转运蛋白编码基因插入酵母基因组的选定位置处。在这些其他实施方式中，所述一个或多个拷贝的包含转运蛋白编码序列的表达盒包含允许所述转运蛋白的强表达的调控序列，诸如在酵母细胞中有功能的强启动子。

在优选的实施方式中，将所述氨基酸输出蛋白编码基因AQR1置于强启动子pTEF3的控制下。

说明性地，可以将AQR1基因插入PYK1基因内，如在本文示例中所示。

在优选的实施方式中，将所述氨基酸输出蛋白编码基因_TPO1置于强诱导型启动子或强阻遏型启动子pSAM4或强组成型启动子pTEF1的控制下。

TPO1-1可以替代TPO1来使用。TPO1-1是人工等位基因，其中，赖氨酸10、49、86、143、144和145被精氨酸替代。

本发明人相信，这些修饰保护TPO1免于通过泛素蛋白酶体途径降解，从而使其稳定。

在优选的实施方式中，将所述氨基酸输出蛋白编码基因_TPO1置于强启动子pTEF3的控制下。

说明性地，可以将TPO1基因插入PYK1基因内，如在本文示例中所示。

考虑到进一步增加依克多因产生，根据本发明的重组酵母可以包含另外的遗传变化，使得它们产生大量的中间产物草酰乙酸。这些任选的遗传变化在下文中描述。

产依克多因重组酵母的另外实施方式

根据本发明的重组酵母的一些实施方式，通过将所述重组酵母置于导致中间代谢物草酰乙酸产生增加的条件下，可以进一步增加依克多因的产生。

可以通过在酵母基因组中引入另外的遗传修饰，将所述重组酵母置于导致草酰乙酸产生增加的条件下。

本发明人发现，通过将另外的遗传变化引入下述的产依克多因重组酵母中，可以达到最佳增加的依克多因产生。

产依克多因重组酵母的第一另外实施方式

根据本发明的产依克多因重组酵母的这些第一另外的实施方式，进行了重组酵母的另外遗传工程化，目的是增加中间产物磷酸烯醇-丙酮酸(PEP)的产生。

在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本发明人相信，在产依克多因重组酵母中引入另外的遗传变化(i)导致NADPH过度产生，(ii)导致磷酸烯醇丙酮酸分别受控和平衡地转化为草酰乙酸和丙酮酸，和(iii)导致丙酮酸减少地转化为乙醇，并重新定向为将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸。

在根据本发明的产依克多因重组酵母中通过遗传工程化引入的这些另外的遗传变化在下面更详细地说明。

根据这些实施方式，引入遗传变化以便过表达葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(也称为MET19或ZWF1)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(脱羧)1(也称为GND1)。在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本发明人相信，MET19和GND1的过表达导致NADPH产生增加。

根据这些实施方式，引入遗传变化以便过表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(也称为PEPC或PPC)和/或磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶[ATP](也称为PCK1或PEPCK)。

根据这些实施方式，引入遗传变化以便低表达丙酮酸激酶1(也称为PYK1或CDC19)和丙酮酸激酶2(也称为PYK2)。在这些实施方式的一些实施方式中，PYK2基因可以被缺失而非低表达。

在这些实施方式的一些实施方式中，优选通过缺失使编码丙酮酸脱羧酶的一种或多种基因失活。丙酮酸脱羧酶编码基因分别涵盖了称为PDC1、PDC5和PDC6的那些基因。根据这些实施方式的一些实施方式，优选通过中断或缺失而使PDC1和/或PDC6基因失活，而另一种丙酮酸脱羧酶编码基因PDC5则保持不变；或者通过用弱启动子控制PDC5来使其表达减少。

在这些实施方式的一些实施方式中，通过改变一种或多种醇脱氢酶编码基因的表达来减少重组酵母的醇脱氢酶活性。在这些实施方式的一些实施方式中，通过将基因置于弱启动子的控制下或通过产生非稳定的ADH1酶来减少ADH1的表达。在这些实施方式的一些实施方式中，可以优选通过中断或缺失来使ADH3、ADH4和ADH5中的一种或多种失活。

在这些实施方式的一些实施方式中，可以将外源乙酰脱氢酶编码基因(也称为MHPF)引入酵母基因组中并过表达。

在这些实施方式的一些实施方式中，可以将外源乙酸激酶编码基因(也称为ACKA)引入酵母基因组中并过表达。

在这些实施方式的一些实施方式中，可以将外源磷酸乙酰转移酶编码基因(也称为PTA)引入酵母基因组中并过表达。

葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶

葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶是在本领域中描述的用于催化D-葡萄糖6-磷酸为6-磷酸-D-葡萄糖酸-1,5-内酯并同时将NADP还原为NADPH的蛋白质。

为测量葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域的技术人员可以有利地参考由Kuby,S.等人(1966)Dehydrogenases and Oxidases Methods in Enzymology 9,116-117所述的方法。

本说明书中优选的葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶是EC编号为NO.1.1.1.49的酶。

对于葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(也称为MET19)的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_014158.1。对于核酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NM_001183079.1。

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(脱羧)1

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(脱羧)1是在本领域中描述的用于催化6-磷酸葡萄糖酸的氧化脱羧为核酮糖5-磷酸和CO2并同时将NADP还原为NADPH的蛋白质。

为测量6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(脱羧)1的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域的技术人员可以有利地参考He W.等人(2007)BMC StructuralBiology,7:38中所述的方法。

本说明书中优选的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(脱羧)1是EC编号为NO.1.1.1.44的酶。

对于6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(脱羧)1(也称为GND1)的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_012053。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001179314。

丙酮酸激酶1

丙酮酸激酶1是本领域中描述的用于将丙酮酸在ATP的存在下转化为磷酸烯醇丙酮酸的蛋白质。

为测量丙酮酸激酶1的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域的技术人员可以有利地参考由Susan-resiga和Nowak(biochemistry,2004,43,15230-15245)所述的方法。

本说明书中优选的丙酮酸激酶1是EC编号为NO.2.7.1.40的酶。

对于丙酮酸激酶1(也称为PYK1)的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_009362。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001178183。

丙酮酸激酶2

丙酮酸激酶2是在本领域中描述用于催化丙酮酸在ATP的存在下转化为磷酸烯醇丙酮酸的蛋白质。在糖酵解通量水平非常低的条件下，酵母细胞可以使用丙酮酸激酶2。

为测量丙酮酸激酶2的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

本说明书中优选的丙酮酸激酶2是EC编号为NO.2.7.1.40的酶。

对于丙酮酸激酶2(也称为PYK2)的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_014992。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001183767。

丙酮酸脱羧酶同工酶1

丙酮酸脱羧酶同工酶1是在本领域中描述的参与在酒精发酵期间丙酮酸非氧化转化为乙醛和二氧化碳的蛋白质。

为测量丙酮酸脱羧酶同工酶1的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域的技术人员可以有利地参考由Wang等人(Biochemistry,2001,40:1755-1763)所述的方法。

本说明书中优选的丙酮酸脱羧酶同工酶1是EC编号为NO.4.1.1.1的酶。

对于丙酮酸脱羧酶同工酶1(也称为PDC1)的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_013145。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001181931。

丙酮酸脱羧酶同工酶5

丙酮酸脱羧酶同工酶5是在本领域中描述的参与在酒精发酵期间丙酮酸非氧化转化为乙醛和二氧化碳的蛋白质。

为测量丙酮酸脱羧酶同工酶5的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

本说明书中优选的丙酮酸脱羧酶同工酶5是EC编号为NO.4.1.1.1的酶。

对于丙酮酸脱羧酶同工酶5(也称为PDC5)的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_013235。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001182021。

丙酮酸脱羧酶同工酶6

丙酮酸脱羧酶同工酶6是在本领域中描述的参与在酒精发酵期间丙酮酸非氧化转化为乙醛和二氧化碳的蛋白质。

本说明书中优选的丙酮酸脱羧酶同工酶6是EC编号为NO.4.1.1.1的酶。

对于丙酮酸脱羧酶同工酶6(也称为PDC6)的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_013235。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001182021。

乙醛脱氢酶

乙醛脱氢酶是在本领域中描述的用于使用NAD和辅酶A催化乙醛转化为乙酰-CoA的蛋白质。

为测量乙醛脱氢酶的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域的技术人员可以有利地参考由Fisher等人(2013)Chemi.Biol.Interact.202 70-77所述的方法。

本说明书中优选的乙醛脱氢酶是EC编号为NO.1.1.1.10的酶。

对于乙醛脱氢酶(也称为MHPF)的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_414885。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为在登录号NC_000913.3中公开的核酸序列。

乙酸激酶

乙酸激酶是在本领域中描述的用于由乙酸和ATP形成乙酰磷酸的蛋白质。

为测量乙酸激酶的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域的技术人员可以有利地参考由Sagers等人J.Bacteriology(1961)82 233-238所述的方法。

对于乙酸激酶(也称为ACKA)的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_416799。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为在登录号NC_000913.3中公开的核酸序列。

磷酸乙酰转移酶

磷酸乙酰转移酶是在本领域中描述的用于催化乙酰-CoA和乙酰磷酸的可逆相互转化的蛋白质。

为测量磷酸乙酰转移酶的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域的技术人员可以有利地参考由Castano-Cerezo和Canovas,Microbial Cell Factories 2009,8:54所述的方法。

本说明书中优选的磷酸乙酰转移酶是EC编号为NO.2.3.1.8的酶。

对于磷酸乙酰转移酶(也称为PTA)的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_416800。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为在登录号NC_000913中公开的核酸序列。

醇脱氢酶1

醇脱氢酶1是在本领域中描述的用于催化直链伯醇转化为其相应的醛的蛋白质。

为测量醇脱氢酶1的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域的技术人员可以有利地参考由Ganzhorn等人(1987)TheJournal of Biological Chemistry,262,3754-61所述的方法

本说明书中优选的醇脱氢酶1是EC编号为NO.1.1.1.1的酶。

对于醇脱氢酶1(也称为ADH1)的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_014555。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001183340。

醇脱氢酶3

醇脱氢酶3是在本领域中描述的用于催化直链伯醇转化为其相应的醛的蛋白质。

为测量醇脱氢酶3的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域的技术人员可以有利地参考由Ganzhorn等人(1987)TheJournal of Biological Chemistry,262,3754-61所述的方法。

本说明书中优选的醇脱氢酶3是EC编号为NO.1.1.1.1的酶。

对于醇脱氢酶3(也称为ADH3)的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_013800。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001182582。

醇脱氢酶4

醇脱氢酶4是在本领域中描述的用于催化直链伯醇转化为其相应的醛的蛋白质。

为测量醇脱氢酶4的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

本说明书中优选的醇脱氢酶4是EC编号为NO.1.1.1.1的酶。

对于醇脱氢酶4(也称为ADH4)的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_011258。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001181122。

醇脱氢酶5

醇脱氢酶5是在本领域中描述的用于催化直链伯醇转化为其相应的醛的蛋白质。

为测量醇脱氢酶5的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

本说明书中优选的醇脱氢酶5是EC编号为NO.1.1.1.1的酶。

对于醇脱氢酶5(也称为ADH5)的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_009703。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_001178493。

产依克多因重组酵母的第二另外实施方式

根据本发明的产依克多因重组酵母的这些另外的实施方式，进行了重组酵母的另外遗传工程化，目的是增加中间产物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的产生。

为此目的，本发明人构想了一种完全新的代谢途径，从磷酸烯醇丙酮酸开始，至产生草酰乙酸结束。

根据这些实施方式，引入遗传变化以便低表达丙酮酸激酶1(也称为PYK1)，和还任选地低表达丙酮酸激酶2(也称为PYK2)。在这些实施方式的一些实施方式中，可以通过将基因置于弱启动子或诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下来低表达PYK1。在这些实施方式的一些实施方式中，例如通过中断或缺失可以使PYK2失活。在这些实施方式的一些实施方式中，PYK1基因可以被缺失而非低表达。在这些实施方式的一些实施方式中，PYK1基因和PYK2基因可以被缺失而非低表达。

根据这些实施方式，引入遗传变化以便(i)通过组成型过表达或(ii)通过诱导型过表达来过表达磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶[ATP](也称为PCK或PCKA或PEPCK)。

根据这些实施方式，引入遗传变化以便(i)通过组成型过表达或(ii)通过诱导型过表达来在细胞质中过表达苹果酸脱氢酶，诸如过氧化物酶体苹果酸脱氢酶(也称为MDH3)。

根据这些实施方式，引入遗传变化以便(i)通过组成型过表达或(ii)通过诱导型过表达来过表达NADP-依赖性苹果酸酶3(也称为ME3或NADP-ME3)。

根据这些实施方式，引入遗传变化以便例如(i)通过将相应的编码序列置于弱启动子或诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下，或(ii)通过产生非稳定形式的所述一种或多种醇脱氢酶，减少一种或多种醇脱氢酶、优选选自包括醇脱氢酶1(也称为ADH1)、醇脱氢酶3(也称为ADH3)、醇脱氢酶4(也称为ADH4)和醇脱氢酶5(也称为ADH5)的组的一种或多种醇脱氢酶的表达。

根据仍然这些实施方式，引入遗传变化以便(i)通过组成型过表达或(ii)通过诱导型过表达来过表达外源乙醛脱氢酶(也称为MHPF)。

磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(PPCK)

磷酸烯醇羧化激酶[ATP]是在本领域中描述的用于催化通过三磷酸核苷和草酰乙酸之间的直接磷酰基转移来将草酰乙酸转化为磷酸烯醇丙酮酸的蛋白质。

为测量磷酸烯醇羧化激酶[ATP]的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域的技术人员可以有利地参考由Bazaes S.等人(2007)TheProtein Journal,26,265-269和 J.Van der Werf等人·(1997)Arch Microbiol167:332–342所述的方法。

本说明书中优选的磷酸烯醇羧化激酶[ATP]是EC编号为NO.4.1.1.49的酶。

对于磷酸烯醇羧化激酶[ATP](也称为PCKA)的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_417862。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NC_000913中公开的核酸序列。

根据本发明的优选的磷酸烯醇羧化激酶可以选自磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶PPCK、诸如EC编号为NO.4.1.1.32的PEPCK。

苹果酸脱氢酶

苹果酸脱氢酶是在本领域中描述的用于催化苹果酸在NADH的存在下转化为草酰乙酸的蛋白质。

为测量苹果酸脱氢酶的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。例如可以提及由Sigma以标题“苹果酸脱氢酶测定试剂盒(Malate dehydrogenase assaykit)”、编号MAK196-1KT出售的商购试剂盒。

对于苹果酸脱氢酶(也称为MDH3)的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_010205。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_00118037。

NADP-依赖性苹果酸酶3

NADP-依赖性苹果酸酶3是在本领域中描述的用于催化苹果酸在NADP存在下转化为丙酮酸的蛋白质。

为测量NADP-依赖性苹果酸酶3的活性水平而实施的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域的技术人员可以有利地参考由Gerrard-Wheeler等人FEBSJournal 276(2009)5665–5677所述的方法。

本说明书中优选的NADP-依赖性苹果酸酶3是EC编号为NO.1.1.1.40的酶。

对于NADP-依赖性苹果酸酶3(也称为NADP-ME3或ME3)的氨基酸序列，其可以在UniProt数据库中被称为登录号NP_197960。对于核酸序列，其可以在NCBI数据库中被称为登录号NM_122489。

醇脱氢酶1、醇脱氢酶3、醇脱氢酶4、醇脱氢酶5和乙醛脱氢酶如上文所指示。

启动子

如本文所公开的，为了获得根据本发明的重组酵母而经过遗传工程化的感兴趣的基因的表达包括在酵母细胞中、包括在酿酒酵母中有功能的适当调控序列。

如本说明书中所公开的，各种启动子可以用于感兴趣的编码序列的期望表达，其包括(i)组成型强启动子(在本文中也称为强启动子)，(ii)组成型弱启动子(在本文中也称为弱启动子)和(iii)诱导型启动子或阻遏型启动子。可以在Keren等人(2013)MolecularSystems Biology 9:701中找到具有在不同培养基中的相对活性的酵母启动子的列表。

允许给定基因组成型过表达的启动子可以见于文献(Velculescu等人(1997)Cell88,243-251)中。

在本发明中更特别感兴趣的强启动子可以选自包括以下的组：

·pTDH3(SEQ ID NO.24)，

·pENO2(SEQ ID NO.25)，

·pTEF KI(SEQ ID NO.26)，

·pTEF3(SEQ ID NO.27)，

·pTEF1(SEQ ID NO.28)，

·pADH1(SEQ ID NO.29)，

·pGMP1(SEQ ID NO.30)，

·pFBA1(SEQ ID NO.31)，

·pPDC1(SEQ ID NO.32)，

·pCCW12(SEQ ID NO.33)，和

·pGK1(SEQ ID NO.34)。

根据特定的实施方式，根据本发明的强启动子独立地选自由以下组成的组：pTDH3、pENO2、pTEF-KI、pTEF3、pTEF1、pADH1、pGMP1、pFBA1、pPDC1、pCCW12和pGK1。

在本发明中更特别感兴趣的弱启动子可以选自包括以下的组：

·pURA3(SEQ ID NO.36)，

·pRPLA1(SEQ ID NO.37)，

·pNUP57(SEQ ID NO.119)，和

·pGAP1(SEQ ID NO.120)。

根据特定的实施方式，根据本发明弱启动子独立地选自由以下组成的组：pURA3、pRPLA1、pNUP57和pGAP1。

如前所述，诱导型启动子或阻遏型启动子是其活性受生物因子或非生物因子的存在或不存在以及还有所述因子的量控制的启动子。因此，对于某些启动子，当给定因子的量增加或被增加时，其活性将特别被诱导并因此增加，并因此当所述因子的量减少或被减少时，这些相同启动子的活性可以被阻遏并因此降低。本领域技术人员可以决定并因此控制包含诱导型启动子或阻遏型启动子的本发明的重组酵母的培养基中所述一种或多种因子的量。

例如，增加包含pSAM4启动子的根据本发明的重组酵母的培养基中甲硫氨酸的量将诱导并因此增加在该启动子的控制下的基因的转录。相反，减少所述培养基中甲硫氨酸的量将导致在该启动子的控制下基因的转录受到阻遏并因此减少。

在另一个示例中，增加包含pCTR1启动子的根据本发明的重组酵母的培养基中铜的量将阻遏并因此减少在该启动子的控制下的基因的转录。相反，减少所述培养基中铜的量将导致在该启动子的控制下的该基因的转录被诱导并因此增加。

由于这个原因，以下启动子在本文中被称为“诱导型启动子或阻遏型启动子”。

根据第一实施方式，根据本发明的诱导型启动子或阻遏型启动子可以选自包括以下的组：用铜可诱导或可阻遏的启动子、用甲硫氨酸可诱导或可阻遏的启动子和用苏氨酸可诱导或可阻遏的启动子，并且特别选自由以下组成的组：

·pSAM4-甲硫氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.38)，

·pCUP1-1–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.39)，

·pCUP1.cgla–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.40)，

·pCUP1.sba–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.41)，

·pACU1–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.42)，

·pACU2–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.43)，

·pACU3p–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.44)，

·pACU4p–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.45)，

·pACU5–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.46)，

·pACU6–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.47)，

·pACU7–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.48)，

·pACU8–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.49)，

·pACU9–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.50)，

·pACU10p–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.51)，

·pACU11–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.52)，

·pACU12–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.53)，

·pACU13–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.54)，

·pACU14–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.55)，

·pACU15–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.56)，

·pGAL/CUP1p–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.57)，

·pCRS5–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.58)，和

·pCHA1–苏氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.59)。

根据该实施方式，根据本发明的诱导型启动子或阻遏型启动子可以特别地、独立地选自由以下组成的组：pSAM4、pCUP1-1、pCUP1.Cgla、pCUP1.Sba、pACU1、pACU2、pACU3p、pACU4p、pACU5、pACU6、pACU7、pACU8、pACU9、pACU10p、pACU11、pACU12、pACU13、pACU14、pACU15、pGAL/CUP1p、pCRS5和pCHA1。

因此，如上所指示，这些启动子的活性被甲硫氨酸、铜或苏氨酸的增加的存在所诱导，并且当甲硫氨酸、铜或苏氨酸的量减少时，它们的活性降低、即被阻遏。

根据第二实施方式，根据本发明的诱导型启动子或阻遏型启动子可以选自包括以下的组：用铜可诱导或可阻遏的启动子、用赖氨酸可诱导或可阻遏的启动子和用甲硫氨酸可诱导或可阻遏的启动子，并且特别选自由以下组成的组：

·pCTR1–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.60)，

·pCTR3–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.61)，

·pCUR1–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.62)，

·pCUR2–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.63)，

·pCUR3–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.64)，

·pCUR4–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.65)，

·pCUR5p–铜可诱导或可阻遏的(SEQ IDNO.66)，

·pCUR6–铜可诱导或可阻遏的(SEQ IDNO.67)，

·pCUR7–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.68)，

·pCUR8–铜可诱导或可阻遏的(SEQ IDNO.69)，

·pCUR9–铜可诱导或可阻遏的(SEQ IDNO.70)，

·pCUR10–铜可诱导或可阻遏的(SEQ IDNO.71)，

·pCUR11–铜可诱导或可阻遏的(SEQ IDNO.72)，

·pCUR12–铜可诱导或可阻遏的(SEQ IDNO.73)，

·pCUR13–铜可诱导或可阻遏的(SEQ IDNO.74)，

·pCUR14–铜可诱导或可阻遏的(SEQ IDNO.75)，

·pCUR15–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.76)，

·pCUR16–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.77)，

·pCUR17–铜可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.78)，

·pLYS1–赖氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.79)，

·pLYS4–赖氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ IDNO.80)，

·pLYS9–赖氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.81)，

·pLYR1p–赖氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.82)，

·pLYR2p–赖氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.83)，

·pLYR3p–赖氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.84)，

·pLYR4p–赖氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.85)，

·pLYR5p–赖氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.86)，

·pLYR6p–赖氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.87)，

·pLYR7p–赖氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.88)，

·pLYR8–赖氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.89)，

·pLYR9–赖氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.90)，

·pLYR10–赖氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.91)，

·pLYR11–赖氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.92)，

·pMET17–甲硫氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.93)，

·pMET6–甲硫氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.94)，

·pMET14–甲硫氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.95)，

·pMET3–甲硫氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.96)，

·pSAM1–甲硫氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.97)，

·pSAM2–甲硫氨酸可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.98)，

·pMDH2–葡萄糖可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.35)，

·pJEN1–葡萄糖可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.118)，

·pICL1–葡萄糖可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.119)，

·pADH2–葡萄糖可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.120)，和

·pMLS1–葡萄糖可诱导或可阻遏的(SEQ ID NO.121)。

根据该特定的实施方式，根据本发明的诱导型启动子或阻遏型启动子可以独立地选自由以下组成的组：pCTR1、pCTR3、pCUR1、pCUR2、pCUR3、pCUR4、pCUR5p、pCUR6、pCUR7、pCUR8、pCUR9、pCUR10、pCUR11、pCUR12、pCUR13、pCUR14、pCUR15、pCUR16、pCUR17、pLYS1、pLYS4、pLYS9、pLYR1p、pLYR2p、pLYR3p、pLYR4p、pLYR5p、pLYR6p、pLYR7p、pLYR8、pLYR9、pLYR10、pLYR11、pMET17、pMET6、pMET14、pMET3、pSAM1、pSAM2、pMDH2、pJEN1、pICL1、pADH2和pMLS1。

如上所指示，这些启动子的活性因此被甲硫氨酸、铜、赖氨酸或葡萄糖的增加的存在所阻遏，并且当甲硫氨酸、铜、赖氨酸或葡萄糖的量减少时，它们的活性增加、即被诱导。

在特定的实施方式中，根据本发明的诱导型启动子或阻遏型启动子可以选自包括以下的组：用铜可诱导或可阻遏的启动子、用葡萄糖可诱导或可阻遏的启动子、用赖氨酸可诱导或可阻遏的启动子、用甲硫氨酸可诱导或可阻遏的启动子和用苏氨酸可诱导或可阻遏的启动子。

在更特定的实施方式中，根据本发明的诱导型启动子或阻遏型启动子可以独立地选自由以下组成的组：pSAM4、pCUP1-1、pCUP1.Cgla、pCUP1.Sba、pACU1、pACU2、pACU3p、pACU4p、pACU5、pACU6、pACU7、pACU8、pACU9、pACU10p、pACU11、pACU12、pACU13、pACU14、pACU15、pGAL/CUP1p、pCRS5、pCHA1、pCTR1、pCTR3、pCUR1、pCUR2、pCUR3、pCUR4、pCUR5p、pCUR6、pCUR7、pCUR8、pCUR9、pCUR10、pCUR11、pCUR12、pCUR13、pCUR14、pCUR15、pCUR16、pCUR17、pLYS1、pLYS4、pLYS9、pLYR1p、pLYR2p、pLYR3p、pLYR4p、pLYR5p、pLYR6p、pLYR7p、pLYR8、pLYR9、pLYR10、pLYR11、pMET17、pMET6、pMET14、pMET3、pSAM1、pSAM2、pMDH2、pJEN1、pICL1、pADH2和pMLS1。

更特别地，所述启动子相同或不同，可以优选特征在于选自由以下组成的组的核酸序列：与SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:116至SEQ ID NO:121的序列具有至少80％的同一性的序列。

还可以使用如Blazeck&Alper(2013)Biotechnol.J.8 46-58所述的合成启动子。

本发明的强启动子、弱启动子和诱导型启动子或阻遏型启动子可以来源于来自任何酵母菌纲的生物体，并且特别是可以独立地来源于选自由以下组成的组的生物体：酿酒酵母、鲍氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)、芽殖酵母(Saccharomyces castelii)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、耐寒酵母(Saccharomyces arboricola)、库德里阿兹威酵母(Saccharomyces kudriavzevii)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、卡氏德巴利酵母(Debaryomycescastelii)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolitica)和杰丁塞伯林德纳氏酵母(Cyberlindnera jadinii)。

本发明的强启动子、弱启动子和诱导型启动子或阻遏型启动子可以优选来源于选自由以下组成的组的生物体：酿酒酵母、芽殖酵母、贝酵母、耐寒酵母、库德里阿兹威酵母和乳酸克鲁维酵母。

终止子

如在本文中公开，已经遗传工程化以用于获得根据本发明的重组酵母的感兴趣的基因的表达包括在酵母细胞(包括酿酒酵母)中有功能的适当的转录终止子序列。

所述转录终止子相同或不同，可以见于文献Yamanishi等人,(2013)ACSsynthetic biology 2,337-347。

在本发明中更特别感兴趣的终止子可以选自包括以下的组：

·来自编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶，同工酶2的基因的tTDH2(TDH2基因＝序列SEQID NO.99)，

·tCYC1(＝序列SEQ ID NO.100)，

·tTDH3(＝序列SEQ ID NO.101)，和

·来自编码醇脱氢酶的基因的tADH1(ADH1基因＝序列SEQ ID NO.102)，

·来自编码醇脱氢酶的基因的tADH2(ADH2基因＝序列SEQ IDNO.103)，

·来自编码磷酸丙糖异构酶的基因的tTPI1(TPI1基因＝序列SEQ ID NO.104)，

·来自编码O-乙酰高丝氨酸-O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶的基因的tMET17(Met17基因＝序列SEQ ID NO.105)，

·来自编码烯醇化酶II的基因的tENO2(ENO2基因＝序列SEQ ID NO.106)，

·tMET3(＝序列SEQ ID NO.107)，和

·来自编码3-磷酸甘油酸激酶的基因的tPGK1(PGK1基因＝序列SEQ ID NO.108)，

·tDIT1(＝序列SEQ ID NO.109)

·tRPL3(＝序列SEQ ID NO.110)

·tRPL41B(＝序列SEQ ID NO.111)

·tRPL15A(＝序列SEQ ID NO.112)

·tIDP1(＝序列SEQ ID NO.113)。

更具体地，所述相同或不同的终止子可以优选地特征在于选自由以下组成的组的核酸序列：与SEQ ID NO:99至SEQ ID NO:113的序列具有至少80％的同一性的序列。

重组酵母

通常，与细菌相比，酵母可以快速生长并且可以以更高的密度培养，并且在工业环境中不需要无菌环境。此外，与细菌细胞相比，酵母细胞可以更容易地从培养基中分离出来，从而大大简化了产物提取和纯化的过程。

优选地，本发明的酵母可以选自以下属：酵母属、假丝酵母属(Candida)阿舒囊霉属(Ashbya)、德克酵母属(Dekkera)、毕赤酵母属(Pichia)(汉逊酵母属(Hansenula))、德巴利酵母属(Debaryomyces)、棒孢酵母属(Clavispora)、洛德酵母(Lodderomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、接合酵母属(Zigosaccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酒香酵母属(Brettanomycces)、隐球菌属(Cryptococcus)或(Malassezia)。

更优选地，酵母可以是酵母属、德克酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、有孢圆酵母属/接合酵母属或酒香酵母属的克勒勃屈利(Crabtree)阳性酵母。

更优选地，酵母可以来自以下种：酿酒酵母、鲍氏酵母菌、道格拉氏酵母、巴氏酵母、拜耳接合酵母(Zigosaccharomyces bailii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、布鲁塞尔德克酵母(Dekkera brucelensis)、间型德克酵母(Dekkeraintermedia)、卡斯酒香酵母(Brettanomycces custersii)、间型酒香酵母(Brettanomycces intermedius)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces themotolerens)、球有孢圆酵母(Torulaspora globosa)或光滑有抱圆酵母(Torulaspora glabrata)。

更优选地，重组酵母可以属于酵母属，并且优选地属于酿酒酵母种。

如上所述，根据本发明的重组酵母具有被插入选自本说明书中公开的那些DNA构建体中的至少一种DNA构建体而减少的丙酮酸脱羧酶活性。

为将特异性的DNA构建体插入基因内而实施的方法属于本领域技术人员的常识。在下文的实施例中，更详细地描述了相关方法。

培养条件

本发明还涉及诸如以上定义的重组酵母用于产生依克多因的用途。

本发明还涉及产生依克多因的方法，其包括以下步骤：

-提供如前所述的重组微生物，在含有碳源的培养基中培养重组微生物，和

-回收依克多因。

通常，本发明的微生物在适当的培养基中在约20℃至约37℃范围内的温度下、优选在27℃至34℃范围内的温度下生长。

当根据本发明的重组酵母属于酿酒酵母种时，在适当的培养基中温度可以有利地在27℃至34℃的范围内。

适用于酵母的生长培养基是常见的商业制备培养基，诸如包含酵母氮基、硫酸铵和右旋糖作为碳源/能源的肉汤)或YPD培养基(用于生长最多的最佳比例的蛋白胨、酵母提取物和右旋糖的掺混物)。也可以使用其他限定的生长培养基或合成的生长培养基，并且微生物学或发酵科学领域的技术人员将知道用于特定微生物生长的适当培养基。

术语“适当的培养基”是上面定义的。

根据本发明的重组酵母的已知培养基的实例是本领域技术人员已知的，并在以下出版物D.Burke等人,Methods in yeast Genetics–A cold spring harbor laboratorycourse Manual(2000)中介绍。

适用于发酵的pH范围可以是pH 3.0至pH 7.5，其中优选pH 4.5至pH 6.5作为初始条件。

发酵可以在好氧条件或微好氧条件下进行。

发酵培养基中产物的量可以使用本领域已知的多种方法来确定，例如高效液相色谱(HPLC)或气相色谱(GC)。

本方法可以采用分批发酵方法。经典的分批发酵是封闭的系统，其中，培养基的组成在发酵开始时设置，并且在发酵期间不发生人为改变。因此，在发酵开始时，将培养基用所期望的一种或多种生物体接种，并允许在向系统中不添加任何物质的情况下进行发酵。通常，然而，“分批”发酵相对于碳源的添加是分批的，并且经常尝试控制诸如温度、pH和氧浓度的因素。在分批系统中，系统的代谢物和生物质组成在发酵停止之前一直在变化。在分批培养中，细胞通过静态滞后期进入高生长对数期，并最后进入静止期，在该静止期，生长速率降低或停止。如果不处理，固定相中的细胞将最终死亡。对数期的细胞通常负责最终产物或中间体的大量产生。

补料分批系统也可以用于本发明中。补料分批系统类似于典型的分批系统，不同之处在于，随着发酵的进行逐渐增加碳源底物。当分解代谢物阻遏(例如葡萄糖阻抑)易于抑制细胞的代谢并且希望在培养基中具有有限量的底物时，补料分批系统是有用的。在补料分批系统中，实际底物浓度的测量很困难，并因此根据可测量因素(诸如pH、溶解氧和废气、诸如CO2的分压)的变化进行估算。

发酵是本领域公知的，并且实例可以见于Sunderland等人,(1992)，其通过引用并入本文。尽管本发明以分批模式进行，但是可以预期该方法将适用于连续发酵。

连续发酵是一种开放系统，其中，将限定的发酵培养基连续添加至生物反应器，并同时去除等量的条件培养基以进行处理。连续发酵通常使培养物保持恒定的高密度，其中，细胞主要处于对数生长期。

连续发酵允许调控影响细胞生长或终产物浓度的一种因素或任何数量的因素。例如，一种方法将有限的营养素(诸如碳源)或氮水平维持在固定速率，并允许所有其他参数变化。在其他系统中，影响生长的许多因素可以连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持恒定。连续系统努力维持稳态生长条件，并因此必须将由于培养基被抽出而引起的细胞损失针对发酵中的细胞生长速率进行平衡。在工业微生物学领域中，为连续发酵过程调控营养素和生长因子的方法以及使产物形成速率最大化的技术是众所周知的。

预期可以使用分批过程、补料分批过程或连续过程来实施本发明，并且任何已知的发酵模式都是适合的。另外，考虑将细胞作为全细胞催化剂固定在底物上，并使其经受发酵条件进行生产。

为了进一步提高依克多因产生，特定的实施方式可以包括在诸如上述的适当的培养基中培养重组酵母细胞，其中，所述培养基包含最佳量的碳源、特别是葡萄糖。

优选地，仅在整个培养持续时间的一部分期间在此类最佳培养基中培养细胞。在一些实施方式中，在培养开始后10小时或更长时间(涵盖在培养开始后11小时、12小时、13小时、14小时、15小时或16小时或更长时间)，将酵母细胞孵育在所述最佳培养基中。

优选地，在培养开始后5小时至15小时(包括6小时至10小时，例如8小时)的时间段期间在此类最佳培养基中培养细胞。

在优选的实施方式中，所述最佳培养基中所含的碳源由葡萄糖组成。在优选的实施方式中，所述最佳培养基包含12％w/w或更多的葡萄糖，包括15％w/w或更多的葡萄糖。在优选的实施方式中，所述最佳培养基包含至多40％w/w的葡萄糖，其包含至多35％w/w的葡萄糖。

因此，在上述优选的实施方式中，根据本发明用于产生依克多因的方法还可以包括在步骤(a)和(c)之间的中间步骤(b)，该步骤(b)包括在所述最佳培养基中培养酵母细胞。

依克多因的纯化

根据本发明的特定方面，依克多因的发酵产生包括从培养基中分离依克多因的步骤。从培养基中回收依克多因是本领域技术人员的常规任务。这可以通过本领域中众所周知的许多技术来实现，包括但不限于蒸馏、气提、渗透蒸发、选择性沉淀或液相萃取。本领域的专家知道如何根据待分离材料的特性来调整每种技术的参数。

保留了本发明中作为微生物模型的酵母，因为合成的依克多因完全输出到细胞外，从而简化了纯化过程。

合成的依克多因可以通过蒸馏收集。蒸馏可以涉及不同于培养基的任选组分，以通过形成共沸物并且尤其是与水形成共沸物来促进依克多因分离。该任选组分是有机溶剂，诸如环己烷、戊烷、丁醇、苯、甲苯、三氯乙烯、辛烷、二乙醚或其混合物。

用选自氦、氩、二氧化碳、氢、氮或其混合物的汽提气体实现气提。

用有机溶剂作为疏水相(诸如戊烷、己烷、庚烷或十二烷)进行液相萃取。

除非另有说明，否则术语“在...与...之间”和“从...至...的范围”应理解为包括端点值。

下面的实施例和附图是通过举例说明的方式提出的，并不意味着对本发明的限制。

实施例

实施例1：用于制备根据本发明的重组酿酒酵母菌株的方案

下文实施的所有重组酿酒酵母菌株均使用标准酵母分子遗传学程序(D.Burke,D.Dawson的Methods in yeast Genetics–A cold spring harbor laboratory courseManual(2000),T.Stearns CSHL Press)从标准菌株构建而成。

利用酵母有效重组具有序列同源性的游离DNA末端的能力，将下述基因的簇一次整合在重组酵母中。

此外，为了更好地理解以下基因型：

-ade2、his3、leu2、trp1和ura3是营养缺陷型标志物基因。

-小写字母意指所考虑的基因无活性，大写字母表示活性基因。

-“::”：在基因名称后，意指该基因被随后的物质中断(如果插入了多于一个基因，则将其在方括号[]中注明)。基因的中断伴随着编码序列的整个缺失，但保留了启动子。结果，紧跟着“::”的基因是无活性的，并以小写字母表示。如果未指定，则插入的基因的转录由破坏的基因的启动子控制。

-“gene.Kl”意指该基因起源于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。

更特别地，要克隆的编码序列是人工合成的。对于异源序列(非酵母)，使用酵母密码子使用修饰了核酸序列，以获得同义编码序列。使用限制酶和经典克隆技术，将每个合成的序列克隆在转录启动子和转录终止子之间。每个启动子序列之前都有与上游基因终止子序列同源的50个至200个核苷酸序列。类似地，每个基因(包含启动子编码序列终止子的基因)的终止子后面有与紧跟的基因同源的序列。因此，每个待整合的单元都与上游单元和下游单元有50个至200个核苷酸的重叠。对于第一单元，启动子之前是与酵母染色体核苷酸在其将整合其中的基因座同源的50个至200个核苷酸。类似地，对于最后一个单元，终止子之后是与酵母染色体核苷酸在其将整合其中的基因座同源的50个至200个核苷酸。

然后从质粒构建体中PCR扩增每个单元，产生具有重叠序列的直链DNA的X单元。为了选择重组事件，该基因的至少一个是营养缺陷型标志物。所有直链片段都在酵母中一次转化，并选择重组酵母作为与所用标志物有关的营养缺陷型。然后通过PCR和测序验证序列的完整性。

实施例2：用于产生依克多因的比较性实施例

A.首先，获得了两种重组菌株：YA3370-20和YA3371-46。为了仅包含根据本发明的修饰的一部分，已经将这两种菌株重组。

因此，这两种菌株如下：

YA3370-20：adc2，can1：：[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-PPC-5.Ec-tTPI1]x4，his3：：[pACU5-HOM2-2-tRPL3-pTDH3-GDH-2.Eca-tIDP1]x4，hom6：：[URA3-pCCW12-ECTB.He-tIDP1]x5，leu2，lyp1：：[pPDC1-ECTA.He-tCYC1-pTDH3-ECTC.He-tTDH3]x2，pyk1：：[LEU2.K1-RS，pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1，pTEF3-AQR1-tRPL41B，pCUR3-PYK1-tPYK1]，sam3：：[pPDC1-METX.Cg-tRPL3-pTDH3-MHPF.ec-tIDP1]x2，trp1：：[pPDC1-PPC-5.Ec-tRPL3-pACU7-AK.Bs-tIDP1-TRP1]x6，ura3

YA3371-46：ade2，can1：：[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-PPC-5.Ec-tTPI1]x4，his3：：[pACU5-HOM2-2-tRPL3-pTDH3-GDH-2.Eca-tIDP1]x4，hom6：：[URA3-pCCW12-ECTB.He-tIDP1]x5，leu2，lyp1：：[pPDC1-ECTA.He-tCYC1-pTDH3-ECTC.He-tTDH3]x2，pyk1：：[LEU2.K1-RS，pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1，pTEF3-AQR1-tRPL41B，pCUR3-PYK1-tPYK1]，sam3：：[pCCW12-ECTB.Pa-tRPL3-pTDH3-MHPF.Ec-tRPL41B]x4，trp1：：[pPDC1-PPC-5.Ec-tRPL3-pACU7-AK.Bs-tIDP1-TRP1]x6，ura3

PEPCK-1是通过用甘氨酸修饰位置2中的精氨酸氨基酸来稳定的PEPCK形式。

PPC-5是更稳定的PPC形式，其中，在N+1中添加了丙氨酸。

所有这些菌株均在2％YE(酵母提取物)和8％葡萄糖中生长24小时，并在8小时后添加500μM CuSO₄。24小时后，如制造商的建议，使用来自Waters的AccQ-Tag UltraDerivatization试剂盒，使用用于氨基酸测定的AccQ-Tag前置柱衍生化方法测定培养基中的依克多因含量。

用这些不同菌株获得的依克多因量分别为：

-YA3370-20：1g/L^-1。

-YA3371-46：1.55g/L^-1。

相比之下，天然菌株不产生依克多因。

由该对比实验得出的是，当在与不包含根据本发明的所有遗传修饰的其他重组菌株相同的条件下培养时，包含根据本发明的修饰的重组菌株产生更大量的依克多因。

B.还获得了其他五种重组菌株：YA3380-40B、YA3595-25和YA3595-34。

这三种菌株如下：

YA3380-40B：gnp1：：[LEU2.K1-RS，pADH1-AAT2-tRPL15A，pTEF3-MDH3-1-tRPL3，pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET25，pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1，pCCW12-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1，pCCW12-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1，pCCW12-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1，pCCW12-ME3.At-tRPL3]，his3：：[pACU5-ME3.At-tRPL3-pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x11，hom6：：[TRP1.K1，pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1]，leu2，mup3：：[HIS5.Sp，pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3，pCCW12-HOM2-1-tTDH3，pPGK1-AAT2-tTDH2，pENO2-MDH3-1-tRPL15A，pCUP1-1-GDH-2.Eca-tTPI1，pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1，pPDC1-ECTA.He-tRPL41B，pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A]，pyk1：：[LEU2.K1，pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1，pPDC1-MDH3-1-tRPL15A，pTEF3-TPO1-tENO2，pCUR3-PYK1-7-tCYC1]，trp1，ura3

YA3595-25：ade2，gnp1：：[LEU2.K1-RS，pADH1-AAT2-tRPL15A，pTEF3-MDH3-1-tRPL3，pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET25，pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1，pCCW12-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1，pCCW12-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1，pCCW12-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1，pCCW12-ME3.At-tRPL3]，his3，hom6：：[TRP1.K1，pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1]，leu2，mup3：：[HIS5.Sp，pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3，pCCW12-HOM2-1-tTDH3，pPGK1-AAT2-tTDH2，pENO2-MDH3-1-tRPL15A，pCUP1-1-GDH-2.Eca-tTPI1，pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1，pPDC1-ECTA.He-tRPL41B，pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A]，pyk1：：[LEU2.K1，pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1，pPDC1-MDH3-1-tRPL15A，pTEF3-TPO1-tENO2，pCUR3-PYK1-7-tCYC1]，sam3：：[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tDIT1]x7，trp1，ura3：：[pCCW12-ECTB.Ab-tRPL3-pTDH3-ECTC.He-tRPL41B.Sba]x14

YA3595-34：ade2，gnp1：：[LEU2.K1-RS，pADH1-AAT2-tRPL15A，pTEF3-MDH3-1-tRPL3，pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET25，pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1，pCCW12-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1，pCCW12-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1，pCCW12-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1，pCCW12-ME3.At-tRPL3]，his3，hom6：：[TRP1.K1，pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1]，leu2，mup3：：[HIS5.Sp，pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3，pCCW12-HOM2-1-tTDH3，pPGK1-AAT2-tTDH2，pENO2-MDH3-1-tRPL15A，pCUP1-1-GDH-2.Eca-tTPI1，pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1，pPDC1-ECTA.He-tRPL41B，pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A]，pyk1：：[LEU2.K1，PTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1，pPDC1-MDH3-1-tRPL15A，pTEF3-TPO1-tENO2，pCUR3-PYK1-7-tCYC1]，sam3：：[PACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tDIT1]x7，trp1，ura3：：[pCCW12-ECTB.Ab-tRPL3-pTDH3-ECTC.He-tRPL41B.Sba]x9

将菌株YA3380-40B和YA3595-25在YPA培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、0.01％半硫酸腺嘌呤)、葡萄糖8％、(NH₄)₂SO₄ 50mM和甲硫氨酸0.5mM和苏氨酸0.85mM中生长24小时。24小时后，如制造商的建议，使用来自Waters的AccQ-Tag Ultra Derivatization试剂盒，使用用于氨基酸测定的AccQ-Tag前置柱衍生化方法测定培养基中的依克多因含量。

用这两种菌株获得的依克多因量分别为：

-YA3380-40B：211mg/L^-1。

-YA3595-25：1.29g/L^-1。

相比之下，天然菌株不产生依克多因。

将菌株YA3595-34以及菌株YA3595-25在YPA培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、0.01％半硫酸腺嘌呤)、蔗糖8％、(NH₄)₂SO₄ 50mM和甲硫氨酸0.5mM和苏氨酸0.85mM中生长24小时。24小时后，如制造商的建议，使用来自Waters的AccQ-Tag Ultra Derivatization试剂盒，使用用于氨基酸测定的AccQ-Tag前置柱衍生化方法测定培养基中的依克多因含量。

用这两种菌株获得的依克多因量分别为：

-YA3595-25：2.63g/L^-1。

-YA3595-34：2.58g/L^-1。

相比之下，天然菌株不产生依克多因。

C.还获得了其他三种重组菌株：YA4440、YA4442和YA4444。

这三种菌株如下：

YA4440：MAT-α，gnp1：：[LEU2.K1-RS，pADH1-AAT2-tRPL15A，pTEF3-MDH3-1-tRPL3，pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17，pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1，pCCWI2-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tIDPI，pCCW12-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1，pCCW12-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1，pCCW12-ME3.At-tRPL3]，his3：：[HIS3-pACU5-ME3.At-tRPL3，pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x5，hom6：：[TRP1.K1-RS，pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1]，leu2，lys2Δ201，mup3：：[HIS5.sp-RS，pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3，pCCW12-HOM2-1-tTDH3，pPGK1-AAT2-tTDH2，pENO2-MDH3-1-tRPL15A，pCUP1-1-GDH-21.Eca-tTPI1，pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1，pPDC1-ECTA.He-tRPL41B，pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A]，pyk1：：[LEU2.K1-RS，pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1，pPDC1-MDH3-1-tRPL15A，pTEF3-TPO1-tENO2，pCUR3-PYK1-7-tCYC1]，sam3：：[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3，pCUP1-1-HOM3-tDIT1-sam3]x5，trp1，trp4：：[LYS2-loxP，pCCW12-PEPCK-1.Ec-tTPI1，pCCW12-GDH2-tRPL3，pCCW12-METX-1.Cg-tRPL41B.Sba，pCCW12.Sba-HOM3-tRPL15A]，ura3：：[ECTB.Ab-ECTC.He-URA3]x7

YA4442：MAT-α，gnp1：：[LEU2.K1-RS，pADH1-AAT2-tRPL15A，pTEF3-MDH3-1-tRPL3，pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17，pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1，pCCW12-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1，pCCW12-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1，pCCW12-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1，pCCW12-ME3.At-tRPL3]，his3：：[HIS3-pACU5-ME3.At-tRPL3，pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x5，hom6：：[TRP1.K1-RS，pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1]，Icu2，Iys2Δ201，mup3：：[HIS5.sp-RS，pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3，pCCW12-HOM2-1-tTDH3，pPGK1-AAT2-tTDH2，pENO2-MDH3-1-tRPL15A，pCUP1-1-GDH-21.Eca-tTPI1，pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1，pPDC1-ECTA.He-tRPL41B，pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A]，pyk1：：[LEU2.K1-RS，pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1，pPDC1-MDH3-1-tRPL15A，pTEF3-TPO1-tENO2，pCUR3-PYK1-7-tCYC1]，sam3：：[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3，pCUP1-1-HOM3-tDIT1-sam3]x5，trp1，trp4：：[LYS2-loxP，pCCW12-PEPCK-1.Ec-tTPI1，pCCW12-GDH1-tRPL3，pCCW12-METX-1.Cg-tRPL41B.Sba，pCCW12.Sba-HOM3-tRPL15A]，ura3：：[ECTB.Ab-ECTC.Hc-URA3]x7

YA4444：MAT-α，gnp1：：[LEU2.K1-RS，pADH1-AAT2-tRPL15A，pTEF3-MDH3-1-tRPL3，pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17，pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1，pCCW12-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1，pCCW12-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1，pCCW12-ME3.At-tRPL3，pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1，pCCW12-ME3.At-tRPL3]，his3：：[HIS3-pACU5-ME3.At-tRPL3，pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x5，hom6：：[TRP1.K1-RS，pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1]，leu2，lys2Δ201，mup3：：[HIS5.sp-RS，pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3，pCCW12-HOM2-1-tTDH3，pPGK1-AAT2-tTDH2，pENO2-MDH3-1-tRPL15A，pCUP1-1-GDH-21.Eca-tTPI1，pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1，pPDC1-ECTA.Hc-tRPL41B，pTEF1.Sba-ECTC.Hc-tRPL15A]，pyk1：：[LEU2.K1-RS，pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1，pPDC1-MDH3-1-tRPL15A，pTEF3-TPO1-tENO2，pCUR3-PYK1-7-tCYC1]，sam3：：[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3，pCUP1-1-HOM3-tDIT1-sam3[x5，trp1，trp4：：[LYS2-loxP，pCCW12-PEPCK-1.Ec-tTPI1，pCCW12-GDH2.Eca-tRPL3，pCCW12-METX-1.Cg-tRPL41B.Sba，pCCW12.Sba-HOM3-tRPL15A]，ura3：：[ECTB.Ab-ECTC.He-URA3]x7

GDH1和GDH2是内源性酿酒酵母酶，而GDH2.Eca是来自尾状线虫(Entodimiumcaudatum)的GDH酶。

将这些菌株在28℃下在锥形瓶中于酵母提取物2％、蔗糖8％、甲硫氨酸0.5mM、苏氨酸4.2mM、尿素50mM、维生素B5 4μM、维生素B1 6μM、维生素B6 10μM、维生素B10 1.5μM、维生素B3 2.9μM、维生素B2 0.5μM、维生素B8 0.08μM、维生素B9 4.5nM，CuSO4 500μM中生长16小时。16小时后，添加500μM CuSO4和尿素100mM，并将培养物再生长8小时。

然后基本上按照Ono H，等人(1999)Journal of Bacteriology，第91-99页中所述评价依克多因产生，不同之处在于用HPLC-UV检测依克多因。

在这些条件下，YA4440产生6.4g/l依克多因，YA4442产生4.7g/l依克多因，并且YA4444产生6.1g/l依克多因。需要提醒的是，在这些相同条件下，野生型菌株(例如非重组)不产生可检测量的依克多因。

这三种菌株是相同的，但是GDH酶过表达。以上结果表明，NADH依赖性GDH(YA4440中的GDH2和YA4444中的GDH2.Eca)的过表达允许比NADPH依赖性GDH(YA4442中的GDH1)的过表达产生更多的依克多因。

因此，与NADPH依赖性谷氨酸脱氢酶(GDH1)的过表达相比，NADH依赖性谷氨酸脱氢酶的过表达允许产生更多的依克多因。

序列表

<110> 阿尔德里斯公司

<120> 产依克多因酵母

<130> PR75767

<150> EP17305910

<151> 2017-07-11

<160> 121

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 1583

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> 天冬氨酸激酶 (HOM3)

<220>

<223> 天冬氨酸激酶 (HOM3)

<400> 1

atgccaatgg atttccaacc tacatcaagt cattcgaact gggtcgtgca aaagttcggt 60

ggtacatctg tcggtaaatt tcccgtccaa atagtggatg acattgtgaa gcactattct 120

aaacctgacg gcccaaacaa taatgtcgct gtcgtttgtt ccgcccgttc ttcatacacc 180

aaggctgaag gtaccacttc tcgtcttttg aaatgttgtg atttggcttc gcaagaatct 240

gaatttcaag acattatcga agttatcaga caagaccata tcgataatgc cgaccgcttc 300

attctcaatc ctgccttgca agccaagtta gtggatgata ccaataaaga acttgaactg 360

gtcaagaaat atttaaatgc ttcaaaagtt ttgggtgaag tgagttcacg tacagtagat 420

ctggtgatgt catgtggtga gaagttgagt tgtttgttca tgactgcttt atgtaatgac 480

cgtggctgta aggccaaata tgtggatttg agccacattg ttccctctga tttcagtgcc 540

agcgctttgg ataacagttt ctacactttc ctggttcaag cattgaaaga aaaattggcc 600

ccctttgtaa gtgctaaaga gcgtatcgtt ccagtcttta cagggttttt tggtttagtt 660

ccaactggtc ttctgaatgg tgttggtcgt ggctataccg atttatgtgc cgctttgata 720

gcagttgctg taaatgctga tgaactacaa gtttggaagg aagttgatgg tatatttact 780

gctgatcctc gtaaggttcc tgaagcacgt ttgctagaca gtgttactcc agaagaagct 840

tctgaattaa catattatgg ttccgaagtt atacatcctt ttacgatgga acaagttatt 900

agggctaaga ttcctattag aatcaagaat gttcaaaatc cattaggtaa cggtaccatt 960

atctacccag ataatgtagc aaagaagggt gaatctactc caccacatcc tcctgagaac 1020

ttatcctcat ctttctatga aaagagaaag agaggtgcca ctgctatcac caccaaaaat 1080

gacattttcg tcatcaacat tcattccaat aagaaaaccc tatcccatgg tttcctagct 1140

caaatattta ccatcctgga taagtacaag ttagtcgtag atttaatatc tacttctgaa 1200

gttcatgttt cgatggcttt gcccattcca gatgcagact cattaaaatc tctgagacaa 1260

gctgaggaaa aattgagaat tttaggttct gttgatatca caaagaagtt gtctattgtt 1320

tcattagttg gtaaacatat gaaacaatac atcggcattg ctggtaccat gtttactact 1380

cttgctgaag aaggcatcaa cattgaaatg atttctcaag gggcaaatga aataaacata 1440

tcctgcgtta tcaatgaatc tgactccata aaagcgctac aatgtattca tgccaagtta 1500

ctaagtgagc ggacaaatac ttcaaaccaa tttgaacatg ccattgatga acgtttagaa 1560

caattgaaaa gacttggaat taa 1583

<210> 2

<211> 526

<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> 天冬氨酸激酶 (HOM3)

<220>

<223> 天冬氨酸激酶 (HOM3)

<400> 2

Pro Met Asp Phe Gln Pro Thr Ser Ser His Ser Asn Trp Val Val Gln

1 5 10 15

Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Gly Lys Phe Pro Val Gln Ile Val Asp

20 25 30

Asp Ile Val Lys His Tyr Ser Lys Pro Asp Gly Pro Asn Asn Asn Val

35 40 45

Ala Val Val Cys Ser Ala Arg Ser Ser Tyr Thr Lys Ala Glu Gly Thr

50 55 60

Thr Ser Arg Leu Leu Lys Cys Cys Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ser Glu

65 70 75 80

Phe Gln Asp Ile Ile Glu Val Ile Arg Gln Asp His Ile Asp Asn Ala

85 90 95

Asp Arg Phe Ile Leu Asn Pro Ala Leu Gln Ala Lys Leu Val Asp Asp

100 105 110

Thr Asn Lys Glu Leu Glu Leu Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ala Ser Lys

115 120 125

Val Leu Gly Glu Val Ser Ser Arg Thr Val Asp Leu Val Met Ser Cys

130 135 140

Gly Glu Lys Leu Ser Cys Leu Phe Met Thr Ala Leu Cys Asn Asp Arg

145 150 155 160

Gly Cys Lys Ala Lys Tyr Val Asp Leu Ser His Ile Val Pro Ser Asp

165 170 175

Phe Ser Ala Ser Ala Leu Asp Asn Ser Phe Tyr Thr Phe Leu Val Gln

180 185 190

Ala Leu Lys Glu Lys Leu Ala Pro Phe Val Ser Ala Lys Glu Arg Ile

195 200 205

Val Pro Val Phe Thr Gly Phe Phe Gly Leu Val Pro Thr Gly Leu Leu

210 215 220

Asn Gly Val Gly Arg Gly Tyr Thr Asp Leu Cys Ala Ala Leu Ile Ala

225 230 235 240

Val Ala Val Asn Ala Asp Glu Leu Gln Val Trp Lys Glu Val Asp Gly

245 250 255

Ile Phe Thr Ala Asp Pro Arg Lys Val Pro Glu Ala Arg Leu Leu Asp

260 265 270

Ser Val Thr Pro Glu Glu Ala Ser Glu Leu Thr Tyr Tyr Gly Ser Glu

275 280 285

Val Ile His Pro Phe Thr Met Glu Gln Val Ile Arg Ala Lys Ile Pro

290 295 300

Ile Arg Ile Lys Asn Val Gln Asn Pro Leu Gly Asn Gly Thr Ile Ile

305 310 315 320

Tyr Pro Asp Asn Val Ala Lys Lys Gly Glu Ser Thr Pro Pro His Pro

325 330 335

Pro Glu Asn Leu Ser Ser Ser Phe Tyr Glu Lys Arg Lys Arg Gly Ala

340 345 350

Thr Ala Ile Thr Thr Lys Asn Asp Ile Phe Val Ile Asn Ile His Ser

355 360 365

Asn Lys Lys Thr Leu Ser His Gly Phe Leu Ala Gln Ile Phe Thr Ile

370 375 380

Leu Asp Lys Tyr Lys Leu Val Val Asp Leu Ile Ser Thr Ser Glu Val

385 390 395 400

His Val Ser Met Ala Leu Pro Ile Pro Asp Ala Asp Ser Leu Lys Ser

405 410 415

Leu Arg Gln Ala Glu Glu Lys Leu Arg Ile Leu Gly Ser Val Asp Ile

420 425 430

Thr Lys Lys Leu Ser Ile Val Ser Leu Val Gly Lys His Met Lys Gln

435 440 445

Tyr Ile Gly Ile Ala Gly Thr Met Phe Thr Thr Leu Ala Glu Glu Gly

450 455 460

Ile Asn Ile Glu Met Ile Ser Gln Gly Ala Asn Glu Ile Asn Ile Ser

465 470 475 480

Cys Val Ile Asn Glu Ser Asp Ser Ile Lys Ala Leu Gln Cys Ile His

485 490 495

Ala Lys Leu Leu Ser Glu Arg Thr Asn Thr Ser Asn Gln Phe Glu His

500 505 510

Ala Ile Asp Glu Arg Leu Glu Gln Leu Lys Arg Leu Gly Ile

515 520 525

<210> 3

<211> 1215

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

<220>

<223> 天冬氨酸激酶 (AK)

<220>

<223> 天冬氨酸激酶 (AK)

<400> 3

atggctatta tcgtccaaaa attcggagga actagcgtta aggatgacaa agggagaaag 60

ttggccttag ggcacattaa ggaggcaatt tcagagggtt ataaggtggt tgtagttgta 120

tcggctatgg gtagaaaagg ggacccctac gcgacggact cactattggg tttactttac 180

ggggatcaat cagcaatcag cccaagagag caggatctgc tgctatcatg tggagaaacc 240

atatcctcgg ttgtgttcac cagcatgtta ttagataatg gagtaaaagc agcagccctg 300

acgggagccc aggctggttt tttaaccaac gatcagcata ctaatgcaaa aattatagag 360

atgaagcctg aacgtctttt cagtgttctt gcaaaccacg acgcagttgt cgtcgctgga 420

tttcagggcg ctaccgagaa aggagatact accacaatcg gtagaggtgg ctcggacacg 480

tcagctgcag ccctaggtgc tgctgttgat gcagagtaca tagatatctt tactgacgta 540

gaaggggtga tgaccgcaga tccaagagta gtagaaaatg caaagccact accagtggta 600

acttataccg aaatctgcaa cttggcttac caaggtgcta aggtaatatc tccaagagct 660

gtggaaattg ctatgcaagc aaaggttcct atccgtgtta ggagtactta ttcaaacgat 720

aaaggtacgt tagtaactag tcatcatagt tccaaagttg gctctgacgt ctttgaaagg 780

ttaatcactg gtatcgcaca tgttaaagac gtcactcaat tcaaggtccc ggcgaaaata 840

ggtcaatata acgttcaaac agaagtgttt aaagcgatgg cgaatgccgg tatatctgtc 900

gatttcttta atattacacc ctctgaaata gtatatacag tcgcgggtaa taagactgaa 960

acagctcaaa ggattttgat ggatatgggc tatgatccta tggtcacaag aaattgtgcc 1020

aaggtgtctg ccgtgggtgc tggcattatg ggtgtcccag gtgtgacatc gaaaattgtt 1080

tctgccttat ctgaaaaaga aattccgatt ttgcaatctg ctgattccca tacaacaatt 1140

tgggttttgg ttcatgaagc cgatatggtt cctgctgtta atgccttgca cgaagttttt 1200

gaattgtcca aataa 1215

<210> 4

<211> 404

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌

<220>

<223> 天冬氨酸激酶 (AK)

<220>

<223> 天冬氨酸激酶 (AK)

<400> 4

Met Ala Ile Ile Val Gln Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Lys Asp Asp

1 5 10 15

Lys Gly Arg Lys Leu Ala Leu Gly His Ile Lys Glu Ala Ile Ser Glu

20 25 30

Gly Tyr Lys Val Val Val Val Val Ser Ala Met Gly Arg Lys Gly Asp

35 40 45

Pro Tyr Ala Thr Asp Ser Leu Leu Gly Leu Leu Tyr Gly Asp Gln Ser

50 55 60

Ala Ile Ser Pro Arg Glu Gln Asp Leu Leu Leu Ser Cys Gly Glu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Val Phe Thr Ser Met Leu Leu Asp Asn Gly Val Lys

85 90 95

Ala Ala Ala Leu Thr Gly Ala Gln Ala Gly Phe Leu Thr Asn Asp Gln

100 105 110

His Thr Asn Ala Lys Ile Ile Glu Met Lys Pro Glu Arg Leu Phe Ser

115 120 125

Val Leu Ala Asn His Asp Ala Val Val Val Ala Gly Phe Gln Gly Ala

130 135 140

Thr Glu Lys Gly Asp Thr Thr Thr Ile Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr

145 150 155 160

Ser Ala Ala Ala Leu Gly Ala Ala Val Asp Ala Glu Tyr Ile Asp Ile

165 170 175

Phe Thr Asp Val Glu Gly Val Met Thr Ala Asp Pro Arg Val Val Glu

180 185 190

Asn Ala Lys Pro Leu Pro Val Val Thr Tyr Thr Glu Ile Cys Asn Leu

195 200 205

Ala Tyr Gln Gly Ala Lys Val Ile Ser Pro Arg Ala Val Glu Ile Ala

210 215 220

Met Gln Ala Lys Val Pro Ile Arg Val Arg Ser Thr Tyr Ser Asn Asp

225 230 235 240

Lys Gly Thr Leu Val Thr Ser His His Ser Ser Lys Val Gly Ser Asp

245 250 255

Val Phe Glu Arg Leu Ile Thr Gly Ile Ala His Val Lys Asp Val Thr

260 265 270

Gln Phe Lys Val Pro Ala Lys Ile Gly Gln Tyr Asn Val Gln Thr Glu

275 280 285

Val Phe Lys Ala Met Ala Asn Ala Gly Ile Ser Val Asp Phe Phe Asn

290 295 300

Ile Thr Pro Ser Glu Ile Val Tyr Thr Val Ala Gly Asn Lys Thr Glu

305 310 315 320

Thr Ala Gln Arg Ile Leu Met Asp Met Gly Tyr Asp Pro Met Val Thr

325 330 335

Arg Asn Cys Ala Lys Val Ser Ala Val Gly Ala Gly Ile Met Gly Val

340 345 350

Pro Gly Val Thr Ser Lys Ile Val Ser Ala Leu Ser Glu Lys Glu Ile

355 360 365

Pro Ile Leu Gln Ser Ala Asp Ser His Thr Thr Ile Trp Val Leu Val

370 375 380

His Glu Ala Asp Met Val Pro Ala Val Asn Ala Leu His Glu Val Phe

385 390 395 400

Glu Leu Ser Lys

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<211> 1098

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> 天冬氨酸半醛脱氢酶 (HOM2)

<220>

<223> 天冬氨酸半醛脱氢酶 (HOM2)

<400> 5

atggctggaa agaaaattgc tggtgttttg ggtgctactg gttccgttgg tcaacgtttc 60

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<211> 1098

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> 天冬氨酸半醛脱氢酶 (HOM2)

<220>

<223> 天冬氨酸半醛脱氢酶 (HOM2)

<400> 6

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<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> 天冬氨酸半醛脱氢酶 (HOM2)

<220>

<223> 天冬氨酸半醛脱氢酶 (HOM2)

<400> 7

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85 90 95

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Leu Val Ala Pro Leu Lys Pro Leu Ile Glu Lys Phe Gly Pro Ile Asp

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Pro Gly Val Pro Gly Ile Asp Ile Leu Asp Asn Ile Ile Pro Tyr Ile

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<210> 8

<211> 1413

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌

<220>

<223> 二氨基丁酸氨基转移酶 (EctB)

<220>

<223> 二氨基丁酸氨基转移酶 (EctB)

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<212> DNA

<213> 伸长盐单胞菌

<220>

<223> 二氨基丁酸氨基转移酶 (EctB)

<220>

<223> 二氨基丁酸氨基转移酶 (EctB)

<400> 9

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<212> PRT

<213> 铜绿假单胞菌

<220>

<223> 二氨基丁酸氨基转移酶 (EctB)

<220>

<223> 二氨基丁酸氨基转移酶 (EctB)

<400> 10

Met Ala His Val Ala Thr Ser Val Ile Glu Asp Gln Pro Leu Arg Ala

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Thr Pro Ala Glu Gly Glu Thr Leu Tyr Glu Phe Ser Gln Ser Pro Leu

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Arg Ile Pro Leu Ala Leu Lys Lys Ala Arg Gly Leu Leu Val Glu Asp

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85 90 95

Leu Ala Asp Glu Leu Pro Leu His Thr Leu Asp Leu Thr Thr Pro Val

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Ala Ala Glu Ala Lys Ile Gln Phe Cys Gly Pro Thr Gly Thr Asp Ala

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Val Glu Ala Ala Leu Lys Leu Val Arg Thr Ala Thr Gly Arg Ser Thr

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Ile Leu Ser Phe Gln Gly Gly Tyr His Gly Met Ser Gln Gly Ala Leu

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Gly Leu Met Gly Asn Leu Gly Pro Lys Lys Pro Leu Gly Ala Val Leu

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Ser Thr Gly Val Gln Phe Leu Pro Tyr Pro Tyr Asp Tyr Arg Cys Pro

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Glu Asn Leu Leu Asn Asp Pro Glu Gly Gly Val Gln Leu Pro Ala Ala

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Val Ile Val Glu Val Val Gln Gly Glu Gly Gly Val Val Pro Ala Asp

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Leu Asp Trp Leu Arg Gly Leu Arg Arg Ile Thr Glu Gln Ala Gly Val

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Ala Leu Ile Val Asp Glu Ile Gln Ser Gly Phe Ala Arg Thr Gly Arg

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Met Phe Ala Phe Glu His Ala Gly Ile Val Pro Asp Val Val Val Leu

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Ser Lys Ala Ile Gly Gly Ser Leu Pro Leu Ala Val Val Val Tyr Arg

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Ser Arg Val Gln Arg Glu Cys Leu Arg Arg Gly Leu Ile Leu Glu Leu

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Gly Gly Arg His Gly Ser Val Val Arg Phe Leu Pro Pro Leu Ile Ile

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<210> 11

<211> 421

<212> PRT

<213> 伸长盐单胞菌

<220>

<223> 二氨基丁酸氨基转移酶 (EctB)

<220>

<223> 二氨基丁酸氨基转移酶 (EctB)

<400> 11

Met Gln Thr Gln Ile Leu Glu Arg Met Glu Ser Asp Val Arg Thr Tyr

1 5 10 15

Ser Arg Ser Phe Pro Val Val Phe Thr Lys Ala Arg Asn Ala Arg Leu

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Thr Asp Glu Glu Gly Arg Glu Tyr Ile Asp Phe Leu Ala Gly Ala Gly

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Ala Leu Ala Thr Thr Gly Asn Arg Lys Phe Arg Glu Ala Thr Gly Gly

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Val Pro Thr Gln Ala Ala Ser Phe Met Pro Phe Asp Gly Tyr Leu Gly

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Ser Ser Thr Asp Thr Leu Asp Tyr Phe Glu Lys Leu Leu Gly Asp Lys

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Gly Glu Gly Gly Ile Asn Val Ala Gly Leu Glu Trp Leu Lys Arg Leu

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Lys Pro Gly Gln Tyr Asn Gly Thr Phe Arg Gly Phe Asn Leu Ala Phe

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<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> 高丝氨酸 O-乙酰转移酶 (MET2; METX)

<220>

<223> 高丝氨酸 O-乙酰转移酶 (MET2; METX)

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gaggctcaaa gacaatcgat ttactcagat cccaactact tggacgggta ctatccggta 660

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aaagctcaaa gggaggagac acgcaaacca tctactgtca gcgaacactc cctacaaatc 840

cacaatgatg ggtataaaac aaaagccagc actgccatcg ctggcatttc tgggcaaaaa 900

ggtcaaagcg tggtgtccac cgcatcttct tcggattcat tgaattcttc aacatcgatg 960

acttcggtaa gttctgtaac gggtgaagtg aaggacataa agcctgcgca gacgtatttt 1020

tctgcacaaa gttacttgag gtaccagggc acaaagttca tcaataggtt cgacgccaat 1080

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gatggactgt tcacatattc agaacaagaa tttttggctg agcacatacc gaagtcgcaa 1260

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<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> 高丝氨酸 O-乙酰转移酶 (MET2; METX)

<220>

<223> 高丝氨酸 O-乙酰转移酶 (MET2; METX)

<400> 13

Met Ser His Thr Leu Lys Ser Lys Thr Leu Gln Glu Leu Asp Ile Glu

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Glu Ile Lys Glu Thr Asn Pro Leu Leu Lys Leu Val Gln Gly Gln Arg

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Gly Ser Met Gly Gly Met Leu Ser Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Gly

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Ser Ala Trp Cys Ile Ser Trp Ser Glu Ala Gln Arg Gln Ser Ile Tyr

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Ser Asp Pro Asn Tyr Leu Asp Gly Tyr Tyr Pro Val Glu Glu Gln Pro

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Val Ala Gly Leu Ser Ala Ala Arg Met Ser Ala Leu Leu Thr Tyr Arg

225 230 235 240

Thr Arg Asn Ser Phe Glu Asn Lys Phe Ser Arg Arg Ser Pro Ser Ile

245 250 255

Ala Gln Gln Gln Lys Ala Gln Arg Glu Glu Thr Arg Lys Pro Ser Thr

260 265 270

Val Ser Glu His Ser Leu Gln Ile His Asn Asp Gly Tyr Lys Thr Lys

275 280 285

Ala Ser Thr Ala Ile Ala Gly Ile Ser Gly Gln Lys Gly Gln Ser Val

290 295 300

Val Ser Thr Ala Ser Ser Ser Asp Ser Leu Asn Ser Ser Thr Ser Met

305 310 315 320

Thr Ser Val Ser Ser Val Thr Gly Glu Val Lys Asp Ile Lys Pro Ala

325 330 335

Gln Thr Tyr Phe Ser Ala Gln Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Gly Thr Lys

340 345 350

Phe Ile Asn Arg Phe Asp Ala Asn Cys Tyr Ile Ala Ile Thr Arg Lys

355 360 365

Leu Asp Thr His Asp Leu Ala Arg Asp Arg Val Asp Asp Ile Thr Glu

370 375 380

Val Leu Ser Thr Ile Gln Gln Pro Ser Leu Ile Ile Gly Ile Gln Ser

385 390 395 400

Asp Gly Leu Phe Thr Tyr Ser Glu Gln Glu Phe Leu Ala Glu His Ile

405 410 415

Pro Lys Ser Gln Leu Glu Lys Ile Glu Ser Pro Glu Gly His Asp Ala

420 425 430

Phe Leu Leu Glu Phe Lys Leu Ile Asn Lys Leu Ile Val Gln Phe Leu

435 440 445

Lys Thr Asn Cys Lys Ala Ile Thr Asp Ala Ala Pro Arg Ala Trp Gly

450 455 460

Gly Asp Val Gly Asn Asp Glu Thr Lys Thr Ser Val Phe Gly Glu Ala

465 470 475 480

Glu Glu Val Thr Asn Trp

485

<210> 14

<211> 579

<212> DNA

<213> 伸长盐单胞菌

<220>

<223> 酸乙酰转移酶 (EctA)

<220>

<223> 酸乙酰转移酶 (EctA)

<400> 14

atgactccca caacagaaaa ttttactcct agtgcagatc tggctcgccc ttcagtggct 60

gacaccgtta ttggctccgc caagaaaaca ctattcatca gaaagcctac cacggacgat 120

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gcttacttat tattagccac gcaatttagg gatacgtgtg ctgtcgctac cgacgaggaa 240

ggggagatcg ttggctttgt atcaggatac gttaagcgta acgcacctga tacctatttt 300

ctatggcaag ttgctgtggg cgaaaaggct cgtgggacgg gtcttgcaag aagattagtc 360

gaagccgtat tgatgagacc aggtatggga gatgtccggc acctggagac taccataact 420

cctgataacg aagcaagctg gggtctcttt aaacgacttg ccgatagatg gcaagcgcca 480

ttgaattcta gggaatattt ctctactggt cagttgggtg gtgaacatga tccggaaaat 540

ctggtgagaa ttggaccgtt cgaaccacag caaatttaa 579

<210> 15

<211> 192

<212> PRT

<213> 伸长盐单胞菌

<220>

<223> 酸乙酰转移酶 (EctA)

<220>

<223> 酸乙酰转移酶 (EctA)

<400> 15

Met Thr Pro Thr Thr Glu Asn Phe Thr Pro Ser Ala Asp Leu Ala Arg

1 5 10 15

Pro Ser Val Ala Asp Thr Val Ile Gly Ser Ala Lys Lys Thr Leu Phe

20 25 30

Ile Arg Lys Pro Thr Thr Asp Asp Gly Trp Gly Ile Tyr Glu Leu Val

35 40 45

Lys Ala Cys Pro Pro Leu Asp Val Asn Ser Gly Tyr Ala Tyr Leu Leu

50 55 60

Leu Ala Thr Gln Phe Arg Asp Thr Cys Ala Val Ala Thr Asp Glu Glu

65 70 75 80

Gly Glu Ile Val Gly Phe Val Ser Gly Tyr Val Lys Arg Asn Ala Pro

85 90 95

Asp Thr Tyr Phe Leu Trp Gln Val Ala Val Gly Glu Lys Ala Arg Gly

100 105 110

Thr Gly Leu Ala Arg Arg Leu Val Glu Ala Val Leu Met Arg Pro Gly

115 120 125

Met Gly Asp Val Arg His Leu Glu Thr Thr Ile Thr Pro Asp Asn Glu

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Ala Ser Trp Gly Leu Phe Lys Arg Leu Ala Asp Arg Trp Gln Ala Pro

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Leu Asn Ser Arg Glu Tyr Phe Ser Thr Gly Gln Leu Gly Gly Glu His

165 170 175

Asp Pro Glu Asn Leu Val Arg Ile Gly Pro Phe Glu Pro Gln Gln Ile

180 185 190

<210> 16

<211> 414

<212> DNA

<213> 伸长盐单胞菌

<220>

<223> 依克多因合酶 (EctC)

<220>

<223> 依克多因合酶 (EctC)

<400> 16

atgatagttc gtaacctgga ggaagctagg caaacagata gattagtgac cgctgagaat 60

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<210> 17

<211> 137

<212> PRT

<213> 伸长盐单胞菌

<220>

<223> 依克多因合酶 (EctC)

<220>

<223> 依克多因合酶 (EctC)

<400> 17

Met Ile Val Arg Asn Leu Glu Glu Ala Arg Gln Thr Asp Arg Leu Val

1 5 10 15

Thr Ala Glu Asn Gly Asn Trp Asp Ser Thr Arg Leu Ser Leu Ala Glu

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Asp Gly Gly Asn Cys Ser Phe His Ile Thr Arg Ile Phe Glu Gly Thr

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Glu Thr His Ile His Tyr Lys His His Phe Glu Ala Val Tyr Cys Ile

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Glu Gly Glu Gly Glu Val Glu Thr Leu Ala Asp Gly Lys Ile Trp Pro

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85 90 95

Leu Arg Ala Ser Lys Thr Met His Leu Ala Cys Val Phe Thr Pro Gly

100 105 110

Leu Thr Gly Asn Glu Val His Arg Glu Asp Gly Ser Tyr Ala Pro Ala

115 120 125

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130 135

<210> 18

<211> 1080

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> 高丝氨酸脱氢酶 (HOM6)

<220>

<223> 高丝氨酸脱氢酶 (HOM6)

<400> 18

atgagcacta aagttgttaa tgttgccgtt atcggtgccg gtgttgttgg ttcagctttc 60

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<210> 19

<211> 308

<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> 高丝氨酸脱氢酶 (HOM6)

<220>

<223> 高丝氨酸脱氢酶 (HOM6)

<400> 19

Met Ser Thr Lys Val Val Asn Val Ala Val Ile Gly Ala Gly Val Val

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Gly Ser Ala Phe Leu Asp Gln Leu Leu Ala Met Lys Ser Thr Ile Thr

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Gln Thr Gly Asp Glu Val Glu Lys Ile Glu Gly Ile Phe Ser Gly Thr

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210 215 220

Thr Ile Val Gly Arg Ile Ser Gly Val Glu Val Glu Ser Pro Thr Ser

225 230 235 240

Phe Pro Val Gln Ser Leu Ile Pro Lys Pro Leu Glu Ser Val Lys Ser

245 250 255

Ala Asp Glu Phe Leu Glu Lys Leu Ser Asp Tyr Asp Lys Asp Leu Thr

260 265 270

Gln Leu Lys Lys Glu Ala Ala Thr Glu Asn Lys Val Leu Arg Phe Ile

275 280 285

Gly Lys Val Asp Val Ala Thr Lys Ser Val Ser Val Gly Ile Glu Lys

290 295 300

Tyr Asp Tyr Ser

305

<210> 20

<211> 1257

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> 天冬氨酸转氨酶 (AAT2)

<220>

<223> 天冬氨酸转氨酶 (AAT2)

<400> 20

atgtctgcca ctctgttcaa taacatcgaa ttgctgcccc ctgatgccct ttttggtatt 60

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<210> 21

<211> 418

<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> 天冬氨酸转氨酶 (AAT2)

<220>

<223> 天冬氨酸转氨酶 (AAT2)

<400> 21

Met Ser Ala Thr Leu Phe Asn Asn Ile Glu Leu Leu Pro Pro Asp Ala

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Leu Phe Gly Ile Lys Gln Arg Tyr Gly Gln Asp Gln Arg Ala Thr Lys

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Val Asp Leu Gly Ile Gly Ala Tyr Arg Asp Asp Asn Gly Lys Pro Trp

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Val Leu Pro Ser Val Lys Ala Ala Glu Lys Leu Ile His Asn Asp Ser

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Ser Tyr Asn His Glu Tyr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Pro Ser Leu Thr

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Ser Asn Ala Ala Lys Ile Ile Phe Gly Thr Gln Ser Asp Ala Phe Gln

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Glu Asp Arg Val Ile Ser Val Gln Ser Leu Ser Gly Thr Gly Ala Leu

100 105 110

His Ile Ser Ala Lys Phe Phe Ser Lys Phe Phe Pro Asp Lys Leu Val

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Tyr Leu Ser Lys Pro Thr Trp Ala Asn His Met Ala Ile Phe Glu Asn

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Ser Leu Asp Leu Asn Gly Phe Leu Asn Ala Ile Gln Lys Ala Pro Glu

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Gly Ser Ile Phe Val Leu His Ser Cys Ala His Asn Pro Thr Gly Leu

180 185 190

Asp Pro Thr Ser Glu Gln Trp Val Gln Ile Val Asp Ala Ile Ala Ser

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Lys Asn His Ile Ala Leu Phe Asp Thr Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Thr

210 215 220

Gly Asp Leu Asp Lys Asp Ala Tyr Ala Val Arg Leu Gly Val Glu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Thr Val Ser Pro Val Phe Val Cys Gln Ser Phe Ala Lys Asn

245 250 255

Ala Gly Met Tyr Gly Glu Arg Val Gly Cys Phe His Leu Ala Leu Thr

260 265 270

Lys Gln Ala Gln Asn Lys Thr Ile Lys Pro Ala Val Thr Ser Gln Leu

275 280 285

Ala Lys Ile Ile Arg Ser Glu Val Ser Asn Pro Pro Ala Tyr Gly Ala

290 295 300

Lys Ile Val Ala Lys Leu Leu Glu Thr Pro Glu Leu Thr Glu Gln Trp

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His Lys Asp Met Val Thr Met Ser Ser Arg Ile Thr Lys Met Arg His

325 330 335

Ala Leu Arg Asp His Leu Val Lys Leu Gly Thr Pro Gly Asn Trp Asp

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His Ile Val Asn Gln Cys Gly Met Phe Ser Phe Thr Gly Leu Thr Pro

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Gln Met Val Lys Arg Leu Glu Glu Thr His Ala Val Tyr Leu Val Ala

370 375 380

Ser Gly Arg Ala Ser Ile Ala Gly Leu Asn Gln Gly Asn Val Glu Tyr

385 390 395 400

Val Ala Lys Ala Ile Asp Glu Val Val Arg Phe Tyr Thr Ile Glu Ala

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Lys Leu

<210> 22

<211> 1317

<212> DNA

<213> 有尾内毛虫

<220>

<223> 谷氨酸脱氢酶 (GDH)

<220>

<223> 谷氨酸脱氢酶 (GDH)

<400> 22

atgatagatt tagaagcgag aaaccctgct caacccgaat tcattcaagc cagtagagaa 60

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tataagggag gcctaaggtt tcacagagca gtcactctag gtactctgaa attccttggt 300

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tcagattttg atcctagagg taaatcagat gccgagattt taagattctg taggtctttt 420

atgacttcgt tgttcaaata tattgggcca gagatagatg ttcctgctgg agatataggt 480

gtcggaggta gggaaattgg ttacttgttt ggccaataca aaagactgac ccaacaacat 540

gaaggagttc taactggtaa gggtcttaac tggggtggct ctcttgttag acctgaagcc 600

acaggttttg gaacgatgta ttttgctaac gaagtcttac atgcacatgg tgacgacatc 660

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gcgaaacaat taggcgctaa ggtagtcact atatctggcc cagatggtta catttatgac 780

gagaatggga taaacaccga cgagaaaatc aactacatgt tggaattaag agcctcaaat 840

aatgatgtgg ttgcgccatt tgcagagaag tttggtgcaa aattcatacc agggaagaag 900

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gaagatgctg ccactttaca taagaatgga gtgaaatatg tgatcgagac atccaatatg 1020

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<210> 23

<211> 438

<212> PRT

<213> 有尾内毛虫

<220>

<223> 谷氨酸脱氢酶 (GDH)

<220>

<223> 谷氨酸脱氢酶 (GDH)

<400> 23

Met Ile Asp Leu Glu Ala Arg Asn Pro Ala Gln Pro Glu Phe Ile Gln

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Ala Ser Arg Glu Val Ile Glu Ser Ile Ile Asp Val Val Asn Ser Asn

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Pro Lys Tyr Leu Glu Asn Lys Ile Leu Glu Arg Ile Thr Glu Pro Asn

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Leu Ile His Glu Phe Lys Val Glu Trp Glu Asn Asp Lys His Glu Ile

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Met Val Asn Lys Gly Tyr Arg Ile Gln Phe Asn Asn Ala Ile Gly Pro

65 70 75 80

Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Arg Ala Val Thr Leu Gly Thr Leu

85 90 95

Lys Phe Leu Gly Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Gly Leu

100 105 110

Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Arg Gly Lys

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Ser Asp Ala Glu Ile Leu Arg Phe Cys Arg Ser Phe Met Thr Ser Leu

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Phe Lys Tyr Ile Gly Pro Glu Ile Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly

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Val Gly Gly Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu

165 170 175

Thr Gln Gln His Glu Gly Val Leu Thr Gly Lys Gly Leu Asn Trp Gly

180 185 190

Gly Ser Leu Val Arg Pro Glu Ala Thr Gly Phe Gly Thr Met Tyr Phe

195 200 205

Ala Asn Glu Val Leu His Ala His Gly Asp Asp Ile Lys Gly Lys Thr

210 215 220

Ile Ala Ile Ser Gly Phe Gly Asn Val Ala Phe Gly Ala Val Leu Lys

225 230 235 240

Ala Lys Gln Leu Gly Ala Lys Val Val Thr Ile Ser Gly Pro Asp Gly

245 250 255

Tyr Ile Tyr Asp Glu Asn Gly Ile Asn Thr Asp Glu Lys Ile Asn Tyr

260 265 270

Met Leu Glu Leu Arg Ala Ser Asn Asn Asp Val Val Ala Pro Phe Ala

275 280 285

Glu Lys Phe Gly Ala Lys Phe Ile Pro Gly Lys Lys Pro Trp Glu Val

290 295 300

Pro Val Asp Met Ala Phe Pro Cys Ala Ile Gln Asn Glu Leu Asn Ala

305 310 315 320

Glu Asp Ala Ala Thr Leu His Lys Asn Gly Val Lys Tyr Val Ile Glu

325 330 335

Thr Ser Asn Met Gly Cys Thr Ala Asp Ala Val Gln Tyr Phe Ile Lys

340 345 350

Asn Arg Ile Val Phe Ala Pro Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val

355 360 365

Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln Asn Ser Met Lys Leu Asn Trp

370 375 380

Thr Ala Glu Glu Val Asp Ala Lys Leu Lys Asn Ile Met Thr Asn Ile

385 390 395 400

His Ala Ser Cys Val Lys Glu Gly Lys Glu Ser Asp Gly Tyr Ile Asn

405 410 415

Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Lys Lys Val Ala Asp Ala

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Met Val Asp Leu Gly Tyr

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<210> 24

<211> 554

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pTDH3" <223> "pTDH3

<220>

<223> pTDH3

<220>

<223> pTDH3

<400> 24

ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt 60

tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa 120

aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc 180

tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat 240

ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat 300

ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga 360

aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa 420

agacggtagg tattgattgt aattctgtaa atctatttct taaacttctt aaattctact 480

tttatagtta gtcttttttt tagttttaaa acaccaagaa cttagtttcg aataaacaca 540

cataaacaaa caaa 554

<210> 25

<211> 550

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pENO2" <223> "pENO2

<220>

<223> pENO2

<220>

<223> pENO2

<400> 25

cgctcagcat ctgcttcttc ccaaagatga acgcggcgtt atgtcactaa cgacgtgcac 60

caacttgcgg aaagtggaat cccgttccaa aactggcatc cactaattga tacatctaca 120

caccgcacgc cttttttctg aagcccactt tcgtggactt tgccatatgc aaaattcatg 180

aagtgtgata ccaagtcagc atacacctca ctagggtagt ttctttggtt gtattgatca 240

tttggttcat cgtggttcat taattttttt tctccattgc tttctggctt tgatcttact 300

atcatttgga tttttgtcga aggttgtaga attgtatgtg acaagtggca ccaagcatat 360

ataaaaaaaa aaagcattat cttcctacca gagttgattg ttaaaaacgt atttatagca 420

aacgcaattg taattaattc ttattttgta tcttttcttc ccttgtctca atcttttatt 480

tttattttat ttttcttttc ttagtttctt tcataacacc aagcaactaa tactataaca 540

tacaataata 550

<210> 26

<211> 419

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pTEF Kl" <223> "pTEF Kl

<220>

<223> pTEF Kl

<220>

<223> pTEF Kl

<400> 26

ctctctcgca ataacaatga acactgggtc aatcatagcc tacacaggtg aacagagtag 60

cgtttataca gggtttatac ggtgattcct acggcaaaaa tttttcattt ctaaaaaaaa 120

aaagaaaaat ttttctttcc aacgctagaa ggaaaagaaa aatctaatta aattgatttg 180

gtgattttct gagagttccc tttttcatat atcgaatttt gaatataaaa ggagatcgaa 240

aaaatttttc tattcaatct gttttctggt tttatttgat agtttttttg tgtattatta 300

ttatggatta gtactggttt atatgggttt ttctgtataa cttcttttta ttttagtttg 360

tttaatctta ttttgagtta cattatagtt ccctaactgc aagagaagta acattaaaa 419

<210> 27

<211> 598

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pTEF3" <223> "pTEF3

<220>

<223> pTEF3

<220>

<223> pTEF3

<400> 27

ggctgataat agcgtataaa caatgcatac tttgtacgtt caaaatacaa tgcagtagat 60

atatttatgc atattacata taatacatat cacataggaa gcaacaggcg cgttggactt 120

ttaattttcg aggaccgcga atccttacat cacacccaat cccccacaag tgatccccca 180

cacaccatag cttcaaaatg tttctactcc ttttttactc ttccagattt tctcggactc 240

cgcgcatcgc cgtaccactt caaaacaccc aagcacagca tactaaattt cccctctttc 300

ttcctctagg gtgtcgttaa ttacccgtac taaaggtttg gaaaagaaaa aagagaccgc 360

ctcgtttctt tttcttcgtc gaaaaaggca ataaaaattt ttatcacgtt tctttttctt 420

gaaaattttt ttttttgatt tttttctctt tcgatgacct cccattgata tttaagttaa 480

taaacggtct tcaatttctc aagtttcagt ttcatttttc ttgttctatt acaacttttt 540

ttacttcttg ctcattagaa agaaagcata gcaatctaat ctaagtttta attacaaa 598

<210> 28

<211> 383

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pTEF1" <223> "pTEF1

<220>

<223> pTEF1

<220>

<223> pTEF1

<400> 28

gtttagcttg cctcgtcccc gccgggtcac ccggccagcg acatggaggc ccagaatacc 60

ctccttgaca gtcttgacgt gcgcagctca ggggcatgat gtgactgtcg cccgtacatt 120

tagcccatac atccccatgt ataatcattt gcatccatac attttgatgg ccgcacggcg 180

cgaagcaaaa attacggctc ctcgctgcag acctgcgagc agggaaacgc tcccctcaca 240

gacgcgttga attgtcccca cgccgcgccc ctgtagagaa atataaaagg ttaggatttg 300

ccactgaggt tcttctttca tatacttcct tttaaaatct tgctacgata cagttctcac 360

atcacatccg aacataaaca acc 383

<210> 29

<211> 700

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pADH1" <223> "pADH1

<220>

<223> pADH1

<220>

<223> pADH1

<400> 29

gggtgtacaa tatggacttc ctcttttctg gcaaccaaac ccatacatcg ggattcctat 60

aataccttcg ttggtctccc taacatgtag gtggcggagg ggagatatac aatagaacag 120

ataccagaca agacataatg ggctaaacaa gactacacca attacactgc ctcattgatg 180

gtggtacata acgaactaat actgtagccc tagacttgat agccatcatc atatcgaagt 240

ttcactaccc tttttccatt tgccatctat tgaagtaata ataggcgcat gcaacttctt 300

ttcttttttt ttcttttctc tctcccccgt tgttgtctca ccatatccgc aatgacaaaa 360

aaatgatgga agacactaaa ggaaaaaatt aacgacaaag acagcaccaa cagatgtcgt 420

tgttccagag ctgatgaggg gtatctcgaa gcacacgaaa ctttttcctt ccttcattca 480

cgcacactac tctctaatga gcaacggtat acggccttcc ttccagttac ttgaatttga 540

aataaaaaaa agtttgctgt cttgctatca agtataaata gacctgcaat tattaatctt 600

ttgtttcctc gtcattgttc tcgttccctt tcttccttgt ttctttttct gcacaatatt 660

tcaagctata ccaagcatac aatcaactat ctcatataca 700

<210> 30

<211> 549

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pGPM 1" <223> "pGPM 1

<220>

<223> pGPM 1

<220>

<223> pGPM 1

<400> 30

gccaaacttt tcggttaaca catgcagtga tgcacgcgcg atggtgctaa gttacatata 60

tatatatata tatatatata tatatatata gccatagtga tgtctaagta acctttatgg 120

tatatttctt aatgtggaaa gatactagcg cgcgcaccca cacacaagct tcgtcttttc 180

ttgaagaaaa gaggaagctc gctaaatggg attccacttt ccgttccctg ccagctgatg 240

gaaaaaggtt agtggaacga tgaagaataa aaagagagat ccactgaggt gaaatttcag 300

ctgacagcga gtttcatgat cgtgatgaac aatggtaacg agttgtggct gttgccaggg 360

agggtggttc tcaactttta atgtatggcc aaatcgctac ttgggtttgt tatataacaa 420

agaagaaata atgaactgat tctcttcctc cttcttgtcc tttcttaatt ctgttgtaat 480

taccttcctt tgtaattttt tttgtaatta ttcttcttaa taatccaaac aaacacacat 540

attacaata 549

<210> 31

<211> 650

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pFBA1" <223> "pFBA1

<220>

<223> pFBA1

<220>

<223> pFBA1

<400> 31

acgcaagccc taagaaatga ataacaatac tgacagtact aaataattgc ctacttggct 60

tcacatacgt tgcatacgtc gatatagata ataatgataa tgacagcagg attatcgtaa 120

tacgtaatag ttgaaaatct caaaaatgtg tgggtcatta cgtaaataat gataggaatg 180

ggattcttct atttttcctt tttccattct agcagccgtc gggaaaacgt ggcatcctct 240

ctttcgggct caattggagt cacgctgccg tgagcatcct ctctttccat atctaacaac 300

tgagcacgta accaatggaa aagcatgagc ttagcgttgc tccaaaaaag tattggatgg 360

ttaataccat ttgtctgttc tcttctgact ttgactcctc aaaaaaaaaa aatctacaat 420

caacagatcg cttcaattac gccctcacaa aaactttttt ccttcttctt cgcccacgtt 480

aaattttatc cctcatgttg tctaacggat ttctgcactt gatttattat aaaaagacaa 540

agacataata cttctctatc aatttcagtt attgttcttc cttgcgttat tcttctgttc 600

ttctttttct tttgtcatat ataaccataa ccaagtaata catattcaaa 650

<210> 32

<211> 700

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pPDC1" <223> "pPDC1

<220>

<223> pPDC1

<220>

<223> pPDC1

<400> 32

ttatttacct atctctaaac ttcaacacct tatatcataa ctaatatttc ttgagataag 60

cacactgcac ccataccttc cttaaaaacg tagcttccag tttttggtgg ttccggcttc 120

cttcccgatt ccgcccgcta aacgcatatt tttgttgcct ggtggcattt gcaaaatgca 180

taacctatgc atttaaaaga ttatgtatgc tcttctgact tttcgtgtga tgaggctcgt 240

ggaaaaaatg aataatttat gaatttgaga acaattttgt gttgttacgg tattttacta 300

tggaataatc aatcaattga ggattttatg caaatatcgt ttgaatattt ttccgaccct 360

ttgagtactt ttcttcataa ttgcataata ttgtccgctg cccctttttc tgttagacgg 420

tgtcttgatc tacttgctat cgttcaacac caccttattt tctaactatt ttttttttag 480

ctcatttgaa tcagcttatg gtgatggcac atttttgcat aaacctagct gtcctcgttg 540

aacataggaa aaaaaaatat ataaacaagg ctctttcact ctccttgcaa tcagatttgg 600

gtttgttccc tttattttca tatttcttgt catattcctt tctcaattat tattttctac 660

tcataacctc acgcaaaata acacagtcaa atcaatcaaa 700

<210> 33

<211> 998

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pCCW12" <223> "pCCW12

<220>

<223> pCCW12

<220>

<223> pCCW12

<400> 33

aaccagggca aagcaaaata aaagaaactt aatacgttat gccgtaatga agggctacca 60

aaaacgataa tctcaactgt aaacaggtac aatgcggacc cttttgccac aaaacataca 120

tcattcattg ccggaaaaag aaagaagtga agacagcagt gcagccagcc atgttgcgcc 180

aatctaatta tagatgctgg tgccctgagg atgtatctgg agccagccat ggcatcatgc 240

gctaccgccg gatgtaaaat ccgacacgca aaagaaaacc ttcgaggttg cgcacttcgc 300

ccacccatga accacacggt tagtccaaaa ggggcagttc agattccaga tgcgggaatt 360

agcttgctgc caccctcacc tcactaacgc tgcggtgtgc ggatacttca tgctatttat 420

agacgcgcgt gtcggaatca gcacgcgcaa gaaccaaatg ggaaaatcgg aatgggtcca 480

gaactgcttt gagtgctggc tattggcgtc tgatttccgt tttgggaatc ctttgccgcg 540

cgcccctctc aaaactccgc acaagtccca gaaagcggga aagaaataaa acgccaccaa 600

aaaaaaaaat aaaagccaat cctcgaagcg tgggtggtag gccctggatt atcccgtaca 660

agtatttctc aggagtaaaa aaaccgtttg ttttggaatt ccccatttcg cggccaccta 720

cgccgctatc tttgcaacaa ctatctgcga taactcagca aattttgcat attcgtgttg 780

cagtattgcg ataatgggag tcttacttcc aacataacgg cagaaagaaa tgtgagaaaa 840

ttttgcatcc tttgcctccg ttcaagtata taaagtcggc atgcttgata atctttcttt 900

ccatcctaca ttgttctaat tattcttatt ctcctttatt ctttcctaac ataccaagaa 960

attaatcttc tgtcattcgc ttaaacacta tatcaata 998

<210> 34

<211> 700

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pGK1" <223> "pGK1

<220>

<223> pGK1

<220>

<223> pGK1

<400> 34

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 240

tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag 300

cgacggctca caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt 360

agtaccacat gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg 420

ttactctctc tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca 480

cacactcttt tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac 540

atttacatat atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt 600

tctaattcgt agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc 660

aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaaca 700

<210> 35

<211> 913

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pMDH2" <223> "pMDH2

<220>

<223> pMDH2

<220>

<223> pMDH2

<400> 35

ccttcgctaa ataataaacc tgaactgtac ttagcgaagc cttcatagca cctacgtaca 60

cgtatatata gacattttac gtaatggaga aactgaggtt tttgttttca ctttttttct 120

ttctttttca ctattgctcg aaccgcctgc gatgagctaa gaaaaaaaag tgaaagaaat 180

catagaaagc aaaaatgaga ttatatagcc cagagccctc ttctggcgcc tgtcccaagg 240

cggaccaaca acaacacttg cccaaaccta agaaaatccc ctcatacttt tccgtttgta 300

tctcctactt tcttacttcc tttttttctt ctttatttgc ttggtttacc attgaagtcc 360

atttttacta cagacaatag ctagtcattc gctatcttcc gtttgtcact ttttttcaaa 420

tttctcatct atatagcgaa gtacggaaaa gatgtcactt gccggcatct cggccttccc 480

cggccaaatg gactcatcat ctacgatacg gcccctttaa tccgcaatta ctttgcccat 540

tcggccgtag ccgttctaaa gccgccgtgc cttgccccca atactcccct aatgatccgg 600

gaagttccgg tttttttcct ttgtttagtg gcattttgtg ttgcccaagg ttgggaaggt 660

ccgatttgac tttaaggaac tacggaaggt atctaaggtt tctaaaaaca atatacacgc 720

gcgtgcgtag atatataaag ataaagattt atcgatatga gataaagatt gctgcatgat 780

tctccttctg attctttttc cctgtatata ttttctcccc ttctgtataa atcgtacagt 840

cagaagtagt ccagaatata gtgctgcaga ctattacaaa agttcaatac aatatcataa 900

aagttatagt aac 913

<210> 36

<211> 406

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pURA3" <223> "pURA3

<220>

<223> pURA3

<220>

<223> pURA3

<400> 36

ggtacccaaa ccgaagttat ctgatgtaga aaaggattaa agatgctaag agatagtgat 60

gatatttcat aaataatgta attctatata tgttaattac cttttttgcg aggcatattt 120

atggtgaagg ataagttttg accatcaaag aaggttaatg tggctgtggt ttcagggtcc 180

ataaagcttt tcaattcatc tttttttttt ttgttctttt ttttgattcc ggtttctttg 240

aaattttttt gattcggtaa tctccgagca gaaggaagaa cgaaggaagg agcacagact 300

tagattggta tatatacgca tatgtggtgt tgaagaaaca tgaaattgcc cagtattctt 360

aacccaactg cacagaacaa aaacctgcag gaaacgaaga taaatc 406

<210> 37

<211> 535

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pRPLA1" <223> "pRPLA1

<220>

<223> pRPLA1

<220>

<223> pRPLA1

<400> 37

tcaagttgga tactgatctg atctctccgc cctactacca gggaccctca tgattaccgc 60

tcgaatgcga cgtttcctgc ctcataaaac tggcttgaaa atatttattc gctgaacagt 120

agcctagctt ataaaaattt catttaatta atgtaatatg aaaactcaca tgccttctgt 180

ttctaaaatt gtcacagcaa gaaataacat taccatacgt gatcttatta aactctagta 240

tcttgtctaa tacttcattt aaaagaagcc ttaaccctgt agcctcatct atgtctgcta 300

catatcgtga ggtacgaata tcgtaagatg ataccacgca actttgtaat gatttttttt 360

ttttcatttt ttaaagaatg cctttacatg gtatttgaaa aaaatatctt tataaagttt 420

gcgatctctt ctgttctgaa taatttttag taaaagaaat caaaagaata aagaaatagt 480

ccgctttgtc caatacaaca gcttaaaccg attatctcta aaataacaag aagaa 535

<210> 38

<211> 400

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pSAM4" <223> "pSAM4

<220>

<223> pSAM4

<220>

<223> pSAM4

<400> 38

agattttggt gttagatggt actcttgcat atgtaacctt taataaattt tgcaaatcga 60

attcctttgt aacgtgcaaa gcattttata gcctggcgct cgcattgtta agcaacaggc 120

ggtgcggcaa cgttgaaatg tttcacgcag ggttttttac gtactgcacg gcattctgga 180

gtgaaaaaaa atgaaaagta cagctcgaag ttttttgtcc atcggttgta ctttgcagag 240

tattagtcat ttttgatatc agagtactac tatcgaagca tttttacgct tgaataactt 300

gaatattatt gaaagcttag ttcaaccaag ctgaaaagaa ccattattca acataattgg 360

aaatcatttc gttactaaat cgtccgaaaa ttgcagaaaa 400

<210> 39

<211> 505

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pCUP1-1" <223> "pCUP1-1

<220>

<223> pCUP1-1

<220>

<223> pCUP1-1

<400> 39

cggcaaactt caacgatttc tatgatgcat tttataatta gtaagccgat cccattaccg 60

acatttgggc gctatacgtg catatgttca tgtatgtatc tgtatttaaa acacttttgt 120

attatttttc ctcatatatg tgtataggtt tatacggatg atttaattat tacttcacca 180

ccctttattt caggctgata tcttagcctt gttactagtt agaaaaagac atttttgctg 240

tcagtcactg tcaagagatt cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc 300

gtcttttccg ctgaaccgtt ccagcaaaaa agactaccaa cgcaatatgg attgtcagaa 360

tcatataaaa gagaagcaaa taactccttg tcttgtatca attgcattat aatatcttct 420

tgttagtgca atatcatata gaagtcatcg aaatagatat taagaaaaac aaactgtaca 480

atcaatcaat caatcatcac ataaa 505

<210> 40

<211> 500

<212> DNA

<213> 光滑假丝酵母

<220>

<223> pCUP1.Cgla" <223> "pCUP1.Cgla

<220>

<223> pCUP1.Cgla

<220>

<223> pCUP1.Cgla

<400> 40

cacaccacac aaccgtcagc accccggctg tacgtctgtg aaggctgcgg tatagacacg 60

gactgcgata cagaactcat gacttatatc tgtagactcc tctgcttcaa tgcgaactcc 120

aggatcaccg aatagcatgc gatgagctgt tgattcttat atataattat ctattgcatt 180

ttttttttaa tgctgcatgg gggggcctag taaatcaccc gtacaagtca cgcgtgagag 240

aaagagaagg gccctttcgt cgtggaagcg tggatcgtga gcgacctgtt tctaaatata 300

gcttttgggt aggatattat attaagtgaa attttattag agggtaaatg tatgtgaaag 360

ttatgtataa tatgttgcta aattagcgat cgtgaatgca tagaatctaa tcgttataga 420

aaaccgcaac ttgtgctgtt ttgttgtgtt ttcttgtcgt ttttttatat tatttatcta 480

gtattttgct ttagttgtta 500

<210> 41

<211> 425

<212> DNA

<213> 贝酵母

<220>

<223> pCUP1.Sba" <223> "pCUP1.Sba

<220>

<223> pCUP1.Sba

<220>

<223> pCUP1.Sba

<400> 41

agaaggaggg gtcctattac caatacttgg acgctatacg tgcatatgta catgtacgta 60

tctgtattta aacacttttg tattattttc tttatatatg tgtataggtt tacatggttg 120

acttttatca ttgtttgtgc acatttgcaa tggccatttt tttgtttttg agaaaggtat 180

tattgctgtc actattcgag atgcttttgc tgacattcct cctagaagcc aaaaggccga 240

tgcgtttttt ccgctgagag gataccagca aaaaaagcta ccagtacaag atgggacggc 300

aaaagcgtat aaaagaagaa gcaaaatgac cagatatgct ttcaatttca tcaatgtttc 360

tttctccctg ttatgatcca gaagaataat caaaagcaaa acatctattc aatcaatctc 420

ataaa 425

<210> 42

<211> 741

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU1" <223> "pACU1

<220>

<223> pACU1

<220>

<223> pACU1

<400> 42

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc 420

cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca 480

acgaattcta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta acataataac 540

cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa aaaataagat 600

atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt cttgctctct 660

tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc gtcagataca tagatacaat 720

tctattaccc ccatccatac a 741

<210> 43

<211> 757

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU2" <223> "pACU2

<220>

<223> pACU2

<220>

<223> pACU2

<400> 43

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccgaatt cgaaaaagac atttttgctg tcagtcactg 360

tcaagagatt cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc gtcttttccg 420

ctgaaccgtt ccagcaaaaa agactaccaa cgaattccac gtgaagctgt cgatattggg 480

gaactgtggt ggttggcaaa tgactaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac 540

tgtgtaacat aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg 600

atgaaaaaaa taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc 660

ctttttcttg ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca 720

gatacataga tacaattcta ttacccccat ccataca 757

<210> 44

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU3p" <223> "pACU3p

<220>

<223> pACU3p

<220>

<223> pACU3p

<400> 44

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attcgaaaaa gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag 180

attcttttgc tggcatttct tccagaagca aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc 240

gttccagcaa aaaagactac caacgaattc ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt 300

atttctgggg taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat 360

ggaaaagctg cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct 420

tattcaaatg tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt 480

caaggagaaa aaactata 498

<210> 45

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU4p" <223> "pACU4p

<220>

<223> pACU4p

<220>

<223> pACU4p

<400> 45

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa 180

aagacgcatc gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg 240

actgacagca aaaatgtctt tttcgaattc ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt 300

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ggaaaagctg cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct 420

tattcaaatg tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt 480

caaggagaaa aaactata 498

<210> 46

<211> 530

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU5" <223> "pACU5

<220>

<223> pACU5

<220>

<223> pACU5

<400> 46

ggaggacgaa acaaaaaagt gaaaaaaaat gaaaattttt ttggaaaacc aagaaatgaa 60

ttatatttcc gtgtgagacg acatcgtcga atatgattca gggtaacagt attgatgtaa 120

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cactgtcaag agattctttt gctggcattt cttccagaag caaaaagagc gatgcgtctt 240

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atgtgtgcga cgacacatga tcatatggca tgcatgtgct ctgtatgtat ataaaactct 420

tgttttcttc ttttctctaa atattctttc cttatacatt aggacctttg cagcataaat 480

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<210> 47

<211> 867

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU6" <223> "pACU6

<220>

<223> pACU6

<220>

<223> pACU6

<400> 47

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc 420

cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca 480

acgaattcga aaaagacatt tttgctgtca gtcactgtca agagattctt ttgctggcat 540

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taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg 780

ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga 840

tacaattcta ttacccccat ccataca 867

<210> 48

<211> 867

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU7" <223> "pACU7

<220>

<223> pACU7

<220>

<223> pACU7

<400> 48

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

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taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg 780

ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga 840

tacaattcta ttacccccat ccataca 867

<210> 49

<211> 1119

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU8" <223> "pACU8

<220>

<223> pACU8

<220>

<223> pACU8

<400> 49

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

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tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc 420

cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca 480

acgaattcga aaaagacatt tttgctgtca gtcactgtca agagattctt ttgctggcat 540

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<210> 50

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU9" <223> "pACU9

<220>

<223> pACU9

<220>

<223> pACU9

<400> 50

tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 60

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attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccga attcgaaaaa 240

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ggtggtaatg ccatgtaata tgattattaa acttctttgc gtccatccaa aaaaaaagta 600

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<210> 51

<211> 876

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU10p" <223> "pACU10p

<220>

<223> pACU10p

<220>

<223> pACU10p

<400> 51

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attggttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa 180

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gattagtttt ttagccttat ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct 720

attaacagat atataaatgg aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt 780

tcagtttgta ttacttctta ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat 840

acctctatac tttaacgtca aggagaaaaa actata 876

<210> 52

<211> 633

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU11" <223> "pACU11

<220>

<223> pACU11

<220>

<223> pACU11

<400> 52

gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60

aacttgcggg aattcgaaaa agacattttt gctgtcagtc actgtcaaga gattcttttg 120

ctggcatttc ttccagaagc aaaaagagcg atgcgtcttt tccgctgaac cgttccagca 180

aaaaagacta ccaacgaatt ccaccgcacg ccttttttct gaagcccact ttcgtggact 240

ttgccatata tgcaaaattc atgaagtgtg ataccaagtc agcatacacc tcactagggt 300

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tgctttctgg ctttgatctt actatcattt ggatttttgt cgaaggttgt agaattgtat 420

gtgacaagtg gcaccaagca tatataaaaa aaaaaagcat tatcttccta ccagagttga 480

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ttcccttgtc tcaatctttt atttttattt tatttttctt ttcttagttt ctttcataac 600

accaagcaac taatactata acatacaata ata 633

<210> 53

<211> 1119

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU12" <223> "pACU12

<220>

<223> pACU12

<220>

<223> pACU12

<400> 53

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tggttggtag tcttttttgc tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct 420

tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt 480

tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt 540

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tctttttcga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa aagacgcatc 660

gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca 720

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cgcatcgctc tttttgcttc tggaagaaat gccagcaaaa gaatctcttg acagtgactg 840

acagcaaaaa tgtctttttc caattctaat taagttagtc aaggcgccat cctcatgaaa 900

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cgatgaaaaa aataagatat atataaggtt aagtaaagcg tctgttagaa aggaagtttt 1020

tcctttttct tgctctcttg tcttttcatc tactatttcc ttcgtgtaat acagggtcgt 1080

cagatacata gatacaattc tattaccccc atccataca 1119

<210> 54

<211> 1497

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU13" <223> "pACU13

<220>

<223> pACU13

<220>

<223> pACU13

<400> 54

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tggttggtag tcttttttgc tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct 420

tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt 480

tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt 540

tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg 600

tctttttcga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa aagacgcatc 660

gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca 720

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cgcatcgctc tttttgcttc tggaagaaat gccagcaaaa gaatctcttg acagtgactg 840

acagcaaaaa tgtctttttc gaattcgttg gtagtctttt ttgctggaac ggttcagcgg 900

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tgactgacag caaaaatgtc tttttcgaat tcgttggtag tcttttttgc tggaacggtt 1020

cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct 1080

tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga 1140

acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga 1200

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ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct 1320

tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc 1380

tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt 1440

cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga tacaattcta ttacccccat ccataca 1497

<210> 55

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU14" <223> "pACU14

<220>

<223> pACU14

<220>

<223> pACU14

<400> 55

gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60

aacttgcggg aattggaaaa agacattttt gctgtcagtc actgtcaaga gattcttttg 120

ctggcatttc ttccagaagc aaaaagagcg atgcgtcttt tccgctgaac cgttccagca 180

aaaaagacta ccaacgaatt cgaaaaagac atttttgctg tcagtcactg tcaagagatt 240

cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc gtcttttccg ctgaaccgtt 300

ccagcaaaaa agactaccaa cgaattcgaa aaagacattt ttgctgtcag tcactgtcaa 360

gagattcttt tgctggcatt tcttccagaa gcaaaaagag cgatgcgtct tttccgctga 420

accgttccag caaaaaagac taccaacgaa ttcgaaaaag acatttttgc tgtcagtcac 480

tgtcaagaga ttcttttgct ggcatttctt ccagaagcaa aaagagcgat gcgtcttttc 540

cgctgaaccg ttccagcaaa aaagactacc aaccaattcc accgcacgcc ttttttctga 600

agcccacttt cgtggacttt gccatatatg caaaattcat gaagtgtgat accaagtcag 660

catacacctc actagggtag tttctttggt tgtattgatc atttggttca tcgtggttca 720

ttaatttttt ttctccattg ctttctggct ttgatcttac tatcatttgg atttttgtcg 780

aaggttgtag aattgtatgt gacaagtggc accaagcata tataaaaaaa aaaagcatta 840

tcttcctacc agagttgatt gttaaaaacg tatttatagc aaacgcaatt gtaattaatt 900

cttattttgt atcttttctt cccttgtctc aatcttttat ttttatttta tttttctttt 960

cttagtttct ttcataacac caagcaacta atactataac atacaataat a 1011

<210> 56

<211> 398

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU15" <223> "pACU15

<220>

<223> pACU15

<220>

<223> pACU15

<400> 56

tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 60

ttttatgaca tttgaataag aagtaataca aactgaaaat gttgaaagta ttagttaaag 120

tggttatgca gcttttccat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg 180

attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccga attcgttggt 240

agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa aagacgcatc gctctttttg cttctggaag 300

aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca aaaatgtctt tttcgaattc 360

gggctcttta catttccaca acatataagt aagattag 398

<210> 57

<211> 428

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pGAL/CUP1p" <223> "pGAL/CUP1p

<220>

<223> pGAL/CUP1p

<220>

<223> pGAL/CUP1p

<400> 57

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attcgaaaaa gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag 180

attcttttgc tggcatttct tccagaagca aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc 240

gttccagcaa aaaagactac caacgcaata tggattgtca gaatcatata aaagagaagc 300

aaataactcc ttgtcttgta tcaattgcat tataatatct tcttgttagt gcaatatcat 360

atagaagtca tcgaaataga tattaagaaa aacaaactgt acaatcaatc aatcaatcat 420

cacataaa 428

<210> 58

<211> 518

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pCRS5" <223> "pCRS5

<220>

<223> pCRS5

<220>

<223> pCRS5

<400> 58

gtggacgaaa agacataact gcagaagtac agctgccttt atttcttgtg gtcatttatt 60

gcttttattt tcaagtcaga tatacaagaa aatcaaatcc catcgtcaac gtcacgtata 120

aacgattaat ttacagtaat accatactct accaacatta ttttagtccg acgttcagtc 180

ctgtaggtgt tccaaatcct tctggcattg acttctgtgc agaaaccctt caaaatgagt 240

tccactttac gtcagatcgc ataacaaccg gtcatatatt tttttctttt gctaaacccc 300

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gatttttgtc tttcggacaa aaaaaggata gggatgcgag agggctgtga agtagtgatc 420

aagcggggcc tatataagaa gggcgcacat cgtcccccct aagaatagcg aagcgatatt 480

acactgaaca ctacaatgtc aaatagtact caataaat 518

<210> 59

<211> 510

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pCHA1" <223> "pCHA1

<220>

<223> pCHA1

<220>

<223> pCHA1

<400> 59

gatctctgct gacgttgtat ccacagatct aattgcaaga tagcctcttg cgaccttatt 60

aaaagcctct ccgtgatatc ctctagggct tgggttgcca ttaatcgatg tgtccttgtt 120

tccttatgcg agctgtttct tatctatctt atggtcccat tctttactgc actgtttaca 180

ttttgatcaa ttgcgaaatg ttcctactat ttttcttttt ctcttttcgc gagtactaat 240

caccgcgaac ggaaactaat gagtcctctg cgcggagaca tgattccgca tgggcggctc 300

ctgttaagcc ccagcggaaa tgtaattcca ctgagtgtca ttaaatagtg ccaaagcttt 360

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taaatatcgc caaataaaag gaaaatgttt atacagtttt ctctttttta agtgctggat 480

agacaagaga caggaaaatt aaccagcgag 510

<210> 60

<211> 601

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pCTR1" <223> "pCTR1

<220>

<223> pCTR1

<220>

<223> pCTR1

<400> 60

caagtccgat tgttcctctt caggagcttc ctgaaccaaa ctttttccgc aaggccgcat 60

tttgaaccgt attttgctcg ttccagcctt tccacgtttt tgttatctaa gcaacttggc 120

acatttccct actatactac aaaccgatac gtaaatactt ccctaaatag catatgaatt 180

attcagtaat ttttaaggat cgaaactgca cctcaactat tcgttactgt ggttatgttc 240

tcatgtattg atgcaaatca tgggatattt gctcaagacg acggtaaaat gagcaaaaat 300

ggcacgatcc tgaaaagagc acttttcaag attcgggcta caaaatgcaa cataaaaaat 360

gttgtattgt catctcgaca gggtcttgta tgttttattc ctcttatgat tagttcacat 420

tagtaaaaca gatacgcagt gtgctcttaa taaacaacta ctccatagct ttatttgcat 480

aacaaaactt ttaagcacaa acttaaacag gtggagtaat agttcggcgg cgactcaaat 540

tacatttgtt ggaagaatcg aatagaaaat aaaaaaaagt gtattatatt tgacattcaa 600

a 601

<210> 61

<211> 522

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pCTR3" <223> "pCTR3

<220>

<223> pCTR3

<220>

<223> pCTR3

<400> 61

gatgtgatga caaaacctct tccgataaaa acatttaaac tattaacaaa caaatggatt 60

cattagatct attacattat gggtggtatg ttggaataaa aatcaactat catctactaa 120

ctagtattta cgttactagt atattatcat atacggtgtt agaagatgac gcaaatgatg 180

agaaatagtc atctaaatta gtggaagctg aaacgcaagg attgataatg taataggatc 240

aatgaatatt aacatataaa acgatgataa taatatttat agaattgtgt agaattgcag 300

attccctttt atggattcct aaatcctcca ggagaacttc tagtatatct acatacctaa 360

tattattgcc ttattaaaaa tggaatccca acaattacat caaaatccac attctcttca 420

cttctccgat agacttgtaa tttatcttat ttcatttcct aacactttga tcgaagaaga 480

gggataacaa cagacgaaaa cacatttaag ggctatacaa ag 522

<210> 62

<211> 675

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR1" <223> "pCUR1

<220>

<223> pCUR1

<220>

<223> pCUR1

<400> 62

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat 420

tctaattaag ttagtcaagg cgccatcctc atgaaaactg tgtaacataa taaccgaagt 480

gtcgaaaagg tggcaccttg tccaattgaa cacgctcgat gaaaaaaata agatatatat 540

aaggttaagt aaagcgtctg ttagaaagga agtttttcct ttttcttgct ctcttgtctt 600

ttcatctact atttccttcg tgtaatacag ggtcgtcaga tacatagata caattctatt 660

acccccatcc ataca 675

<210> 63

<211> 674

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR2" <223> "pCUR2

<220>

<223> pCUR2

<220>

<223> pCUR2

<400> 63

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgatt 360

gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt 420

ctaattaagt tagtcaaggc gccatcctca tgaaaactgt gtaacataat aaccgaagtg 480

tcgaaaaggt ggcaccttgt ccaattgaac acgctcgatg aaaaaaataa gatatatata 540

aggttaagta aagcgtctgt tagaaaggaa gtttttcctt tttcttgctc tcttgtcttt 600

tcatctacta tttccttcgt gtaatacagg gtcgtcagat acatagatac aattctatta 660

cccccatcca taca 674

<210> 64

<211> 794

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR3" <223> "pCUR3

<220>

<223> pCUR3

<220>

<223> pCUR3

<400> 64

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

taggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt 420

gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt 480

gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt 540

ctaattaagt tagtcaaggc gccatcctca tgaaaactgt gtaacataat aaccgaagtg 600

tcgaaaaggt ggcaccttgt ccaattgaac acgctcgatg aaaaaaataa gatatatata 660

aggttaagta aagcgtctgt tagaaaggaa gtttttcctt tttcttgctc tcttgtcttt 720

tcatctacta tttccttcgt gtaatacagg gtcgtcagat acatagatac aattctatta 780

cccccatcca taca 794

<210> 65

<211> 850

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR4" <223> "pCUR4

<220>

<223> pCUR4

<220>

<223> pCUR4

<400> 65

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat 420

tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat 480

gtcatgggat atttgctcaa gacgacggta aaatgagcaa atatggcacg atcctcaatt 540

gtcatgggat atttgctcaa gacgacggta aaatgagcaa atatcccatg acaattctaa 600

ttaagttagt caaggcgcca tcctcatgaa aactgtgtaa cataataacc gaagtgtcga 660

aaaggtggca ccttgtccaa ttgaacacgc tcgatgaaaa aaataagata tatataaggt 720

taagtaaagc gtctgttaga aaggaagttt ttcctttttc ttgctctctt gtcttttcat 780

ctactatttc cttcgtgtaa tacagggtcg tcagatacat agatacaatt ctattacccc 840

catccataca 850

<210> 66

<211> 491

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR5p" <223> "pCUR5p

<220>

<223> pCUR5p

<220>

<223> pCUR5p

<400> 66

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag 180

caaatatggc acgatcctca attgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag 240

caaatatggc acgatcccaa ttcggatgat aatgcgatta gttttttagc cttatttctg 300

gggtaattaa tcagcgaagc gatgattttt gatctattaa cagatatata aatggaaaag 360

ctgcataacc actttaacta atactttcaa cattttcagt ttgtattact tcttattcaa 420

atgtcataaa agtatcaaca aaaaattgtt aatatacctc tatactttaa cgtcaaggag 480

aaaaaactat a 491

<210> 67

<211> 833

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR6" <223> "pCUR6

<220>

<223> pCUR6

<220>

<223> pCUR6

<400> 67

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccgaatt gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc 360

gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc 420

gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc 480

gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt catgatcgca aaatggcaaa tggcacgtga 540

agctgtcgat attggggaac tgtggtggtt ggcaaatgac taattaagtt agtcaaggcg 600

ccatcctcat gaaaactgtg taacataata accgaagtgt cgaaaaggtg gcaccttgtc 660

caattgaaca cgctcgatga aaaaaataag atatatataa ggttaagtaa agcgtctgtt 720

agaaaggaag tttttccttt ttcttgctct cttgtctttt catctactat ttccttcgtg 780

taatacaggg tcgtcagata catagataca attctattac ccccatccat aca 833

<210> 68

<211> 803

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR7" <223> "pCUR7

<220>

<223> pCUR7

<220>

<223> pCUR7

<400> 68

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 360

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 420

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 480

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 540

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 600

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 660

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 720

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 780

ctttttacaa caaatataaa aca 803

<210> 69

<211> 863

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR8" <223> "pCUR8

<220>

<223> pCUR8

<220>

<223> pCUR8

<400> 69

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 360

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 420

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 480

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 540

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 600

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 660

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 720

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 780

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 840

ctttttacaa caaatataaa aca 863

<210> 70

<211> 863

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR9" <223> "pCUR9

<220>

<223> pCUR9

<220>

<223> pCUR9

<400> 70

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 420

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 480

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 540

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 600

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 660

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 720

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 780

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 840

ctttttacaa caaatataaa aca 863

<210> 71

<211> 923

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR10" <223> "pCUR10

<220>

<223> pCUR10

<220>

<223> pCUR10

<400> 71

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 420

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 480

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 540

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 600

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 660

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 720

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 780

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 840

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 900

ctttttacaa caaatataaa aca 923

<210> 72

<211> 983

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR11" <223> "pCUR11

<220>

<223> pCUR11

<220>

<223> pCUR11

<400> 72

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 420

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 480

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 540

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 600

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 660

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 720

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 780

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 840

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 900

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 960

ctttttacaa caaatataaa aca 983

<210> 73

<211> 1043

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR12" <223> "pCUR12

<220>

<223> pCUR12

<220>

<223> pCUR12

<400> 73

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 360

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattcag gatcgtgcca 420

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 480

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 540

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 600

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 660

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 720

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 780

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 840

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 900

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 960

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 1020

ctttttacaa caaatataaa aca 1043

<210> 74

<211> 1043

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR13" <223> "pCUR13

<220>

<223> pCUR13

<220>

<223> pCUR13

<400> 74

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctc atgggatatt 420

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 480

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 540

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 600

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 660

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 720

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 780

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 840

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 900

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 960

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 1020

ctttttacaa caaatataaa aca 1043

<210> 75

<211> 1223

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR14" <223> "pCUR14

<220>

<223> pCUR14

<220>

<223> pCUR14

<400> 75

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctc atgggatatt 420

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 480

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 540

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctc atgggatatt 600

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 660

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 720

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 780

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 840

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 900

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 960

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 1020

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 1080

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 1140

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 1200

ctttttacaa caaatataaa aca 1223

<210> 76

<211> 1283

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR15" <223> "pCUR15

<220>

<223> pCUR15

<220>

<223> pCUR15

<400> 76

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 360

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 420

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattcag gatcgtgcca 480

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 540

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 600

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattcag gatcgtgcca 660

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 720

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 780

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 840

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 900

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 960

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 1020

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accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 1140

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 1200

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 1260

ctttttacaa caaatataaa aca 1283

<210> 77

<211> 686

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR16" <223> "pCUR16

<220>

<223> pCUR16

<220>

<223> pCUR16

<400> 77

gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60

aacttgcggg aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 120

cacgatcctc aattgtcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 180

cacgatcctc aatgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag caaatatggc 240

acgatcctga attccaccgc acgccttttt tctgaagccc actttcgtgg actttgccat 300

atatgcaaaa ttcatgaagt gtgataccaa gtcagcatac acctcactag ggtagtttct 360

ttggttgtat tgatcatttg gttcatcgtg gttcattaat tttttttctc cattgctttc 420

tggctttgat cttactatca tttggatttt tgtcgaaggt tgtagaattg tatgtgacaa 480

gtggcaccaa gcatatataa aaaaaaaaag cattatcttc ctaccagagt tgattgttaa 540

aaacgtattt atagcaaacg caattgtaat taattcttat tttgtatctt ttcttccctt 600

gtctcaatct tttattttta ttttattttt cttttcttag tttctttcat aacaccaagc 660

aactaatact ataacataca ataata 686

<210> 78

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR17" <223> "pCUR17

<220>

<223> pCUR17

<220>

<223> pCUR17

<400> 78

gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60

aacttgcggg aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 120

cacgatcctc aattgtcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 180

cacgatcctc aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 240

cacgatcctc aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 300

cacgatcctg aattccaccg cacgcctttt ttctgaagcc cactttcgtg gactttgcca 360

tatatgcaaa attcatgaag tgtgatacca agtcagcata cacctcacta gggtagtttc 420

tttggttgta ttgatcattt ggttcatcgt ggttcattaa ttttttttct ccattgcttt 480

ctggctttga tcttactatc atttggattt ttgtcgaagg ttgtagaatt gtatgtgaca 540

agtggcacca agcatatata aaaaaaaaaa gcattatctt cctaccagag ttgattgtta 600

aaaacgtatt tatagcaaac gcaattgtaa ttaattctta ttttgtatct tttcttccct 660

tgtctcaatc ttttattttt attttatttt tcttttctta gtttctttca taacaccaag 720

caactaatac tataacatac aataata 747

<210> 79

<211> 500

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pLYS1" <223> "pLYS1

<220>

<223> pLYS1

<220>

<223> pLYS1

<400> 79

gcaagttaac attagggaga acgtggggcc ttcctccatg agtgcagagc aattgaagat 60

gtttagaggt ttaaaggaga ataaccagtt gctggatagc tctgtgccag ctacagttta 120

tgccaaattg gcccttcatg gtattcctga cggtgttaat ggacagtact tgagctataa 180

tgaccctgcc ttggcggact ttatgccttg aggatagcag gtacatataa attgttacat 240

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gacaaagagt cataaagtca tcctcgagaa accacgatga aatatataaa aagcccatct 420

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<210> 80

<211> 650

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pLYS4" <223> "pLYS4

<220>

<223> pLYS4

<220>

<223> pLYS4

<400> 80

ttgaaaaatg cgaagttgaa gtgccataga agagaaacag cccacacagg ggagaagccc 60

actggaaagg gggcactgac caactttaaa taggaaacag aagataccac aagccagcga 120

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gcttgttcgt gcgaaattac cgcaaacccg gtaaaatgta cacgtatcaa gtgataaaca 300

atttcgtgtc aagtgagcag aatggagcga tttggaaaaa aaaaattttt attgtttttt 360

cccccgggat tttgctcgag atgactgaaa ttttgtaatc gatgagtcta taccagaggc 420

agcaaatatc accaacatac acaggtatac acaatctcat gtccacacac acgtacagac 480

acgcacatat atatatatat atatatatcc ccataggtat ttatatatac aaaagaatcc 540

tcgtgtgttt gtgtgtgcaa tagctagttt tgcgctgcct cttatagtag acaatatcac 600

tttttcaata aaatagaact tgcaaggaaa caaaattgta tcgcttcaag 650

<210> 81

<211> 500

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pLYS9" <223> "pLYS9

<220>

<223> pLYS9

<220>

<223> pLYS9

<400> 81

acatatgcaa gagtcttatg tatcgtatct aagtgccacg taggggattc ccatcatttg 60

atgatttcca aatataatac ctgtagagag cggtggagca aaagtcaaat tttaatcgca 120

actgcagaca agtcaagctg aggaaattgt ggatgatctc ttgtttcttt tgatattcac 180

cacaacagaa gtgaagagtg tgattgcggt tactactgac cacgaagcaa tgcgtttagt 240

agtgaaaaga attactcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt cgctttgtag 300

tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta tcagcaatag 360

atgatagaaa gtagcacaga atttggctta atggtatata aaccgtaggg tcctggtaaa 420

attacatggg aaggatcctt aggcagtagg gaaaacttat caggacaatt gagttatatt 480

aacgtattat atattttaat 500

<210> 82

<211> 494

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR1p" <223> "pLYR1p

<220>

<223> pLYR1p

<220>

<223> pLYR1p

<400> 82

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt 180

cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta 240

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ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat ataaatggaa 360

aagctgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc agtttgtatt acttcttatt 420

caaatgtcat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt taacgtcaag 480

gagaaaaaac tata 494

<210> 83

<211> 494

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR2p" <223> "pLYR2p

<220>

<223> pLYR2p

<220>

<223> pLYR2p

<400> 83

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat 180

tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa 240

tttcgattcc agagtatgag gaattcggat gataatgcga ttagtttttt agccttattt 300

ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat ataaatggaa 360

aagctgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc agtttgtatt acttcttatt 420

caaatgtcat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt taacgtcaag 480

gagaaaaaac tata 494

<210> 84

<211> 616

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR3p" <223> "pLYR3p

<220>

<223> pLYR3p

<220>

<223> pLYR3p

<400> 84

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt 180

cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta 240

tcagcaatag atgatagaaa gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa 300

ttcgctttgt agtgaaaaat aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat 360

tatcagcaat agatgataga aagaattcgg atgataatgc gattagtttt ttagccttat 420

ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct attaacagat atataaatgg 480

aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt tcagtttgta ttacttctta 540

ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat acctctatac tttaacgtca 600

aggagaaaaa actata 616

<210> 85

<211> 616

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR4p" <223> "pLYR4p

<220>

<223> pLYR4p

<220>

<223> pLYR4p

<400> 85

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat 180

tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa 240

tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa 300

attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg 360

aatttcgatt ccagagtatg aggaattcgg atgataatgc gattagtttt ttagccttat 420

ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct attaacagat atataaatgg 480

aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt tcagtttgta ttacttctta 540

ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat acctctatac tttaacgtca 600

aggagaaaaa actata 616

<210> 86

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR5p" <223> "pLYR5p

<220>

<223> pLYR5p

<220>

<223> pLYR5p

<400> 86

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat 180

tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa 240

tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa 300

attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg 360

aatttcgatt ccagagtatg aggaattctt tctatcatct attgctgata attccattgg 420

aaattctcaa taccctttat tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa tttttccaac 480

ggaatttcga ttccagagta tgaggaattc ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt 540

atttctgggg taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat 600

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tattcaaatg tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt 720

caaggagaaa aaactata 738

<210> 87

<211> 1104

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR6p" <223> "pLYR6p

<220>

<223> pLYR6p

<220>

<223> pLYR6p

<400> 87

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attgctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt 180

cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta 240

tcagcaatag atgatagaaa gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa 300

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gaaaaattcg ctttgtagtg aaaaataaag atgtcaataa agggtattga gaatttccaa 720

tggaattatc agcaatagat gatagaaaga attcctcata ctctggaatc gaaattccgt 780

tggaaaaatt cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc 840

aatggaatta tcagcaatag atgatagaaa caattcggat gataatgcga ttagtttttt 900

agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat 960

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acttcttatt caaatgtcat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt 1080

taacgtcaag gagaaaaaac tata 1104

<210> 88

<211> 1836

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR7p" <223> "pLYR7p

<220>

<223> pLYR7p

<220>

<223> pLYR7p

<400> 88

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attgtttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat 180

tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa 240

tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa 300

attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg 360

aatttcgatt ccagagtatg aggaattctt tctatcatct attgctgata attccattgg 420

aaattctcaa taccctttat tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa tttttccaac 480

ggaatttcga ttccagagta tgagcaattg tttctatcat ctattgctga taattccatt 540

ggaaattctc aatacccttt attgacatct ttatttttca ctacaaagcg aatttttcca 600

acggaatttc gattccagag tatgaggaat tctttctatc atctattgct gataattcca 660

ttggaaattc tcaataccct ttattgacat ctttattttt cactacaaag cgaatttttc 720

caacggaatt tcgattccag agtatgagga attctttcta tcatctattg ctgataattc 780

cattggaaat tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt 840

tccaacggaa tttcgattcc agagtatgag caattgtttc tatcatctat tgctgataat 900

tccattggaa attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt 960

tttccaacgg aatttcgatt ccagagtatg aggaattctt tctatcatct attgctgata 1020

attccattgg aaattctcaa taccctttat tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa 1080

tttttccaac ggaatttcga ttccagagta tgaggaattc tttctatcat ctattgctga 1140

taattccatt ggaaattctc aatacccttt attgacatct ttatttttca ctacaaagcg 1200

aatttttcca acggaatttc gattccagag tatgagcaat tgtttctatc atctattgct 1260

gataattcca ttggaaattc tcaataccct ttattgacat ctttattttt cactacaaag 1320

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attaacagat atataaatgg aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt 1740

tcagtttgta ttacttctta ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat 1800

acctctatac tttaacgtca aggagaaaaa actata 1836

<210> 89

<211> 981

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR8" <223> "pLYR8

<220>

<223> pLYR8

<220>

<223> pLYR8

<400> 89

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tgctcatact ctggaatcga aattccgttg gaaaaattcg ctttgtagtg aaaaataaag 420

atgtcaataa agggtattga gaatttccaa tggaattatc agcaatagat gatagaaaga 480

attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt cgctttgtag tgaaaaataa 540

agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta tcagcaatag atgatagaaa 600

gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa ttcgctttgt agtgaaaaat 660

aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat tatcagcaat agatgataga 720

aacaattcta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta acataataac 780

cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa aaaataagat 840

atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt cttgctctct 900

tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc gtcagataca tagatacaat 960

tctattaccc ccatccatac a 981

<210> 90

<211> 981

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR9" <223> "pLYR9

<220>

<223> pLYR9

<220>

<223> pLYR9

<400> 90

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tgtttctatc atctattgct gataattcca ttggaaattc tcaataccct ttattgacat 420

ctttattttt cactacaaag cgaatttttc caacggaatt tcgattccag agtatgagga 480

attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat tctcaatacc ctttattgac 540

atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa tttcgattcc agagtatgag 600

gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa attctcaata ccctttattg 660

acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg aatttcgatt ccagagtatg 720

agcaattcta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta acataataac 780

cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa aaaataagat 840

atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt cttgctctct 900

tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc gtcagataca tagatacaat 960

tctattaccc ccatccatac a 981

<210> 91

<211> 1225

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR10" <223> "pLYR10

<220>

<223> pLYR10

<220>

<223> pLYR10

<400> 91

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

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tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa tttttccaac ggaatttcga ttccagagta 840

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tatgagcaat tctaattaag ttagtcaagg cgccatcctc atgaaaactg tgtaacataa 1020

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caattctatt acccccatcc ataca 1225

<210> 92

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR11" <223> "pLYR11

<220>

<223> pLYR11

<220>

<223> pLYR11

<400> 92

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

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atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tgctcatact ctggaatcga aattccgttg gaaaaattcg ctttgtagtg aaaaataaag 420

atgtcaataa agggtattga gaatttccaa tggaattatc agcaatagat gatagaaaga 480

attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt cgctttgtag tgaaaaataa 540

agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta tcagcaatag atgatagaaa 600

gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa ttcgctttgt agtgaaaaat 660

aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat tatcagcaat agatgataga 720

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ataaagatgt caataaaggg tattgagaat ttccaatgga attatcagca atagatgata 840

gaaagaattc ctcatactct ggaatcgaaa ttccgttgga aaaattcgct ttgtagtgaa 900

aaataaagat gtcaataaag ggtattgaga atttccaatg gaattatcag caatagatga 960

tagaaagaat tcctcatact ctggaatcga aattccgttg gaaaaattcg ctttgtagtg 1020

aaaaataaag atgtcaataa agggtattga gaatttccaa tggaattatc agcaatagat 1080

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<210> 93

<211> 686

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pMET17" <223> "pMET17

<220>

<223> pMET17

<220>

<223> pMET17

<400> 93

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgagg 360

tcacatgatc gcaaaatggc aaatggcacg tgaagctgtc gatattgggg aactgtggtg 420

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ataaccgaag tgtcgaaaag gtggcacctt gtccaattga acacgctcga tgaaaaaaat 540

aagatatata taaggttaag taaagcgtct gttagaaagg aagtttttcc tttttcttgc 600

tctcttgtct tttcatctac tatttccttc gtgtaataca gggtcgtcag atacatagat 660

acaattctat tacccccatc cataca 686

<210> 94

<211> 510

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pMET6" <223> "pMET6

<220>

<223> pMET6

<220>

<223> pMET6

<400> 94

ccacaggaaa tatttcacgt gacttacaaa cagagtcgta cgtcaggacc ggagtcaggt 60

gaaaaaatgt gggccggtaa agggaaaaaa ccagaaacgg gactactatc gaactcgttt 120

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tatttccatc tttactagca ttagtttctc ttttacgtat tcaatatttt tgttaaactc 420

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accaatataa tttcaaagta catatcaaaa 510

<210> 95

<211> 508

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pMET14" <223> "pMET14

<220>

<223> pMET14

<220>

<223> pMET14

<400> 95

cctatgcatg tttagagcaa gcgcctttgt gagccctccc ggttacgacg ccttggcaat 60

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tcgcgagaaa tgtaaataag ccaacaacca agaatgcgta acattaaaga atacagttgc 180

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aagccacctc aaaaaatgtg gcaatggaga agaggatgaa cgactcaata tgacttcaac 360

ttcatgaatt tgtcaaaata tctatataag atgcaaaatt tctatacaac atcagttgcg 420

tatccgttaa tgtcgttcat tttctctctt tgttcgaact tgacatcaag aaaagttgga 480

attatttctc caagcacact gtacacca 508

<210> 96

<211> 552

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pMET3" <223> "pMET3

<220>

<223> pMET3

<220>

<223> pMET3

<400> 96

aacgatatgt acgtagtggt ataaggtgag ggggtccaca gatataacat cgtttaattt 60

agtactaaca gagacttttg tcacaactac atataagtgt acaaatatag tacagatatg 120

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ccagaaaagt cacgtgtaat tttgtaactc accgcattct agcggtccct gtcgtgcaca 240

ctgcactcaa caccataaac cttagcaacc tccaaaggaa atcaccgtat aacaaagcca 300

cagttttaca acttagtctc ttatgaagtt acttaccaat gagaaataga ggctctttct 360

cgacaaatat gaatatggat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatgt 420

aaacttggtt cttttttagc ttgtgatctc tagcttgggt ctctctctgt cgtaacagtt 480

gtgatatcgt ttcttaacaa ttgaaaagga actaagaaag tataataata acaagaataa 540

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<210> 97

<211> 363

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pSAM1" <223> "pSAM1

<220>

<223> pSAM1

<220>

<223> pSAM1

<400> 97

gaaacggacg taagacggaa atagaatttg aagataaagt tatatatcac tacacacgaa 60

tactttcttt tttttttttc acaggaaaac tgtggtggcg cccttgccta ctagtgcatt 120

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gacgtatata tcgactggtg ttgtctgtta ttcatcgttg tttttcggtt agcttcgaaa 300

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aat 363

<210> 98

<211> 500

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pSAM2" <223> "pSAM2

<220>

<223> pSAM2

<220>

<223> pSAM2

<400> 98

gagctttgct ctattatata agataaaata tgcactaaaa gtttgcattt ctttacataa 60

ctaaaactaa gacattatgc atagcttacc tgatcaaaaa gtatgtaaac ttgttaacat 120

cttcacatgt gattcatctg gtcgtacttt cttgcggtgc agtgtaatat ttctacccac 180

gtgactataa ttgagcttga aaactgtggc gtttttccac cgatgggtcc acgccagata 240

ttaaccgaag ccaaaatacc gatgaaattt ctgagatagc tcttgtaaac gacgtcaaat 300

cttcatatgc aaggagatct tgatttcttt ttggtagtca tctgtcgtct tgaggcgtat 360

aagaaggagg ttatatctgt cctttctaca aagtattttc gagaatcttg cttctgcccc 420

ttttttcttt ttttaaaagg tttaaaaaac ataactgtct tcaatatatc cagtatttac 480

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<210> 99

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> tTDH2" <223> "tTHD2

<220>

<223> tTDH2

<220>

<223> tTHD2

<400> 99

atttaactcc ttaagttact ttaatgattt agtttttatt attaataatt catgctcatg 60

acatctcata tacacgttta taaaacttaa atagattgaa aatgtattaa agattcctca 120

gggattcgat ttttttggaa gtttttgttt ttttttcctt gagatgctgt agtatttggg 180

aacaattata caatcgaaag atatatgctt acattcgacc gttttagccg tgatcattat 240

cctatagtaa cataacctga agcataactg acactactat catcaatact tgtcacatga 300

<210> 100

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> tCYC1" <223> "tCYC1

<220>

<223> tCYC1

<220>

<223> tCYC1

<400> 100

acaggcccct tttcctttgt cgatatcatg taattagtta tgtcacgctt acattcacgc 60

cctcctccca catccgctct aaccgaaaag gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc 120

cctatttatt ttttttaata gttatgttag tattaagaac gttatttata tttcaaattt 180

ttcttttttt tctgtacaaa cgcgtgtacg catgtaacat tatactgaaa accttgcttg 240

agaaggtttt gggacgctcg aaggctttaa tttgcaagct tcgcagttta cactctcatc 300

<210> 101

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> tTDH3" <223> "tTDH3

<220>

<223> tTDH3

<220>

<223> tTDH3

<400> 101

gtgaatttac tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatgacttag 60

tttcaattta tatactattt taatgacatt ttcgattcat tgattgaaag ctttgtgttt 120

tttcttgatg cgctattgca ttgttcttgt ctttttcgcc acatgtaata tctgtagtag 180

atacctgata cattgtggat gctgagtgaa attttagtta ataatggagg cgctcttaat 240

aattttgggg atattggctt ttttttttaa agtttacaaa tgaatttttt ccgccaggat 300

<210> 102

<211> 354

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> tADH1" <223> "tADH1

<220>

<223> tADH1

<220>

<223> tADH1

<400> 102

actagttcta gagcggccgc caccgcggtg ggcgaatttc ttatgattta tgatttttat 60

tattaaataa gttataaaaa aaataagtgt atacaaattt taaagtgact cttaggtttt 120

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tcggtgtgta ttttatgtcc tcagaggaca acacctgttg taatcgttct tcca 354

<210> 103

<211> 301

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> tADH2" <223> "tADH2

<220>

<223> tADH2

<220>

<223> tADH2

<400> 103

gcggatctct tatgtcttta cgatttatag ttttcattat caagtatgcc tatattagta 60

tatagcatct ttagatgaca gtgttcgaag tttcacgaat aaaagataat attctacttt 120

ttgctcccac cgcgtttgct agcacgagtg aacaccatcc ctcgcctgtg agttgtaccc 180

attcctctaa actgtagaca tggtagcttc agcagtgttc gttatgtacg gcatcctcca 240

acaaacagtc ggttatagtt tgtcctgctc ctctgaatcg tctccctcga tatttctcat 300

t 301

<210> 104

<211> 299

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> tTPI1" <223> "tTPI1

<220>

<223> tTPI1

<220>

<223> tTPI1

<400> 104

gattaatata attatataaa aatattatct tcttttcttt atatctagtg ttatgtaaaa 60

taaattgatg actacggaaa gcttttttat attgtttctt tttcattctg agccacttaa 120

atttcgtgaa tgttcttgta agggacggta gatttacaag tgatacaaca aaaagcaagg 180

cgctttttct aataaaaaga agaaaagcat ttaacaattg aacacctcta tatcaacgaa 240

gaatattact ttgtctctaa atccttgtaa aatgtgtacg atctctatat gggttactc 299

<210> 105

<211> 299

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> tMET17" <223> "tMET17

<220>

<223> tMET17

<220>

<223> tMET17

<400> 105

gtgtgcgtaa tgagttgtaa aattatgtat aaacctactt tctctcacaa gtactatact 60

tttataaaac gaactttatt gaaatgaata tccttttttt cccttgttac atgtcgtgac 120

tcgtactttg aacctaaatt gttctaacat caaagaacag tgttaattcg cagtcgagaa 180

gaaaaatatg gtgaacaaga ctcatctact tcatgagact actttacgcc tcctataaag 240

ctgtcacact ggataaattt attgtaggac caagttacaa aagaggatga tggaggttt 299

<210> 106

<211> 305

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> tENO2" <223> "tENO2

<220>

<223> tENO2

<220>

<223> tENO2

<400> 106

ggatcctaaa gtgcttttaa ctaagaatta ttagtctttt ctgcttattt tttcatcata 60

gtttagaaca ctttatatta acgaatagtt tatgaatcta tttaggttta aaaattgata 120

cagttttata agttactttt tcaaagactc gtgctgtcta ttgcataatg cactggaagg 180

ggaaaaaaaa ggtgcacacg cgtggctttt tcttgaattt gcagtttgaa aaataactac 240

atggatgata agaaaacatg gagtacagtc actttgagaa ccttcaatca gctggtaacg 300

tcttc 305

<210> 107

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> tMET3" <223> "tMET3

<220>

<223> tMET3

<220>

<223> tMET3

<400> 107

tcgtcataaa atgctcccat ctcaaaagta gggcaaaatt catgatcgac cgcgcaaaat 60

aaatagattt gcaaataagt tttgtatgta catttattaa tatatataat atatcaaaag 120

aaaaaaatca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ttgcactctt attcagtcat caattacaaa 180

acctagagat agcgatggtg catattcaat aaaaaactcc ttatactgtc gagaaagctt 240

attattggta cttctcgaag atactaaaaa aggttaattt ttggagacgg aggcaatagc 300

<210> 108

<211> 301

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> tPGK1" <223> "tPGK1

<220>

<223> tPGK1

<220>

<223> tPGK1

<400> 108

attgaattga attgaaatcg atagatcaat ttttttcttt tctctttccc catcctttac 60

gctaaaataa tagtttattt tattttttga atatttttta tttatatacg tatatataga 120

ctattattta tcttttaatg attattaaga tttttattaa aaaaaaattc gctcctcttt 180

taatgccttt atgcagtttt tttttcccat tcgatatttc tatgttcggg ttcagcgtat 240

tttaagttta ataactcgaa aattctgcgt tcgttaaagc tttcgagaag gatattattt 300

a 301

<210> 109

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> tDIT1" <223> "tDIT1

<220>

<223> tDIT1

<220>

<223> tDIT1

<400> 109

taaagtaaga gcgctacatt ggtctacctt tttgttcttt tacttaaaca ttagttagtt 60

cgttttcttt ttctcatttt tttatgtttc ccccccaaag ttctgatttt ataatatttt 120

atttcacaca attccattta acagaggggg aatagattct ttagcttaga aaattagtga 180

tcaatatata tttgcctttc ttttcatctt ttcagtgata ttaatggttt cgagacactg 240

caatggccct agttgtctaa gaggatagat gttactgtca aagatgatat tttgaatttc 300

<210> 110

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> tRPL3" <223> "tRPL3

<220>

<223> tRPL3

<220>

<223> tRPL3

<400> 110

gaagttttgt tagaaaataa atcatttttt aattgagcat tcttattcct attttattta 60

aatagtttta tgtattgtta gctacataca acagtttaaa tcaaattttc tttttcccaa 120

gtccaaaatg gaggtttatt ttgatgaccc gcatgcgatt atgttttgaa agtataagac 180

tacatacatg tacatatatt taaacatgta aacccgtcca ttatattgct tactttcttc 240

ttttttgccg ttttgacttg gacctctggt ttgctatttc cttacaatct ttgctacaat 300

<210> 111

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> tRPL41B" <223> "tRPL41B

<220>

<223> tRPL41B

<220>

<223> tRPL41B

<400> 111

gcggattgag agcaaatcgt taagttcagg tcaagtaaaa attgatttcg aaaactaatt 60

tctcttatac aatcctttga ttggaccgtc atcctttcga atataagatt ttgttaagaa 120

tattttagac agagatctac tttatattta atatctagat attacataat ttcctctcta 180

ataaaatatc attaataaaa taaaaatgaa gcgatttgat tttgtgttgt caacttagtt 240

tgccgctatg cctcttgggt aatgctatta ttgaatcgaa gggctttatt atattaccct 300

<210> 112

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> tRPL15A" <223> "tRPL15A

<220>

<223> tRPL15A

<220>

<223> tRPL15A

<400> 112

gctggttgat ggaaaatata attttattgg gcaaactttt gtttatctga tgtgttttat 60

actattatct ttttaattaa tgattctata tacaaacctg tatatttttt ctttaaccaa 120

tttttttttt tatagaccta gagctgtact tttattctgc tatcaagcaa acccctaccc 180

cctcttctca atcctcccct caggcagaac ttatctacct gtatcaagga gcggacgagg 240

gagtcctaat tgttctacgt ataccaatgc tagcagctta cataggtggt ggcactacca 300

<210> 113

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> tIDP1" <223> "tIDP1

<220>

<223> tIDP1

<220>

<223> tIDP1

<400> 113

tcgaatttac gtagcccaat ctaccacttt tttttttcat tttttaaagt gttatactta 60

gttatgctct aggataatga actacttttt tttttttttt tttactgtta tcataaatat 120

atatacctta ttgttgtttg caaccgtcgg ttaattcctt atcaaggttc cccaagttcg 180

gatcattacc atcaatttcc aacattttca tgagttcttc ttcttcatta ccgtgtttta 240

gggggctgtt cgcacttcta atagggctat caccaagctg ttctaattcg tccaaaagtt 300

<210> 114

<211> 1089

<212> DNA

<213> 乳酸克鲁维酵母

<220>

<223> Leu2" <223> "Leu2

<220>

<223> Leu2

<220>

<223> Leu2

<400> 114

atgtctaaga atatcgttgt cctaccgggt gatcacgtcg gtaaagaagt tactgacgaa 60

gctattaagg tcttgaatgc cattgctgaa gtccgtccag aaattaagtt caatttccaa 120

catcacttga tcgggggtgc tgccatcgat gccactggca ctcctttacc agatgaagct 180

ctagaagcct ctaagaaagc cgatgctgtc ttactaggtg ctgttggtgg tccaaaatgg 240

ggtacgggcg cagttagacc agaacaaggt ctattgaaga tcagaaagga attgggtcta 300

tacgccaact tgagaccatg taactttgct tctgattctt tactagatct ttctcctttg 360

aagcctgaat atgcaaaggg taccgatttc gtcgtcgtta gagaattggt tggtggtatc 420

tactttggtg aaagaaaaga agatgaaggt gacggagttg cttgggactc tgagaaatac 480

agtgttcctg aagttcaaag aattacaaga atggctgctt tcttggcatt gcaacaaaac 540

ccaccattac caatctggtc tcttgacaag gctaacgtgc ttgcctcttc cagattgtgg 600

agaaagactg ttgaagaaac catcaagact gagttcccac aattaactgt tcagcaccaa 660

ttgatcgact ctgctgctat gattttggtt aaatcaccaa ctaagctaaa cggtgttgtt 720

attaccaaca acatgtttgg tgatattatc tccgatgaag cctctgttat tccaggttct 780

ttgggtttat taccttctgc atctctagct tccctacctg acactaacaa ggcattcggt 840

ttgtacgaac catgtcatgg ttctgcccca gatttaccag caaacaaggt taacccaatt 900

gctaccatct tatctgcagc tatgatgttg aagttatcct tggatttggt tgaagaaggt 960

agggctcttg aagaagctgt tagaaatgtc ttggatgcag gtgtcagaac cggtgacctt 1020

ggtggttcta actctaccac tgaggttggc gatgctatcg ccaaggctgt caaggaaatc 1080

ttggcttaa 1089

<210> 115

<211> 362

<212> PRT

<213> 乳酸克鲁维酵母

<220>

<223> Leu2 " <223> Leu2

<220>

<223> Leu2

<220>

<223> Leu2

<400> 115

Met Ser Lys Asn Ile Val Val Leu Pro Gly Asp His Val Gly Lys Glu

1 5 10 15

Val Thr Asp Glu Ala Ile Lys Val Leu Asn Ala Ile Ala Glu Val Arg

20 25 30

Pro Glu Ile Lys Phe Asn Phe Gln His His Leu Ile Gly Gly Ala Ala

35 40 45

Ile Asp Ala Thr Gly Thr Pro Leu Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ala Ser

50 55 60

Lys Lys Ala Asp Ala Val Leu Leu Gly Ala Val Gly Gly Pro Lys Trp

65 70 75 80

Gly Thr Gly Ala Val Arg Pro Glu Gln Gly Leu Leu Lys Ile Arg Lys

85 90 95

Glu Leu Gly Leu Tyr Ala Asn Leu Arg Pro Cys Asn Phe Ala Ser Asp

100 105 110

Ser Leu Leu Asp Leu Ser Pro Leu Lys Pro Glu Tyr Ala Lys Gly Thr

115 120 125

Asp Phe Val Val Val Arg Glu Leu Val Gly Gly Ile Tyr Phe Gly Glu

130 135 140

Arg Lys Glu Asp Glu Gly Asp Gly Val Ala Trp Asp Ser Glu Lys Tyr

145 150 155 160

Ser Val Pro Glu Val Gln Arg Ile Thr Arg Met Ala Ala Phe Leu Ala

165 170 175

Leu Gln Gln Asn Pro Pro Leu Pro Ile Trp Ser Leu Asp Lys Ala Asn

180 185 190

Val Leu Ala Ser Ser Arg Leu Trp Arg Lys Thr Val Glu Glu Thr Ile

195 200 205

Lys Thr Glu Phe Pro Gln Leu Thr Val Gln His Gln Leu Ile Asp Ser

210 215 220

Ala Ala Met Ile Leu Val Lys Ser Pro Thr Lys Leu Asn Gly Val Val

225 230 235 240

Ile Thr Asn Asn Met Phe Gly Asp Ile Ile Ser Asp Glu Ala Ser Val

245 250 255

Ile Pro Gly Ser Leu Gly Leu Leu Pro Ser Ala Ser Leu Ala Ser Leu

260 265 270

Pro Asp Thr Asn Lys Ala Phe Gly Leu Tyr Glu Pro Cys His Gly Ser

275 280 285

Ala Pro Asp Leu Pro Ala Asn Lys Val Asn Pro Ile Ala Thr Ile Leu

290 295 300

Ser Ala Ala Met Met Leu Lys Leu Ser Leu Asp Leu Val Glu Glu Gly

305 310 315 320

Arg Ala Leu Glu Glu Ala Val Arg Asn Val Leu Asp Ala Gly Val Arg

325 330 335

Thr Gly Asp Leu Gly Gly Ser Asn Ser Thr Thr Glu Val Gly Asp Ala

340 345 350

Ile Ala Lys Ala Val Lys Glu Ile Leu Ala

355 360

<210> 116

<211> 499

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pNUP57

<220>

<223> pNUP57

<400> 116

tcatctgcgc aatgactatc aagaccttct gcaagaattt caaatctcac tgaaaatctt 60

gaccgaaaag tgtcttgaaa acccatcaag cctgcaaaac ctatctttga cattagtctc 120

cattataaaa acggcatagt tgggagaaaa cttttcatac ttcaattgtg gactgatata 180

agtattttgg ttttgcccgc atgatcatcc cacatggcta cagcagttct ctcataggaa 240

atagtacaat agctacgtga tataatctaa ataattgttg ccaatgtgta attatatcat 300

tttgaacgtt cgcgaaatgg attattttca aaaattttgt ttcttgaaat gagtaaaagc 360

aaaagtccaa ctctccaagt cgatgtaaac aactttttgc caaagggact gaaagactaa 420

atcgaggatt atcccgttca aactattcca gaaacgctcg ttagtaacaa aagacatacc 480

ttgttgacca attgatcac 499

<210> 117

<211> 451

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pGAP1

<220>

<223> pGAP1

<400> 117

cactttcacc agatcccaaa tgtcccgccc ctattcccgt gttccatcac gtaccataac 60

ttaccatttc atcacgttct ctatggcaca ctggtactgc ttcgactgct ttgcttcatc 120

ttctctatgg gccaatgagc taatgagcac aatgtgctgc gaaataaagg gatatctaat 180

ttatattatt acattataat atgtactagt gtggttattg gtaattgtac ttaattttga 240

tatataaagg gtggatcttt ttcattttga atcagaattg gaattgcaac ttgtctcttg 300

tcactattac ttaatagtaa ttatatttct tattaacctt ttttttaagt caaaacacca 360

aggacaagaa ctactcttca aaggtatttc aagttatcat acgtctcaca cacgcttcac 420

agtttcaagt aaaaaaaaag aatattacac a 451

<210> 118

<211> 998

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pJEN1

<220>

<223> pJEN1

<400> 118

aatgtgttta taaattattt tttttgctgg tagcaaaatc aactcattgt cttccattca 60

gagtctaatc gaacgttatc gcaatgcttg cacactttta aacaatacga tttagtttaa 120

gtggatggac ccccacgctt agtgttccac aggtttgtcc ccactgtttt tacattccac 180

tgtacatttt tgcaatagaa ggtcattgta tgctaccttg ggcggctaag aatacctgta 240

aaaatttgga gaaattagat tcgtaaagaa tgactcgcaa cgactccaat gatttcttct 300

tttcaccctt tgaacggccg atatccgcgc gggatcctga ccccgcaatt tactccacta 360

gaccggcgtg tttctctttt tccttttcct ggggttagag cccaagagct aatagccgac 420

aaacggactc caaaaaaaaa aggaggcaca ggacaaacgc agcacctgcg tcattcacgc 480

tgaagcggca gcaagcattt tcgatcagct ccaattaaat gaagactatt cgccgtaccg 540

ttcccagatg ggtgcgaaag tcagtgatcg aggaagttat tgagcgcgcg gcttgaaact 600

atttctccat ctcagagccg ccaagcctac cattattctc caccaggaag ttagtttgta 660

agcttctgca caccatccgg acgtccataa ttcttcactt aacggtcttt tgccccccct 720

tctactataa tgcattagaa cgttacctgg tcatttggat ggagatctaa gtaacactta 780

ctatctccta tggtactatc ctttaccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaatcag 840

caaagtgaag taccctcttg atgtataaat acattgcaca tcattgttga gaaatagttt 900

tggaagttgt ctagtccttc tcccttagat ctaaaaggaa gaagagtaac agtttcaaaa 960

gtttttcctc aaagagatta aatactgcta ctgaaaat 998

<210> 119

<211> 450

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pICL1

<220>

<223> pICL1

<400> 119

ttttgctact cgtcatccga tgagaaaaac tgttcccttt tgccccaggt ttccattcat 60

ccgagcgatc acttatctga cttcgtcact ttttcatttc atccgaaaca atcaaaactg 120

aagccaatca ccacaaaatt aacactcaac gtcatctttc actacccttt acagaagaaa 180

atatccatag tccggactag catcccagta tgtgactcaa tattggtgca aaagagaaaa 240

gcataagtca gtccaaagtc cgcccttaac caggcacatc ggaattcaca aaacgtttct 300

ttattatata aaggagctgc ttcactggca aaattcttat tatttgtctt ggcttgctaa 360

tttcatctta tccttttttt cttttcacac ccaaatacct aacaattgag agaaaactct 420

tagcataaca taacaaaaag tcaacgaaaa 450

<210> 120

<211> 598

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pADH2

<220>

<223> pADH2

<400> 120

tatcttaact gatagtttga tcaaaggggc aaaacgtagg ggcaaacaaa cggaaaaatc 60

gtttctcaaa ttttctgatg ccaagaactc taaccagtct tatctaaaaa ttgccttatg 120

atccgtctct ccggttacag cctgtgtaac tgattaatcc tgcctttcta atcaccattc 180

taatgtttta attaagggat tttgtcttca ttaacggctt tcgctcataa aaatgttatg 240

acgttttgcc cgcaggcggg aaaccatcca cttcacgaga ctgatctcct ctgccggaac 300

accgggcatc tccaacttat aagttggaga aataagagaa tttcagattg agagaatgaa 360

aaaaaaaaaa aaaaaaggca gaggagagca tagaaatggg gttcactttt tggtaaagct 420

atagcatgcc tatcacatat aaatagagtg ccagtagcga cttttttcac actcgaaata 480

ctcttactac tgctctcttg ttgtttttat cacttcttgt ttcttcttgg taaatagaat 540

atcaagctac aaaaagcata caatcaacta tcaactatta actatatcgt aatacaca 598

<210> 121

<211> 793

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<223> pMLS1

<220>

<223> pMLS1

<400> 121

tgtctaatgc gaaggtactt ttattttttt cagattcaaa gcaatattat ttagacaatt 60

gatactaagt gagcttaagg aggattaaac aactgtggaa tccttcacaa ggattcaata 120

tttgtttttc ctggttattt tgccatcatt caactttcct cagacgtaaa attcgtgctt 180

agtgatgtct caatattccc gcagggtaat aaaattcaat aactatcact atatacgcaa 240

cagtattacc ctacattgct atcggctcaa tggaaatccc catatcatag cttccattgg 300

gccgatgaag ttagtcgacg gatagaagcg gttgtcccct ttcccggcga gccggcagtc 360

gggccgaggt tcggataaat tttgtattgt gttttgattc tgtcatgagt attacttatg 420

ttctctttag gtaaccccag gttaatcaat cacagtttca taccggctag tattcaaatt 480

atgacttttc ttctgcagtg tcagccttac gacgattatc tatgagcttt gaatatagtt 540

tgccgtgatt cgtatcttta attggataat aaaatgcgaa ggatcgatga cccttattat 600

tatttttcta cactggctac cgatttaact catcttcttg aaagtatata agtaacagta 660

aaatataccg tacttctgct aatgttattt gtcccttatt tttcttttct tgtcttatgc 720

tatagtacct aagaataacg actattgttt tgaactaaac aaagtagtaa aagcacataa 780

aagaattaag aaa 793

Claims

1.一种产依克多因重组酵母，在其基因组中：

(A)(i)编码天冬氨酸激酶的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；和/或

(ii)编码天冬氨酸激酶的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；

(B)编码能够用作辅酶NAD和NADP两者的天冬氨酸半醛脱氢酶的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；

(F)(i)编码高丝氨酸脱氢酶的至少一种内源核酸已经缺失和/或中断，和/或

(ii)编码高丝氨酸脱氢酶的至少一种核酸独立地：

-在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下；

-在弱启动子的控制下；和/或

-呈非稳定形式。

2.根据权利要求1所述的重组酵母，在其基因组中，编码天冬氨酸转氨酶的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

3.根据权利要求1所述的重组酵母，在其基因组中，编码将氧化戊二酸转化为谷氨酸的谷氨酸脱氢酶的至少一种核酸过表达和/或在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下。

4.根据权利要求1所述的重组酵母，在其基因组中，已经进行以下修饰中的至少一者：

(A)编码一般氨基酸通透酶AGP3的至少一种内源核酸已经从所述酵母的基因组中缺失，以及：

(B)编码支链氨基酸通透酶3的至少一种内源核酸已经从所述酵母的基因组中缺失，以及：

(C)编码支链氨基酸通透酶2的至少一种内源核酸已经从所述酵母的基因组中缺失，以及：

(D)编码一般氨基酸通透酶GAP1的至少一种内源核酸已经从所述酵母的基因组中缺失，以及：

(E)编码高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的至少一种内源核酸已经从所述酵母的基因组中缺失，以及：

(F)编码一般氨基酸通透酶AGP1的至少一种内源核酸已经从所述酵母的基因组中缺失，以及：

(i)编码一般氨基酸通透酶AGP1的至少一种核酸已经插入并且在诱导型启动子或阻遏型启动子的控制下，和/或

(G)编码低亲和力甲硫氨酸通透酶MUP3的至少一种内源核酸已经从所述酵母的基因组中缺失，以及：

(H)编码高亲和力甲硫氨酸通透酶MUP1的至少一种内源核酸已经从所述酵母的基因组中缺失，以及：

(I)编码可能的转运蛋白AQR1的至少一种核酸过表达；和/或

(J)编码多胺转运蛋白1的至少一种核酸过表达。

5.根据权利要求4所述的重组酵母，在其基因组中，已经进行如权利要求4所指示的所述修饰中的至少两者。

6.根据权利要求1所述的重组酵母，其中，编码天冬氨酸激酶的所述核酸是来自酵母的核酸。

7.根据权利要求1所述的重组酵母，其中，编码高丝氨酸-O-乙酰转移酶METX的所述核酸是来自细菌的核酸。

8.根据权利要求1所述的重组酵母，其中，编码一般氨基酸通透酶、支链氨基酸通透酶3、支链氨基酸通透酶2、一般氨基酸通透酶GAP1、高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1、一般氨基酸通透酶AGP1、低亲和力甲硫氨酸通透酶MUP3和高亲和力甲硫氨酸通透酶MUP1的至少一种核酸独立地是来自酵母的核酸。

9.根据权利要求1所述的重组酵母，其中，过表达的所述核酸中的至少一者在强启动子的控制下。

10.根据权利要求1所述的重组酵母，其中，所述诱导型启动子或阻遏型启动子独立地选自由以下组成的组：用铜可诱导或可阻遏的启动子、用甲硫氨酸可诱导或可阻遏的启动子和用苏氨酸可诱导或可阻遏的启动子。

11.根据权利要求1所述的重组酵母，其中，所述弱启动子独立地选自由以下组成的组：pURA3、pRPLA1、pNUP57和pGAP1。

12.根据权利要求1所述的重组酵母，其中，所述诱导型启动子或阻遏型启动子独立地选自由以下组成的组：用铜可诱导或可阻遏的启动子、用赖氨酸可诱导或可阻遏的启动子和用甲硫氨酸可诱导或可阻遏的启动子。

13.一种用于产生依克多因的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在培养基中培养如权利要求1所限定的重组酵母；和

(b)从所述培养基回收所述依克多因。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述培养基至少包含碳源。