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CN110894237B - 抗cd127的抗体、分泌该抗体的细胞株及其制备方法和应用 - Google Patents

抗cd127的抗体、分泌该抗体的细胞株及其制备方法和应用 Download PDF

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CN110894237B CN201911235422.6A CN201911235422A CN110894237B CN 110894237 B CN110894237 B CN 110894237B CN 201911235422 A CN201911235422 A CN 201911235422A CN 110894237 B CN110894237 B CN 110894237B
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Abstract

本发明提供一种抗CD127的抗体、分泌该抗体的细胞株及其制备方法和应用，属于生物医药和免疫化学技术领域。所述抗体或抗体的抗原结合片段，其特异性结合CD127并且特异性识别CD127的表位序列。本发明制备得到的抗hCD127单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的单克隆抗体杂交瘤细胞株CD127‑7E7能够特异性识别人CD127，且具有良好的亲和力，其不仅可用于CD127蛋白的定性或定量检测；同时还可对CD127蛋白表位或功能域进行判定，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

抗CD127的抗体、分泌该抗体的细胞株及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药和免疫化学技术领域，具体涉及抗CD127的抗体、分泌该抗体的细胞株及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
CD127是白细胞介素-7(IL-7)受体α链(IL-7Rα)，在T淋巴细胞生命周期的不同阶段所发挥的作用。(1)它对T淋巴细胞在胸腺中的发育过程中起到重要作用，胸腺细胞的分化依赖于IL-7的表达，在整个T淋巴细胞生命周期中仅有两个阶段缺乏CD127的表达。(2)它是外周成熟T细胞稳态维持的重要调节因子。在T细胞缺乏的条件下，CD127信号可以不依赖TCR刺激T细胞增殖，促进T细胞数量的恢复；CD127也可以不依赖TCR与自身主要组织相容性复合物抗原相互作用，调节记忆性CD8+T细胞环境稳态；此外，在体内效应性CD4+ T细胞的存活及向记忆性CD4+ T细胞转化过程中，CD127也发挥重要作用。(3)CD127在病毒感染后免疫应答及病毒特异性CD4和CD8记忆性T细胞库的产生和维持过程中同样有十分重要的作用。CD127作为CD8+ T细胞分化的表面标记物，在可清除病毒的特异性CD8+ T细胞表面高效表达，如在急性乙型肝炎病毒(HBV)感染被有效控制后，CD127开始在病毒特异性CD8+ T细胞表面表达，而CD127+ HBV特异的效应性CD8+ T细胞增殖能力明显增强，并分泌众多的抗病毒细胞因子，当病毒被清除后大多数的特异性CD8+ T细胞为CD127+亚型，因此CD127是病毒感染后效应性CD8+ T细胞向记忆性CD8+ T细胞转化的重要标志。(4)调节功能Treg细胞表面低表达CD127，它可以作为一个Treg细胞表面标志，通过CD25+CD127lo对Treg细胞进行纯化。CD127作为IL-7的受体，在T淋巴细胞的发育、T细胞内环境稳态的维持及记忆性T细胞的分化及幸存等方面发挥重要的作用，也是识别记忆和效应T细胞的有用标记。基于CD127的多重作用，开发更好的抗CD127的单克隆抗体变得尤其有市场价值和应用前景。然而，发明人发现，目前的抗CD127单克隆抗体其免疫原普遍为重组蛋白或重组胞外蛋白，因此使得制备得到的单克隆抗体难以对CD127的具体位点进行表位或功能域的判定。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供抗CD127的抗体、分泌该抗体的细胞株及其制备方法和应用，本发明制备得到一种全新的抗CD127的单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的单克隆抗体杂交瘤细胞株CD127-7E7，其能够特异性识别人CD127，且该单克隆抗体与人CD127结合具有较强的亲和力，同时适用于对CD127的具体位点进行表位或功能域进行判定，因此具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特异性结合CD127并且特异性识别CD127的表位序列；
所述CD127的表位序列选自：包括或由SEQ ID NO.1构成的序列。
进一步的，所述抗体可以是嵌合抗体或者人源化抗体或者去免疫化抗体。
进一步的，所述抗体为抗人CD127(hCD127)的单克隆抗体，所述抗体亚型为IgG2a。
本发明的第二个方面，提供编码上述抗体或抗体的抗原结合片段的核酸分子。
本发明的第三个方面，提供一株单克隆抗体杂交瘤细胞株CD127-7E7，该细胞株已于2019年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC No.18897。所述细胞株可分泌上述抗体。
本发明的第四个方面，提供由CD127的表位序列构成的抗原，所述抗原包括或由SEQ ID NO.1序列构成。
本发明的第五个方面，提供一种上述抗体或抗体的抗原结合片段的制备方法，所述制备方法包括针对上述抗原对非人动物进行免疫获得。所述非人动物包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔和猴。
本发明的第六个方面，提供上述抗体或抗体的抗原结合片段、上述核酸分子和/或上述细胞株7E7在如下1)-2)中的任意一种或多种中的应用：
1)治疗免疫相关疾病的药物组合物或制备治疗免疫相关疾病的药物组合物；
2)检测试剂盒或制备检测试剂盒。
本发明的第七个方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括上述抗体或抗体的抗原结合片段、上述细胞株CD127-7E7和/或上述细胞株CD127-7E7的分泌物；还可以包含药学上可接受的载体、赋形剂及稀释剂。
本发明的第八个方面，提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述抗体或抗体的抗原结合片段、上述细胞株CD127-7E7和/或上述细胞株CD127-7E7的分泌物，还含有与上述的单克隆抗体结合的标记物，所述的标记物为荧光标记物、放射性标记物和酶标标记物中的任意一种或多种。所述试剂盒具有如下任意一种或多种应用：
a)用于CD127蛋白的定性或定量检测；
b)对CD127蛋白表位或功能域进行判定。
本发明的有益技术效果：
本发明提供了一种抗hCD127单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株CD127-7E7，经试验验证，其能够特异性识别人CD127，且具有良好的亲和力，其不仅可用于CD127蛋白的定性或定量检测；同时还可对CD127蛋白表位或功能域进行判定，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中OT-II小鼠初始CD4+ T增强免疫反应模型构建图；
图2为本发明实施例1中CD45.2小鼠免疫模型中GC B细胞占B细胞的比例相关图；
图3为本发明实施例1中单抗7E7与抗原CD127-225-239-OVA的亲和力图；
图4为本发明实施例2中单抗7E7对293T，Hela，K562细胞中CD127蛋白氨基酸序列的识别图；
图5为本发明实施例2中单抗7E7对293T细胞中过表达CD127蛋白的原位识别图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
如前所述，目前的抗CD127单克隆抗体其免疫原普遍为重组蛋白或重组胞外蛋白，因此使得制备得到的单克隆抗体难以对CD127的具体位点进行表位或功能域的判定。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特异性结合CD127并且特异性识别CD127的表位序列；
所述CD127的表位序列选自：包括或由SEQ ID NO.1构成的序列。
本发明的抗体的“抗原结合片段”是抗体的一部分，即对应于本发明的抗体的结构的一部分的分子，其显示对人IL-7的IL-7受体的抗原结合能力，可能以其天然形式；与相应的四链抗体的抗原结合特异性相比，这种片段对所述抗原特别表现出相同或基本上相同的抗原结合特异性。有利地，该抗原结合片段具有与相应的四链抗体相似的结合亲和力。然而，相对于相应的四链抗体具有降低的抗原结合亲和力的抗原结合片段也包括在本发明内。可以通过测量抗体和所考虑的片段的亲和力来确定抗原结合能力。这些抗原结合片段也可以被称为抗体的功能片段。
抗体的抗原结合片段是包括其含有抗原识别位点即人IL-7的IL-7受体CDR(互补决定区)或其部分的超变区的片段，从而限定抗原识别特异性。
本发明的一个具体实施方式中，所述抗体可以是嵌合抗体或者人源化抗体或者去免疫化抗体。
本发明的一个具体实施方式中，所述抗体是被修饰的，并且因此是嵌合抗体，其包括，在功能抗体中结合在一起的不同抗体的氨基酸残基的结构域或链，特别是从不同动物物种获得的抗体。
本发明的一个具体实施方式中，人源化可以通过根据已知技术的表面重建或通过CDRR(互补决定区)移植来进行。尤其通过用啮齿类残基取代人氨基酸残基来实现表面重建。以保持原始抗体的框架结构以及CDR呈递的方式进行取代，由此使得表面重建的抗体中的框架和CDR相互作用保持接触抗原的表面的天然构象，使得其保留抗原结合亲和力。
本发明的一个具体实施方式中，使鼠源抗体人源化是为了降低其在人体内的免疫原性，那么去免疫也是一种有用的可选途径。去免疫化可以通过去除那些可能在人体内产生免疫原性的啮齿类抗体可变区的抗原决定基，来降低抗体在人体内的免疫原性。比如去除潜在免疫原性的B细胞和T细胞的抗原决定簇或者通过化学方法将鼠源抗体的恒定区用人抗体恒定区域来代替完成。
本发明的一个具体实施方式中，所述抗体为抗人CD127(hCD127)的单克隆抗体，因此就抗原结合特异性和就可变区组成而言，这些抗体的组合物是同质或者是相同的。因此，即使抗体是通过杂交瘤技术的替代技术获得的，抗体也可以称为单克隆抗体。所述抗体亚型为IgG2a。
本发明的又一具体实施方式中，提供编码上述抗体或抗体的抗原结合片段的核酸分子。
本发明的又一具体实施方式中，提供一株单克隆抗体杂交瘤细胞株CD127-7E7，该细胞株已于2019年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC No.18897。所述细胞株可用于分泌上述抗hCD127单克隆抗体。
本发明的又一具体实施方式中，提供由CD127的表位序列构成的抗原，所述抗原包括或由SEQ ID NO.1序列构成。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种上述抗体的制备方法，所述制备方法包括针对上述抗原对非人动物进行免疫获得。所述非人动物包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔和猴。
本发明的又一具体实施方式中，所述制备方法包括：
初始CD4+T(naive CD4+T)细胞免疫小鼠，然后以合成OVA偶联多肽作为抗原免疫小鼠获得免疫脾细胞；将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞；培养所述杂交瘤细胞(可采用体外培养或体内培养)，收集纯化即得。
本发明的又一具体实施方式中，所述初始CD4+T细胞获得方法为：从OT-II小鼠的脾脏细胞中无菌分选初始CD4+T细胞。进一步的，所述初始CD4+T细胞为CD44lowCD62L+ CD25-CD4+CD8- B220- CD3+的初始CD4+ T细胞。
在本发明中，初始CD4+T细胞能特异的识别OVA蛋白323-339的多肽，所以更多的多肽-OVA抗原被提呈。从而能获得更多的GC B细胞。并进一步分化成能产生抗体的效应B细胞，从而产生大量的抗体。
本发明的又一具体实施方式中，所述小鼠为雌性C57BL/B6小鼠。
所述合成OVA偶联多肽为带有CD127抗原表位的OVA载体蛋白；所述CD127抗原表位序列为SEQ ID NO.1；
本发明的又一具体实施方式中，所述制备方法具体包括：
初始CD4+ T细胞免疫小鼠后，将合成OVA偶联多肽与弗氏佐剂混合，免疫BALB/c小鼠；首次免疫用弗氏完全佐剂(CFA)，多次加强免疫用弗氏不完全佐剂(IFA)；最后用合成OVA偶联多肽冲刺免疫，将小鼠免疫脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，再经过间接竞争酶联免疫筛选及亚克隆，即得到细胞株CD127-7E7，培养细胞株(可采用体外培养或体内培养)，纯化即得细胞株7E7分泌的上述抗体。
在本发明中，上述培养获得的CD127单克隆抗体细胞株CD127-7E7已于2019年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC No.18897。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述抗体或抗体的抗原结合片段、上述核酸分子和/或上述细胞株CD127-7E7在如下1)-2)中的任意一种或多种中的应用：
1)治疗免疫相关疾病的药物组合物或制备治疗免疫相关疾病的药物组合物；
2)检测试剂盒或制备检测试剂盒。
所述免疫相关疾病包括但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化、I型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎或狼疮、或炎性疾病例如炎症性肠病(IBD)和脑脊髓炎、或过敏性疾病、或癌症、或呼吸道疾病、或与移植有关的疾病。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗免疫相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包括上述抗体或抗体的抗原结合片段或细胞株7E7或细胞株7E7的分泌物。
药物组合物还可以包含通常使用的适量载体、赋形剂及稀释剂。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
本发明的又一具体实施方式中，所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述抗体或抗体的抗原结合片段或细胞株CD127-7E7或细胞株CD127-7E7的分泌物，还含有与上述抗体结合的标记物，所述的标记物为荧光标记物、放射性标记物和酶标标记物中的任意一种或多种。所述试剂盒具有如下任意一种或多种应用：
a)用于CD127蛋白的定性或定量检测；
b)对CD127蛋白表位或功能域进行判定。
本发明的又一具体实施方式中，还提供了上述的抗体或抗体的抗原结合片段、上述核酸分子、上述细胞株CD127-7E7、上述检测试剂盒在免疫相关疾病的血清学、病理学诊断、X线断层显像、或者正电子发射断层扫描-X线断层显像中的应用。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1抗hCD127单克隆抗体7E7的制备
1.1利用OT-II小鼠构建增强小鼠免疫的模型
(1)从OT-II CD45.1小鼠的脾脏细胞中无菌分选初始CD4+ T细胞。在无菌超净台内解剖小鼠取其脾脏，通过研磨制备悬浮单细胞并对细胞表面的蛋白进行荧光标记，分别标记如下Marker：CD3-AF700，B220-APC-cy7，CD8-BV605，CD4-PE-cy7，CD25-PE，CD44-FITC，CD62L-BV421，7-AAD。采用FACS III分选标记CD44lowCD62L+ CD25- CD4+CD8- B220- CD3+的初始CD4+ T细胞。
(2)尾静脉细胞免疫C57BL/B6 CD45.2小鼠(标记为D-(-1)天)。以PBS为阴性对照，对照组和实验组各尾静脉注射100μl/只。
(3)抗原免疫C57BL/B6 CD45.2小鼠(标记为D-0天)。
腹腔注射OVA-CFA，每200μl/只，OVA的质量为50μg。
(4)免疫后第7天(标记为D-7天)，断颈处死小鼠后分别取脾脏细胞和腹股沟中淋巴结细胞测定它们中的GC B细胞。
解剖小鼠取其脾脏和腹股沟中淋巴结，通过研磨制备悬浮单细胞并对细胞表面的蛋白进行荧光标记，分析GC B细胞分别标记如下Marker：CD3-AF700，B220-APC-cy7，IgD-APC，GL-7-FITC，Fas-PE。采用FACS III分析标记Fas+GL-7+IgDlowCD4-B220+的GC B细胞。
如图2所示：实验组与对照组相比CD45.2小鼠脾脏中的GC B细胞占B细胞的比例显著性升高(p<0.01)。GC B细胞通过Tfh细胞的辅助作用而分化成可分泌长效高亲和力抗体的浆细胞和记忆性B细胞。GC B细胞占B细胞比例增多，一方面，可以推测可能产生更多的高亲和力抗体的浆细胞和记忆性B细胞，如果这些细胞与SP2/0细胞融合就能产生更多的分泌高亲和力抗体的杂交瘤细胞。另一方面可以说明抗原能更有效激发免疫反应，因为从OT-II小鼠分选的初始CD4+T细胞能特异的识别OVA蛋白323-339的多肽，所以更多的多肽-OVA抗原被提呈。从而能获得更多的GC B细胞。并进一步分化成能产生抗体的效应B细胞，从而产生大量的抗体。
1.2抗原免疫小鼠及细胞融合
第0天，从OT-II CD45.1小鼠的脾脏中无菌分选初始CD4+ T细胞。尾静脉注射6周雌性C57BL/B6 CD45.2小鼠。第1天，免疫前小鼠脸颊取血，血清备用(待测定效价)，CFA与合成OVA偶联多肽(OVA-YFRTPEINNSSGEMD，SEQ ID NO.1，CD127-225-239-OVA，50μg)等体积混合，腹腔注射C57BL/B6 CD45.2小鼠，每只注射200μl，一共免疫5只小鼠；第14天和第28天分别继续用200μl IFA与合成多肽(25μg)等体积混合液腹腔免疫小鼠；第35天，脸颊取血，用间接ELISA法测定血清的效价：以合成多肽(P-YFRTPEINNSSGEMD)为抗原，免疫后(AI)血清等比稀2000、4000、8000、16000、32000和64000倍，免疫前(BI)血清稀释1000倍作为阴性对照，PBS作为空白对照，Rabbit anti-mouse IgG(L+H)-HRP为二抗(50μl/孔，1:3000，A9044-2ML，Sigma)，TMB单组份显示液(50μl/孔，PR1200，Solarbio)显色，37℃下避光温育15min，1M H2SO4(50μl/孔)终止后，1min内在450nm处测定吸光度值(实验结果见表1)。根据实验结果选取5455-1#，5455-2#和5455-3#小鼠进行后续融合实验。细胞融合前3天，用50μg合成OVA偶联多肽尾静脉加强免疫小鼠；三天后取小鼠的脾脏与SP2/0细胞进行融合实验。一共融合32块96孔板。
表1.免疫小鼠血清效价
Figure GDA0002319255630000121
Figure GDA0002319255630000131
1.3杂交瘤细胞的筛选及阳性杂交瘤细胞的亚克隆
细胞融合后第10天，采用间接ELISA法对融合杂交瘤细胞孔筛选。通过初步筛选获得12个阳性杂交瘤细胞孔(见表2)，并针对阳性克隆孔进行3次亚克隆。采用的间接ELISA法如下：合成多肽(P-YFRTPEINNSSGEMD)包被浓度为1μg/m L(50μl/孔)，融合细胞上清(50μl/孔)为一抗，细胞培养基作为阴性对照，rabbit anti-mouse IgG(L+H)-HRP为二抗，50μl/孔(1:3000，A9044-2ML，Sigma)，TMB单组份显示液(50μl/孔，PR1200，Solarbio)显色，37℃下避光温育15min，1M H2SO4(50μl/孔)终止后，1min内在450nm处测定吸光度值。以P/N>2.1为阳性(P为样品孔读数，N为空白孔读数)。单克隆抗体7E7的筛选结果见表3。
表2.阳性杂交瘤细胞孔
Figure GDA0002319255630000132
表3.单抗7E7的初筛和亚克隆筛选
Figure GDA0002319255630000133
Figure GDA0002319255630000141
1.4单克隆抗体的交叉反应检测
在检测单克隆抗体对免疫原中多肽的识别的同时，我们也对单抗对CD127其它3个片段的氨基酸序列的识别进行了鉴定，它们分别是：P1-OVA-YRQEKDENKWTHVNLSSTKLTLLQRKLQPA(SEQ ID NO.2)；P2-OVA-TLLQRKLQPAAMYEIKVRSIPDHYFKGFWS(SEQ ID NO.3)；P3-OVA-DHYFKGFWSEWSPSYYFRTPEINNSSG EMD(SEQ IDNO.4)；同样采用间接ELISA法，分别以P1，P2和P3为抗原，包被浓度为1μg/mL(50μl/孔)，细胞培养基为阴性对照，PBS为空白对照，单抗杂交瘤细胞株7E7的培养细胞上清(50μl/孔)为一抗，其它步骤同阳性杂交瘤细胞的筛选。实验结果见表4。
表4.单抗7E7的交叉性检测
Figure GDA0002319255630000142
1.5单克隆抗体7E7的体外扩增
(1)制备腹水。IFA腹腔免疫雌性8周Balb/c小鼠2只，每只注射300μl，7天后，每只小鼠腹腔注射1x 106个单克隆杂交瘤细胞7E7。10天后，杀死小鼠取腹水，共收集7ml。腹水5000rpm，离心10min，之后4℃条件下，快速滤纸过滤，收集滤液，-20℃保存。
(2)纯化腹水制备单抗。采用protein G纯化腹水获得单抗。冰上融化-20℃保存的腹水，4℃条件下，13000rpm，离心10min，收集上清，除去沉淀。上清首先过SefinoseTM4B琼脂糖(生工；C600014-0100)，滤液直接过Protein G预装色谱柱(生工；C600993-0105)，具体实验过程按照说明书操作。收集Protein G滤液，在4℃PBS缓冲液中透析2天。4℃短期保存，-20℃长期保存。
1.6单克隆抗体7E7与抗原的亲和力测定
采用7E7单抗腹水测定与CD127-225-239-OVA的亲和力。在MST试验中，保持二抗(R-Phycoerythrin-conjugated affinipure F(ab’)2fragment goat anti-mouse IgG，115-116-071，Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.)荧光标记的7E7浓度不变，同时将CD127-225-239--OVA进行梯度稀释，浓度梯度分别为：11000nM–2.69nM。反应溶液为PBS Buffer。短时间的结合反应后，将样品装载到NT.115标准毛细管中，通过MonolithNT.115进行测量。X轴的浓度单位为M。本反应测定结果：Kd＝682nM实验结果见图3。
1.7单克隆抗体7E7的亚型鉴定
采用间接ELISA法利用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(SEK003-100，Sinobiological)，利用细胞培养基上检测单抗7E7的亚型，同时以PBS做阴性对照，以商品化抗体2D10(Anti-Histones H3 mouse monoclonal antibody，1:2000，Abbkine，Inc.)做阳性对照，具体实验过程按照说明书操作。实验结果表明单抗7E7的亚型是IgG2a(见表5)。
表5.单抗7E7的亚型鉴定
Figure GDA0002319255630000161
实施例2抗hCD127单克隆抗体7E7的应用
2.1单克隆抗体7E7识别hCD127蛋白的氨基酸序列
采用Western Blot的方法，鉴定单克隆抗体7E7对真核细胞中表达hCD127蛋白的氨基酸的识别。
(1)蛋白样品的准备。分别传代K562细胞，293T和Hela细胞于6孔板中，24h后细胞密度达到90％时，直接用上样缓冲液裂解细胞，金属浴100℃孵育10min。
(2)Western Blot鉴定单克隆抗体7E7对hCD127全长蛋白氨基酸序列的识别。①跑变性胶SDS-PAGE：上层胶5％，下层胶10％，取蛋白40μL上样，电压60-80V。②转膜。采用NC膜，转膜参数设定：恒定电压100V，时间1.5h。③封闭。加入Odyssey blocking buffer，室温，以水平摇床最慢速度孵育2h。④孵育一抗7E7：直接向封闭液中加入7E7。4℃孵育过夜。⑤孵育荧光二抗：去掉一抗，加入1×PBS-T，室温摇床洗3次，每次5min。加入荧光二抗IRDye800CW goat anti-mouse IgG(H+L)(Odyssey，926-32210)，避光室温以水平摇床最慢速度孵育1h，然后用1×PBS-T，室温摇床洗3次，每次5min。⑥拍照。利用双色红外激光成像系统(Odyssey-9140，LI-COR美国)记录图像。
实验结果显示(见图4)：7E7能识别293T，Hela，K562细胞中表达的CD127蛋白的氨基酸序列。
2.2单克隆抗体7E7原位识别真核细胞过表达的hCD127蛋白
采用IF的方法，鉴定单克隆抗体7E7原位对293T细胞过表达的hCD127蛋白的识别。
(1)细胞接种。第1天，将293T细胞种于96孔黑色底透板中。
(2)转染细胞。第2天，细胞密度达到80％时，瞬转质粒hCD127-pR-GFP(LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent，L3000001，invitrogen)。第4天，进行免疫荧光实验。
(3)固定细胞：吸走培养基，1×PBS洗2次，加入200μl/孔固定液(含4％多聚甲醛和4％蔗糖)，室温孵育15min。然后弃掉固定液，1×PBS洗3次。
(4)防淬灭：向细胞中加入50mmol/L NH4Cl，覆盖细胞，4℃放置1h。
(5)封闭：加入Odyssey blocking buffer，200μl/孔，置于水平摇床室温孵育1.5h。
(6)孵育一抗7E7：直接向封闭液中加入7E7。4℃孵育过夜。
(7)孵育荧光二抗：去掉一抗，用1×PBS洗3次。加入荧光二抗Alexa Fluor568Donkey Anti-Mouse IgG(Life Technologies,Invitrogen TM，catalog number:A10037，1:2000)，避光室温放置1h，然后用1×PBS洗3次，吸干。
(8)孵育核酸染料：加入NucBlueTM Live ReadyProbesTM Reagent(InvitrogenTM,catalog number:R37605，2滴/ml)避光室温放置20min，然后用1×PBS洗3次，吸干。
(9)荧光信号检测：加入1×PBS，100μl/孔，在Opera Phenix high contentscreening system下拍照。
实验结果显示(见图5)：单抗7E7能识别293T细胞过表达于细胞膜的CD127蛋白。
实施例3单克隆抗体7E7与商品化抗体的比较
利用https://www.citeab.com检索到296种商品化anti-CD127单克隆抗体产品，根据所提供的信息，它们的免疫原是重组蛋白或重组胞外蛋白。本发明的免疫原是CD127的YFRTPEINNSSGEMD氨基酸序列。明确的识别位点能在抗体使用时具有针对性。因为CD127目前没有完整的蛋白解析结构，所以利用B细胞表位预测抗原表位。合成CD127的多肽氨基酸序列225-239即YFRTPEINNSSGEMD(SEQ ID NO.1)。根据实验结果7E7也能应用于ELISA，WB，IF免疫学研究中。另外，根据IF的实验结果表明CD127的YFRTPEINNSSGEMD氨基酸序列翻译后是CD127的线性表位。用重组蛋白做免疫原的单抗，不能对蛋白的具体位点进行表位或功能域的判定。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省分析测试中心
<120> 抗CD127的抗体、分泌该抗体的细胞株及其制备方法和应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp
1 5 10 15
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser
1 5 10 15
Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln Pro Ala
20 25 30
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys
1 5 10 15
Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser
20 25 30
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr
1 5 10 15
Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp
20 25 30

Claims (12)

1.一种抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于，其特异性结合CD127并且特异性识别CD127的表位序列；
所述CD127的表位序列选自：包括或由SEQ ID NO.1构成的序列；
所述抗体由单克隆抗体杂交瘤细胞株CD127-7E7分泌，该细胞株已于2019年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCCNo.18897。
2.编码权利要求1所述抗体或抗体的抗原结合片段的核酸分子。
3.单克隆抗体杂交瘤细胞株CD127-7E7，该细胞株已于2019年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCC No.18897。
4.权利要求1所述抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括针对CD127的表位序列构成的抗原对非人动物进行免疫获得。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
初始CD4+ T细胞免疫小鼠，然后以合成OVA偶联多肽作为抗原免疫小鼠获得免疫脾细胞；将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞；培养所述杂交瘤细胞，收集细胞培养上清液，纯化即得；
所述合成OVA偶联多肽为带有CD127抗原表位的OVA载体蛋白；所述CD127抗原表位序列为SEQ ID NO.1；
所述初始CD4+T细胞获得方法为：从OT-II小鼠的脾脏细胞中无菌分选获得CD4+ T细胞；
所述初始CD4+ T细胞为CD44lowCD62L+ CD25- CD4+CD8- B220- CD3+的初始CD4+ T细胞。
6.权利要求1所述抗体或抗体的抗原结合片段、权利要求2所述核酸分子和/或权利要求3所述细胞株CD127-7E7在如下1）-2）中的任意一种或多种中的应用：
1）制备治疗免疫相关疾病的药物组合物，所述免疫相关疾病为类风湿性关节炎、多发性硬化、I型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、狼疮、炎性疾病、过敏性疾病、癌症、或呼吸道疾病；
2）制备检测试剂盒。
7.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述炎性疾病为炎症性肠病或脑脊髓炎。
8.一种治疗免疫相关疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述抗体或抗体的抗原结合片段、权利要求2所述核酸分子和/或权利要求3所述细胞株CD127-7E7或细胞株CD127-7E7的分泌物。
9.如权利要求8所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含载体、赋形剂及稀释剂。
10.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述抗体或抗体的抗原结合片段、权利要求2所述核酸分子和/或权利要求3所述细胞株CD127-7E7或细胞株CD127-7E7的分泌物。
11.如权利要求10所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有与权利要求1所述抗体结合的标记物，所述的标记物为荧光标记物、放射性标记物和酶标标记物中的任意一种或多种。
12.如权利要求10或11所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒具有如下任意一种或多种应用：
a）对CD127蛋白的定性或定量检测；
b）对CD127蛋白表位或功能域进行判定。
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