CN110903345A - 靶向雄激素受体的小分子降解剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向雄激素受体的小分子降解剂，属于生物医药领域，具体包括一系列靶向泛素化降解雄激素受体蛋白的化合物、其合成方法以及医药用途，特别是作为预防或治疗雄激素受体相关疾病。同时发明人针对合成的化合物做了一系列的体外抗肿瘤活性评价，本发明中的化合物对癌细胞均有一定的抑制活性。

Description

靶向雄激素受体的小分子降解剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体包括靶向雄激素受体降解剂的一系列衍生物及其制备方法与应用。

技术背景

前列腺癌(PC)是全球癌症相关男性死亡的第二大原因，美国癌症协会预计2019年前列腺癌将占所有新增癌症诊断病例的20％(R.L.Siegel.et al.Cancer statistics,2019,69:7-34)。研究表明，前列腺癌的发展和恶化与雄激素和雄激素受体信号调控密切相关。雄激素受体(androgen receptor,AR)属于核受体超家族中的类固醇受体，是一种配体依赖型的反式转录调节蛋白。人类的AR基因全长约90kb，分子质量约110 kD，共编码919个氨基酸。AR包含N端域(N-terminal domain,NTD)、DNA结合域C(DNA-binding domain,DBD)、铰链区以及配体结合域(ligand-binding domain,LBD) 4个结构(Liu C.et al.Prostate,2015,75:1341-1353)。由于PC的进展主要受雄激素的刺激，因此抑制雄激素的分泌、作用对控制PC的发展非常有效。1941年，Charles和Huggins 首次报道了系统性雄激素切除对于晚期前列腺癌患者有着很好的作用(Yap,T.et al.Sci. Transl Med,2012,4:127-110)。自此通过手术或化学药物实行的雄激素剥夺疗法(ADT) 普遍用于晚期前列腺癌患者的治疗，该方法在初始阶段具有明显抑制前列腺癌的效果，但2-3年后大部分病人最终都会不可避免的发展成更为严重的去势抵抗性前列腺癌 (castration resistant prostate cancer,CRPC)。但幸运的是有研究证据表明，在血清睾酮达到去势水平的情况下，前列腺癌组织中的雄激素浓度仍有低水平的维持，足够激活AR 介导的信号转导途径和相关基因的表达，因此该阶段肿瘤的发展与恶化仍依赖AR信号转导途径生长。

泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是细胞中蛋白降解的主要途径，参与细胞中80％以上的蛋白质的降解。UPS由泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素-蛋白质连接酶(E3)、26S蛋白酶体及其目标蛋白组成。泛素活化酶系统负责活化泛素，并将其结合到待降解的蛋白上，形成靶蛋白多聚泛素链，即泛素化。蛋白酶体系统可以识别已泛素化的蛋白并将其降解。蛋白水解靶向嵌合分子(protein proteolysis-targeting chimeras,PROTACs)是一种杂合双功能小分子化合物 (Sakamoto KM.etal.Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98:8554-8559)，包括一个能够与目标靶蛋白(protein of interst,POI)结合的小分子化合物，在其合适位置上连接基团，再与一个能够与E3泛素连接酶结合的小分子化合物连接。PROTACs通过将目标靶蛋白和细胞内的E3拉近，形成靶蛋白-PROTACs-E3三元聚合体，通过E3泛素连接酶给目标靶蛋白加上泛素化蛋白标签，利用泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)特异性地降解靶蛋白(如图1)。

恩扎鲁胺(Enzalutamide)是由Medivation和阿斯特拉制药公司联合开发的硫代乙内酰脲类AR拮抗剂，并且于2012年8月31日被FDA批准用于治疗多西他赛耐受的去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。这也是目前唯一一个已上市的用于治疗晚期前列腺癌的第二代雄激素受体拮抗剂药物。2013年，恩扎鲁胺的销售额已接近10亿美元，有分析师甚至预测至2020年该药的销售额可达57亿美元。基于对恩杂鲁胺构效关系的研究，设计并合成了一系列基于恩杂鲁胺的雄激素受体降解剂，其能选择性的结合AR，降解 AR全长和AR-V7。

发明内容

发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一类靶向泛素化降解AR的化合物，以及该类化合物作为AR降解剂在预防、治疗肿瘤中的作用。

技术方案：靶向雄激素受体的小分子降解剂，包括AR抑制剂、连接链、泛素连接酶配体，所述的AR抑制剂为MDV-3100，所述的泛素连接酶配体为泊马度胺或VHL 抑制剂(V-1)；

所述的连接链分别与AR抑制剂、泛素连接酶配体共价连接。

靶向雄激素受体的小分子降解剂，其结构如式(Ⅰ)或(II)所示，或式(Ⅰ)、(II) 的立体异构体或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物；

式(Ⅰ)和(II)中，连接链的结构如式(Ⅲ)所示，

其中，

x是选自0-10的整数；

y是选自0-14的整数；

n是选自0-6的整数；

m是选自0-2的整数；

A为-CH₂-或-C(O)-；

B为-CH₂-或

其中所述连接链通过A旁边的

共价结合于AR抑制剂MDV-3100，并通过 -C(O)-旁边的

共价结合于泛素连接酶配体泊马度胺或VHL抑制剂(V-1)。

本发明中所优选的部分化合物结构如下：

一种药物组合物，包括权利要求1～2中任一所述小分子降解剂和药学上可接受的载体。

用于预防、治疗或预后受试者的疾病或障碍的组合物，包括有效量的至少一种权利要求1～2中任一所述小分子降解剂和药学上可接受的载体。

其中，所述的疾病或障碍为：前列腺癌、晚期前列腺癌和去势抗性前列腺癌。

有益效果：

由细胞增殖实验结果可知本发明大部分化合物对癌细胞有一定的抑制活性，并且体外抗肿瘤活性明显优于恩杂鲁胺，尤其是对AR-V7高表达的细胞株22RV1活性更优。Western-blot实验结果表明部分化合物对AR及ARV7均具有明显的降解作用。

附图说明

图1本发明利用泛素-蛋白酶体系统特异性地降解雄激素受体的示意图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，但并不将本发明限制在所举的实施例范围之中。

实施例1：中间体Ⅰ-5的合成

第一步：中间体Ⅰ-2的制备

将2-氟-4-硝基甲苯Ⅰ-1(70g，0.45mol)、四丁基氯化铵(8.01g，0.025mol)加入420mL水和280mL叔丁醇的混合溶剂中，加热至回流，回流后分五批，每次间隔1.5h 缓慢加入高锰酸钾(共367.75g，2.56mol)，回流反应30h，TLC检测(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝2:1)反应完全，静止待反应液温度降温至室温，抽滤，滤液加6N HCl调PH至1-2，用乙酸乙酯萃取，旋干乙酸乙酯层，得白色固体71g，收率85％。HRMS(ESI),calculated for C₇H₄FNO₄ 186.0203[M+H]⁺,found 186.0236.

第二步：中间体Ⅰ-3的制备

将1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺(32.32g，0.17mol)、1-羟基苯并三唑(25g，0.16mol)和三乙胺(32.82g，0.32mol)加入300Ml二氯甲烷中，中间体Ⅰ-2(20g， 0.11mol)加入150mL二氯甲烷中，室温搅拌溶解，冰浴降温至0℃，0℃下加入Ⅰ-2 (20g，0.11mol)，0℃搅拌1h，加入N-叔丁氧羰基乙二胺(27.36g，0.17mol)，撤去冰浴，室温下反应12h，TLC检测(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝2:1)反应完全，聚酰胺柱层析 (V_石油醚：V_乙酸乙酯＝5:1)得淡黄色固体26.52g，收率75％。HRMS(ESI),calculated for C₁₄H₁₈FN₃O₅ 328.1309[M+H]⁺,found 328.1343.

第三步：中间体Ⅰ-4的制备

将Ⅰ-3(25g，0.076mol)加入500mL甲醇中，室温搅拌溶解，加入5.0g Pd/C， H₂置换三次，室温搅拌20h，TLC检测(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝1:1)反应完全，停止反应，抽滤，滤液直接旋干，得黄色粗品25.10g，将此粗品溶于乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠水溶液洗三次，无水硫酸钠干燥，旋干，得淡黄色固体22.25g，收率98％。HRMS(ESI), calculated for C₁₄H₂₀FN₃O₃298.1567[M+H]⁺,found 298.1602.

第四步：中间体Ⅰ-5的制备

将Ⅰ-4(20g，0.068mol)、2-溴异丁酸乙酯(52.52g，0.16mol)、N，N-二异丙基乙胺(17.4g，0.13mol)和碘化钾(2g，0.012mol)加入250mL三颈瓶中，N₂置换三次，加热至110℃反应15h，TLC检测(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝2:1)原料点与产物点荧光强度相近，停止加热，趁热缓慢加入150mL二氯甲烷，待反应液温度降至室温，反应液用饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，聚酰胺柱层析(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝3:1)得淡黄色固体12.50g，收率45％。HRMS(ESI),calculated for C₂₀H₃₀FN₃O₅ 412.2248[M+H]⁺,found 412.2285.

第五步：中间体Ⅰ-6的制备

将Ⅰ-5(10g，0.024mol)加入10mL乙酸异丙酯和2mL二甲亚砜的混合溶剂中，室温搅拌溶解，完全溶解后加入Z-2(22g，0.097mol)，升温至80℃，反应15h，TLC 检测(V_二氯甲烷：V_甲醇＝20:1)，应当原料点与产物点荧光强度相似时停止反应，反应液水洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，旋干，所得油状物溶于100mL甲醇中，5N HCl调PH至2-3，升温至回流，TLC检测(V_二氯甲烷：V_甲醇＝7:1)反应完全，停止反应，静置待反应液温度降至室温，反应液旋干，加乙酸乙酯溶解，2N氢氧化钠水溶液调PH至7-8，将乙酸乙酯层旋干，聚酰胺柱层析(V_二氯甲烷：V_甲醇＝20:1)得淡黄色固体4.56g，收率38％。HRMS(ESI),calculated forC₂₂H₁₉F₄N₅O₂S 494.1274[M+H]⁺, found 494.1305.

实施例2：中间体P-1的合成

第一步：中间体II-2的制备

将II-1 3-氟酞酐(5g，0.018mol)、3-氨基-2,6-哌啶二酮(2.31g，0.018mol)及乙酸钠(1.78g，0.022mol)加入60mL乙酸中，室温搅拌溶解，升温至80℃，80℃反应15h，TLC检测(V_二氯甲烷：V_甲醇＝15:1)反应完全，停止反应，旋干，聚酰胺柱层析(V_二氯甲烷：V_甲醇＝50:1)得金黄色固体6.7g，收率81％。HRMS(ESI),calculated for C₁₃H₉FN₂O₄ 277.0625[M+H]⁺,found277.0685.

第二步：中间体II-3的制备

将II-2(3g，0.011mol)加入30ml N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌溶解，完全溶解后依次加入N-叔丁氧羰基乙二胺(2.61g，0.016mol)及N,N-二异丙基乙胺(7.02g，0.054mol)，升温至90℃，反应3h，TLC检测(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝1:1)反应完全，停止反应。静置待反应液温度降至室温。向反应液中加入30mL水，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层旋干，聚酰胺柱层析(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝3:1)得金黄色固体1.52g，收率 33％。HRMS(ESI),calculated forC₂₀H₂₄N₄O₆ 417.1774[M+H]⁺,found 417.1708.

第三步：中间体P-1的制备

将II-3(0.9g，0.0022mol)加入6mL三氟乙酸中，室温搅拌，反应8h，TLC检测(V_二氯甲烷：V_甲醇＝10:1)检测反应完全，停止反应，将反应液旋干，得金黄色固体 1.10g，收率95％。HRMS(ESI),calculated for C₁₅H₁₆N₄O₄ 316.1172[M+H]⁺,found 316.1205.

实施例3：中间体P-2的合成

第一步：中间体II-5的合成

将II-4 6-溴己酸(5g，0.026mol)加入5mL氯化亚砜中，室温搅拌反应12h，旋干，得橙黄色油状物。HRMS(ESI),calculated for C₆H₁₀BrClO 212.9682[M+H]⁺,found212.9661.

第二步：中间体II-6的合成

将上一步所得油状物加入30mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌溶解，待完全溶解后加入泊马度胺(3.50g，0.013mol)，N₂置换三次。升温至105℃，105℃反应 3.5h，TLC检测(V_二氯甲烷：V_甲醇＝20:1)反应完全，停止反应，向反应液中加入100mL 水，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，旋干得3.91g，收率68％。HRMS(ESI),calculated for C₁₉H₂₀BrN₃O₅ 450.0665[M+H]⁺,found 450.0644.

第三步：中间体P-2的合成

将II-6(3g，6.68mmol)加入20mL二甲亚砜中，室温搅拌溶解，完全溶解后加入叠氮钠(0.65g，10.02mmol)，升温至30℃，30℃反应48h，质谱检测未发现原料分子量，停止反应，向反应液中加入100mL水，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯等用饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，旋干得1.73g，收率63％。HRMS(ESI),calculated for C₁₉H₂₀N₆O₅ 413.1573[M+H]⁺,found 413.1607.

实施例4：中间体V-1的合成：

第一步：中间体III-2的合成

将(R)-(+)-1-(4-溴苯基)乙胺(9g，0.045mol)加入60mL水与60mL乙酸乙酯的混合溶液中，室温搅拌溶解，完全溶解后加入碳酸氢钠(3.78g，0.045mol)，降温至0 ℃，0℃时加入二碳酸二叔丁酯(9.81g，0.045mol)，0℃反应3h，TLC检测(V_石油醚： V_乙酸乙酯＝1:3，加三乙胺)反应完全，停止反应，抽滤，得白色固体13.11g，收率97％。 HRMS(ESI),calculated forC₁₃H₁₈BrNO₂ 300.0599[M+H]⁺,found 300.0579.

第二步：中间体III-3的合成

将III-2(12g，0.039mol)加入30ml N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌溶解，完全溶解后依次加入4-甲基噻唑(7.71g，0.078mol)、醋酸钯(90mg，0.39mmol)及醋酸钾(7.65g，0.078mol)，N₂保护，升温至80℃，80℃反应15h，TLC检测(V_石油醚 ：V_乙酸乙酯 ＝ 1:3，加三乙胺)反应完全，停止加热，降温至室温，向反应液中加入180 mL水，室温搅拌3h，抽滤，得白色固体10.98g，收率86％。HRMS(ESI),calculated for C₁₇H₂₂N₂O₂S 319.1480[M+H]⁺,found319.1446.

第三步：中间体III-4的合成

将III-3(10.5g，0.033mol)加入60mL饱和盐酸的甲醇溶液中，室温搅拌4h， TLC检测(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝1:3，加三乙胺)反应完全，抽滤，得白色固体7.11g，收率99％。HRMS(ESI),calculated for C₁₂H₁₄N₂S 219.0956[M+H]⁺,found 219.0989.

第四步：中间体III-7的合成

将N-Boc-L-叔亮氨酸III-5(10g，0.043mol)及反式-4-羟基-L-脯氨酸甲酯盐酸盐III-6(6.28g，0.043mol)加入100mL N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌溶解，完全溶解后加入N,N-二异丙基乙胺(19.57g，0.15mol)，N₂保护，降温至0℃，0℃时加入HATU (17.27g，0.045mol)，室温反应12h，TLC碘熏检测(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝1:1)反应完全，停止反应，向反应液中加入200mL水，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层依次用5％柠檬酸水溶液洗三次，饱和碳酸氢钠洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，旋干，得黄色油状物，将所得油状物溶于100mL四氢呋喃与50mL水的混合溶液中，加入氢氧化锂(16.67g，0.69mol),室温反应24h，TLC检测(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝1:3，加三乙胺)反应完全，将反应液倒入500mL冰水中，有大量白色固体析出，抽滤，干燥得白色固体14.08g，收率94％。HRMS(ESI),calculated for C₁₇H₃₀N₂O₆359.2182[M+H]⁺, found 359.2216.

第五步：中间体V-1的合成

将III-4(6.04g，0.028mol)及III-7(9.54g，0.028mol)加入150ml N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌溶解，完全溶解后加入N,N-二异丙基乙胺(14.33g，0.11mol)， N₂保护，降温至0℃，0℃时加入HATU(15.80g，0,042mol)，室温反应15h，TLC 检测(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝1:3，加三乙胺)反应完全，停止反应，向反应液中加入300mL 水，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层水洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，旋干，聚酰胺柱层析(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝1:1)得淡黄色固体13.11g，收率86％。将所得的淡黄色固体溶于300mL二氯甲烷中，室温搅拌溶解，完全溶解后降温至0℃，0℃时缓慢滴入95mL 4N盐酸的二氧六环溶液，滴加完毕，室温反应1h，TLC检测(V_石油醚： V_乙酸乙酯＝1:3，加三乙胺)反应完全，停止反应，将反应液旋干，得淡黄色固体，所得固体用V_二氯甲烷：V_石油醚＝1:1的混合溶液洗，干燥得淡黄色固体10.38g，收率97％。HRMS(ESI),calculated for C₂₃H₃₂N₄O₃S 445.2273[M+H]⁺,found 445.2307.

实施例5：连接链Y-1的合成

第一步：中间体IV-2的制备

将二乙二醇IV-1(2.23g，0.021mol)加入20mL四氢呋喃中，室温搅拌溶解，完全溶解后降温至0℃，N₂保护，0℃时加入钠氢(1.0g，0.042mol)，0℃搅拌2h，加入溴乙酸叔丁酯(8.2g，0.042mol)，0℃搅拌12h，TLC碘熏检测(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝ 3:1)反应完全，停止反应，加入30mL水淬灭反应，真空旋蒸除去四氢呋喃，水层用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，旋干，聚酰胺柱层析(V _石油醚：V_乙酸乙酯＝10:1)，得淡黄色油状物4.78g，收率68％。HRMS(ESI),calculated for C₁₆H₃₀O₇ 335.2070[M+H]⁺,found 335.2103.

第二步：连接链Y-1的制备

将IV-2(4.5g，0.013mol)加入500mL二氯甲烷中，室温搅拌溶解，完全溶解后降温至0℃，0℃时缓慢滴入三氟乙酸(101.96mL，0.16mol)，室温反应2h，TLC检测(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝1:1)反应完全，停止反应，旋干，得淡黄色油状物2.33g，收率 78％。HRMS(ESI),calculatedfor C₈H₁₅O₇ 223.0818[M+H]⁺,found 223.0851.

实施例6：以关于Y-1的制备类似的方式制备下述连接链(Y)

连接链Y-2的合成:

以乙二醇为原料制备Y-2。HRMS(ESI),calculated for C₆H₁₀O₆ 179.0556[M+H]⁺,found 179.0563.

连接链Y-3的合成:

以二缩三乙二醇为原料制备Y-3。HRMS(ESI),calculated for C₁₀H₁₈O₈ 267.1080[M+ H]⁺,found 267.1086.

连接链Y-4的合成：

第一步：中间体IV-3的制备

将二乙二醇IV-1(2g，0.019mol)加入100mL二氯甲烷中，室温搅拌溶解，完全溶解后依次加入4-甲基苯-1-磺酰氯(7.17g，0.038mol)、三乙胺(4.77g，0.047mol) 和4-二甲氨基吡啶(0.45g，0.0037mol)。室温反应12h，TLC碘熏检测(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝3:1)反应完全，停止反应，旋干，聚酰胺柱层析(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝5:1)，得淡黄色油状物3.38g，收率69％。HRMS(ESI),calculated for C₁₁H₁₆O₅S 261.0797[M+H]⁺, found 261.0830.

第二步：中间体IV-4的制备

将IV-3(3g，0.012mol)加入30ml N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌溶解，N₂保护，完全溶解后加入叠氮钠(3.72g，0.058mol)，缓慢升温至60℃，60℃反应6h，TLC 碘熏检测(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝1:1)反应完全，停止反应，向反应液中加入100mL水，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层水洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，旋干得淡黄色油状物1.44g，收率95％。HRMS(ESI),calculated for C₄H₉N₃O₂ 132.0773[M+H]⁺, found 132.0807.

第三步：中间体IV-5的制备

将IV-4(1.44g，0.011mol)加入30mL四氢呋喃中，室温搅拌溶解，完全溶解后降温至0℃，N₂保护，0℃时加入钠氢(1.2g，0.050mol)，0℃搅拌2h，加入溴乙酸叔丁酯(3.66g，0.019mol)，0℃搅拌12h，TLC碘熏检测(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝3:1)反应完全，停止反应，加入30mL水淬灭反应，真空旋蒸除去四氢呋喃，水层用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，旋干，聚酰胺柱层析(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝10:1)，得淡黄色油状物2.07g，收率77％。HRMS(ESI), calculated for C₁₀H₁₉N₃O₄ 246.1454[M+H]⁺,found 246.1487.

第四步：连接链Y-4的制备

将IV-5(2.07g，0.0085mol)加入10mL二氯甲烷中，室温搅拌溶解，完全溶解后降温至0℃，0℃时缓慢滴入三氟乙酸(0.63mL，0.085mol)，室温反应2h，TLC 检测(V_石油醚：V_乙酸乙酯＝1:1)反应完全，停止反应，旋干，得淡黄色油状物0.72g，收率45％。HRMS(ESI),calculatedfor C₆H₁₁₁N₃O₄ 190.0828[M+H]⁺,found 190.0861.

实施例7：化合物L4的合成

第一步：中间体Z-1的合成

将Y-1(0.27g，1.22mmol)溶于溶于25mL二氯甲烷中，室温搅拌溶解，完全溶解后降温至0℃，依次加入N,N-二异丙基乙胺(0.50g，4.06mmol)及HATU(0.60g， 1.50mmol)，室温搅拌30min，加入I-6(0.50g，1.01mmol)，室温反应1h，TLC 检测(V_二氯甲烷：V_甲醇＝7:1)反应完全，停止反应，反应液依次用水洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，旋干，聚酰胺柱层析(V_二氯甲烷：V_甲醇＝30:1)，得淡黄色固体0.37g，收率53％。HRMS(ESI),calculated forC₃₀H₃₁F₄N₅O₈S 698.1908[M+H]⁺, found 698.1921.

第二步：化合物L4的合成

将Z-1(0.31g，0.44mmol)、V-1(0.20g，0.44mmol)及N,N-二异丙基乙胺(0.17 g，1.37mmol)加入10mL四氢呋喃中，室温搅拌溶解，完全溶解后加入HATU(0.20g， 0.53mmol)，室温反应12h，TLC检测(V_二氯甲烷：V_甲醇＝7:1)反应完全，停止反应，将反应液旋干，所得油状物溶于乙酸乙酯，依次用3N HCl洗三次，饱和碳酸氢钠洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，旋干，聚酰胺柱层析(V_二氯甲烷：V_甲醇＝30:1)，得淡黄色固体0.15g，收率30％。HRMS(ESI),calculated for C₅₃H₆₁F₄N₉O₁₀S₂ 1124.3997 [M+H]⁺,found 1124.3965.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝8.99(s,1H,Thiazole-H), 8.58(t,J＝3.45Hz,1H,NH),8.46-8.40(m,2H,Ar-H×2),8.30(s,1H,Ar-H),8.09(d,J＝ 8.47Hz,1H,NH),7.88(d,J＝5.58Hz,1H,NH),7.80(t,J＝8.10Hz,1H,NH),7.45-7.33(m, 7H,Ar-H×7),5.15(s,1H,OH),4.91(t,J＝6.57Hz,1H,CH),4.54(d,J＝9.69Hz,1H,CH), 4.44(t,J＝7.71Hz,1H,CH),4.29(s,1H,CH),3.98(s,1H,CH),3.90(s,2H,CH₂),3.61(s, 8H,CH₂×4),2.46(s,3H,CH₃),2.09-1.99(m,2H,CH₂),1.91-1.73(m,2H,CH₂),1.55(s,6H, CH₃×2),1.36(t,J＝6.72Hz,4H,CH₂×2),1.24(d,J＝2,70Hz,3H,CH₃),0.94(s,9H,CH₃×3) ppm.

实施例8：化合物L6的合成

第一步：中间体Z-2的合成

将V-1(0.50g，1.13mmol)及Y-4(0.26g，1.35mmol)溶于溶于10mL二氯甲烷中，室温搅拌溶解，完全溶解后降温至0℃，依次加入N,N-二异丙基乙胺(0.52g，4.50 mmol)，调PH大于9及HATU(0.64g，1.69mmol)，室温搅拌30min，加入I-1(0.50 g,1.01mmol)，室温反应40min，TLC检测(V_二氯甲烷：V_甲醇＝7:1)反应完全，停止反应，反应液依次用水洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，旋干，聚酰胺柱层析(V_二氯甲烷：V_甲醇＝15:1)，得淡黄色固体0.45g，收率65％。HRMS(ESI), calculated for C₂₉H₄₁N₇O₆S 616.2917[M+H]⁺,found 616.2951.

第二步：中间体Z-3的合成

将戊炔酸(0.047g，0.47mmol)、EDCI(0.14g，0.73mmol)及HOBT(0.094 g，0.69mmol)加入5mL二氯甲烷中，室温搅拌15min，加入I-6(0.36g，0.73mmol)，降温至0℃，0℃时加入三乙胺(0.074g，0.73mmol)，室温反应10h，TLC检测(V _二氯甲烷：V_甲醇＝15:1，加三乙胺)反应完全，停止反应，向反应液中加入30mL二氯甲烷，水洗三次，5％HCl水溶液洗三次，饱和碳酸氢钠水溶液洗三次，无水硫酸钠干燥，聚酰胺柱层析(V二_氯甲烷：V_甲醇＝30:1)，得淡黄色固体0.25g，收率60％。HRMS(ESI), calculated for C₂₇H₂₃F₄N₅O₃S 574.1536[M+H]⁺,found 574.1570.

第三步：化合物L6的合成

将五水硫酸铜(0.08g，0.32mmol)及抗坏血酸钠(0.063g，0.32mmol)加入1.6ml 水中，N₂保护，室温搅拌10min，将Z-3(0.2g，0.35mmol)溶于12mL N,N- 二甲基甲酰胺中，滴入反应液中，室温搅拌10min，将Z-2(0.42g，0.70mol)溶于6mL N,N-二甲基甲酰胺中，滴入反应液中，室温反应5h，TLC检测(V_二氯甲烷：V_甲醇＝15:1) 反应完全，停止反应，向反应液中加入30mL水，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用水洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，旋干，聚酰胺柱层析(V_二氯甲烷：V_甲醇＝30:1)，得淡黄色固体0.14g，收率34％。HRMS(ESI),calculated for C₅₆H₆₄F₄N₁₂O₉S₂1189.4375[M +H]⁺,found 1189.4307.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝8.98(s,1H,Thiazole-H),8.53 (s,1H,NH),8.43(q,J＝7.80Hz,2H,Ar-H×2),8.29(s,1H,NH),8.08(d,J＝8.34Hz,1H, NH),8.02(s,1H,NH),7.95(s,1H,CH),7.81(s,2H,Ar-H×2),7.45-7.33(m,6H,Ar-H×6), 4.90(t,J＝7.50Hz,1H,OH),4.56(s,1H,CH),4.54-4.42(m,4H,CH₂×2),4.29(s,1H,CH), 3.94(s,2H,CH₂),3.91(s,2H,CH₂),3.58(s,8H,CH₂×4),2.89(s,1H,CH),2.85(d,J＝7.20 Hz,2H,CH₂),2.73(s,1H,CH),2.45(s,3H,CH₃),1.54(s,6H,CH₃×2),1.46(s,1H,CH), 1.34(d,J＝6.96Hz,3H,CH₃),1.23(s,2H,CH₂),0.93(s,9H,CH₃×3)ppm.

实施例9：化合物L7的合成

第一步：中间体Z-4的合成

将6-氯己酸(0.17g，1.13mmol)溶于溶于30mL二氯甲烷中，室温搅拌溶解，完全溶解后降温至0℃，依次加入N,N-二异丙基乙胺(0.50g，4.06mmol)及HATU(0.60 g，1.50mmol)，室温搅拌30min，向反应液中加入V-1(0.5g，1.13mmol)，室温反应1h，TLC检测(V_二氯甲烷：V_甲醇＝30:1)反应完全，停止反应，反应液依次用水洗三次，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，旋干，聚酰胺柱层析(V_二氯甲烷：V_甲醇＝50:1)，得淡黄色固体0.27g，收率35％。HRMS(ESI),calculated for C₂₉H₄₁ClN₄O₄S 577.2615[M +H]⁺,found 577.2586.

第二步：中间体Z-5的合成

将Z-4(0.25g，0.43mmol)、叠氮钠(0.028g，0.43mmol)、碘化亚铜(0.015 g，0.078mmol)和N,N-二甲基乙二胺(0.011g，0.13mmol)加入2.1mL乙醇和0.9mL 水的混合溶液中，N₂置换三次，升温至回流，回流反应45min，TLC检测(V_二氯甲烷： V_甲醇＝30:1)反应完全，停止反应，向反应液中加入10mL水，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，旋干聚酰胺柱层析(V_二氯甲烷：V_甲醇＝50:1)，得黄褐色固体0.16g，收率62％。HRMS(ESI),calculated for C₂₉H₄₁N₇O₄S 584.3019[M+ H]⁺,found 584.3053.

第三步：中间体Z-6的合成

将I-6(0.5g，1.01mmol)、碳酸钾(0.14g，1.01mmol)及碘化钾(0.25g，1.52mmol)加入20mLN,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌20min，加入3-溴丙炔(0.15g，1.27mmol)，室温搅拌30min，补加3-溴丙炔(0.06g，0.5mmol)，室温反应30min，补加3-溴丙炔(0.06g，0.5mmol)，室温反应3.5h，TLC检测(V_二氯甲烷：V_甲醇＝20:1)反应完全，停止反应，向反应液中加入40mL水，用乙酸乙酯萃取，旋干，聚酰胺柱层析(V_二氯甲烷：V_甲醇＝50:1)，得淡黄色固体0.48g，收率89％。HRMS(ESI),calculated for C₂₅H₂₁F₄N₅O₂S 532.1430[M+H]⁺,found 532.1465.

第四步：化合物L7的合成

将五水硫酸铜(0.027g，0.11mmol)及抗坏血酸钠(0.022g，0.11mmol)加入0.8 mL水中，N₂保护，室温搅拌10min，将Z-6(0.069g，0.13mmol)溶于6mL N,N-二甲基甲酰胺中，滴入反应液中，室温搅拌10min，将Z-5(0.15g，0.26mol)溶于3mL N,N-二甲基甲酰胺中，滴入反应液中，室温反应6h，TLC检测(V_二氯甲烷：V_甲醇＝15:1) 反应完全，停止反应，向反应液中加入15mL水，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，旋干，聚酰胺柱层析(V_二氯甲烷：V_甲醇＝30:1)，得淡黄色固体0.12g，收率43％。HRMS(ESI),calculated forC₅₄H₆₂F₄N₁₂O₆S₂ 1115.4371[M+ H]⁺,found 1115.4305.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝8.99(s,1H,Thiazole-H),8.45(q, J＝7.89Hz,2H,Ar-H×2),8.31(s,1H,NH),8.11(d,J＝8.94Hz,1H,NH),8.03(s,1H,NH), 7.98(s,1H,CH),7.83(d,J＝9.69Hz,2H,Ar-H×2),7.54-7.33(m,6H,Ar-H×6),5.45(s,1H, OH),5.33(s,1H,CH),4.92(t,J＝6.90Hz,1H,CH),4.39(s,1H,CH),3.84-3.70(m,2H, CH₂),3.59-3.46(m,4H,CH₂×2),3.65-3.46(m,6H,CH₂×3),3.33-3.27(m,4H,CH₂×2),3.18 (d,J＝7.05Hz,1H,CH),2.54(t,J＝7.95Hz,2H,CH₂),2.46(s,3H,CH₃),1.89-1.77(m,2H, CH₂),1.56(s,6H,CH₃×2),1.45(d,J＝7.35Hz,3H,CH₃),1.32(s,2H,CH₂),0.98(s,9H, CH₃×3)ppm.

除非另外指出，否则根据上面关于实施例7、8和9的合成描述的类似程序，利用相应的试剂、中间体和起始原料合成下述实施例。

实施例10：化合物L1的合成

从I-6、戊二酸和V-1制备化合物L1。HRMS(ESI),calculated for C₅₀H₅₅F₄N₉O₇S₂1034.3680[M+H]⁺,found 1034.3693.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝8.99(s,1H, Thiazole-H),8.55(s,1H,NH),8.42(d,J＝7.65Hz,2H,Ar-H×2),8.31(s,1H,NH),8.09(d,J ＝8.07Hz,1H,NH),7.92(s,1H,NH),7.84(d,J＝8.25Hz,2H,Ar-H×2),7.46-7.34(m,6H, Ar-H×6),5.76(s,1H,OH),5.13(s,1H,CH),4.92(t,J＝6.60Hz,1H,CH),4.52(d,J＝8.64 Hz,1H,CH₂),4.44(t,J＝7.98Hz,1H,CH₂),4.29(s,1H,CH),3.62(s,2H,CH₂),3.25(s,2H, CH₂),3.08(d,J＝7.38Hz,1H,CH),2.46(s,3H,CH₃),2.25-2.16(m,2H,CH₂),2.08-2.00(m, 2H,CH₂),1.80-1.73(m,2H,CH₂),1.56(s,6H,CH₃×2),1.38(d,J＝6.54Hz,3H,CH₃), 1.24-1.16(m,2H,CH₂),0.95(s,9H,CH₃×3)ppm.

实施例11：化合物L2的合成

从I-6、庚二酸和V-1制备化合物L2。HRMS(ESI),calculated for C₅₂H₅₉F₄N₉O₇S₂1084.3813[M+Na]⁺,found 1084.3797.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝9.02(s,1H,Thiazole-H),8.57(s,1H,NH),8.44(d,J＝8.04Hz,2H,Ar-H×2),8.33(s,1H,NH),8.12(d,J＝7.80Hz,1H,NH),7.95(t,J＝5.40Hz,1H,NH),7.85(t,J＝8.07Hz,2H,Ar-H×2), 7.48-7.36(m,6H,Ar-H×6),5.16(d,J＝3.24Hz,1H,CH),4.94(t,J＝7.11Hz,1H,CH),4.54 (d,J＝9.30Hz,1H,CH₂),4.44(t,J＝7.98Hz,1H,CH),4.31(s,1H,CH),4.16-4.02(m,1H, CH₂),3.63(s,2H,CH₂),3.26(d,J＝5.46Hz,2H,CH₂),2.48(s,3H,CH₃),2.17-2.02(m, 4H,CH₂×2),1.57(s,6H,CH₃×2),1.49(s,4H,CH₂),1.40(d,J＝7.05Hz,3H,CH₃), 1.22-1.13(m,4H,CH₂×2),0.96(s,9H,CH₃×3)ppm.

实施例12：化合物L3的合成

从I-6、Y-2和V-1制备化合物L3。HRMS(ESI),calculated for C₅₁H₅₇F₄N₉O₉S₂1102.3554[M+Na]⁺,found 1102.3543.¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝9.01(s,1H,Thiazole-H),8.58(s,1H,NH),8.46(q,J＝7.62Hz,2H,Ar-H×2),8.32(s,1H,NH),8.11(d,J＝8.16Hz,1H,NH),7.94(s,1H,Ar-H),7.82(t,J＝7.92Hz,1H,NH),7.51-7.35(m,7H, Ar-H×7),5.18(d,J＝2.64Hz,1H,OH),4.92(t,J＝7.17Hz,1H,CH),4.62(d,J＝9.51Hz, 1H,CH),4.48(t,J＝7.74Hz,1H,CH),4.39(t,J＝5.01Hz,2H,CH₂),4.31(s,1H,CH),4.01 (d,J＝3.12Hz,2H,CH₂),3.95(s,2H,CH₂),3.67(s,4H,CH₂×2),3.62(s,2H,CH₂),3.46(t, J＝6.84Hz,6H,CH₂×3),2.48(s,3H,CH₃),1.57(s,6H,CH₃×2),1.39(d,J＝6.90Hz,3H, CH₃),0.96(s,9H,CH₃×3)ppm.

实施例13：化合物L5的合成

从I-6、Y-3和V-1制备化合物L5。HRMS(ESI),calculated for C₅₅H₆₅F₄N₉O₁₁S₂1190.4079[M+Na]⁺,found 1190.4062.1H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝9.01(s,1H,Thiazole-H),8.59(s,1H,NH),8.44(d,J＝8.91Hz,2H,Ar-H×2),8.32(s,1H,NH),8.11(d,J＝6.90Hz,1H,NH),7.90(s,1H,NH),7.83(s,1H,Ar-H),7.48-7.41(m,7H,Ar-H×7),5.17(s,1H,OH),4.93(s,1H,CH),4.58(d,J＝9.72Hz,1H,CH),4.40(s,4H,CH₂×2),4.31(s,1H,CH),3.99(s,1H,CH),3.93(s,2H,CH₂),3.61(s,14H,CH₂×9),2.48(s,3H,CH₃),1.57(s, 6H,CH₃×2),1.40(d,J＝5.61Hz,3H,CH₃),0.96(s,9H,CH₃×3)ppm.

实施例14：化合物L8的合成

从I-6、戊二酸和P-1制备化合物L8。HRMS(ESI),calculated for C₄₂H₃₉F₄N₉O₈S928.2476[M+Na]⁺,found 928.2474.1H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝11.13(s,1H, NH),8.46(s,1H,NH),8.44(d,J＝8.37Hz,1H,Ar-H),8.33(s,1H,Ar-H),8.11(d,J＝8.13 Hz,2H,Ar-H×2),7.95(s,1H,NH),7.84(t,J＝8.10Hz,1H,Ar-H),7.62(t,J＝8.01Hz,1H, NH),7.47(d,J＝10.77Hz,1H,Ar-H),7.37(d,J＝8.34Hz,1H,Ar-H),7.21(d,J＝8.61Hz, 1H,Ar-H),7.06(d,J＝7.02Hz,1H,Ar-H),6.79(s,1H,Ar-H),5.09(q,J＝4.84Hz,1H,CH), 4.13(q,J＝7.14Hz,1H,CH₂),3.64(s,3H,CH₂),3.26(s,4H,CH₂×2),2.10(s,4H,CH₂×2), 1.79(s,4H,CH₂×2),1.58(s,6H,CH₃×2),1.50(s,2H,CH₂)ppm.

实施例15：化合物L9的合成

从I-6、庚二酸和P-1制备化合物L9。HRMS(ESI),calculated for C₄₅H₄₇F₄N₉O₈S956.2789[M+Na]⁺,found 956.2772.1H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝11.13(s,1H, NH),8.54(s,1H,NH),8.43(d,J＝8.16Hz,1H,Ar-H),8.32(s,1H,Ar-H),8.11(d,J＝8.19 Hz,1H,Ar-H),8.05(s,1H,Ar-H),7.92(s,1H,Ar-H),7.83(t,J＝8.04Hz,1H,Ar-H),7.61(t, J＝7.53Hz,1H,NH),7.46(d,J＝10.77Hz,1H,Ar-H),7.37(d,J＝8.10Hz,1H,Ar-H),7.20 (d,J＝8.40Hz,1H,Ar-H),7.05(d,J＝6.84Hz,1H,Ar-H),6.75(s,1H,NH),5.08(q,J＝4.59Hz,1H,CH),4.41(s,8H,CH₂×4),2.06(s,6H,CH₂×3),1.57(s,6H,CH₃×2),1.50(s,4H, CH₂×2),1.26(s,4H,CH₂×2)ppm.

实施例16：化合物L10的合成

从I-6、Y-2和P-1制备化合物L10。HRMS(ESI),calculated for C₄₃H₄₁F₄N₉O₁₀S974.2531[M+Na]⁺,found 974.2516.1H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝11.13(s,1H, NH),8.60(s,1H,NH),8.43(d,J＝8.16Hz,1H,Ar-H),8.33(s,1H,Ar-H),8.10(t,J＝8.67 Hz,2H,NH×2),7.93(s,1H,Ar-H),7.82(t,J＝7.80Hz,1H,NH),7.61(t,J＝7.56Hz,1H, Ar-H),7.47(d,J＝10.62Hz,1H,Ar-H),7.37(d,J＝7.98Hz,1H,Ar-H),7.23(d,J＝8.55Hz, 1H,Ar-H),7.06(d,J＝6.90Hz,1H,Ar-H),6.78(s,1H,Ar-H),5.08(q,J＝4.50Hz,1H,CH), 3.93(s,4H,CH₂×2),3.65(s,4H,CH₂×2),1.57(s,8H,CH₂×4),1.26(s,6H,CH₃×2),1.20(s, 2H,CH₂),0.88-0.80(m,2H,CH₂)ppm.

实施例17：化合物L11的合成

从I-6、Y-1和P-1制备化合物L11。HRMS(ESI),calculated for C₄₅H₄₅F₄N₉O₁₁S1018.2793[M+Na]⁺,found 1018.2769.1H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝11.13(s,1H, NH),8.59(s,1H,NH),8.44(d,J＝8.22Hz,1H,Ar-H),8.33(s,1H,NH),8.11(d,J＝6.66Hz, 1H,Ar-H),8.00(s,1H,NH),7.89(s,1H,Ar-H),7.82(t,J＝8.13Hz,Ar-H),7.61(t,J＝7.53 Hz,1H,NH),7.47(d,J＝10.47Hz,1H,Ar-H),7.37(d,J＝8.04Hz,1H,Ar-H),7.22(d,J＝8.46Hz,1H,Ar-H),7.06(d,J＝6.90Hz,1H,Ar-H),6.78(s,1H,Ar-H),5.08(q,J＝4.56Hz,1H,CH),3.92(s,4H,CH₂×2),3.59(s,8H,CH₂×4),2.96-2.87(m,1H,CH₂),2.64-2.58(m,2H,CH₂),2.07-2.03(m,1H,CH₂),1.57(s,6H,CH₃×2),1.46-1.37(m,2H,CH₂),1.26(s,4H,CH₂×2),0.96-0.89(m,2H,CH₂)ppm.

实施例18：化合物L12的合成

从I-6、Y-3和P-1制备化合物L12。HRMS(ESI),calculated for C₄₇H₄₉F₄N₉O₁₂S1062.3055[M+Na]⁺,found 1062.3058.1H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝11.13(s,1H, NH),8.59(s,1H,NH),8.43(d,J＝7.95Hz,1H,Ar-H),8.32(s,1H,NH),8.11(d,J＝7.95Hz, 1H,Ar-H),7.99(s,1H,NH),7.89(s,1H,Ar-H),7.82(t,J＝8.46Hz,1H,Ar-H),7.61(t,J＝7.68Hz,1H,NH),7.47(d,J＝10.68Hz,1H,Ar-H),7.37(d,J＝8.04Hz,1H,Ar-H),7.22(d, J＝8.07Hz,1H,Ar-H),7.06(d,J＝6.81Hz,1H,Ar-H),6.78(s,1H,Ar-H),5.08(d,J＝8.07Hz,1H,CH),3.91(s,4H,CH₂×2),3.58(s,10H,CH₂×5),3.54(s,6H,CH₂×3),1.57(s,6H,CH₃×2),1.26(s,6H,CH₂×3),1.08(t,J＝6.93Hz,1H,CH₂),0.88(s,1H,CH₂)ppm.

实施例19：化合物L13的合成

从I-6、Y-4和II-4制备化合物L13。HRMS(ESI),calculated for C₄₆H₄₃F₄N₁₁O₁₀S1040.2749[M+Na]⁺,found 1040.2753.1H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝11.07(s,1H, NH),9.87(s,1H,NH),8.56(t,J＝8.85Hz,1H,NH),8.32(d,J＝6.42Hz,1H,Ar-H),8.13(d, J＝8.85Hz,1H,Ar-H),8.05(d,J＝7.95Hz,1H,Ar-H),7.96-7.89(m,2H,Ar-H×2), 7.77-7.70(m,1H,Ar-H),7.65-7.59(m,1H,CH),7.33(t,J＝8.94Hz,1H,Ar-H),7.21(d,J＝ 8.97Hz,1H,Ar-H),7.07-7.02(d,J＝6.45Hz,1H,Ar-H),6.58(s,1H,Ar-H),4.54-4.41(m, 4H,CH₂×2),4.35(s,1H,CH),3.98(s,2H,CH₂),3.93(s,2H,CH₂),3.67(s,8H,CH₂×4), 2.87(s,2H,CH₂),2.67(s,2H,CH₂),2.07-2.03(m,1H,CH₂),1.67(s,6H,CH₃×2)ppm.

实施例20：化合物L14的合成

从Z-6和P-2制备化合物L14。HRMS(ESI),calculated for C₄₅H₄₇F₄N₉O₈S 966.2745[M+Na]⁺,found 966.2739.1H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝11.10(s,1H,NH),9.75(s, 1H,NH),8.39(q,J＝5.40Hz,1H,NH),8.22(d,J＝1.80Hz,1H,Ar-H),8.03(q,J＝1.77Hz, 1H,Ar-H),7.90-7.83(m,2H,Ar-H×2),7.74-7.65(m,1H,Ar-H),7.59-7.56(m,1H,CH),7.26(t,J＝11.33Hz,1H,Ar-H),7.15(d,J＝8.52Hz,1H,Ar-H),7.07-7.02(m,1H,Ar-H),6.60(s,1H,Ar-H),3.64-3.60(m,2H,CH₂,CH),3.57-3.50(m,4H,CH₂×2),3.51-3.37(m,5H,CH₂×2,NH),3.22-3.17(m,4H,CH₂×2),2.14(t,J＝7.20Hz,2H,CH₂),1.84-1.75(m,2H,CH₂),1.38(s,2H,CH₂),1.24(s,6H,CH₃×2)ppm.

下面是此发明部分化合物的生物药理学实验和结果：

一、本发明部分化合物对癌细胞的生长抑制活性

实验原理：

MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT为黄色化合物，是一种可以接受氢离子的染料,在活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶与细胞色素C的作用下使外源性 MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。然后用二甲基亚砜(DMSO)溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在492nm 波长处测定其光吸收值，由于在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与活细胞数成正比，因此可以反映出活细胞的数量。

实验材料：

a.MTT溶液的配置

将500mg MTT，加入到100mL灭菌后的1×PBS(0.01mol/L pH＝7.4)中，避光搅拌30min，用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后分装于4ml EP管中，-20℃避光保存。

b.细胞培养:

细胞株：LNCap和22RV1

细胞培养材料：1640液体培养基，胎牛血清，0.25％胰酶，1×PBS

c.其他：

细胞计数板，96孔细胞培养板，分析纯DMSO溶液，

实验仪器：

酶联免疫检测仪

实验步骤：

(1)铺板

接种细胞：用0.25％胰酶将细胞从培养皿上消化下来，用含10％FBS或10％GIBCO-FBS的细胞培养基轻轻吹打配成单个细胞悬液。以每孔5000个细胞接种于96 孔培养板中，每孔体积100μL。

培养细胞：将96孔细胞培养板放入细胞培养箱，37℃、5％二氧化碳及饱和湿度条件下，培养24小时。

(2)给药

显微镜下观察细胞已贴壁且呈正常生长形态，即可进行给药：吸去培养板中的旧培养液，加入含药物的培养液200μL继续在细胞培养箱内培养7d。

(3)显色

培养7d后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，放入细胞培养箱，37℃继续孵育4h，吸除上清液，每孔加入150μL DMSO，剧烈震荡，使甲瓒充分溶解。

(4)比色

492nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录实验结果。

(5)实验结果分析

利用graphpad软件处理数据，得到IC₅₀值。

实验结果如下表1所示

表1本发明部分化合物对癌细胞的生长抑制活性

由表1可见，本发明大部分化合物对癌细胞有一定的抑制活性，并且体外抗肿瘤活性明显优于恩杂鲁胺，尤其是对AR-V7高表达的细胞株22RV1活性更优。

二、Western-blot测定化合物对AR/ARV7蛋白的降解活性

实验方法：将处于对数生长期的LNCap细胞接种于6孔板内，将化合物配成30μM 的浓度，给药48h后收集细胞，PMSF与RIPA裂解液以1:99的比例混合，冰上裂解1 h，4℃，12500r/min×30min离心，取上清，用BCA法定量检测蛋白含量，用5×蛋白上样缓冲液稀释蛋白后100℃变性8min。蛋白在SDS-PAGE电泳分离，湿法转模，封闭2 h，一抗4℃孵育过夜。TBST洗膜，二抗室温孵育1h，化学发光显影。以DMSO作为阴性对照，β-actin作为内参。

实验结果如下表2所示。

表2本发明部分化合物对AR/ARV7的降解活性

ND表示对蛋白不降解

由表2可见，部分化合物对AR及ARV7均具有明显的降解作用，且在聚乙二醇的连接链中，降解活性随乙二醇聚合度的增大而减小。

Claims (6)

1.靶向雄激素受体的小分子降解剂，包括AR抑制剂、连接链、泛素连接酶配体，所述的AR抑制剂为MDV-3100，所述的泛素连接酶配体为泊马度胺或VHL抑制剂V-1；

所述的连接链分别与AR抑制剂、泛素连接酶配体共价连接。

2.根据权利要求1所述的靶向雄激素受体的小分子降解剂，其结构如式(Ⅰ)或(Ⅱ)所示，或式(Ⅰ)、(Ⅱ)的立体异构体或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物；

式(Ⅰ)和(Ⅱ)中，连接链的结构如式(Ⅲ)所示，

其中，

x是选自0-10的整数；

y是选自0-14的整数；

n是选自0-6的整数；

m是选自0-2的整数；

A为-CH₂-或-C(O)-；

B为-CH₂-或

其中所述连接链通过A旁边的

与AR抑制剂MDV-3100共价结合，并通过-C(O)-旁边的

与泛素连接酶配体泊马度胺或V-1共价结合。

3.权利要求1所述靶向雄激素受体的小分子降解剂，所述小分子降解剂选自以下化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物：

4.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求1～2中任一所述小分子降解剂和药学上可接受的载体。

5.用于预防、治疗或预后受试者的疾病或障碍的组合物，其特征在于，包括有效量的至少一种权利要求1～3任一所述小分子降解剂和药学上可接受的载体。

6.根据权利要求5所述的用于预防、治疗或预后受试者的疾病或障碍的组合物，其特征在于，所述的疾病或障碍为：前列腺癌、晚期前列腺癌和去势抗性前列腺癌。

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