CN110791488A - 用于拆分手性化合物的脂肪酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于拆分手性化合物的脂肪酶及其制备方法和应用。制备脂肪酶时先将如SEQ.ID NO.1所示的基因片段克隆入表达载体并转化感受态细胞，再转入大肠杆菌菌株中得重组脂肪酶基因工程菌；然后对重组脂肪酶基因工程菌进行两步培养，得用于拆分手性化合物的脂肪酶。采用本发明中的脂肪酶可以克服目前酶法拆分并同步回收手性物质过程中存在的成本高、连续化生产困难、产物抑制带来的反应效率低、反应时间长等难题，使手性化合物的拆分工艺得以简化，拆分时间短，成本降低，经济可行。

Description

用于拆分手性化合物的脂肪酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于手性化合物拆分技术领域，具体涉及一种用于拆分手性化合物的脂肪酶及其制备方法。

背景技术

生物催化具有反应条件温和、效率高、立体和区域选择性强、环境友好等特点，因此生物催化在新药的研究和开发中得到广泛的应用。此外，利用理性设计和定向化对生物催化剂进行改造优化，如提高催化剂稳定性和底物选择性，将使其能够更好地应用于生产工艺。

(R)-6-florochromane-2-carboxylate在有机合成和药物生产中，有着广泛的用途(如萘必洛尔的合成)，其结构式如下：

目前该化合物多采用化学方法合成，但是化学方法合成的化合物为外消旋体，需要经过拆分才能得到需要的手性化合物。现有的拆分技术分为化学拆分和物理拆分，其中化学拆分困难，会产生大量污染环境的废弃物，而且得到的化合物光学选择性差。因此，开发一种快速拆分手性化合物的物质和方法很有必要。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供一种用于拆分手性化合物的脂肪酶及其制备方法，以实现快速拆分手性化合物，并且光学选择性高、对环境友好等目的。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种用于拆分手性化合物的脂肪酶，该脂肪酶经过以下步骤制得：

S1：将如SEQ.ID NO.1所示的基因片段克隆入表达载体，并转化感受态细胞，挑取阳性转化子得重组表达载体，然后将重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，得重组脂肪酶基因工程菌；

ATGCCGTCCACGTCCGACTTTGAGCGTGTCATCGCCAAGGCGGTCGAGGACCGCGTCATCCCCGGCGTCGTGCTGCTGGCCGAGAATGCCTCGGGGTCGTTCCGCTACGAAAAGGTGCTCGGCTTCAGCTCCATCGAGCCGGGCAACGAGAAGAAACTCGAGCGCGACAGCGTCTTCATGTTCATGTCGATGACAAAGCTCATCACGGCCGTCACGGCGATGCAGGCTGTCGAGCGCGGCCTCTGGGACCTCGACGCCGACGTCGCGCCGCTGCTGCCCGAGCTCGCAGCCCTGCCGGTCCTCAAGGGCTTCGCGTCGGACGGTGTGCCCGAGCTGGTGCCGCGCGCGTCGCCCATCACTCTGCGCCAGCTGCTCTCGCACTCGTCGGGCGCGGCCTACGACTTCCTGTCGCCCGACCTGATGAACTACCACAAGTGGGTGCGCAAGCAGCCTCCGTCGGCCGGGCTCGCGCAGCCGCCCGCTATGACCATCGCGCCCCCCTCCGTCGAGGAGCGGTTCCGGTTCCCGCTCGTCTTCCAGCCTGGCCAGGGCTGGCAGTACGGCTCGGGCATCGACTGGGTCGGCCGGCTCGTCGAGCGCATCAATGCCAAGGCCCAGGGCAAGACGGAGCCCGAGGCCGGCACAAAGCTGCCGTCGGTGCCGCTCGAGGACGTTGTGATCCGCGACGTGCTCACGCCCTTGGGGCTGCCTGCTGGGTCCCTGACCTTTGTCCCTGAGCGCTACGCCGACGTGTTTGCACGGCTATGGCCGACGCTTCCTACGCGTGTTGGCAACAACGGCGCACTCGACAGCGGGCCCGTGGTCCACGGACCGTCGCTCTACAAGAAGGCGCCCGCCGCTCTGGGCGGCCAGGGCATGTATGGCGACATGTCCTCGTTCTTCCAGGTGGTGCTCTCTCTTTTCCGCGACGACGGCAAGCTGCTCAAGCCCGCGTCGGTCAAGCTGTTCTTTGAGCCGCAGCTGGCGTCCGAGGCAGCACACGCCGGCCTCATGCACAGCACGGAGAACTCGGGGTGGATTACTGGCGACGTCCCCGACACCAAGGAGTACGACTGGAGCGTCGGCGGTCTGCTGGTGACGGGGCATTCGCACCCGTTCCGGAAGAAGGGTGCAGCACTATGGGCCGGCGCCATCAACCTAACCTGGGTGAGTTTTTACGTTATATCCCCCTCTCTTGTGATGACGATGCCACCGATGCTAACAATACCAGATCATCGACAAGGAGGCCGATGTTTGTGCCGTGTTTGCATCCAACTACCAGCCGCCGGGCGACCAGCAGGGCAAGGCCTTGATGCGGCAGTGGGAGGAGTTTGTCTACCCGCAGGCAAAGACGGCGAAGCTATAA(SEQ.ID NO.1)；

S2：将重组脂肪酶基因工程菌接种于第一培养基中培养，得种子培养液；

S3：将种子培养液接种于第二培养基中培养，取培养液并离心，收集上清液，得用于拆分手性化合物的脂肪酶。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，表达载体为pET-28a。

进一步，感受态细胞为大肠杆菌DH5α。

进一步，：S2中重组脂肪酶基因工程菌的培养温度为35～40℃，培养时间为15～20h。

进一步，S3中种子培养液的培养包括以下步骤：将种子培养液接种于第二培养基中，接种量为第二培养基体积的1％～3％，然后于35～40℃下培养至OD600值为0.6～0.8，再加入异丙基-β-D-半乳糖苷，于25℃下继续培养20～24h；然后离心，收集上清液，得用于拆分手性化合物的脂肪酶。

进一步，所加入的异丙基-β-D-半乳糖苷的终浓度为0.25mM。

进一步，第一培养基和第二培养基均为LB液体培养基，LB液体培养基包括以下质量百分比的组分：

胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠3％，余量为水。

本发明中的重组脂肪酶通过构建大肠杆菌基因工程菌，然后通过发酵大量制备，制备过程简便。得到重组脂肪酶后，用其拆分6-氟色满-2-羧酸乙酯，以制备(R)-6-氟色满-2-羧酸，具体的操作为：

(1)向磷酸缓冲液中加入终浓度为10～300mmol/L的6-氟色满-2-羧酸乙酯、质量百分浓度为2～15％的助溶剂和质量百分浓度为0.01～1％的重组脂肪酶，于25～30℃下反应16～24h；

(2)用萃取剂萃取反应后的混合物，取水相并调节其pH值为1，然后减压浓缩至析出结晶，得(R)-6-氟色满-2-羧酸。

上述制备过程中所用助溶剂为二甲基亚砜或甲醇；所用萃取剂为二氯甲烷。

本发明的有益效果是：

本发明制备的用于拆分手性化合物的脂肪酶克服了目前酶法拆分并同步回收手性物质过程中，存在的成本高、连续化生产困难、产物抑制带来的反应效率低、反应时间长等难题，使手性化合物的拆分工艺得以简化，拆分时间短，成本降低，经济可行。

本发明在制备(R)-6-氟色满-2-羧酸时，初始原料为6-氟色满-2-羧酸乙酯，价格便宜；拆分反应为“一锅煮”式，即将底物和酶同时加入并反应，直接得到终产物(R)-6-氟色满-2-羧酸，中间无需分离提纯。而且反应结束后，产品易于分离和纯化，使整个拆分工艺成本低、转化率高，更适合工业生产。

附图说明

图1为实施例三中R-6-氟色满-2-羧酸的高效液相色谱图；

图2为实施例三中S-6-氟色满-2-羧酸酯的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例一：制备用于拆分手性化合物的脂肪酶

本实施例中用于拆分手性化合物的脂肪酶经过以下步骤制得：

步骤一：将如SEQ.ID NO.1所示的基因片段克隆入表达载体pET-28a中，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；挑取阳性转化子得重组表达载体，然后将重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达制备重组脂肪酶的重组脂肪酶基因工程菌。

步骤二：将重组脂肪酶基因工程菌接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃下培养16h，得到种子培养液；所用LB液体培养基包括以下质量百分比的组分：

胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠3％，余量为水。

步骤三：将种子培养液接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，接种量为含有卡那霉素抗性的LB液体培养基体积的1％；然后置于37℃下培养至OD600值为0.7左右，再加入终浓度为0.25mM的异丙基-β-D-半乳糖苷，置于25℃继续培养24h，然后于8000rmp、4℃下离心、收集菌体，再采用pH值为7.5、浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲液清洗收集的菌体，然后将菌体重悬，超声破碎15min，再离心，收集上清液即为重组脂肪酶。

实施例二：制备用于拆分手性化合物的脂肪酶

本实施例中用于拆分手性化合物的脂肪酶经过以下步骤制得：

步骤一：将如SEQ.ID NO.1所示的基因片段克隆入表达载体pET-28a中，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；挑取阳性转化子得重组表达载体，然后将重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达制备重组脂肪酶的重组脂肪酶基因工程菌。

步骤二：将重组脂肪酶基因工程菌接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于35℃下培养20h，得到种子培养液；所用LB液体培养基包括以下质量百分比的组分：

胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠3％，余量为水。

步骤三：将种子培养液接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，接种量为含有卡那霉素抗性的LB液体培养基体积的2％；然后置于于35℃下培养至OD600值为0.6左右，再加入终浓度为0.25mM的异丙基-β-D-半乳糖苷，置于25℃继续培养20h，然后于8000rmp、4℃下离心、收集菌体，再采用pH值为7.5、浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲液清洗收集的菌体，然后将菌体重悬，超声破碎15min，再离心，获得上清液即为重组脂肪酶。

实施例三：制备(R)-6-氟色满-2-羧酸

向pH为10左右的磷酸缓冲液中加入终浓度为200mmol/L的6-氟色满-2-羧酸乙酯、质量百分浓度为10％的二甲基亚砜和质量百分浓度为0.5％的实施例一中制备的重组脂肪酶，组成的反应体系进行反应；将反应体系置于28℃的条件下反应20h；通过HPLC监测反应；反应结束后，采用二氯甲烷萃取混合物，分别收集油相和水相；然后用1N盐酸将水相酸化至pH为1，减压浓缩水相，至有结晶析出，再缓慢加热，至晶体完全析出，得化合物一R-6-氟色满-2-羧酸；用盐水洗涤有机相，并旋蒸除去二氯甲烷，得化合物二S-6-氟色满-2-羧酸酯。采取高效液相分别对化合物一和化合物二进行检测，谱图中均出现单一峰(ee大于99％)，检测结果分别如图1(R-6-氟色满-2-羧酸)和图2(S-6-氟色满-2-羧酸酯)所示。经检测R-6-氟色满-2-羧酸手性纯度为99.47％，含量为99.7％。

实施例四：制备(R)-6-氟色满-2-羧酸

向pH为10左右的磷酸缓冲液中加入终浓度为50mmol/L的6-氟色满-2-羧酸乙酯、质量百分浓度为2％的二甲基亚砜和质量百分浓度为0.02％的实施例二中制备的重组脂肪酶，组成的反应体系进行反应；将反应体系置于25℃的条件下反应24h；通过HPLC监测反应；反应结束后，采用二氯甲烷萃取混合物，分别收集油相和水相；然后用1N盐酸将水相酸化至pH为1，减压浓缩水相，至有结晶析出，再缓慢加热，至晶体完全析出，得化合物一R-6-氟色满-2-羧酸；用盐水洗涤有机相，并旋蒸除去二氯甲烷，得化合物二S-6-氟色满-2-羧酸酯。采取高效液相分别对化合物一和化合物二进行检测，经检测该成品R-6-氟色满-2-羧酸手性纯度为99.5％，含量为99.0％。

虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

序列表

<110> 西南交通大学

<120> 用于拆分手性化合物的脂肪酶及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgccgtcca cgtccgactt tgagcgtgtc atcgccaagg cggtcgagga ccgcgtcatc 60

cccggcgtcg tgctgctggc cgagaatgcc tcggggtcgt tccgctacga aaaggtgctc 120

ggcttcagct ccatcgagcc gggcaacgag aagaaactcg agcgcgacag cgtcttcatg 180

ttcatgtcga tgacaaagct catcacggcc gtcacggcga tgcaggctgt cgagcgcggc 240

ctctgggacc tcgacgccga cgtcgcgccg ctgctgcccg agctcgcagc cctgccggtc 300

ctcaagggct tcgcgtcgga cggtgtgccc gagctggtgc cgcgcgcgtc gcccatcact 360

ctgcgccagc tgctctcgca ctcgtcgggc gcggcctacg acttcctgtc gcccgacctg 420

atgaactacc acaagtgggt gcgcaagcag cctccgtcgg ccgggctcgc gcagccgccc 480

gctatgacca tcgcgccccc ctccgtcgag gagcggttcc ggttcccgct cgtcttccag 540

cctggccagg gctggcagta cggctcgggc atcgactggg tcggccggct cgtcgagcgc 600

atcaatgcca aggcccaggg caagacggag cccgaggccg gcacaaagct gccgtcggtg 660

ccgctcgagg acgttgtgat ccgcgacgtg ctcacgccct tggggctgcc tgctgggtcc 720

ctgacctttg tccctgagcg ctacgccgac gtgtttgcac ggctatggcc gacgcttcct 780

acgcgtgttg gcaacaacgg cgcactcgac agcgggcccg tggtccacgg accgtcgctc 840

tacaagaagg cgcccgccgc tctgggcggc cagggcatgt atggcgacat gtcctcgttc 900

ttccaggtgg tgctctctct tttccgcgac gacggcaagc tgctcaagcc cgcgtcggtc 960

aagctgttct ttgagccgca gctggcgtcc gaggcagcac acgccggcct catgcacagc 1020

acggagaact cggggtggat tactggcgac gtccccgaca ccaaggagta cgactggagc 1080

gtcggcggtc tgctggtgac ggggcattcg cacccgttcc ggaagaaggg tgcagcacta 1140

tgggccggcg ccatcaacct aacctgggtg agtttttacg ttatatcccc ctctcttgtg 1200

atgacgatgc caccgatgct aacaatacca gatcatcgac aaggaggccg atgtttgtgc 1260

cgtgtttgca tccaactacc agccgccggg cgaccagcag ggcaaggcct tgatgcggca 1320

gtgggaggag tttgtctacc cgcaggcaaa gacggcgaag ctataa 1366

Claims (10)

1.一种用于拆分手性化合物的脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将如SEQ.ID NO.1所示的基因片段克隆入表达载体，并转化感受态细胞，挑取阳性转化子得重组表达载体，然后将重组表达载体转入大肠杆菌菌株中，得重组脂肪酶基因工程菌；

S2：将重组脂肪酶基因工程菌接种于第一培养基中培养，得种子培养液；

S3：将种子培养液接种于第二培养基中培养，取培养液并离心，收集上清液，得用于拆分手性化合物的脂肪酶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述表达载体为pET-28a。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述感受态细胞为大肠杆菌DH5α。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：S2中重组脂肪酶基因工程菌的培养温度为35～40℃，培养时间为15～20h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S3中种子培养液的培养包括以下步骤：将种子培养液接种于第二培养基中，接种量为第二培养基体积的1％～3％，然后于35～40℃下培养至OD600值为0.6～0.8，再加入异丙基-β-D-半乳糖苷，于25℃下继续培养20～24h；然后离心，收集上清液，得用于拆分手性化合物的脂肪酶。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所加入的异丙基-β-D-半乳糖苷的终浓度为0.25mM。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述第一培养基和第二培养基均为LB液体培养基，所述LB液体培养基包括以下质量百分比的组分：

胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠3％，余量为水。

8.采用权利要求1～7任一项所述的制备方法制备的用于拆分手性化合物的脂肪酶。

9.根据权利要求8所述的用于拆分手性化合物的脂肪酶在制备(R)-6-氟色满-2-羧酸中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)向磷酸缓冲液中加入终浓度为10～300mmol/L的6-氟色满-2-羧酸乙酯、质量百分浓度为2～15％的助溶剂和质量百分浓度为0.01～1％的重组脂肪酶，于25～30℃下反应16～24h；

(2)用萃取剂萃取反应后的混合物，取水相并调节其pH值为1，然后减压浓缩至析出结晶，得(R)-6-氟色满-2-羧酸。

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