CN110894216B - 一种猪流行性腹泻病毒抗原表位肽、单克隆抗体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞工程及免疫学技术领域，具体公开一种猪流行性腹泻病毒抗原表位肽、单克隆抗体及应用。所述抗原包含SEQ ID No.1所示的表位多肽，采用杂交瘤细胞技术制备与该抗原对应的单克隆抗体。本发明提供的单克隆抗体能够与PEDV重组S蛋白和PEDV特异性结合，该单克隆抗体可以有效鉴别PEDV变异毒株与经典毒株。
Description
技术领域
本发明涉及细胞工程及免疫学技术领域，尤其涉及一种猪流行性腹泻病毒抗原表位肽、单克隆抗体及应用。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒亚科(Coronaviridae)甲型冠状病毒属(Alphacoronavirus)的成员，为有囊膜的单股正链RNA病毒。PEDV是猪流行性腹泻(PED)的病原，主要引起猪呕吐、腹泻和脱水死亡，对1～2周龄哺乳仔猪危害最为严重，病死率可高达90％～100％，对养猪业造成严重损失。
自从1973年在中国首次发生PED以来，随着以PEDV CV777毒株制备的油佐剂灭活疫苗在全国的广泛应用，该病主要以地方流行或零星散发形式发生。但近年来PED又开始频繁暴发和流行，造成初生哺乳仔猪大批死亡。病毒基因组序列和分子遗传进化分析表明，这是由于PEDV的S基因发生了变异。当前在中国、韩国、日本和美国等国家的猪群中PEDV变异毒株和经典毒株均有流行，其中PEDV变异强毒株是导致哺乳仔猪严重腹泻的优势毒株。在PED发生时，鉴别其PEDV的类型对于疫情的防治具有重要意义。基因测序是鉴定毒株类型的有效方式，但该方法存在有操作复杂、消耗时间长、费用成本高等问题。虽然，荧光定量PCR(qPCR)可以鉴别PEDV变异毒株和经典毒株，但血清学检测技术是qPCR临床调查PEDV感染状态和科学研究的重要手段，然而，目前仍缺乏能够鉴别PEDV经典毒株和变异强毒株的血清学检测试剂。因此，急需研究相关的检测试剂，建立一种快速简便有效的猪流行性腹泻病毒变异毒株和经典毒株的鉴别检测方法。
发明内容
针对现有鉴别猪流行性腹泻病毒经典毒株和变异强毒株存在的上述技术问题，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒抗原表位肽、单克隆抗体及应用。
为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种猪流行性腹泻病毒抗原表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
相对于现有技术，本发明提供的猪流行性腹泻病毒抗原表位肽(Pep)，其包含的表位在猪流行性腹泻病毒变异毒株和经典毒株之间存在差异，且抗原性强，采用该抗原表位肽免疫的小鼠的血清抗体全部转阳，ELISA抗体效价均在1:51200以上，最高可以高于1:105。
本发明还提供了上述抗原表位肽在制备鉴别猪流行性腹泻病毒经典毒株和变异毒株试剂中的应用。
采用本发明提供的抗原表位肽进行动物免疫，将抗原表位肽与杂交瘤单克隆抗体技术相结合，得到能够与PEDV重组S蛋白和PEDV特异性结合的单克隆抗体，用于鉴别猪流行性腹泻病毒经典毒株和变异毒株。
本发明还提供了一种抗原偶联物，包含上述的抗原表位肽和载体蛋白，所述载体蛋白为血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或人血清白蛋白(HSA)。
本发明提供的抗原偶联物，将抗原表位肽与载体蛋白偶联，载体蛋白刺激辅助性T细胞，进一步诱导B细胞免疫反应，与抗原表位肽协同作用激起充分的免疫反应，提高ELISA抗体效价。
本发明还提供了一种抗PEDV杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：采用上述的抗原偶联物进行动物免疫，并将所得B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，挑选阳性克隆后进行亚克隆，得到抗PEDV杂交瘤细胞株。
本发明提供的制备方法，将动物免疫后所得的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，第10d可观察到细胞克隆出现，用间接ELISA方法经过两次筛选后，获得抗PEDV杂交瘤细胞株，抗PEDV杂交瘤细胞株诱生的腹水效价可达106。
进一步地，所述动物免疫过程为：对BALB/c小鼠注射所述抗原，进行三次免疫，免疫间隔时间为14d，并在细胞融合前2-4d再次腹腔注射所述抗原，进行加强免疫。第三次免疫后8-12d，眼眶取血，用间接ELISA检测血清特异性抗体效价，融合前选择效价高的小鼠加强免疫。
进一步地，所述三次免疫的抗原注射量为25-35μg/只；所述加强免疫的抗原注射量为45-55μg/只。
进一步地，将ELISA抗体效价高于1：105的小鼠的脾B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合。
进一步地，先以抗原偶联物作为包被抗原筛选阳性克隆，再以PEDV重组S蛋白作为包被抗原，对阳性克隆进行亚克隆，得到抗PEDV杂交瘤细胞株，保证抗PEDV杂交瘤细胞株分泌的抗体能够与PEDV的S蛋白特异结合。
本发明还提供了一种猪流行性腹泻病毒单克隆抗体，由上述的抗PEDV杂交瘤细胞株产生。
进一步地，所述单克隆抗体的亚型为IgG2b，轻链为κ链，能更好地与PEDV的S蛋白和PEDV特异性结合。
进一步地，所述单克隆抗体为HRP标记抗体，与PEDV的S蛋白的特异性结合活性强，可作为基于单克隆抗体的抗原和抗体酶标检测技术的必要实验材料。
本发明还提供了上述单克隆抗体在制备鉴别猪流行性腹泻病毒经典毒株和变异毒株试剂中的应用。
本发明提供的单克隆抗体具有良好的生物学活性，能够与PEDV重组S蛋白和PEDV特异性结合，可用于鉴别PEDV变异强毒株与经典毒株，简单方便，快捷有效。
附图说明
图1是本发明实施例中免疫小鼠的血清抗体效价图；
图2是本发明实施例杂交瘤细胞株A诱生的腹水抗体效价结果图；
图3是本发明实施例杂交瘤细胞株A的SDS-PAGE图；
图4是本发明实施例杂交瘤细胞株A的Western-blot图；
图5是本发明实施例中杂交瘤细胞株A产生的单克隆抗体对应的间接免疫荧光图；
图6是阴性对照对应的间接免疫荧光图；
图7是杂交瘤细胞株A产生的单克隆抗体作1:400倍稀释后对PEDV QY2016的免疫荧光图；
图8是杂交瘤细胞株A产生的单克隆抗体作1:400倍稀释后对PEDV CV777的免疫荧光图；
图9是本发明实施例HRP标记的单克隆抗体的PEDV重组S蛋白的结合活性图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种猪流行性腹泻病毒抗原表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
上述抗原表位肽用于制备鉴别猪流行性腹泻病毒经典毒株和变异毒株的单克隆抗体。
根据PEDV变异毒株与经典毒株(如表1所示)的S蛋白氨基酸序列，合成四种抗原表位肽：IGENQGVNSTWYCAGRHPTAS、FVSHIRGGHG、PAHMSEHSVVG和LQNHTSTEYFVSS，然而，后三者的抗原性较差，难以用于动物免疫，不利于抗体的获得，IGENQGVNSTWYCAGRHPTAS的抗原性较强。抗原表位肽由苏州强耀生物科技有限公司合成制备。
表1
注：经典毒株包括：CV777、DR13、LZC和attenuated CV777；变异毒株包括：HBMC2012、ZJCZ4、USA/NC/2013/35140、USA/Colorado/2013和GD-A。
将上述抗原表位肽与载体蛋白血蓝蛋白偶联，得到抗原偶联物Pep-KLH，作为单克隆抗体制备用免疫原，同时，将抗原表位肽与牛血清白蛋白偶联，得到抗原偶联物Pep-BSA，作为筛选抗体用检测抗原。
实施例2
一种抗PEDV杂交瘤细胞株的制备方法，采用上述的抗原偶联物Pep-KLH进行动物免疫，并将所得B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，先以抗原偶联物Pep-BSA作为包被抗原筛选阳性克隆，再以PEDV重组S蛋白作为包被抗原，对阳性克隆进行亚克隆，得到抗PEDV杂交瘤细胞株，具体步骤如下：
S1：选取7周龄的4只BALB/c小鼠注射抗原偶联物Pep-KLH，注射量为30μg/只，进行三次免疫，免疫间隔时间为14d，第三次免疫后10d，眼眶取血，用间接ELISA检测血清特异性抗体效价，结果如图1所示，融合前选择ELISA抗体效价高于1：105的小鼠腹腔注射抗原偶联物Pep-KLH加强免疫，注射量为50μg/只。
S2：在聚乙二醇(PEG 1500)介导下，将状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞与加强免疫后3d的小鼠脾B淋巴细胞融合。向融合后的细胞沉淀中加入10mL的胎牛血清和5mL的IMDM，混匀，并加入5mL的饲养细胞(小鼠胸腺细胞)和25mL的经灭菌处理的半固体培养基(含2.2％甲基纤维素、1％HAT的IMDM)，充分混匀后，转移至细胞培养皿中，每个细胞培养皿转入量为1.5mL。将细胞培养皿放入湿盒中，置于孵箱中培养10d，期间每天观察细胞克隆生长情况。
S3：细胞融合后10d，可观察到细胞克隆出现，挑取93个细胞单克隆培养于预先铺有饲养细胞(小鼠胸腺细胞)的96孔细胞培养板内，当孔内杂交瘤细胞克隆生长到孔底面积的1/4时，取杂交瘤细胞上清液，先用抗原偶联物Pep-BSA作为包被抗原，对细胞克隆用ELISA方法进行两次初步筛选，然后对第二次筛选得到的阳性克隆，用PEDV重组S蛋白作为包被抗原，筛选阳性克隆得到抗PEDV杂交瘤细胞株。ELISA主要步骤：用2μg/mL的抗原偶联物Pep-BSA或PEDV重组S蛋白包被酶标板各孔，于4℃孵育过夜；加入5％脱脂奶粉的PBST于37℃封闭2h；加入用PBS作1:4倍稀释的细胞培养上清100μL，37℃孵育1h，同时设立阴性对照(SP2/0骨髓瘤细胞培养上清)、空白对照(PBS)、阳性对照(1:1000倍稀释的阳性血清)。洗涤3次后，加入PBS稀释20000倍的HRP-山羊抗小鼠IgG，100μL/孔，37℃孵箱1h；洗涤3次后，加入显色液，100μL/孔，显色5min；每孔加入50μL终止液终止反应后，双波长(450nm和630nm)测定OD值。将获取的阳性细胞的上清液作1:50倍稀释，按照鼠单克隆抗体类/亚类鉴定ELISA试剂盒(Thermo Scientific)的说明书进行抗体类型鉴定，当OD450nm≥0.2判为阳性反应。
实施例3
一种抗PEDV杂交瘤细胞株的制备方法，采用上述的抗原偶联物Pep-KLH进行动物免疫，并将所得B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，挑选阳性克隆后进行亚克隆，得到抗PEDV杂交瘤细胞株，具体步骤如下：
S1：选取8周龄的4只BALB/c小鼠注射抗原偶联物Pep-KLH，注射量为25μg/只，进行三次免疫，免疫间隔时间为14d，第三次免疫后12d，眼眶取血，用间接ELISA检测血清特异性抗体效价，融合前选择ELISA抗体效价高于1：105的小鼠腹腔注射抗原偶联物Pep-KLH加强免疫，注射量为45μg/只。
S2：在聚乙二醇(PEG 1500)介导下，将状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞与加强免疫后3d的小鼠脾B淋巴细胞融合。向融合后的细胞沉淀中加入10mL的胎牛血清和5mL的IMDM，混匀，并加入5mL的饲养细胞(小鼠胸腺细胞)和25mL的经灭菌处理的半固体培养基(含2.2％甲基纤维素、1％HAT的IMDM)，充分混匀后，转移至细胞培养皿中，每个细胞培养皿转入量为1.5mL。将细胞培养皿放入湿盒中，置于孵箱中培养14d，期间每天观察细胞克隆生长情况。
S3：细胞融合后14d，可观察到细胞克隆出现，挑取93个细胞单克隆培养于预先铺有饲养细胞(小鼠胸腺细胞)的96孔细胞培养板内，当孔内杂交瘤细胞克隆生长到孔底面积的1/3时，取杂交瘤细胞上清液，先用抗原偶联物Pep-BSA作为包被抗原，对细胞克隆用ELISA方法进行两次初步筛选，然后对第二次筛选得到的阳性克隆，用PEDV重组S蛋白作为包被抗原，筛选阳性克隆得到抗PEDV杂交瘤细胞株。ELISA主要步骤同实施例2。
实施例4
一种抗PEDV杂交瘤细胞株的制备方法，采用上述的抗原偶联物Pep-KLH进行动物免疫，并将所得B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，挑选阳性克隆后进行亚克隆，得到抗PEDV杂交瘤细胞株，具体步骤如下：
S1：选取8w的4只BALB/c小鼠注射抗原偶联物Pep-KLH，注射量为35μg/只，进行三次免疫，免疫间隔时间为14d，第三次免疫后8d，眼眶取血，用间接ELISA检测血清特异性抗体效价，结果如图1所示，融合前选择ELISA抗体效价高于1：105的小鼠腹腔注射抗原偶联物Pep-KLH加强免疫，注射量为55μg/只。
S2：在聚乙二醇(PEG 1500)介导下，将状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞与加强免疫后3d的小鼠脾B淋巴细胞融合。向融合后的细胞沉淀中加入10mL的胎牛血清和5mL的IMDM，混匀，并加入5mL的饲养细胞(小鼠胸腺细胞)和25mL的经灭菌处理的半固体培养基(含2.2％甲基纤维素、1％HAT的IMDM)，充分混匀后，转移至细胞培养皿中，每个细胞培养皿转入量为1.5mL。将细胞培养皿放入湿盒中，置于孵箱中培养12d，期间每天观察细胞克隆生长情况。
S3：细胞融合后12d，可观察到细胞克隆出现，挑取93个细胞单克隆培养于预先铺有饲养细胞(小鼠胸腺细胞)的96孔细胞培养板内，当孔内杂交瘤细胞克隆生长到孔底面积的1/4时，取杂交瘤细胞上清液，先用抗原偶联物Pep-BSA作为包被抗原，对细胞克隆用ELISA方法进行两次初步筛选，然后对第二次筛选得到的阳性克隆，用PEDV重组S蛋白作为包被抗原，筛选阳性克隆得到抗PEDV杂交瘤细胞株。ELISA主要步骤同实施例2。
实施例5
一种抗PEDV杂交瘤细胞株的制备方法，采用上述的抗原偶联物Pep-KLH进行动物免疫，并将所得B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，挑选阳性克隆后进行亚克隆，得到抗PEDV杂交瘤细胞株，具体步骤如下：
S1：选取8周龄的4只BALB/c小鼠注射抗原偶联物Pep-KLH，注射量为25μg/只，进行三次免疫，免疫间隔时间为14d，第三次免疫后12d，眼眶取血，用间接ELISA检测血清特异性抗体效价，融合前选择ELISA抗体效价高于1：105的小鼠腹腔注射抗原偶联物Pep-KLH加强免疫，注射量为45μg/只。
S2：在聚乙二醇(PEG 1500)介导下，将状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞与加强免疫后3d的小鼠脾B淋巴细胞融合。向融合后的细胞沉淀中加入10mL的胎牛血清和5mL的IMDM，混匀，并加入5mL的饲养细胞(小鼠胸腺细胞)和25mL的经灭菌处理的半固体培养基(含2.2％甲基纤维素、1％HAT的IMDM)，充分混匀后，转移至细胞培养皿中，每个细胞培养皿转入量为1.5mL。将细胞培养皿放入湿盒中，置于孵箱中培养14d，期间每天观察细胞克隆生长情况。
S3：细胞融合后14d，可观察到细胞克隆出现，挑取93个细胞单克隆培养于预先铺有饲养细胞(小鼠胸腺细胞)的96孔细胞培养板内，当孔内杂交瘤细胞克隆生长到孔底面积的1/3时，取杂交瘤细胞上清液，先用抗原偶联物Pep-BSA作为包被抗原，对细胞克隆用ELISA方法进行两次初步筛选，然后对第二次筛选得到的阳性克隆，用PEDV重组S蛋白作为包被抗原，筛选阳性克隆得到抗PEDV杂交瘤细胞株。ELISA主要步骤同实施例2。
实施例6
一种猪流行性腹泻病毒单克隆抗体，由实施例2-5中所得的四株抗PEDV杂交瘤细胞株A-D产生，具体方法如下。
采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体。取雌性BALB/c小鼠(≥12周龄)，每只小鼠腹腔注射经灭菌处理的石蜡油0.5mL；10～14d后，腹腔注射杂交瘤细胞株A5×106个/只；7～10d后，用注射器抽取腹水，以8000r/min离心10min，收集上清，按照IgG类单克隆抗体纯化试剂盒的说明纯化腹水，用实施例2中所述的ELISA方法测定抗体效价后，得到含单克隆抗体的腹水，分装后冻存于-80℃。
对杂交瘤细胞株A-D及其产生的抗体的类、亚类及型进行鉴定，结果如表2所示。除D分泌的抗体为IgG2a外，其他几株分泌的抗体均为IgG2b。B分泌的抗体轻链为λ链，其他几株细胞分泌的抗体轻链均为κ。其中A杂交瘤细胞诱生的腹水效价可达106(如图2所示)。
表2
为了更好的说明本发明实施例提供的单克隆抗体的特性，下面将实施例6中由杂交瘤细胞株A制备的含单克隆抗体的腹水进行Western blot试验和间接免疫荧光试验(IFA)。所涉及的Vero-81细胞，由河北农业大学传染病实验室保存；表达PEDV重组N蛋白的E.Coli BL21，由河北农业大学传染病实验室制备及保存；PEDV HBMC2012株(GenBank ID:JX163294)，由河北农业大学传染病实验室分离鉴定与保存。
Western blot试验：
取PEDV重组N蛋白、S蛋白以及E.coli BL21/pET-32a诱导表达的裂解物进行SDS-PAGE电泳，通过半干转印法将蛋白转印到PVDF膜上，封闭后，取1∶500倍稀释的腹水作western blot，检测抗体与S蛋白的特异性结合活性。SDS-PAGE及western blot结果分别如图3、4所示。图中，1为蛋白分子量标准；2为截短的PEDV重组N蛋白；3为截短的PEDV重组S蛋白；4为E.coli BL21/pET-32a的诱导表达裂解物，Western blot结果显示，抗PEDV杂交瘤细胞株A诱生的腹水单抗与PEDV重组S蛋白反应后，出现一条预期大小的清晰条带(约38kDa)，而与PEDV重组N蛋白及E.coli BL21/pET-32a诱导表达的裂解物反应后无可见预期大小的目的条带，说明该单克隆抗体能够与PEDV重组S蛋白发生特异结合。
间接免疫荧光试验(IFA)：
将Vero-81细胞铺于96孔细胞培养板内，1.6×104个/孔，当细胞达到90％汇合时(约48h)，用PBS洗一次；用100μL的PEDV变异株HBQY2012感染细胞，感染剂量为0.5MOI；同时设立阴性血清对照。将细胞培养板置于37℃的5％CO2培养箱孵育1h，弃病毒液，每孔用100μL的PBS(0.01mol/L，pH7.4)洗涤1次；每孔加入200μL的MEM维持液，置于37℃的5％CO2培养箱培养24h，弃维持液，每孔用280μL的PBS洗涤2次。用冰冷的无水甲醇于-20℃固定细胞10min，50μL/孔，弃甲醇，每孔用280μL PBS洗1次。加入1:400倍稀释的腹水，100μL/孔，37℃反应1h，弃去反应液，每孔加入280μL的PBS洗2次，每孔加入100μL的1:500倍稀释的羊抗猪FITC标记的荧光抗体，37℃反应45min，弃去反应液，每孔加入280μL PBS洗2次，每孔加入50μL的双苯甲酰胺(10μg/mL)，于室温染色20-30min，加入280μL/孔PBS清洗2次。荧光显微镜观察，阳性结果呈现绿色荧光，阴性无信号。结果如图5、6所示，实施例6制备的单抗能够与PEDV感染Vero-81细胞内的病毒发生特异性结合，在胞浆内发出特异性绿色荧光(图5)，而未感染病毒的阴性对照细胞内没有绿色荧光(图6)。
同时，用0.5MOI的PEDV QY2016和CV777分别感染Vero-81细胞，于37℃的5％CO2培养箱培养48h后，分别加入经1:300、1:400、1:500和1:1000倍稀释的腹水，通过IFA检测变异强毒株QY2016和弱毒株CV777，评价该实施例6所得腹水能否区分两个毒株。结果如图7、8所示，图7为QY2016(单抗作1:400倍稀释)结果，图8为CV777弱毒株(单抗作1:400倍稀释)结果。由以上结果可知，当腹水与CV777弱毒株反应后，看不到明显的荧光信号(图8)，说明实施例6制备的腹水可以区分PEDV变异毒株QY2016和以CV777为代表的经典毒株。
此外，对实施例6中得到的单克隆抗体进行HRP标记，并检测其活性。按照HRP标记试剂盒说明，将50μL标记缓冲液加到500μL实施例6中所得的腹水中，充分混匀；加入50μL的HRP酶，反复吹吸充分混匀，室温避光反应3h；加入60μL的反应终止液，充分混匀，室温避光放置1h；加入660μL标记物保存液，充分混匀，得到HRP标记的单克隆抗体，置于-20℃保存。
用10μg/mL的PEDV重组S蛋白包被酶标板，每孔加入100μL倍比(1:100～1:12800)稀释的HRP标记的单克隆抗体，同时设立倍比稀释的HRP-羊抗小鼠IgG作为阴性对照。37℃孵育1h，洗板后，加入底物TMB，于37℃避光显色15min，终止反应后，酶标仪测定OD450nm光吸收值。当实验孔平均OD值≥2倍阴性孔平均OD值时，判定HRP标记的单克隆抗体具有结合活性。结果如图9所示，HRP标记的单克隆抗体的效价为1:3200，表明HRP标记的单克隆抗体与PEDV重组S蛋白具有良好的结合活性。由本发明实施例3-5中所得的抗PEDV杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体与实施例6中所得的单克隆抗体具有相当的效果。
由以上数据可知，本发明提供的单克隆抗体能够与PEDV重组S蛋白和PEDV特异性结合，且单克隆抗体稀可以有效鉴别PEDV变异毒株与经典毒株。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北农业大学
<120> 一种猪流行性腹泻病毒抗原表位肽、单克隆抗体及应用
<130> 20191028
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr Trp Tyr Cys Ala Gly Arg
1 5 10 15
His Pro Thr Ala Ser
20
Claims (6)
1.一种猪流行性腹泻病毒抗原表位肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的抗原表位肽在制备鉴别猪流行性腹泻病毒经典毒株和变异毒株抗体中的应用。
3.一种抗原偶联物，其特征在于：包含权利要求1所述的抗原表位肽和载体蛋白，所述载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或人血清白蛋白。
4.一种抗PEDV杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：采用权利要求3所述的抗原偶联物进行动物免疫，并将所得脾B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，挑选阳性克隆后进行亚克隆，得到抗PEDV杂交瘤细胞株。
5.如权利要求4所述的抗PEDV杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：将ELISA抗体效价高于1：105的小鼠的脾B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合。
6.如权利要求4所述的抗PEDV杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：先以所述抗原偶联物作为包被抗原筛选阳性克隆，再以PEDV重组S蛋白作为包被抗原，对阳性克隆进行亚克隆，得到抗PEDV杂交瘤细胞株。
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| 猪流行性腹泻病毒 HBMC/2012 株的致病性与免疫研究;朱卫霞;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20160215;全文 * |
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| CN110894216A (zh) | 2020-03-20 |
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