CN102079771B - 具有抗肿瘤活性的雌甾氨基酸酯化合物及其合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有抗肿瘤活性的雌甾氨基酸酯化合物及其合成方法，有效解决具有抗肿瘤活性的雌甾氨基酸酯化合物的制备问题，将氨基酸或小分子肽类溶于氢氧化钠水溶液或碳酸氢钠饱和溶液中，用氯甲酸苄酯滴加，反应至用茚三酮显色至无紫色或做薄层检测，用乙醚洗涤，弃乙醚，水相用盐酸调PH，出现乳白色固体，用乙酸乙酯萃取，合并液用蒸馏水、饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩，纯化，再和甾体母核混合溶解于反应溶剂中，加缩合剂和催化剂，补加另备的缩合剂，做薄层检测，过滤，浓缩，纯化，溶于溶解溶剂中，加钯碳催化，加氢反应，薄层检测后，过滤，浓缩，纯化，本发明的抗肿瘤活性具有较好的水溶性，对肿瘤细胞的抑制作用优于2-甲氧基雌二醇。
Description
一、技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种具有抗肿瘤活性的雌甾氨基酸酯化合物及其合成方法。
二、背景技术
2-甲氧基雌二醇(2-ME)作为激素类化合物是雌二醇在体内的代谢终产物。近几年发现其具有非常广谱的抗肿瘤活性，可用来治疗多发性骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、甲状腺癌等疾病，具有广谱抗肿瘤作用，并且一些已经产生抗药性的癌细胞对2-ME非常敏感。2-ME作用机制上与传统抗肿瘤药物不同，其抗肿瘤作用机制主要是：抑制细胞增值；诱导肿瘤细胞和内皮细胞调亡；抗血管生成作用；促进细胞周期停滞；增强肿瘤细胞对辐射的敏感性等等。但是2-ME存在水溶性差，生物利用度低等缺陷，限制了它的广泛应用。
以2-ME类似物为底物的雌甾衍生物是针对生物利用低的缺陷制备的，是既保持或增强抗肿瘤活性又增加其水溶性的新的抗肿瘤化合物。目前关于2-ME衍生物的抗肿瘤研究已有很多，据Abby Ho等人报道，2-ME 17位羟基与甘氨酸羧基成酯后的化合物保留了2-ME抗肿瘤活性。基于该研究报道和雌二醇的构效关系可知：若在母核A环及B环进行结构修饰，将会使其抗肿瘤活性降低，所以在母核C环及D环上的修饰就成为了改善2-ME活性及水溶性的主要研究方向，其中D环上的修饰相对而言更具有吸引力。文献报道，17位羟基被F取代后，其化合物抗肿瘤活性消失，而当被亚甲基取代后，其化合物保持与2-ME相当的抗肿瘤活性(Abby Ho等，2006)，因此通过2-ME类似物17位上进行结构修饰，更有希望得到既保持或增强抗肿瘤活性又增加其水溶性的新的抗肿瘤化合物，从而提高其生物利用度。
三、发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种具有抗肿瘤活性的雌甾氨基酸酯化合物及其合成方法，可有效解决具有抗肿瘤活性的雌甾氨基酸酯化合物的制备问题。
本发明解决的技术方案是，该化合物是由氨基酸或小分子肽类和甾体母核、化合物中间体制成，所说的雌甾氨基酸酯化合物的分子结构通式为：
所说的化合物中间体的分子结构通式为：
所说的甾体母核的分子结构通式为：
所说的雌甾氨基酸酯化合物、化合物中间体及甾体母核的结构通式中：R4为β-丙氨酸残基、L-丙氨酸残基、D-丙氨酸残基、L-苯丙氨酸残基、D-苯丙氨酸残基、L-亮氨酸残基、D-亮氨酸残基、L-异亮氨酸残基、D-异亮氨酸残基、L-赖氨酸残基、D-赖氨酸残基、L-精氨酸残基、D-精氨酸残基、L-组氨酸残基、D-组氨酸残基、L-天冬氨酸残基、D-天冬氨酸残基、L-半胱氨酸残基、D-半胱氨酸残基、L-缬氨酸残基、D-缬氨酸残基、L-脯氨酸残基、D-脯氨酸残基、L-色氨酸残基、D-色氨酸残基、L-酪氨酸残基、D-酪氨酸残基、L-丝氨酸残基、D-丝氨酸残基、L-天冬酰胺残基、D-天冬酰胺残基、L-谷氨酰胺残基、D-谷氨酰胺残基、L-苏氨酸残基、D-苏氨酸残基中的一种，以上各种氨基酸残基均为其对应的氨基酸去掉羧基上的羟基后的结构，或R4为由β-丙氨酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-丝氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-苏氨酸中的2-4个组成的小分子肽类的残基，此肽类残基为其对应的小分子肽去掉羧基上的羟基后的基团；R1为N-苄氧羰基-β-丙氨酸残基、N-苄氧羰基-L-丙氨酸残基、N-苄氧羰基-D-丙氨酸残基、N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸残基、N-苄氧羰基-D-苯丙氨酸残基、N-苄氧羰基-L-亮氨酸残基、N-苄氧羰基-D-亮氨酸残基、N-苄氧羰基-L-异亮氨酸残基、N-苄氧羰基-D-异亮氨酸残基、N-苄氧羰基-L-赖氨酸残基、N-苄氧羰基-D-赖氨酸残基、N-苄氧羰基-L-精氨酸残基、N-苄氧羰基-D-精氨酸残基、N-苄氧碳基-L-组氨酸残基、N-苄氧羰基-D-组氨酸残基、N-苄氧羰基-L-天冬氨酸残基、N-苄氧羰基-D-天冬氨酸残基、N-苄氧羰基-L-半胱氨酸残基、N-苄氧羰基-D-半胱氨酸残基、N-苄氧羰基-L-缬氨酸残基、N-苄氧羰基-D-缬氨酸残基、N-苄氧羰基-L-脯氨酸残基、N-苄氧羰基-D-脯氨酸残基、N-苄氧羰基-L-色氨酸残基、N-苄氧羰基-D-色氨酸残基、N-苄氧羰基-L-酪氨酸残基、N-苄氧羰基-D-酪氨酸残基、N-苄氧羰基-L-丝氨酸残基、N-苄氧羰基-D-丝氨酸残基、N-苄氧羰基-L-天冬酰胺残基、N-苄氧羰基-D-天冬酰胺残基、N-苄氧羰基-L-谷氨酰胺残基、N-苄氧羰基-D-谷氨酰胺残基、N-苄氧羰基-L-苏氨酸残基、N-苄氧羰基-D-苏氨酸残基中的一种，以上各种残基均为其对应的N-苄氧羰基氨基酸去掉羧基上的羟基后的结构；或者R1为Cbz-R，其中Cbz为苄氧羰基，R为：由β-丙氨酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸L-色氨酸、L-酪氨酸、L-丝氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-苏氨酸中的2-4个组成的小分子肽类的残基，此肽类残基为其对应的小分子肽去掉羧基上的羟基及伯胺上的一个H后的基团，且伯胺去掉H后与Cbz(苄氧羰基)中的羰基以酰胺键相连接；
R2为1～6个碳原子的直连或支链的烷基或含有1～2个杂原子的1～6个碳原子的直连或支链的烷基，杂原子为N，O，S中的一种或两种，且R2基团中不含有羟基、羧基、氨基中的任一个基团；R3为H或10个碳以内的碳氢化合物或含有1～2个杂原子的10个碳以内的碳氢化合物，其中杂原子为N，O，S中的一种或两种，且R3基团中不含有羟基、羧基、氨基中的任一个基团；
该雌甾氨基酸酯化合物的制备方法是：
(1)、在-5℃-15℃，将氨基酸或小分子肽类溶解于质量浓度为8％－10％的氢氧化钠(NaOH)水溶液或者碳酸氢钠(NaHCO3)饱和溶液中，每1ml的质量浓度为8％-10％的氢氧化钠水溶液溶解2.5mmol的氨基酸或小分子肽类或者每1ml碳酸氢钠饱和溶液中溶解0.2mmol氨基酸或小分子肽类，得溶解液，边搅拌边用氨基酸或小分子肽类摩尔数的1-1.5倍量的氯甲酸苄酯以1滴/3-10秒的速度滴加到溶解液中进行反应，若将氨基酸或小分子肽类溶解于质量浓度为8％-10％的氢氧化钠(NaOH)水溶液中时，在溶解液中需滴加氢氧化钠(NaOH)水溶液保持PH＝8～9，滴完，置于10℃-30℃下，搅拌反应至用茚三酮为显色剂显色至无紫色，或做薄层检测，(薄层检测的目的在于，测定溶液是否反应完全，只有反应完全后，才可进行下一步的操作，以下同)测得完全反应后，再每次用反应溶液体积0.5-1.3倍量的乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为30％-40％的浓盐酸调PH为1-3，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体每次用与乙醚同量的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用每次与乙醚同量的蒸馏水洗涤2次、饱和食盐水洗涤1次，再以无水硫酸镁干燥6-24小时，抽滤，滤液减压浓缩，用体积比为1∶2-5的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过层析柱纯化或过柱色谱纯化，得纯化的化合物；
(2)、在10-30℃，将摩尔比为1-1.2∶1的纯化的化合物和甾体母核的混合物溶解于反应溶剂中，每100ml反应溶剂中溶解2mmol-5mmol甾体母核，边搅拌边先后加入缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)和催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)，甾体母核和1，3-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1∶1-1.5；4-二甲氨基吡啶和1，3-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1∶30-100，搅拌反应10min后，补加上述缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺量的0.4-0.8倍量的另备的缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使甾体母核完全反应，搅拌10-20小时，做薄层检测，过滤，滤液减压浓缩，用体积比为1∶2-5的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，或用乙酸乙酯溶解，过滤，弃去固体，滤液减压浓缩，用甲醇或乙醇重结晶纯化，纯化后即得化合物中间体，其分子结构通式为：
(3)在10-60℃，将化合物中间体溶于溶解溶剂中，溶解后，并加入化合物中间体重量的0.4倍--0.6倍的10％钯碳(Pd/C)催化剂，加氢至压力为40-60Psi，反应4-6小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，用体积比为1∶2的甲醇和乙酸乙酯或体积比为1∶5的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶液，或用乙醇为流动相过柱色谱纯化，或无水甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯中的一种重结晶纯化，即得雌甾氨基酸酯化合物；
所说的氨基酸为β-丙氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-亮氨酸、D-亮氨酸、L-异亮氨酸、D-异亮氨酸、L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸、D-精氨酸、L-组氨酸、D-组氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-脯氨酸、D-脯氨酸、L-色氨酸、D-色氨酸、L-酪氨酸、D-酪氨酸、L-丝氨酸、D-丝氨酸、L-天冬酰胺、D-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-苏氨酸、D-苏氨酸中的一种；所说的小分子肽类是由：β-丙氨酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-丝氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-苏氨酸中的2-4个组成的肽；
所说的反应溶剂为：二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、无水乙腈中的一种；
所说的溶解溶剂为：无水甲醇、无水乙醇、无水乙酸乙酯、无水二氯甲烷、无水丙酮中的一种。
本发明经实验研究表明，本发明雌甾氨基酸酯化合物的抗肿瘤活性不但具有较好的水溶性，同时，在量效关系研究中，其对肿瘤细胞的抑制作用要优于具有广谱抗肿瘤活性的2-甲氧基雌二醇，2-甲氧基雌二醇作为广谱的抗肿瘤药物却有自身的缺陷，如：水溶性低、口服吸收差等，影响了2-甲氧基雌二醇的应用，本发明雌甾氨基酸酯化合物并且在体内缓慢分解为2-甲氧基雌二醇，成为新一类的抗肿瘤药物。
四、具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
以制备如下的雌甾氨基酸酯化合物：
2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-β-丙氨酸酯，简称：A；
16α-乙基-2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-苯丙氨酸酯，简称：B；
16α-(N，N-二甲基)氨甲基-2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-亮氨酸酯简称：C；
2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-赖氨酸酯，简称：D；
2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-缬氨酸酯，简称：E；
2-乙氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-丙氨酸酯，简称：F；
2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-亮氨酸酯，简称：G；
2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-N-β-丙氨酰-L-组氨酸酯，简称：H；
2-乙氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-丙氨酸酯，简称：I；
为例，详情如下：
实施例1：2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-β-丙氨酸酯的制备
(1)、N-苄氧羰基-β-丙氨酸的制备
在5℃，将10mmol的β-丙氨酸溶解于4.0ml质量浓度为10％的氢氧化钠(NaOH)水溶液中，得溶解液，边搅拌边用14mmol(即1.8ml)的氯甲酸苄酯以1滴/4秒的速度滴加到溶解液中进行反应，并滴加质量浓度为10％的氢氧化钠(NaOH)水溶液保持PH为8，滴完，置于10℃下，搅拌反应15小时，用茚三酮为显色剂显色无紫色，再用5ml/次的乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为30％的浓盐酸调PH至3，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体用5ml/次的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用5ml/次的蒸馏水洗涤2次、5ml的饱和食盐水洗涤1次，再用无水硫酸镁干燥10小时，抽滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，以体积比为1∶3的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过层析柱纯化，得白色固体N-苄氧羰基-β-丙氨酸，产率：71.8％，熔点Mp：86-87℃；
(2)、2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-β-丙氨酸酯的制备
在10℃，将3.2mmol的N-苄氧羰基-β-丙氨酸和3.0mmol的2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇溶于75ml二氯甲烷中，边搅拌边先后加入3.0mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和0.09mmol催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌反应10min后，补加1.5mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇完全反应，搅拌10小时，做薄层检测，过滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，用体积比为1∶3的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，得化合物中间体2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-β-丙氨酸酯1.64g，产率为92％，无色油状物，IR(KBr)：3372，2924，1730，1695，1522，1322，1261，1241，1211，1187，1019，1004，747，696cm-1；1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ7.25-7.45(m，10H)，6.83(s，1H)，6.62(s，1H)，5.34(d，J＝7.6Hz，1H)，5.11(d，J＝4.8Hz，4H)，4.77(t，J＝8.8Hz，1H)，4.40(m，1H)，3.86(s，3H)，2.73(m，2H)，0.82(s，3H)；
(3)、2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-β-丙氨酸酯的制备
在60℃，将2.747mmol(1.64g)2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧碳基)-β丙氨酸酯溶于无水甲醇中，溶解后，加入0.82g的10％钯碳(Pd/C)催化剂，加氢至压力为50Psi，反应4小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，得灰白色固体，用体积比为1∶2的甲醇和乙酸乙酯配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，得到0.83g2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-β-丙氨酸酯，产率；81.0％，为淡紫色固体，Mp174-175℃；IR(KBr)：3333，3281，1732，1608，15271260，1212，1182，1102，997，863cm-1；1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ6.77(s，1H)，6.64(s，1H)，4.76(t，J＝8.4Hz，1H)，3.85(s，3H)，3.66(s，1H)，2.77(t，J＝5.6Hz，3H)，0.85(s，3H)。
实施例2：16α-乙基-2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-苯丙氨酸酯的制备
(1)、N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸的制备
在-3℃，将10mmol的L-苯丙氨酸溶解于4.0ml质量浓度为9％的氢氧化钠(NaOH)水溶液中，得溶解液，边搅拌边用14mmol(即1.8ml)的氯甲酸苄酯以1滴/5秒的速度滴加到溶解液中进行反应，并滴加质量浓度为9％的氢氧化钠(NaOH)水溶液保持PH为8，滴完，置于15℃下，搅拌反应15小时，做薄层检测，测得溶液完全反应后，再用5ml/次的乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为35％的浓盐酸调PH至2，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体用5ml/次的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用5ml/次的蒸馏水洗涤2次、5ml的饱和食盐水洗涤1次，再以无水硫酸镁干燥15小时，抽滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，以体积比为1∶4的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过柱色谱纯化，得N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸，产率：65.5％，白色固体，熔点Mp：85-86℃；
(2)、16α-乙基-2-甲氧基-3-二苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-L-苯丙氨酸酯的制备
在15℃，将3.2mmol的N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸和3.0mmol的16α-乙基-2-甲氧基-3-苄氧基1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇溶于75ml二氯甲烷中，边搅拌边先后加入3.0mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和0.09mmol催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌反应10min后，补加1.8mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使16α-乙基-2-甲氧基-3-苄氧基1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇完全反应，搅拌15小时，做薄层检测，过滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，用体积比为1∶4的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，得化合物中间体16α-乙基-2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-L-苯丙氨酸酯1.89g，产率：89.9％，为白色固体，熔点Mp 141-143℃；IR(KBr)：3362，2924，1751，1693，1521，1260，1212，1181，750，699cm-1；1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ7.13-7.45(m，15H)，6.83(s，1H)，6.62(s，1H)，5.18(d，J＝8.0Hz，1H)，5.12(s，2H)，5.10(s，2H)，4.67(s，2H)，3.87(s，3H)，3.073.18(m，2H)，2.73(d，J＝4，1H)，1.23(s，3H)，0.76(s，3H)；
(3)、16α-乙基-2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-苯丙氨酸酯的制备
在60℃，将2.81mmol(1.97g)16α-乙基-2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-L-苯丙氨酸酯溶于无水乙醇中，溶解后，加入0.95g的10％钯碳(Pd/C)催化剂，加氢至压力为55Psi，反应4.5小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，得灰白色固体，用体积比为1∶5的乙酸乙酯：石油醚配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，得到1.12g16α-乙基-2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-苯丙氨酸酯，产率：88.8％，IR(KBr)：3361，2983，2967，2919，2861，2846，1743，1517，1506，1453，1444，1288，1262，1229，1211，1173，1119，1103，1027，1005，761.1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ7.21-7.33(m，5H)，6.78(s，1H)，6.64(s，1H)，4.72(t，J＝8.0Hz，3H)，3.86(s，3H)，3.24(d，J＝8，1H)，3.11(m，1H)，2.88(m，1H)，2.76(m，3H)，0.79(s，3H)。
实施例3：16α-(N，N-二甲基)氨甲基-2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-亮氨酸酯的制备
(1)、N-苄氧羰基-L-亮氨酸的制备
在2℃，将10mmol的L-亮氨酸溶解于4.0ml质量浓度为8％的氢氧化钠(NaOH)水溶液中，得溶解液，边搅拌边用14mmol(即1.8ml)的氯甲酸苄酯以1滴/6秒的速度滴加到溶解液中进行反应，并滴加质量浓度为8％的氢氧化钠(NaOH)水溶液保持PH为9，滴完，置于20℃下，搅拌反应15小时，用茚三酮为显色剂显色无紫色，再用5ml/次的乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为37％的浓盐酸调PH至1，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体用5ml/次的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用5ml/次的蒸馏水洗涤2次、5ml的饱和食盐水洗涤1次，再以无水硫酸镁干燥18小时，抽滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，以体积比为1∶4的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过柱色谱纯化，得N-苄氧羰基-L-亮氨酸，为无色透明油状物，产率：75.5％；
(2)、16α-(N，N-二甲基)氨甲基-2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-L-亮氨酸酯的制备
在20℃，将3.2mmol的N-苄氧羰基-L-亮氨酸和3.0mmol的16α-(N，N-二甲基)氨甲基-2-甲氧基-3苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇溶于75ml氯仿中，边搅拌边先后加入3.0mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和0.09mmol催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌反应10min后，补加2.1mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使16α-(N，N-二甲基)氨甲基-2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇完全反应，搅拌10小时，做薄层检测，过滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，再用乙酸乙酯溶解，过滤，弃去固体，滤液减压浓缩，得淡黄色固体，用无水乙醇重结晶，得化合物中间体16α-(N，N-二甲基)氨甲基-2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-L-亮氨酸酯，产率：85％，为白色固体，1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ7.31-7.46(m，10H)，6.84(s，1H)，6.63(s，1H)，5.12(d，J＝4，4H)，4.73(d，J＝8，1H)，4.41(d，J＝4，1H)，3.86(s，3H)，3.03(s，6H)，2.22-2.28(m，3H)，0.84(s，3H)；
(3)、16α-(N，N-二甲基)氨甲基-2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-亮氨酸酯的制备
在20℃，将1.50g(2.16mmol)16α-(N，N-二甲基)氨甲基-2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-L-亮氨酸酯溶于无水乙醇中，溶解后，加入0.75g的10％钯碳(Pd/C)催化剂，加氢至压力为60Psi，反应6小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，得灰白色固体，用无水甲醇重结晶，得到0.847g 16α-(N，N-二甲基)氨甲基-2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-亮氨酸酯，产率：83.3％，为白色固体。1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ6.78(s，1H)，6.64(s，1H)，4.73(t，J＝8，1H)，3.85(s，3H)，3.48(dd，J1＝4，J2＝4，1H)，2.26(s，6H)，0.95(dd，J1＝4，J2＝4，6H)，0.85(s，3H)。
实施例4：2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-赖氨酸酯的制备
(1)、N，N‘-二苄氧羰基-L-赖氨酸的制备
在6℃，将10mmol的L-赖氨酸溶解于4.0ml质量浓度为10％的氢氧化钠(NaOH)水溶液中，得溶解液，边搅拌边用14mmol(即1.8ml)的氯甲酸苄酯以1滴/7秒的速度滴加到溶解液中进行反应，并滴加质量浓度为10％的氢氧化钠(NaOH)水溶液保持PH为8，滴完，置于23℃下，搅拌反应15小时，用茚三酮为显色剂显色无紫色，再用5ml/次的乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为30％的浓盐酸调PH至3，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体用5ml/次的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用5ml/次的蒸馏水洗涤2次、5ml的饱和食盐水洗涤1次，再以无水硫酸镁干燥20小时，抽滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，以体积比为1∶4的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过柱色谱纯化，得N，N‘-二苄氧羰基-L-赖氨酸，为无色透明油状物，产率：69.5％；
(2)、2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N，N‘-二苄氧羰基)-L-赖氨酸酯的制备
在23℃，将1.6mmol的N，N‘-二苄氧羰基-L-赖氨酸和1.5mmol的2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇溶于35ml氯仿中，边搅拌边先后加入1.mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和0.045mmol催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌反应10min后，补加1.05mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇完全反应，搅拌15小时，做薄层检测，基本反应完全，过滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，用体积比为1∶4的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，得化合物中间体2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N，N‘-二苄氧羰基)-L-赖氨酸酯，产率：87.7％，为无色透明油状物，1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ7.45(s，1H)，7.43(s，1H)，7.29-7.37(m，13H)，6.82(s，1H)，6.62(s，1H)，5.41(s，1H)，5.10(s，4H)，5.08(s，2H)，4.85(s，1H)，4.72-4.76(t，J＝4，1H)，4.34-4.39(dd，J1＝8，J2＝8，1H)，3.85(s，3H)，3.19(d，J＝4，2H)，2.73-2.77(m，2H)，0.81(s，3H)；
(3)、2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-赖氨酸酯的制备
在25℃，将1.03g(1.3mmol)2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N，N‘-三苄氧羰基)-L-赖氨酸酯溶于无水乙酸乙酯中，溶解后，加入0.5g的10％钯碳(Pd/C)催化剂，加氢至压力为40Psi，反应4小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，得灰色固体物，用乙醇为流动相过柱色谱纯化，得到2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-赖氨酸酯，为白色粉末固体，产率：85.5％。1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ6.79(s，1H)，6.63(s，1H)，5.09(s，1H)，4.74(t，J＝8，1H)，3.85(s，3H)，3.48(m，1H)，0.83(s，3H)。
实施例5：2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-缬氨酸酯的制备
(1)、N-苄氧羰基-D-缬氨酸的制备
0℃下，将10mmolD-缬氨酸溶于50ml此温度下的碳酸氢钠(NaHCO3)饱和溶液中，得溶解液，边搅拌边用11mmol的氯甲酸苄酯以1滴/10秒的速度滴加到溶解液中进行反应，滴完，置于30℃下，搅拌反应15小时，做薄层检测，测得溶液完全反应后，再用50ml/次的乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为30％的浓盐酸调PH至3，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体用50ml/次的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用50ml/次的蒸馏水洗涤2次、50ml的饱和食盐水洗涤1次，再以无水硫酸镁干燥7小时，抽滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，以体积比为1∶3的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过层析柱纯化，得N-苄氧羰基-D-缬氨酸，为无色透明油状物，产率为68.7％；
(2)、2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-D-缬氨酸酯的制备
在30℃，将3.2mmol的N-苄氧羰基-D-缬氨酸和3.0mmol的2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇溶于75ml二氯甲烷中，边搅拌边先后加入3.0mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和0.09mmol催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌反应10min后，补加1.5mmol的缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇完全反应，搅拌10小时，做薄层检测，过滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，用体积比为1∶4的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，得化合物中间体2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-D-缬氨酸酯，为无色透明油状物，产率为83.6％，1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ7.45(s，1H)，7.43(s，1H)，7.29-7.36(m，8H)，6.83(s，1H)，6.62(s，1H)，5.11(s，2H)，5.10(s，2H)，4.72(t，J＝8，1H)，4.40(d，J＝4，1H)，3.85(s，3H)，0.98(s，6H)，0.83(s，3H)；
(3)、2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-缬氨酸酯的制备
在30℃，将2.45mmol(1.53g)2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-D-缬氨酸酯溶于无水乙醇中，溶解后，加入0.78g的10％钯碳(Pd/C)催化剂，加氢至压力为45Psi，反应4小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，得灰白色固体，用无水甲醇重结晶，得0.934g 2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-缬氨酸酯，为白色粉末固体，产率为95.1％，Mp：132-133℃，1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ6.77(s，1H)，6.64(s，1H)，4.78(dd，J1＝8，J2＝8，1H)，3.85(s，3H)，3.31(d，J＝4，1H)，2.77(m，2H)，1.01(d，J＝4，3H)，0.93(d，J＝8，3H)，0.85(s，1H)。
实施例6：2-乙氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-丙氨酸酯的制备
(1)、N-苄氧羰基-D-丙氨酸的制备
在10℃，将10mmol的D-丙氨酸溶解于4.0ml质量浓度为8％的氢氧化钠(NaOH)水溶液中，得溶解液，边搅拌边用14mmol(即1.8ml)的氯甲酸苄酯以1滴/9秒的速度滴加到溶解液中进行反应，并滴加质量浓度为8％的氢氧化钠(NaOH)水溶液保持PH为8，滴完，置于28℃下，搅拌反应15小时，做薄层检测，测得溶液完全反应后，再用5ml/次的乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为30％的浓盐酸调PH至3，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体用5ml/次的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用5ml/次的蒸馏水洗涤2次、5ml的饱和食盐水洗涤1次，再以无水硫酸镁干燥12小时，抽滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，以体积比为1∶3的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过层析柱纯化，得N-苄氧羰基-D-丙氨酸，产率：71.8％，熔点Mp：86-87℃；
(2)、2-乙氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-D-丙氨酸酯的制备
在27℃，将3.2mmol的N-苄氧羰基-D-丙氨酸和3.0mmol的2-乙氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β醇溶于75ml二氯甲烷中，边搅拌边先后加入3.0mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和0.09mmol催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌反应10min后，补加1.8mmol的缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使2-乙氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β醇完全反应，搅拌18小时，做薄层检测，过滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，用体积比为1∶3的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，得化合物中间体2-乙氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-D-丙氨酸酯，产率：68％，为白色固体，1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ7.25-7.45(m，10H)，6.83(s，1H)，6.62(s，1H)，5.34(d，J＝7.6Hz，1H)，5.11(d，J＝4.8Hz，4H)，4.77(t，J＝8.8Hz，1H)，4.40(m，1H)，2.73(m，2H)，0.82(s，3H)；
(3)、2-乙氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-丙氨酸酯的制备
在60℃，将2.4mmol(1.466g)2-乙氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-D-丙氨酸酯溶于无水甲醇中，溶解后，加入0.72g的10％钯碳(Pd/C)催化剂，加氢至压力为50Psi，反应4小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，得灰白色固体，用无水甲醇重结晶，得0.77g 2-乙氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-丙氨酸酯，产率：82.9％，为白色固体，1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ6.77(s，1H)，6.64(s，1H)，4.77(t，J＝8.4Hz，1H)，4.08(m，2H)，3.65(s，1H)，2.77(t，J＝5.6Hz，3H)，2.70(m，2H)，0.85(s，3H)。
实施例7：2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-亮氨酸酯的制备
(1)、N-苄氧羰基-D-亮氨酸的制备
在-5℃，将25mmol的D-亮氨酸溶解于10ml质量浓度为10％的氢氧化钠(NaOH)水溶液中，得溶解液，边搅拌边用35mmol(即4.5ml)氯甲酸苄酯(Cbz-Cl)以1滴/4秒的速度滴加到溶解液中进行反应，并滴加质量浓度为10％的氢氧化钠(NaOH)水溶液保持PH为8，滴完，置于10℃下，搅拌反应15小时，用茚三酮为显色剂显色无紫色，再用16ml/次的乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为30％的浓盐酸调PH至3，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体用16ml/次的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用16ml/次的蒸馏水洗涤2次、16ml/次的饱和食盐水洗涤1次，再用无水硫酸镁干燥10小时，抽滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，以体积比为1∶3的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过层析柱纯化，得4.0gN-苄氧羰基-D-亮氨酸，产率：61.5％，为无水透明油状物；
(2)、2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-D-亮氨酸酯的制备
在20℃，将3.2mmolN-苄氧羰基-D-亮氨酸和3.0mmol的2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇溶于75ml二氯甲烷中，边搅拌边先后加入3.0mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和0.09mmol催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌反应10min后，补加2.1mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇完全反应，搅拌10小时，做薄层检测，过滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，再用乙酸乙酯溶解，过滤，弃去固体，滤液减压浓缩，得淡黄色固体，用无水乙醇重结晶，得化合物中间体1.2g 2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-D-亮氨酸酯，产率62.6％，为白色固体，1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ7.31-7.46(m，10H)，6.84(s，1H)，6.63(s，1H)，5.12(d，J＝4，4H)，4.71-4.75(t，J＝8，1H)，4.39(d，J＝4，1H)，3.86(s，3H)，2.75-2.78(m，2H)，2.21-2.29(m，3H)，0.84(S，1H)；
(3)、2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-亮氨酸酯的制备
在20℃，将1.2g(1.88mmol)2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧碳基)-D-亮氨酸酯溶于无水乙醇中，溶解后，加入0.6g的10％钯碳(Pd/C)催化剂，加氢气至压力为60Psi，反应4小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，得灰白色固体，以无水甲醇重结晶，得0.67g2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-亮氨酸酯，产率为77.7％，白色固体，1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ6.78(s，1H)，6.64(s，1H)，4.73(t，J＝8，1H)，3.85(s，3H)，3.46(dd，J1＝4，J2＝4，1H)，0.95(dd，J1＝4，J2＝4，6H)，0.85(s，3H)。
实施例8：2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-N-β-丙氨酰-L-组氨酸酯的制备
(1)、N-苄氧羰基-β-丙氨酰-L-组氨酸的制备
在8℃，将10mmol的N-β-丙氨酰-L-组氨酸(L-肌肽)溶解于4.0ml质量浓度为10％的氢氧化钠(NaOH)水溶液中，得溶解液，边搅拌边用14mmol(即1.8ml)的氯甲酸苄酯以1滴/8秒的速度滴加到溶解液中进行反应，并滴加质量浓度为10％的氢氧化钠(NaOH)水溶液保持PH为8，滴完，置于25℃下，搅拌反应12小时，用茚三酮为显色剂显色无紫色，再用7ml/次乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为30％的浓盐酸调PH至3，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体用7ml/次的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用7ml/次的蒸馏水洗涤2次、7ml的饱和食盐水洗涤1次，再以无水硫酸镁干燥22小时，抽滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，以体积比为1∶4的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过层析柱纯化，得无水透明油状物N-苄氧羰基-β-丙氨酰-L-组氨酸，产率：58.3％；
(2)、2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基-β-丙氨酰)-L-组氨酸酯的制备
在25℃，将3.2mmol的N-苄氧羰基-β-丙氨酰-L-组氨酸和3.0mmol的2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇溶解于75ml无水乙腈中，边搅拌边先后加入3.0mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和0.09mmol催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌反应10min后，补加1.5mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇完全反应，搅拌17小时，做薄层检测，过滤，滤液减压浓缩，得到淡黄色油状物，再用乙酸乙酯溶解，过滤，弃去固体，滤液减压浓缩，得到淡黄色固体，用甲醇重结晶，得化合物中间体2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基-β-丙氨酰)-L-组氨酸酯，产率：42.2％，为白色固体，1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ7.29-7.45(m，11H)，6.96(d，J＝8，1H)，6.69(s，1H)，6.63(s，1H)，5.13(s，2H)，5.09(s，2H)，4.72(t，J＝8，1H)，3.85(s，3H)，3.81(m，1H)，0.83(s，3H)；
(3)、2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-N-β-丙氨酰-L-组氨酸酯的制备
在60℃，将1.50g(2.44mmol)2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-β-丙氨酰-L-组氨酸酯溶于无水甲醇中，溶解后，加入0.75g的10％钯碳(Pd/C)催化剂，加氢至压力为60Psi，反应4小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，得灰白色固体，以乙酸乙酯重结晶，得2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-N-β-丙氨酰-L-组氨酸酯，为白色固体，产率：87.5％。1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ7.45(s，1H)，6.96(d，J＝8，1H)，6.70(s，1H)，6.62(s，1H)，5.01(s，1H)，4.72(t，J＝8，1H)，3.85(s，3H)，3.78(m，1H)，0.83(s，3H)。
实施例9：2-乙氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-丙氨酸酯的制备
(1)、N-苄氧羰基-L-丙氨酸的制备
在-5℃，将10mmol的L-丙氨酸溶解于4.0ml质量浓度为10％的氢氧化钠(NaOH)水溶液中，得溶解液，边搅拌边用14mmol(即1.8ml)的氯甲酸苄酯以1滴/4秒的速度滴加到溶解液中进行反应，并滴加质量浓度为10％的氢氧化钠(NaOH)水溶液保持PH为8，滴完，置于10℃下，搅拌反应15小时，用茚三酮为显色剂显色无紫色，再用5ml/次的乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为30％的浓盐酸调PH至3，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体用5ml/次的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用5ml/次的蒸馏水洗涤2次、5ml的饱和食盐水洗涤1次，再用无水硫酸镁干燥10小时，抽滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，以体积比为1∶3的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过层析柱纯化，得白色固体N-苄氧羰基-L-丙氨酸，产率：71.8％，熔点Mp：86-87℃；
(2)、2-乙氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-L-丙氨酸酯的制备
在10℃，将3.2mmolN-苄氧羰基-L-丙氨酸和3.0mmol的2-乙氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇溶于75ml二氯甲烷中，边搅拌边先后加入3.0mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和0.05mmol催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌反应10min后，补加1.8mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使2-乙氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇完全反应，搅拌15小时，做薄层检测，过滤，滤液减压浓缩，得到淡黄色油状物，用体积比为1∶3的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，得化合物中间体2-乙氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-L-丙氨酸酯1.16g，产率为63.3％，为白色固体，1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ7.25-7.46(m，10H)，6.82(s，1H)，6.62(s，1H)，5.35(d，J＝7.6Hz，1H)，5.10(d，J＝4.8Hz，4H)，4.73(t，J＝8.8Hz，1H)，4.39(m，1H)，4.08(m，2H)，2.73(m，2H)，0.82(s，3H)；
(3)、2-乙氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-丙氨酸酯的制备
在40℃，将1.0g的2-乙氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-L-丙氨酸酯溶于无水乙醇中，溶解后，加入0.5g的10％钯碳(Pd/C)催化剂，加氢气至压力为60Psi，反应4小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，灰白色固体，用体积比为1∶2的甲醇和乙酸乙酯配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，得0.54g白色固体2-乙氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-丙氨酸酯，产率：85.3％，1H-NMR(CDCl3400MHz)：δ6.77(s，1H)，6.64(s，1H)，4.77(t，J＝8.4Hz，1H)，4.10(m，2H)，3.66(s，1H)，2.77(t，J＝5.6Hz，3H)，0.85(s，3H)。
本发明水溶性好、口服吸收效果好等，且抗肿瘤活性优于2-甲氧基雌二醇，并经试验取得了良好的效果，具体实验资料如下：
本发明雌甾氨基酸酯化合物对肿瘤细胞的抗增殖活性评价实验
1)受试样品
本发明雌甾氨基酸酯化合物，用二甲基亚砜DMSO配制成10mmol/L的原药贮存液，4℃保存，临用时以无双抗DMEM完全培养基稀释配制成所需浓度，0.22μm微孔滤膜过滤。
2)人癌细胞株
MCF-7(乳腺癌细胞)、Hela(上皮来源的宫颈癌细胞)、SPC-A-1(肺癌细胞)、SMMC-7721(肝癌细胞)、PC-3(前列腺癌细胞)、SK-N-SH(人神经母细胞瘤)。
3)主要仪器：
CJ-2F超净工作台：苏州冯氏实验动物设备有限公司
二氧化碳培养箱：美国SIM公司
倒置显微镜：德国莱卡公司
Spectra Mr型全波长酶标仪：美国DYNEX公司
细胞培养板：美国Corning公司
SYQ-DSX-280B手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂
4)主要试剂
DMEM培养基：HyClone，北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司
PBS：每升溶液中含有NaCl8.5g，KCl0.2g，Na2HPO3.12H2O 2.85g，KH2PO40.27g，PH为7.4
青霉素、链霉素：HyClone，SH40003-12
胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司
胰蛋白酶：吉诺生物医药技术有限公司
硫基罗丹明蛋白染料(SRB)：美国Sigma公司
Tris碱：美国Sigma公司
TCA(三氯醋酸)：天津市科密欧化学试剂有限公司
冰乙酸：天津市凯通化学试剂有限公司
DMSO(Acs Grade)：Amresco
其它试剂均为国产分析纯。
5)实验方法
用SRB法检测不同浓度的2-甲氧基雌二醇和本发明雌甾氨基酸酯化合物对6株不同癌细胞增殖的抑制作用，取状态良好对数生长期细胞，调整浓度为2.5×104个/ml，接种于96孔培养板中，每孔200μl。5％CO2、饱和湿度37℃孵育箱中培养。待细胞贴壁，雌甾氨基酸酯化合物按预设的浓度梯度加入，对照组加入等体积溶解样品的溶媒，每孔终体积为200μl，每组设6个复孔。5％CO2，37℃孵育48、72小时后，贴壁细胞每个小孔加预冷的50％TCA液50μl(终浓度为10％)固定，加TCA时必须轻轻加在培养液表面，静置10分钟后再将平板移至4℃放置1小时，这样可使悬浮细胞固定在培养孔的底部。倒掉固定液，小孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加100μlSRB液，在室温放置15分钟。未与蛋白结合的SRB用1％醋酸液洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150μl 10mmol/l非缓冲Tris碱液(ph10.5)溶解，用全自动酶标仪在515nm波长处测定每个小孔的OD值。按公式：GI(生长抑制率)＝1-(药物组OD值/对照组OD值)×100％计算各组的生长抑制率。
6)实验结果
在体外细胞毒试实验中，评价了受试样品2-甲氧基雌二醇和雌甾氨基酸酯化合物对MCF-7、Hela、SPC-A-1、SMMC-7721、PC-3、SK-N-SH六种人类肿瘤细胞系的增殖能力的抑制作用。实验结果见表1，2。
对本发明雌甾氨基酸酯化合物进行水溶性测试，由测试结果和本发明雌甾氨基酸酯化合物对肿瘤细胞的抗增殖活性评价实验可知：
2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-β-丙氨酸酯(简称：A)：水溶性为：11μg/ml，较2-ME有明显改善，在化合物A体外对人癌细胞株，如：MCF-7(乳腺癌细胞)、Hela(上皮来源的宫颈癌细胞)、SPC-A-1(肺癌细胞)、SMMC-7721(肝癌细胞)、PC-3(前列腺癌细胞)、SK-N-SH(人神经母细胞瘤)的抗肿瘤活性筛选实验中的发现其不仅具有广谱抗肿瘤效果，且对部分肿瘤细胞的抑制效果明显高于2-ME，并且呈现良好的浓度响应性。具体数据见表1和2。
16α-乙基-2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-苯丙氨酸酯(简称：B)：水溶性为：8μg/ml，较2-ME有明显改善，在化合物B体外对人癌细胞株，如：MCF-7(乳腺癌细胞)、Hela(上皮来源的宫颈癌细胞)、SPC-A-1(肺癌细胞)、SMMC-7721(干癌细胞)、PC-3(前列腺癌细胞)、SK-N-SH(人神经母细胞瘤)的抗肿瘤活性筛选实验中惊奇的发现其不仅具有广谱抗肿瘤效果，且对很多肿瘤细胞的抑制作用明显高于2-ME的抑制作用，同时对部分肿瘤细胞呈现良好的浓度响应性。具体数据见表1和2。
16α-(N，N-二甲基)氨甲基-2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-亮氨酸酯(简称：C)：水溶性为：4μg/ml，较2-ME有明显改善，在化合物C体外对人癌细胞株，如：MCF-7(乳腺癌细胞)、Hela(上皮来源的宫颈癌细胞)、SPC-A-1(肺癌细胞)、SMMC-7721(肝癌细胞)、PC-3(前列腺癌细胞)、SK-N-SH(人神经母细胞瘤)的抗肿瘤活性筛选实验中惊奇的发现其不仅具有广谱的抗肿瘤效果，并且在对某些肿瘤细胞的抑制作用上明显好于2-ME，且呈现良好的浓度响应性。具体数据见表1和2。
2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-赖氨酸酯(简称：D)：水溶性为：9μg/ml，较2-ME有明显改善，在化合物D体外对人癌细胞株，如：MCF-7(乳腺癌细胞)、Hela(上皮来源的宫颈癌细胞)、SPC-A-1(肺癌细胞)、SMMC-7721(肝癌细胞)、PC-3(前列腺癌细胞)、SK-N-SH(人神经母细胞瘤)的抗肿瘤活性筛选实验中惊奇的发现其不仅具有广谱的抗肿瘤效果，并且在对某些肿瘤细胞的抑制作用上明显好于2-ME，且呈现良好的浓度响应性。具体数据见表1和2。
2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-缬氨酸酯(简称：E)：水溶性为：5μg/ml，较2-ME有明显改善，在化合物E体外对人癌细胞株，如：MCF-7(乳腺癌细胞)、Hela(上皮来源的宫颈癌细胞)、SPC-A-1(肺癌细胞)、SMMC-7721(肝癌细胞)、PC-3(前列腺癌细胞)、SK-N-SH(人神经母细胞瘤)的抗肿瘤活性筛选实验中惊奇的发现其不仅具有广谱的抗肿瘤效果，并且对肿瘤细胞表现出良好的抑制作用，不仅对部分肿瘤细胞的抑制作用优于2-ME的抑制作用，且呈现良好的浓度响应性。具体数据见表1和2。
2-乙氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-丙氨酸酯(简称：F)：水溶性为：10μg/ml，较2-ME有明显改善，在化合物F体外对人癌细胞株，如：MCF-7(乳腺癌细胞)、Hela(上皮来源的宫颈癌细胞)、SPC-A-1(肺癌细胞)、SMMC-7721(肝癌细胞)、PC-3(前列腺癌细胞)、SK-N-SH(人神经母细胞瘤)的抗肿瘤活性筛选实验中惊奇的发现其不仅具有广谱抗肿瘤效果，同时呈现出良好的浓度响应性。具体数据见表1和2。
2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-亮氨酸酯(简称：G)：水溶性为：5μg/ml，较2-ME有明显改善，在化合物G体外对人癌细胞株，如：MCF-7(乳腺癌细胞)、Hela(上皮来源的宫颈癌细胞)、SPC-A-1(肺癌细胞)、SMMC-7721(肝瘤细胞)、PC-3(前列腺癌细胞)、SK-N-SH(人补经母细胞瘤)的抗肿瘤活性筛选实验中发现其具有广谱抗肿瘤效果，且呈现出良好的浓度响应性。具体数据见表1和2。
2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-N-β-丙氨酰-L-组氨酸酯(简称：H)：水溶性为：14μg/ml，较2-ME有明显改善，在化合物H体外对人癌细胞株，如：MCF-7(乳腺癌细胞)、Hela(上皮来源的宫颈癌细胞)、SPC-A-1(肺癌细胞)、SMMC-7721(肝癌细胞)、PC-3(前列腺癌细胞)、SK-N-SH(人神经母细胞瘤)的抗肿瘤活性筛选实验中惊奇的发现其具有广谱的抗肿瘤作，且对某些肿瘤细胞的抑制作用明显优于2-ME的抑制作用，同时对部分肿瘤细胞呈现出良好的浓度响应性。具体数据见表1和2。
2-乙氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-丙氨酸酯(简称：I)：水溶性为：10μg/ml，较2-ME有明显改善，在化合物I体外对人癌细胞株，如：MCF-7(乳腺癌细胞)、Hela(上皮来源的宫颈癌细胞)、SPC-A-1(肺癌细胞)、SMMC-7721(肝癌细胞)、PC-3(前列腺癌细胞)、SK-N-SH(入神经母细胞瘤)的抗肿瘤活性筛选实验中惊奇的发现其不仅具有广谱的抗肿瘤作，并且对某些肿瘤细胞的抑制作用要优于2-ME，同时对部分肿瘤细胞呈现出良好的浓度响应性。具体数据见表1和2。
SRB法检测各化合物对不同肿瘤细胞的抑制率(n＝6，X±SD抑制率/％)
表1
表2
aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001vs空白对照。
Claims (9)
1.一种具有抗肿瘤活性的雌甾氨基酸酯化合物的制备方法，其特征在于，该化合物是由氨基酸或小分子肽类和甾体母核、化合物中间体制成，所说的雌甾氨基酸酯化合物的分子结构通式为：
所说的化合物中间体的分子结构通式为：
所说的甾体母核的分子结构通式为：
所说的雌甾氨基酸酯化合物、化合物中间体及甾体母核的结构通式中：R4为β-丙氨酸残基、L-丙氨酸残基、D-丙氨酸残基、L-苯丙氨酸残基、D-苯丙氨酸残基、L-亮氨酸残基、D-亮氨酸残基、L-异亮氨酸残基、D-异亮氨酸残基、L-赖氨酸残基、D-赖氨酸残基、L-精氨酸残基、D-精氨酸残基、L-组氨酸残基、D-组氨酸残基、L-天冬氨酸残基、D-天冬氨酸残基、L-半胱氨酸残基、D-半胱氨酸残基、L-缬氨酸残基、D-缬氨酸残基、L-脯氨酸残基、D-脯氨酸残基、L-色氨酸残基、D-色氨酸残基、L-酪氨酸残基、D-酪氨酸残基、L-丝氨酸残基、D-丝氨酸残基、L-天冬酰胺残基、D-天冬酰胺残基、L-谷氨酰胺残基、D-谷氨酰胺残基、L-苏氨酸残基、D-苏氨酸残基中的一种，以上各种氨基酸残基均为其对应的氨基酸去掉羧基上的羟基后的结构，或R4为由β-丙氨酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-丝氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-苏氨酸中的2-4个组成的小分子肽类的残基，此肽类残基为其对应的小分子肽去掉羧基上的羟基后的基团；R1为N-苄氧羰基-β-丙氨酸残基、N-苄氧羰基-L-丙氨酸残基、N-苄氧羰基-D-丙氨酸残基、N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸残基、N-苄氧羰基-D-苯丙氨酸残基、N-苄氧羰基-L-亮氨酸残基、N-苄氧羰基-D-亮氨酸残基、N-苄氧羰 基-L-异亮氨酸残基、N-苄氧羰基-D-异亮氨酸残基、N-苄氧羰基-L-赖氨酸残基、N-苄氧羰基-D-赖氨酸残基、N-苄氧羰基-L-精氨酸残基、N-苄氧羰基-D-精氨酸残基、N-苄氧羰基-L-组氨酸残基、N-苄氧羰基-D-组氨酸残基、N-苄氧羰基-L-天冬氨酸残基、N-苄氧羰基-D-天冬氨酸残基、N-苄氧羰基-L-半胱氨酸残基、N-苄氧羰基-D-半胱氨酸残基、N-苄氧羰基-L-缬氨酸残基、N-苄氧羰基-D-缬氨酸残基、N-苄氧羰基-L-脯氨酸残基、N-苄氧羰基-D-脯氨酸残基、N-苄氧羰基-L-色氨酸残基、N-苄氧羰基-D-色氨酸残基、N-苄氧羰基-L-酪氨酸残基、N-苄氧羰基-D-酪氨酸残基、N-苄氧羰基-L-丝氨酸残基、N-苄氧羰基-D-丝氨酸残基、N-苄氧羰基-L-天冬酰胺残基、N-苄氧羰基-D-天冬酰胺残基、N-苄氧羰基-L-谷氨酰胺残基、N-苄氧羰基-D-谷氨酰胺残基、N-苄氧羰基-L-苏氨酸残基、N-苄氧羰基-D-苏氨酸残基中的一种，以上各种残基均为其对应的N-苄氧羰基氨基酸去掉羧基上的羟基后的结构；或者R1为Cbz-R，其中Cbz为苄氧羰基，R为：由β-丙氨酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-丝氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-苏氨酸中的2-4个组成的小分子肽类的残基，此肽类残基为其对应的小分子肽去掉羧基上的羟基及伯胺上的一个H后的基团，且伯胺去掉H后与苄氧羰基中的羰基以酰胺键相连接；
R2为1～6个碳原子的直连或支链的烷基或含有1～2个杂原子的1～6个碳原子的直连或支链的烷基，杂原子为N，O，S中的一种或两种，且R2基团中不含有羟基、羧基、氨基中的任一个基团；R3为H或10个碳以内的碳氢化合物或含有1～2个杂原子的10个碳以内的碳氢化合物，其中杂原子为N，O，S中的一种或两种，且R3基团中不含有羟基、羧基、氨基中的任一个基团；
该雌甾氨基酸酯化合物的制备方法是：
(1)、在-5℃-15℃，将氨基酸或小分子肽类溶解于质量浓度为8％-10％的氢氧化钠水溶液或者碳酸氢钠饱和溶液中，每1ml的质量浓度为8％-10％的氢氧化钠水溶液溶解2.5mmol的氨基酸或小分子肽类或者每1ml碳酸氢钠饱和溶液中溶解0.2mmol氨基酸或小分子肽类，得溶解液，边搅拌边用氨基酸或小分子肽类摩尔数的1-1.5倍量的氯甲酸苄酯以1滴/3-10秒的速度滴加到溶解液中进行反应，若将氨基酸或小分子肽类溶解于质量浓度为8％-10％的氢氧化钠水溶液中时，在溶解液中需滴加氢氧化钠水溶液保持pH＝8～9，滴完，置于10℃-30℃下，搅拌反应至用茚三酮为显色剂显色至无紫色，或做薄层检测，薄层检测的目的在于，测定溶液是否反应完全，只有反应完全后，才可进行下一步的操作，以下同，测得完全反应后，再每次用反应溶液体积0.5-1.3倍量的乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为 30％-40％的浓盐酸调pH为1-3，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体每次用与乙醚同量的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用每次与乙醚同量的蒸馏水洗涤2次、饱和食盐水洗涤1次，再以无水硫酸镁干燥6-24小时，抽滤，滤液减压浓缩，用体积比为1∶2-5的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过层析柱纯化或过柱色谱纯化，得纯化的化合物；
(2)、在10-30℃，将摩尔比为1-1.2∶1的纯化的化合物和甾体母核的混合物溶解于反应溶剂中，每100ml反应溶剂中溶解2mmol-5mmol甾体母核，边搅拌边先后加入缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和催化剂4-二甲氨基吡啶，甾体母核和1，3-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1∶1-1.5；4-二甲氨基吡啶和1，3-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1∶30-100，搅拌反应10min后，补加上述缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺量的0.4-0.8倍量的另备的缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使甾体母核完全反应，搅拌10-20小时，做薄层检测，过滤，滤液减压浓缩，用体积比为1∶2-5的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，或用乙酸乙酯溶解，过滤，弃去固体，滤液减压浓缩，用甲醇或乙醇重结晶纯化，纯化后即得化合物中间体，其分子结构通式为：
(3)在10-60℃，将化合物中间体溶于溶解溶剂中，溶解后，并加入化合物中间体重量的0.4倍--0.6倍的10％钯碳催化剂，加氢至压力为40-60Psi，反应4-6小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，用体积比为1∶2的甲醇和乙酸乙酯或体积比为1∶5的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶液，或用乙醇为流动相过柱色谱纯化，或无水甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯中的一种重结晶纯化，即得雌甾氨基酸酯化合物；
所说的氨基酸为β-丙氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-亮氨酸、D-亮氨酸、L-异亮氨酸、D-异亮氨酸、L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸、D-精氨酸、L-组氨酸、D-组氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-脯氨酸、D-脯氨酸、L-色氨酸、D-色氨酸、L-酪氨酸、D-酪氨酸、L-丝氨酸、D-丝氨酸、L-天冬酰胺、D-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-苏氨酸、D-苏氨酸中的一种；所说的小分子肽类是由：β-丙氨酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨 酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-丝氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-苏氨酸中的2-4个组成的肽；
所说的反应溶剂为：二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、无水乙腈中的一种；
所说的溶解溶剂为：无水甲醇、无水乙醇、无水乙酸乙酯、无水二氯甲烷、无水丙酮中的一种。
2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的雌甾氨基酸酯化合物的合成方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)、N-苄氧羰基-β-丙氨酸的制备
在-5℃，将10mmol的β-丙氨酸溶解于4.0ml质量浓度为10％的氢氧化钠水溶液中，得溶解液，边搅拌边用14mmol的氯甲酸苄酯以1滴/4秒的速度滴加到溶解液中进行反应，并滴加质量浓度为10％的氢氧化钠水溶液保持pH为8，滴完，置于10℃下，搅拌反应15小时，用茚三酮为显色剂显色无紫色，再用5ml/次的乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为30％的浓盐酸调pH至3，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体用5ml/次的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用5ml/次的蒸馏水洗涤2次、5ml的饱和食盐水洗涤1次，再用无水硫酸镁干燥10小时，抽滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，以体积比为1∶3的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过层析柱纯化，得白色固体N-苄氧羰基-β-丙氨酸；
(2)、2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-β-丙氨酸酯的制备
在10℃，将3.2mmol的N-苄氧羰基-β-丙氨酸和3.0mmol的2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇溶于75ml二氯甲烷中，边搅拌边先后加入3.0mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和0.09mmol催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌反应10min后，补加1.5mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇完全反应，搅拌10小时，做薄层检测，过滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，用体积比为1∶3的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，得化合物中间体2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-β-丙氨酸酯；
(3)、2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-β-丙氨酸酯的制备
在60℃，将1.64g2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-β-丙氨酸酯溶于无水甲醇中，溶解后，加入0.82g的10％钯碳催化剂，加氢至压力为50Psi，反应4小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，得灰白色固体，用体积比为1∶2的甲醇和 乙酸乙酯配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，得2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-β-丙氨酸酯。
3.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的雌甾氨基酸酯化合物的合成方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)、N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸的制备
在-3℃，将10mmol的L-苯丙氨酸溶解于4.0ml质量浓度为9％的氢氧化钠水溶液中，得溶解液，边搅拌边用14mmol的氯甲酸苄酯以1滴/5秒的速度滴加到溶解液中进行反应，并滴加质量浓度为9％的氢氧化钠水溶液保持pH为8，滴完，置于15℃下，搅拌反应15小时，做薄层检测，测得溶液完全反应后，再用5ml/次的乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为35％的浓盐酸调pH至2，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体用5ml/次的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用5ml/次的蒸馏水洗涤2次、5ml的饱和食盐水洗涤1次，再以无水硫酸镁干燥15小时，抽滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，以体积比为1∶4的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过柱色谱纯化，得N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸；
(2)、16α-乙基-2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-L-苯丙氨酸酯的制备
在15℃，将3.2mmol的N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸和3.0mmol的16α-乙基-2-甲氧基-3-苄氧基1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇溶于75ml二氯甲烷中，边搅拌边先后加入3.0mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和0.09mmol催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌反应10min后，补加1.8mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使16α-乙基-2-甲氧基-3-苄氧基1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇完全反应，搅拌15小时，做薄层检测，过滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，用体积比为1∶4的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，得化合物中间体16α-乙基-2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-L-苯丙氨酸酯；
(3)、16α-乙基-2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-苯丙氨酸酯的制备
在60℃，将1.97g 16α-乙基-2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-L-苯丙氨酸酯溶于无水乙醇中，溶解后，加入0.95g的10％钯碳(Pd/C)催化剂，加氢至压力为55Psi，反应4.5小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，得灰白色固体，用体积比为1∶5的乙酸乙酯∶石油醚配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，得16α-乙基-2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-苯丙氨酸酯。
4.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的雌甾氨基酸酯化合物的合成方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)、N-苄氧羰基-L-亮氨酸的制备
在2℃，将10mmol的L-亮氨酸溶解于4.0ml质量浓度为8％的氢氧化钠水溶液中，得溶解液，边搅拌边用14mmol的氯甲酸苄酯以1滴/6秒的速度滴加到溶解液中进行反应，并滴加质量浓度为8％的氢氧化钠水溶液保持pH为9，滴完，置于20℃下，搅拌反应15小时，用茚三酮为显色剂显色无紫色，再用5ml/次的乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为37％的浓盐酸调pH至1，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体用5ml/次的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用5ml/次的蒸馏水洗涤2次、5ml的饱和食盐水洗涤1次，再以无水硫酸镁干燥18小时，抽滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，以体积比为1∶4的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过柱色谱纯化，得N-苄氧羰基-L-亮氨酸；
(2)、16α-(N，N-二甲基)氨甲基-2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-L-亮氨酸酯的制备
在20℃，将3.2mmol的N-苄氧羰基-L-亮氨酸和3.0mmol的16α-(N，N-二甲基)氨甲基-2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇溶于75ml氯仿中，边搅拌边先后加入3.0mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和0.09mmol催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌反应10min后，补加2.1mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使16α-(N，N-二甲基)氨甲基-2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇完全反应，搅拌10小时，做薄层检测，过滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，再用乙酸乙酯溶解，过滤，弃去固体，滤液减压浓缩，得淡黄色固体，用无水乙醇重结晶，得化合物中间体16α-(N，N-二甲基)氨甲基-2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-L-亮氨酸酯；
(3)、16α-(N，N-二甲基)氨甲基-2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-亮氨酸酯的制备
在20℃，将1.50g16α-(N，N-二甲基)氨甲基-2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-L-亮氨酸酯溶于无水乙醇中，溶解后，加入0.75g的10％钯碳催化剂，加氢至压力为60Psi，反应6小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，得灰白色固体，用无水甲醇重结晶，得16α-(N，N-二甲基)氨甲基-2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-亮氨酸酯。
5.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的雌甾氨基酸酯化合物的合成方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)、N，N‘-二苄氧羰基-L-赖氨酸的制备
在6℃，将10mmol的L-赖氨酸溶解于4.0ml质量浓度为10％的氢氧化钠水溶液中，得溶解液，边搅拌边用14mmol的氯甲酸苄酯以1滴/7秒的速度滴加到溶解液中进行反应，并滴加质量浓度为10％的氢氧化钠水溶液保持pH为8，滴完，置于23℃下，搅拌反应15小时，用茚三酮为显色剂显色无紫色，再用5ml/次的乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为30％的浓盐酸调pH至3，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体用5ml/次的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用5ml/次的蒸馏水洗涤2次、5ml的饱和食盐水洗涤1次，再以无水硫酸镁干燥20小时，抽滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，以体积比为1∶4的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过柱色谱纯化，得N，N‘-二苄氧羰基-L-赖氨酸；
(2)、2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N，N‘-二苄氧羰基)-L-赖氨酸酯的制备
在23℃，将1.6mmol的N，N‘-二苄氧羰基-L-赖氨酸和1.5mmol的2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇溶于35ml氯仿中，边搅拌边先后加入1.5mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和0.045mmol催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌反应10min后，补加1.05mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇完全反应，搅拌15小时，做薄层检测，基本反应完全，过滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，用体积比为1∶4的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，得化合物中间体2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N，N‘-二苄氧羰基)-L-赖氨酸酯；
(3)、2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-赖氨酸酯的制备
在25℃，将1.03g 2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N，N‘-二苄氧羰基)-L-赖氨酸酯溶于无水乙酸乙酯中，溶解后，加入0.5g的10％钯碳催化剂，加氢至压力为40Psi，反应4小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，得灰色固体物，用乙醇为流动相过柱色谱纯化，得2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-L-赖氨酸酯。
6.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的雌甾氨基酸酯化合物的合成方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)、N-苄氧羰基-D-缬氨酸的制备
0℃下，将10mmolD-缬氨酸溶于50ml此温度下的碳酸氢钠饱和溶液中，得溶解液，边搅拌边用11mmol的氯甲酸苄酯以1滴/10秒的速度滴加到溶解液中进行反应，滴完，置于30℃下，搅拌反应15小时，做薄层检测，测得溶液完全反应后，再用50ml/次的乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为30％的浓盐酸调pH至3，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体用50ml/次的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用50ml/次的蒸馏水洗 涤2次、50ml的饱和食盐水洗涤1次，再以无水硫酸镁干燥7小时，抽滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，以体积比为1∶3的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过层析柱纯化，得N-苄氧羰基-D-缬氨酸；
(2)、2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-D-缬氨酸酯的制备
在30℃，将3.2mmol的N-苄氧羰基-D-缬氨酸和3.0mmol的2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇溶于75ml二氯甲烷中，边搅拌边先后加入3.0mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和0.09mmol催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌反应10min后，补加1.5mmol的缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇完全反应，搅拌10小时，做薄层检测，过滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，用体积比为1∶4的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，得化合物中间体2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-D-缬氨酸酯；
(3)、2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-缬氨酸酯的制备
在30℃，将1.53g 2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-D-缬氨酸酯溶于无水乙醇中，溶解后，加入0.78g的10％钯碳催化剂，加氢至压力为45Psi，反应4小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，得灰白色固体，用无水甲醇重结晶，得2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-缬氨酸酯。
7.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的雌甾氨基酸酯化合物的合成方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)、N-苄氧羰基-D-丙氨酸的制备
在10℃，将10mmol的D-丙氨酸溶解于4.0ml质量浓度为8％的氢氧化钠水溶液中，得溶解液，边搅拌边用14mmol的氯甲酸苄酯以1滴/9秒的速度滴加到溶解液中进行反应，并滴加质量浓度为8％的氢氧化钠水溶液保持pH为8，滴完，置于28℃下，搅拌反应15小时，做薄层检测，测得溶液完全反应后，再用5ml/次的乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为30％的浓盐酸调pH至3，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体用5ml/次的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用5ml/次的蒸馏水洗涤2次、5ml的饱和食盐水洗涤1次，再以无水硫酸镁干燥12小时，抽滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，以体积比为1∶3的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过层析柱纯化，得N-苄氧羰基-D-丙氨酸；
(2)、2-乙氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-D-丙氨酸酯的制备
在27℃，将3.2mmol的N-苄氧羰基-D-丙氨酸和3.0mmol的2-乙氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β醇溶于75ml二氯甲烷中，边搅拌边先后加入3.0mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和0.09mmol催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌反应10min后，补加1.8mmol的缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使2-乙氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β醇完全反应，搅拌18小时，做薄层检测，过滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，用体积比为1∶3的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶液为流动相过柱色谱纯化，得化合物中间体2-乙氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-D-丙氨酸酯；
(3)、2-乙氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-丙氨酸酯的制备
在60℃，将1.466g 2-乙氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-D-丙氨酸酯溶于无水甲醇中，溶解后，加入0.72g的10％钯碳催化剂，加氢至压力为50Psi，反应4小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，得灰白色固体，用无水甲醇重结晶，得2-乙氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-丙氨酸酯。
8.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的雌甾氨基酸酯化合物的合成方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)、N-苄氧羰基-D-亮氨酸的制备
在-5℃，将25mmol的D-亮氨酸溶解于10ml质量浓度为10％的氢氧化钠水溶液中，得溶解液，边搅拌边用35mmol氯甲酸苄酯以1滴/4秒的速度滴加到溶解液中进行反应，并滴加质量浓度为10％的氢氧化钠水溶液保持pH为8，滴完，置于10℃下，搅拌反应15小时，用茚三酮为显色剂显色无紫色，再用16ml/次的乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为30％的浓盐酸调pH至3，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体用16ml/次的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用16ml/次的蒸馏水洗涤2次、16ml/次的饱和食盐水洗涤1次，再用无水硫酸镁干燥10小时，抽滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，以体积比为1∶3的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过层析柱纯化，得N-苄氧羰基-D-亮氨酸；
(2)、2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-D-亮氨酸酯的制备
在20℃，将3.2mmolN-苄氧羰基-D-亮氨酸和3.0mmol的2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇溶于75ml二氯甲烷中，边搅拌边先后加入3.0mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和0.09mmol催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌反应10min后，补加2.1mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇完全反应，搅拌10小时，做薄层检测，过滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，再用乙酸乙酯溶解，过 滤，弃去固体，滤液减压浓缩，得淡黄色固体，用无水乙醇重结晶，得化合物中间体1.2g 2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-D-亮氨酸酯；
(3)、2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-亮氨酸酯的制备
在20℃，将1.2g 2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-D-亮氨酸酯溶于无水乙醇中，溶解后，加入0.6g的10％钯碳催化剂，加氢气至压力为60Psi，反应4小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，得到灰白色固体，以无水甲醇重结晶，得2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-D-亮氨酸酯。
9.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的雌甾氨基酸酯化合物的合成方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)、N-苄氧羰基-β-丙氨酰-L-组氨酸的制备
在8℃，将10mmol的N-β-丙氨酰-L-组氨酸(L-肌肽)溶解于4.0ml质量浓度为10％的氢氧化钠水溶液中，得溶解液，边搅拌边用14mmol的氯甲酸苄酯以1滴/8秒的速度滴加到溶解液中进行反应，并滴加质量浓度为10％的氢氧化钠(NaOH)水溶液保持pH为8，滴完，置于25℃下，搅拌反应12小时，用茚三酮为显色剂显色无紫色，再用7ml/次乙醚洗涤3次，弃去乙醚，得水相，水相用质量浓度为30％的浓盐酸调pH至3，出现乳白色固体，对出现乳白色固体后的液体用7ml/次的乙酸乙酯萃取3次，合并，合并液依次用7ml/次的蒸馏水洗涤2次、7ml的饱和食盐水洗涤1次，再以无水硫酸镁干燥22小时，抽滤，滤液减压浓缩，得淡黄色油状物，以体积比为1∶4的乙酸乙酯和石油醚配制的混合溶剂为流动相，过层析柱纯化，得无水透明油状物N-苄氧羰基-β-丙氨酰-L-组氨酸；
(2)、2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基-β-丙氨酰)-L-组氨酸酯的制备
在25℃，将3.2mmol的N-苄氧羰基-β-丙氨酰-L-组氨酸和3.0mmol的2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇溶解于75ml无水乙腈中，边搅拌边先后加入3.0mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺和0.09mmol催化剂4-二甲氨基吡啶，搅拌反应10min后，补加1.5mmol缩合剂1，3-二环己基碳二亚胺，以使2-甲氧基-3-苄氧基-1，3，5(10)-雌三烯-17β-醇完全反应，搅拌17小时，做薄层检测，过滤，滤液减压浓缩，得到淡黄色油状物，再用乙酸乙酯溶解，过滤，弃去固体，滤液减压浓缩，得到淡黄色固体，用甲醇重结晶，得化合物中间体2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基-β-丙氨酰)-L-组氨酸酯；
(3)、2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-N-β-丙氨酰-L-组氨酸酯的制备
在60℃，将1.50g 2-甲氧基-3-苄氧基-17β-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-(N-苄氧羰基)-β-丙氨酰-L-组氨酸酯溶于无水甲醇中，溶解后，加入0.75g的10％钯碳催化剂，加氢至压力为60Psi，反应4小时，薄层检测后，过滤，滤液减压浓缩，得灰白色固体，以乙酸乙酯重结晶，得2-甲氧基-3，17β-二羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-N-β-丙氨酰-L-组氨酸酯。
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