CN104178540B - 一种生物催化法合成腺苷蛋氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物催化法合成腺苷蛋氨酸的方法，属于生物制药技术领域。将大肠杆菌接种到种子培养基中，震荡培养过夜后，取过夜培养物加入LB液体培养基，将其震荡培养至对数中期后，在其菌液中加入IPTG定浓度，继续震荡完成培养并进行SAM合成酶表达后，离心处理得湿菌体，搅拌抽提处理后，通过离子交换树脂柱进行上样，并进行纳滤浓缩后，结晶、真空干燥得晶体。采用本发明技术方案，具有转化率高、周期短、纯度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物催化法合成腺苷蛋氨酸的方法，属于生物制药技术领域。
背景技术
S-腺苷蛋氨酸（S. adenosyl-L．methionine，SAM）是广泛存在于动物、植物和微生物体内的重要代谢中间物质，也是人体内一种重要的生理活性物质，在体内主要起着转甲基、转硫和转氨丙基的作用，对关节炎、抑郁症、肝功能紊乱、胰腺炎等均有较好的疗效。SAM还是预防癌症，心血管疾病和抗衰老的高级保健药物。 1999年，美国FDA批准SAM作为保健品上市，迅速在美国成为最畅销的营养品之一。随着人们的生活质量的提高，健康概念的更新，对SAM的需求也将会越来越多。
原料药（API）丁二磺酸腺苷蛋氨酸的全国年需求量至少在10吨以上，全球的需求每年为50吨，其单位售价在5000元/Kg以上；而如果算上用于其它如饲料行业的，需求量就在200吨以上。国内生产原料药（API）丁二磺酸腺苷蛋氨酸的厂家只有浙江海正，另一厂家浙江震元也已获得生产批文，但仍未形成销售。国内已有开发研究工作，因发酵法的表达水平低，酶促转化法的酶和ATP的成本较高。
目前腺苷蛋氨酸工业化生产工艺主要有酵母发酵法（胞内表达法）和酶促转化法（胞外酶促法）两种，这两种方法都存在着不同的技术难点：
酵母发酵法（胞内表达法）：国外多采用特殊培育的表达SAM的酿酒酵母菌株通过胞内表达制备SAM。国内有人研究出基因工程改构的酿酒酵母，发酵表达SAM，但目前表达最高的也只达到8g/L发酵液，而且大多只完成发酵工艺的探索，用此法生产是在胞内表达，由于SAM的前体L-蛋氨酸需透过胞壁，且受胞内空间的限制所以表达产量很难提高，收率低，成本高，不适合大规模制备。
酶促法（胞外酶促法）：酶促法多以从啤酒酵母或其他工程菌中提取纯化腺苷蛋氨酸合成酶，然后通过优化酶促反应条件来转化制备SAM，该法原料转化率高，SAM易于提取纯化，但是该法中酶的提取纯化工序复杂在酵母菌的破碎、离心、过滤、浓缩上清液及上清液上柱纯化中会有酶的损失，同时影响酶活性的不确定因素较多，纯化酶的周期较长，致使酶的活性受到了影响，同时该法获得的纯化酶量较少，导致酶的成本很高，也不适合大规模制备SAM。
发明内容
本发明提供一种利用生物催化法合成腺苷蛋氨酸的方法并进行腺苷蛋氨酸提取的方法，先利用大肠杆菌代替酵母，采取特有工序表达所需SAM合成酶，再通过酶促法生产获得SAM，以解决通过酵母发酵方法生产腺苷蛋氨酸存在的原料转化率低，产品生产周期长、终产品分离纯化程序复杂、价格昂贵的问题。
本发明采取的技术方案如下：
一种生物催化法合成腺苷蛋氨酸的方法，将-70℃下保存的大肠杆菌接种于种子液体培养基中，在37℃、200rpm转速下震荡培养过夜，次日取过夜培养物加入LB液体培养基中，37℃、200rpm转速下震荡培养至对数中期，在菌液中加入IPTG调节浓度后，18℃下继续震荡培养20小时后，进行酶促反应获得SAM；其中，所述的种子培养基的作用成分为：细菌用胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4 mL，溶解于900mL水中，加入KH2PO4 2.31g，K2HPO416.43于100 mL水溶液；LB液体培养基的作用成分为50mg/ml羟苄青霉素和34mg/ml的氯霉素。
上述技术方案的进一步设置如下：
所述的酶促反应包括如下步骤：（1）提取：将培养的大肠杆菌于4℃、5000rpm转速下离心处理后，加入乙酸乙酯水溶液抽提15-60分钟，乙酸乙酯水溶液的添加量为150-300mL/kg大肠杆菌，再加入0.15-0.2M硫酸溶液进行酸化处理1-2小时后，硫酸溶液的添加量为400-600 mL/kg大肠杆菌，离心，去除细胞碎片后，得到含有S-腺苷-L-甲硫氨酸的萃取液；（2）纯化：调整萃取液pH至3-5，采用离子交换树脂柱进行上样并洗脱，得到SAM洗脱液，将该SAM洗脱液进行纳滤浓缩后，滴入无水甲醇，搅拌静置沉降过滤后，再用90%甲醇溶液洗涤晶体两次，50℃下真空干燥即可得到终产品。
所述的乙酸乙酯水溶液中，乙酸乙酯与水的体积比为1:4-3:2。
上述技术方案中，利用生物催化法将大肠杆菌进行增殖培养形成SAM合成酶，再将获得的SAM合成酶进行酶促反应，从而获得了SAM，与常规SAM制备方法相比，本发明上述技术方案具有如下优点：
1. 常规的酶促法制备SAM的优点在于转化率高，因此天然合成酶在酵母中表达，主要采用啤酒酵母进行SAM合成酶的表达，但由于其分离纯化工序较复杂，酵母菌获得的SAM合成酶的活性会随着处理的进行逐渐失活，受酶活率的影响，最终无法实现大规模生产；本发明上述技术方案中，以大肠杆菌替代酵母菌，利用基因工程技术，将携带有表达SAM合成酶的质粒转化到大肠杆菌内，并通过诱导表达，分离提取而获得高表达、高纯度的SAM合成酶。在采用上述工艺进行SAM合成酶表达过程中，克服了产量低、分离纯度差问题，不仅使最终的活性SAM收率大大提高，而且，所采用的处理工艺中采用了合适的培养基，提高了SAM合成酶的表达，同时，处理工艺中采用离子交换柱分离的方法，使后续的分离纯化难度降低，更有利于SAM的提取，并确保了大肠杆菌在获得产物的产率和纯度方面具有明显由于酵母的优势，因此在采用上述技术方案时，从根本上解决了普通酶促法必须进行复杂分离纯化工序，有效避免了纯化工序对SAM活性的影响，确保大肠杆菌采用生物催化法表达的SAM合成酶具有非常高的活性，最终保证了SAM收率高达96%以上，与采用酵母进行酶促法合成收率仅为，因此，采用本发明上述方案使酶促法合成SAM得以应用于工业化生产，可大规模的进行SAM的制备和提纯。
2. 本发明上述技术方案中，在对SAM合成酶表达工艺进行优化的同时，对后续的酶促反应工艺也进行优化和改善，利用离子交换柱分离的方法，使提取和纯化的操作更为简便，提取纯化过程中，处理强度大大降低，避免了过高强度外界干涉对酶反应活性的影响，同时，在后期进行重结晶，又保证了其提取纯化效果，使得SAM的收率和活性均保持在较高的水平。
采用本发明上述技术方案，不仅有效的发挥了大肠杆菌在获得产物产率和纯度，且优化分离效率等方面的优势，使表达获得的SAM合成酶的活性保持在1.25u（酶活定义在30℃ 5mM ATP和5mML蛋氨酸初始浓度下 20分钟内每分钟生成1 umol 腺酐蛋氨酸的产物定义为 l u）以上的水平上，在将生物催化法表达SAM合成酶与酶促法提取制备SAM结合时，通过基因工程技术，并改变培养基成分，克服了SAM合成酶在大肠杆菌中表达率低的技术难题，使这一结合成为可能，并最终获得了活性与收率俱佳的SAM。
附图说明
图1为实施例1所制备产品的性能测试结果图；
图2为实施例2所制备产品的性能测试结果图。
具体实施方式
实验材料和方法：
1.工程菌和试剂：大肠杆菌BL-21；
2. 培养基：
平板培养基：LB medium （50 mg/ml羧苄青霉素和34 mg/ml 氯霉素）；
种子培养基（以1L为例）：细菌用胰蛋白胨12g、酵母提取物24g、甘油4 mL溶解于900mL水中，并在每100mL该水溶液中加入KH2PO4 2.31g，K2HPO4 16.43g形成种子液体培养基。
3. SAM合成酶的表达：
将保存在-70℃，大肠杆菌接种于5 mL种子液体培养基中，37℃，200 rpm振荡培养过夜；次日取3 mL过夜培养物加入2L的LB液体培养基中，37℃剧烈震荡培养1 h，至对数中期（A550＝0.4 ~ 0.6），在菌液中加入IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，分子式为C9H18O5S）至菌液终浓度0.4 mMol/L，18℃继续震荡培养20 h，完成大肠杆菌发酵培养。取1 mL菌液用于检测酶蛋白表达情况（A550＝1.0 ~ 1.2）。
4. 催化剂制备
将检测剩余的菌液在4℃、4000 rpm离心10 min，收集离心后的菌体沉淀，用15 mL冰预冷的PBS洗涤两次，按3 ~ 5 mL/g加入Loading Buffer（50 mM Tris，500 mM NaCl，10%甘油，pH = 7.5）并将其置于-70℃冰箱和37℃水浴交叉快速反复冻融5次，然后进行超声破碎，电流600 HZ，10s×5次；4℃、4000 rpm离心10 min，去除沉淀（菌体残渣），将上清用0.22 mm或0.45 mm过滤器过滤。
实施例1：
1）取1 mL完成大肠杆菌发酵培养的菌液（A550＝1.0 ~ 1.2）表达SAM合成酶后，于4℃，5000 r/min条件下离心，收获40公斤湿菌体，在湿菌体中加入9.6升体积浓度为50%的乙酸乙酯水溶液，500 r/min转速下剧烈搅拌处理30分钟，然后用20升0.175 mol/L H2S04继续处理1.5小时后，再在5000 r/min条件下离心20分钟，去除细胞碎片，得到含有SAM的萃取液40升，其中萃取液中SAM的含量为8.5 g/L。
2）将40升含有SAM的萃取液用5mol/l氢氧化钠溶液调至pH5.0，以每小时2倍树脂床层体积的流速通过6.7升JK110离子交换树脂柱进行上样处理，上样结束后，先用30升的去离子水冲洗柱子，然后用PBS溶液进行洗脱，得到SAM洗脱液25L，洗脱液中SAM浓度为13.2g/l，SAM回收率为96%。
3）由于SAM对温度的敏感性，使用截留分子量200的交联芳香族聚酰胺膜，将25升SAM洗脱液纳滤浓缩至120g/L，得浓缩液2.70L，SAM回收率为98%。
4）搅拌状态下，将浓缩液以8ml/min的速度缓慢滴入20升无水甲醇中，搅拌转速为45r/min，滴加完成后继续搅拌1.0小时，然后静置，沉降，过滤获得晶体，用90%的甲醇溶液洗涤晶体两次，50℃真空干燥得到产品300克，纯度98%。
实施例2：
1）大肠杆菌发酵培养结束后，4℃，5000r/min离心，收获40公斤湿菌体，向该湿菌体中加入12升体积浓度为20%乙酸乙醅水溶液，500r/min处理60分钟，然后用16升0.15mmol/LH2SO4继续处理2小时。5000r/min离心20分钟，去除细胞碎片，得到含有SAM的萃取液38升，其中SAM的含量为8.7g/l。
2）将38升含有SAM的萃取液用5mol/L氢氧化钠溶液调至pH4.5，以每小时l倍树脂床层体积的流速通过9.5升D113离子交换树脂柱上样。上样结束后，先用30升的去离子水冲洗柱子，然后用PBS溶液进行洗脱，得到SAM洗脱液25L，其SAM浓度为13.2g/l，SAM回收率为96%。
其余后续处理与实施例1相同。
实施例3：催化剂回收
待表达后，取破菌后的滤过液和酶促后的滤过液上弱酸性大孔1AJ烯酸阳离子交换树脂（D11：3）分离柱。每30分钟检测洗脱液，测定其OD值，在波长204nm处溶液吸收大于0.4时改用pH2.0的硫酸水溶液洗涤4小时，停止水洗。回收率达80%。
实施例4：产物腺苷蛋氨酸盐的浓缩和结晶
把腺苷蛋氨酸纯品溶液放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，即得白色粉状的腺苷蛋氨酸（SAM）干粉成品，对该产品进行检测后，数据汇总如下：
纯度98%，1H-NMR-500M δ(ppm): 8.49 (d, J = 4.1, 2H); 6,20 (d, J=3.8,4H); 4.88 (q, J=4.1, 1H); 4.66 (t, J=5.8, 1H); 4.61 (t, J = 2.5, 1H); 4.06-3.97 (m, 3H); 4.06-3.97 (m, 2H); 3.04 (s, 2H); 3.01 (S, 1H); 2.94(td, 6H);2.49-2.38 (m, 2H); 1.89-1.81 (m, 6H). 13C-NMR-500M δ(ppm):173.40, 152.74,150.77, 147.27, 147.24, 122.08, 92.75, 81.43, 75.83, 75.51, 54.25, 53.22,47.04, 46.67, 27.53, 26.28, 25.87, MS (ESI), m/z = 399.1442 [M+H]+. Anal.Calcd for C15H24N6O5S: C, 44.99; H, 6.04; N, 20.99; Found: C, 44.97; H, 6.08;N, 20.96.
对比实施例：常规酶促法制备SAM具体案例（以一升的反应体系为例）
1、加入试剂
分别加入以下配制好的试剂：硼酸缓冲液60mL；1 mol/L K2S04 90mL；l mol/lMgS04 60mL；0.4 mol/L三磷酸腺苷ATP 20mL；0.2 mol/L蛋氨酸60mL；对1，4-丁烷二磺酸钠70g；DTT 0.1 mmol；0.5 mol/L EDTA2mL；去离子水定容至1L。
2、反应温度和时间
将上述混合液加到反应器中，设置反应温度为30℃，反应时间10h。
3、中止反应
反应结束后加入硫酸至终浓度为0.05 mol/L中止反应。
将本发明实施例与所提供的对比实施例中的常规酶促法进行纯度、产率以及制备周期方面进行比较，详见表1。
表1 本发明实施方式与对比实施例的合成对比表
通过表1的对比结果可以看出，采用本发明上述技术方案，产物的纯度、产率等均优于常规酶促法，其制备周期比对比实施例的周期短很多，因此，采用本发明不仅有效的发挥了大肠杆菌在获得产物产率、纯度以及分离效率等方面的优势，使表达获得的SAM合成酶的活性保持在1.25u以上，同时，上述方案中，通过基因工程技术，并改变培养基成分，克服了SAM合成酶在大肠杆菌中表达率低的技术难题，使生物催化法表达SAM合成酶与酶促法提取制备SAM的结合成为可能，结合实施例3的催化剂回收以及实施例4中产物浓缩与结晶这些后处理，最终获得了活性与收率俱佳的SAM。
Claims (1)
1.一种生物催化法合成腺苷蛋氨酸的方法，采用大肠杆菌代替酵母，再通过酶促法生产获得腺苷蛋氨酸，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）大肠杆菌培养及SAM合成酶表达：将利用基因工程技术，将携带有表达SAM合成酶的质粒转化到大肠杆菌内，将重组的大肠杆菌接种到种子培养基中，震荡培养过夜后，取过夜培养物加入LB液体培养基，将其震荡培养至对数中期后，在菌液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至菌液终浓度0.4mMol/L，继续震荡完成培养并进行SAM合成酶表达；
其中，种子培养基的作用成分为：细菌用胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4 mL，KH2PO4、K2HPO4，先将细菌用蛋白胨、酵母提取物和甘油溶解于900 mL 水中形成水溶液，再向每100 mL 该水溶液中加入2.31g KH2PO4、16.43g KH2PO4，LB 液体培养基含有：50mg/ml羟苄青霉素和34mg/ml 的氯霉素；
2）大肠杆菌发酵培养结束后，4℃，5000r/min离心，收获40公斤湿菌体，向该湿菌体中加入12升体积浓度为20%乙酸乙酯水溶液，500r/min处理60分钟，然后用16升0.15mmol/LH2SO4继续处理2小时；5000r/min离心20分钟，去除细胞碎片，得到含有SAM的萃取液38升，其中SAM的含量为8.7g/L；
3）将38升含有SAM的萃取液用5mol/L氢氧化钠溶液调pH值为4.5，以每小时l倍树脂床层体积的流速通过9.5升D113离子交换树脂柱上样；上样结束后，先用30升的去离子水冲洗柱子，然后用PBS溶液进行洗脱，得到SAM洗脱液25L，其SAM浓度为13.2g/l，SAM回收率为96%；
4）使用截留分子量200KD的交联芳香族聚酰胺膜，将25升SAM洗脱液过滤浓缩至120g/L，得浓缩液2.70L，SAM回收率为98%；
5）搅拌状态下，将浓缩液以8ml/min的速度缓慢滴入20升无水甲醇中，搅拌转速为45r/min，滴加完成后继续搅拌1.0小时，然后静置，沉降，过滤获得晶体，用90%的甲醇溶液洗涤晶体两次，50℃真空干燥；
步骤（1）中，将-70℃下保存的大肠杆菌接种于种子培养基中，在37℃、200rpm转速下震荡培养过夜，次日取过夜培养物加入LB液体培养基中，37℃、200rpm转速下震荡培养至对数中期，在培养至对数中期的菌液中加入IPTG调节浓度至0.4mmol/L后，18℃下继续震荡培养20小时完成大肠杆菌培养，并进行SAM合成酶表达；
所述的大肠杆菌培养及SAM合成酶表达后的菌液还可用于催化剂的制备：将菌液进行离心，收集菌体沉淀，并对其进行PBS洗涤后，加入Loading Buffer进行交叉反复冻融，超声破碎，离心去除沉淀后，上清液过滤所得溶液即为催化剂，该催化剂的成分为腺苷蛋氨酸合成酶。
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