CN110780008B

CN110780008B - 一种穿黄制剂指纹图谱及组分含量测定方法

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Publication number: CN110780008B
Application number: CN201911270467.7A
Authority: CN
Inventors: 罗宇东; 覃洁萍; 郭海姣; 谭安蔷; 李芳婵
Original assignee: Guangxi University Of Chinese Medicine Pharmaceutical Factory
Current assignee: Guangxi University Of Traditional Chinese Medicine Bainianle Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2039-12-11
Also published as: CN110780008A

Abstract

本发明提出了一种穿黄制剂指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：S1.供试品溶液的制备：取1.0g穿黄制剂粉末，精密称定，置于25mL容量瓶中，加入70％甲醇20mL，超声，放冷，定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，离心，取上清液过微孔滤膜，即得；S2.高效液相色谱检测：吸取上述供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测，记录65min内的指纹图谱。本发明采用高效液相色谱结合紫外双波长切换检测方法，建立了一个既可测定穿黄制剂的特征指纹图谱，该方法准确、高效、重复性及稳定性好，指纹图谱特征性强，含量测定结果准确，可作为穿黄制剂的质量控制方法。

Description

一种穿黄制剂指纹图谱及组分含量测定方法

技术领域

本发明涉及中药检测技术领域，具体涉及一种穿黄制剂指纹图谱及组分含量测定方法。

背景技术

穿黄制剂是由穿心莲和一枝黄花两味药材制成的中成药，因抗菌谱广泛，被喻为最安全的中药抗生素。具有清热解毒、抗菌消炎、消肿止痛、清上焦火的功效。制剂中穿心莲具有清热解毒、消炎、抗病毒作用，一枝黄花具有抗炎抗菌、疏风泄热、解毒消肿、促进白细胞吞噬的功能。两者协同用于治疗急性上呼吸道感染、急性扁桃腺炎、咽喉炎等热毒壅盛者。目前穿黄制剂的质量控制方法除了原标准对穿心莲及一枝黄花的薄层鉴别及对脱水穿心莲内酯的含量测定外，文献报道的也只有对该制剂中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量测定方法。显然，现有的质量控制方法仍存在一定的局面性，并未能达到较全面控制穿黄制剂质量的目的。据文献报道，穿心莲药材中除穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯外，新穿心莲内酯和脱氧穿心莲内酯含量也很高，并且这两种成分也是穿心莲抗炎、抗病毒的有效成分，因此也应该纳入穿黄制剂质量控制的指标成分中。研究显示，一枝黄花中含有绿原酸等多种咖啡酰奎尼酸类成分。这些成分有明显的抗炎解热、抗菌、抗病毒的药理活性，其抗炎活性比常见的抗炎药阿司匹林还要强，其抗病毒活性及对病毒引起的呼吸道感染的抑制作用效果尤其显著，这些成分均为该制剂的功效相关成分。

发明内容

本发明提出一种穿黄制剂指纹图谱及组分含量测定方法，利用该方法，可以准确、高效、重复性及稳定性好的含量测定穿黄制剂中各组分含量，可作为穿黄制剂的质量控制方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种穿黄制剂指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：

S1.供试品溶液的制备：取1.0g穿黄制剂粉末，精密称定，置于25mL容量瓶中，加入70％甲醇20mL，超声30min，放冷，定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，13000r·min^-1离心，取上清液过0.45μm微孔滤膜，即得；

S2.高效液相色谱检测：吸取上述步骤S1所得供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测，记录65min内的指纹图谱；

其中，指纹色谱条件为：

采用Agilent Technologies EC-C18色谱柱，4.6mm×250mm，4μm，流动相：乙腈-0.2％磷酸水溶液系统；采用梯度洗脱方式：0min→10min→15min→20min→ 30min→40min→50min→65min；乙腈10％→15％→21％→25％→28％→34％→36％；流速1.0mL·min^-1；双波长切换时间序列采样：0～35min，323nm；35～65min，215nm；进样量5μL；柱温25℃；分析时间65min；理论塔板数以异绿原酸C峰计算不低于41000。

作为本发明的进一步改进，所述穿黄制剂粉末的制备方法如下：取穿黄清热片，去掉薄膜衣，研细过五号筛。

作为本发明的进一步改进，所述穿黄制剂粉末的制备方法如下：取穿黄清热胶囊，倾出内容物，研细过五号筛。

本发明进一步保护一种上述的方法建立的穿黄制剂的指纹图谱，所述指纹图谱包括特征峰新绿原酸(1)、绿原酸(2)、隐绿原酸(3)、异绿原酸B(4)、异绿原酸A(5)、异绿原酸C(7)、穿心莲内酯(8)、新穿心莲内酯(9)、去氧穿心莲内酯(10)、脱水穿心莲内酯(11)，其保留时间为7.1-7.3min、 13.1-13.7min、15.5-16.2min、27.8-28.2min、29.4-29.8min、33.2-33.8min、 41.5-42.3min、55.5-56.1min、60.0-60.8min、61.6-62.4min。

作为本发明的进一步改进，所述指纹图谱还包括(6)号特征峰，其保留时间为32.2-32.8min。

本发明进一步保护一种上述指纹图谱用于穿黄制剂的组分含量测定的方法，包括以下步骤：

S1.混合对照品溶液的制备：精密称取各对照品适量，分置于10个5mL的量瓶中，加甲醇溶解并定容，分别制得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸 B、异绿原酸A、异绿原酸C、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的对照品储备液；取上述各对照品储备液适量，置于同一个5ml量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀，制成含上述各对照品浓度分别为0.184、0.258、 0.202、0.260、0.178、0.0934、0.652、1.034、0.234、1.132mg·mL^-1的混合对照品储备液。精密吸取混合对照品储备液0.5mL，置于2mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成含新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸 A、异绿原酸C、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯浓度分别为0.0460，0.0645，0.0505，0.0650，0.0445，0.0234，0.163，0.258，0.0585，0.283mg·mL^-1的混合对照品溶液，即得；

S2.供试品溶液的制备：取1.0g穿黄制剂粉末，精密称定，置于25mL容量瓶中，加入70％甲醇20mL，超声30min，放冷，定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，13000r·min^-1离心，取上清液过0.45μm微孔滤膜，即得；

S3.色谱条件选择及系统适应性试验：采用Agilent Technologies EC-C18 色谱柱，4.6mm×250mm，4μm，流动相：乙腈-0.2％磷酸水溶液系统；采用梯度洗脱方式：0min→10min→15min→20min→30min→40min→50min→65min；乙腈 10％→15％→21％→25％→28％→34％→36％；流速1.0mL·min^-1；双波长切换时间序列采样：0～35min，323nm；35～65min，215nm；进样量5μL；柱温25℃；分析时间65min；理论塔板数以异绿原酸C峰计算不低于41000；

S4.吸取对照品溶液和供试品溶液各1～5μL，注入液相色谱仪，测定各组份相应峰面积，按外标法计算，即得不同批号穿黄制剂中10种主要成分的含量。

作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述对照品溶液和供试品溶液的吸取量分别为5μL。

本发明具有如下有益效果：本发明采用高效液相色谱结合紫外双波长切换检测方法，建立了一个既可测定穿黄制剂的特征指纹图谱，又可同时测定该制剂中咖啡酰奎尼酸类及穿心莲内酯类等10种主要成分的检测方法。试验结果表明，该方法准确、高效、重复性及稳定性好，指纹图谱特征性强，含量测定结果准确，可作为穿黄制剂的质量控制方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为15批穿黄制剂指纹图谱叠加图；

图2为穿黄制剂HPLC指纹图谱共有模式图；

图3为穿黄制剂指纹图谱共有模式与各对照药材供试品HPLC图谱叠加图；

图4专属性HPLC色谱图。

具体实施方式

本发明提供一种穿黄制剂指纹图谱及组分含量测定方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

1仪器与试药

1.1仪器Agilent-1260高效液相色谱仪，包括四元泵(型号：G1311B)、自动进样器(型号：G1329B)、柱温箱(型号：G1316A)、UV型紫外检测器(型号G1314F)、安捷伦工作站(美国安捷伦公司)；Waters e2695高效液相色谱仪，PDA型紫外检测器(型号：2998PDADetector)；密思博超纯水器；电子分析天平(十万分之一，SQP，赛多利斯科学仪器有限公司)；TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)；KQ5200B型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试剂乙腈为色谱纯(Fisher公司，批号：186356)，水为超纯水；甲醇、乙醇等其他试剂均为分析纯。

1.3对照品新绿原酸(批号：6603)、隐绿原酸(批号：3208)、异绿原酸B(批号：3089)上海诗丹德标准技术服务有限公司；绿原酸(批号：110753-201817) 中国食品药品检定研究院；异绿原酸A(批号：180307)、异绿原酸C(批号： 180126)上海融禾医药科技有限公司；新穿心莲内酯(批号：20171215)、去氧穿心莲内酯(批号：A2025J08)天津万象恒远科技有限公司；穿心莲内酯(批号： 110797-200307)、脱水穿心莲内酯(批号：110854-200306)中国药品生物制品检定所，以上对照品经HPLC含量测定纯度均大于98％。

1.4药材一枝黄花(批号：170301)药材和穿心莲(批号：180601)药材由南宁生源中药饮片有限责任公司提供，并经广西中医药大学中药鉴定教研室蔡毅教授鉴定。一枝黄花药材为菊科植物一枝黄花Solidago decurrens Lour.的干燥全草，穿心莲药材为爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata(Burm.f.) Nees的干燥地上部分。经检测上述药材均符合中国药典相关规定。

1.5穿黄制剂样品：穿黄片：批号20171101(0.21g/片，广西中医药大学制药厂)；穿黄胶囊：批号20190408、20190413、20190418、20190421(0.30g/ 粒，广西中医药大学药学中心试验室)；穿黄胶囊：批号：20180101、20180701、 20180704(0.30g/粒，山西华元医药生物技术有限公司)；穿黄胶囊：批号20180331 (0.31g/粒，吉林省康福药业有限公司)；穿黄胶囊：批号20180504、20180905 (0.36g/粒，四川好医生药业集团有限公司)；穿黄胶囊：批号20171201(0.32g/ 粒，天津和治药业集团有限公司)；穿黄胶囊：批号20190201(0.40g/粒，江西银涛药业有限公司)；穿黄胶囊：批号20190101(0.40g/粒，湖北端正药业有限公司)；穿黄胶囊：批号190301NO·043(0.41g/粒，重庆三峡云海药业有限公司)。

2方法与结果

2.1色谱条件Agilent Technologies EC-C18(4.6mm×250mm，4μm)；流动相乙腈(A)-0.2％磷酸水溶液(B)；梯度洗脱(0～10min，10％A；10～15min，10％～ 15％A；15～20min，15％～21％A；20～30min，21％～25％A；30～40min，25％～28％A； 40～50min，28％～34％A；50～65min，34％～36％A)；流速1.0ml·min^-1；双波长切换时间序列采样(0～35min，323nm；35～65min，215nm)；进样量为5μL；柱温为25℃。理论塔板数以异绿原酸C峰计算不低于41000。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备精密称取各对照品适量，分置于10个5mL的量瓶中，加甲醇溶解并定容，分别制得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的对照品储备液；取上述各对照品储备液适量，置于同一个5ml量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀，制成含上述各对照品浓度分别为0.184、0.258、 0.202、0.260、0.178、0.0934、0.652、1.034、0.234、1.132mg·mL^-1的混合对照品储备液。精密吸取混合对照品储备液0.5mL，置于2mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成含新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸 A、异绿原酸C、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯浓度分别为0.0460，0.0645，0.0505，0.0650，0.0445，0.0234，0.163，0.258，0.0585，0.283mg·mL^-1的混合对照品溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备

穿黄清热片供试品制备方法：取本品20片，去掉薄膜衣，精密称定。研细过五号筛，取约1.0g，精密称定，置于25mL容量瓶中，加入70％甲醇20mL，超声30min，放冷，定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，13000r·min^-1离心，取上清液过0.45μm微孔滤膜，即得。

穿黄清热胶囊供试品制备方法：取本品10粒，倾出内容物，精密称定，研细过五号筛，取约1.0g，精密称定，置于25mL容量瓶中，加入70％甲醇20ml，超声30min，放冷，定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，13000r·min^-1离心，取上清液过0.45μm微孔滤膜，即得。

2.2.3药材阴性对照溶液的制备按处方分别称取缺一枝黄花、缺穿心莲药材的样品各一份，按处方制备工艺制备，分别制得缺一枝黄花及缺穿心莲药材的对照样品。取上述对照样品，按“2.2.2”项下方法制备，制得一枝黄花阴性对照样品溶液及穿心莲阴性对照样品溶液，即得。

2.3穿黄制剂指纹图谱研究与建立

2.3.1稳定性试验取20171101样品1.0g，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别于0、2、4、8、12、24h进样5μL 分析，测定色谱峰面积。以4号峰(异绿原酸B)的保留时间和色谱峰面积为参照，计算得到除异绿原酸B外其余10个峰的相对保留时间RSD在0.03％～0.38％之间，相对峰面积RSD在0.47％～1.8％之间，表明穿黄制剂供试品溶液在24h内稳定性良好，符合指纹图谱测定的相关要求和规定。

2.3.2精密度试验精密吸取批号为20171101的供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件，连续进样6次测定分析。以4号峰(异绿原酸B)的保留时间和色谱峰面积为参照，计算得到除异绿原酸B外其余10个峰的相对保留时间RSD在 0.05～0.25％之间，相对峰面积RSD在1.0～2.0％之间，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱测定的相关要求和规定。

2.3.3重复性试验取批号为20171101的样品1.0g共6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样5μL 测定分析。结果，以4号峰(异绿原酸B)的保留时间和色谱峰面积为参照，计算得到除异绿原酸B外其余10个峰的相对保留时间RSD在0.02～0.39％之间，相对峰面积RSD在0.90～1.5％之间，表明该方法重复性良好，符合指纹图谱测定的要求。

2.3.4穿黄制剂HPLC指纹图谱的建立分别取各批次穿黄制剂适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定分析，结果见图1。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.130723版)对测得的各样品指纹图谱进行分析，建立穿黄制剂HPLC指纹图谱的共有模式，共生成11个共有特征峰，结果见图2。其中，4号峰为异绿原酸B，该峰分离度较好，色谱响应值较高，保留时间适宜，故选择其为参照峰。15批次穿黄制剂的指纹图谱的相似度计算结果见表1。由表1可知，各个批次穿黄制剂的相似度均在 0.90以上，相似性良好，表明各批样品中所含指标性成分的一致性较好。

图2中1为新绿原酸；2为绿原酸；3为隐绿原酸；4为异绿原酸B；5为异绿原酸A；7为异绿原酸C；8为穿心莲内酯；9为新穿心莲内酯；10为去氧穿心莲内酯；11为脱水穿心莲内酯。

2.3.5穿黄制剂HPLC指纹图谱共有峰归属分析分别精密吸取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析测定，采用二极管阵列检测器同时记录色谱图和各峰的紫外吸收光谱，并与指纹图谱共有模式中的各共有特征峰进行对比，结果显示指纹图谱共有模式中的1、2、3、4、5、7、8、9、10、11号特征峰的保留时间及紫外吸收光谱分别与新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品的保留时间及紫外吸收光谱一致，因此确认穿黄制剂指纹图谱共有模式中的1号特征峰为新绿原酸，2号特征峰为绿原酸、3号特征峰为隐绿原酸、4号特征峰为异绿原酸B、 5号特征峰为异绿原酸A、7号特征峰为异绿原酸C、8号特征峰为穿心莲内酯、9 号特征峰为新穿心莲内酯、10号特征峰为去氧穿心莲内酯，11号特征峰为脱水穿心莲内酯。分别精密吸取同法制备得到的穿心莲药材供试液、一枝黄花药材供试液，按“2.1”项下色谱条件分析测定，并与穿黄制剂指纹图谱共有模式中的各共有特征峰进行比对，结果见图3。图3中A为穿心莲药材供试液图谱；B为一枝黄花供试液图谱；C为穿黄制剂指纹图谱。

从试验结果可知，1号峰(新绿原酸)、2号峰(绿原酸)、3号峰(隐绿原酸)、4号峰(异绿原酸B)、5号峰(异绿原酸A)、7号峰(异绿原酸C)归属于一枝黄花药材；6号峰(未知成分)、8号峰(穿心莲内酯)、9号峰(新穿心莲内酯)和10号峰(去氧穿心莲内酯)和11号峰(脱水穿心莲内酯)归属于穿心莲药材。

2.4穿黄制剂中10种成分的含量测定

2.4.1系统适用性及专属性试验精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品溶液、穿黄片及穿黄胶囊供试品溶液、药材阴性对照样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定分析，考察系统适应性。结果显示，对照品色谱图和供试品色谱图的相应位置具有相同保留时间的色谱峰，且经DAD检测器检测其UV光谱一致，各组份色谱峰分离度均达到1.5以上，符合含量测定的要求。典型色谱图详见图4。图4中A为为混合对照品溶液；B为一枝黄花阴性对照溶液；C为穿心莲阴性对照溶液；D为穿黄胶囊(批号20180701)；E为穿黄片(批号20171101)，其中 1为新绿原酸；2为绿原酸；3为隐绿原酸；4为异绿原酸B；5为异绿原酸A；6 为异绿原酸C；7为穿心莲内酯；8为新穿心莲内酯；9为去氧穿心莲内酯；10 为脱水穿心莲内酯。理论塔板数以最难分离的异绿原酸C色谱峰计算应不少于 41000。

2.4.2精密度试验精密吸取混合对照品溶液5μL，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，测定各色谱峰面积。结果显示新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯各组分6次测定的峰面积RSD分别为0.89％、0.89％、 0.85％、0.78％、0.82％、0.83％、0.80％、0.83％、0.84％、0.84％，表明仪器精密度良好。

2.4.3稳定性试验精密吸取批号为20171101的供试品溶液5μL，按“2.1”项色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24h进样分析，测定色谱峰面积。结果显示新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯各组分峰面积的RSD 分别为1.7％、0.11％、0.46％、0.45％、1.8％，1.4％、0.55％、0.65％、0.08％、0.30％。表明供试品溶液在24h内稳定。

2.4.4线性关系考察分别精密吸取“2.2.1”项下制得的混合对照品储备液 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1mL，分置于6个2mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成含新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯浓度在0.0092～0.101mg·mL^-1，0.0129～0.142mg·mL^-1，0.0101～0.111mg·mL^-1， 0.0130～0.143mg·mL^-1，0.00890～0.0979mg·mL^-1，0.00467～0.0514mg·mL^-1， 0.0326～0.359mg·mL^-1，0.0517～0.569mg·mL^-1，0.0117～0.129mg·mL^-1，0.0566～ 0.623mg·mL^-1范围的6个混合对照品溶液，分别精密吸取以上各混合对照品溶液 5μL，注入HPLC色谱仪，在“2.1”项色谱条件下进样分析，测定相应峰面积。以峰面积为纵坐标(y)，浓度(mg.mL^-1)为横坐标(x)进行回归计算，得到线性方程，结果在以上浓度范围内各组分峰面积与浓度均呈良好的线性关系，结果见表2。

2.4.5重复性试验取批号为20171101的样品6份各1.0g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备得6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样5μL 分析，测定相应峰面积，计算每份样品中各组分含量，结果测得样品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的平均含量分别为1.07、1.42、1.20、 1.68、1.12、0.518、1.12、6.46、1.37、5.80mg·g^-1，RSD分别为1.6％、2.7％、 2.9％、2.1％、2.0％、1.6％、1.5％、1.3％、1.4％、1.4％，表明该方法重复性良好。

2.4.6加样回收率试验取含量已知的批号为20171101的样品0.5g共6份，精密称定，每份分别精密加入含新绿原酸(0.574mg·mL^-1)、绿原酸(0.806mg·mL^-1)、隐绿原酸(0.629mg·mL^-1)、异绿原酸B(0.814mg·mL^-1)、异绿原酸A(0.556mg·mL^-1)、异绿原酸C(0.292mg·mL^-1)、穿心莲内酯(0.588mg·mL^-1)、新穿心莲内酯 (3.23mg·mL^-1)、去氧穿心莲内酯(0.732mg·mL^-1)和脱水穿心莲内酯(3.535mg·mL^-1) 的混合对照品溶液1.00mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项的色谱条件进样5μL进行分析，计算，结果见表3。试验结果表明该方法准确性良好。

2.4.7含量测定取不同批号的穿黄制剂1.0g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。在“2.1”项色谱条件下，分别精密吸取混合对照品溶液和各批次穿黄制剂供试品溶液5μL，注入高效液相色谱仪进行分析，测定各组份相应峰面积，按外标法计算，即得不同批号穿黄制剂中10种主要成分的含量。结果见表4。

3讨论

3.1色谱条件的选择

本试验考察了3种不同色谱柱的分离情况，考察了Agilent Technologies EC-C18(4.6×250mm，4μm)，Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5.0 μm)，依利特SupersilODS2(250mm×4.6mm，5μm)3种不同色谱柱的分离度、峰形及柱效，结果显示以AgilentTechnologies EC-C18(4.6×250mm，4μ m)为最佳；分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸溶液、乙腈-0.2％磷酸溶液4种流动相进行梯度洗脱，结果显示乙腈-0.2％磷酸溶液作为流动相，梯度洗脱条件下，各峰分离度较好，出峰时间适中，且峰型较好；经考察不同柱温(25、 30、35℃)下的图谱，结果25℃柱温分离度及峰形较好；经对0.8mL·min^-1、1.0mL·min^-1、1.2mL·min^-13种不同的流速进行考察，用1.0mL·min^-1流速洗脱效果较好；经用高效液相色谱仪的紫外二极管阵列检测器对新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯在波长190～400nm进行全波长扫描，结果新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的最佳吸收波长为323nm，穿心莲内酯、新穿心莲内酯和去氧穿心莲内酯最佳吸收波长为 215nm；为使各目标成分能获得尽可能高的测量灵敏度，本试验采用双波长切换时间序列采样的方式进行检测，即0-35min，323nm；35-65min，215nm。试验结果显示，在此检测条件下，各目标成分均有较好的测量灵敏度及较好的峰型，并与共存组份可达到较好的分离。

3.2提取条件的选择

试验考察了不同供试品制备方法(冷浸、超声、回流)，结果显示超声提取和回流提取的效率明显优于冷浸提取，但超声提取和回流提取测得结果相差不大，故本试验选择了更简便快捷的超声提取法；试验还考察比较了不同提取溶剂、不同溶剂用量、不同提取次数及提取时间对含量测定结果的影响，结果显示用70％甲醇25mL，超声提取30min，超声提取1次各成分已基本提取完全，故选择作为本试验的供试品制备方法。

3.3结果分析本试验共测定了15个不同来源的穿黄制剂的HPLC指纹图谱及其10个主要功效相关成分的含量。试验结果显示，15个不同来源穿黄制剂的 HPLC指纹图谱相似度均达0.9以上，说明不同企业生产的穿黄制剂产品各成分组成基本一致；但含量测定结果表明，不同来源穿黄制剂10种主要功效成分含量仍存在一定的差异，如山西、天津、湖北等企业生产的穿黄制剂中，咖啡酰奎宁酸类成分的含量较广西、江西、四川、重庆等企业产品的含量低，这可能与药材的采收产地、采收时间、成熟程度等因素有关。

3.4总结

本试验采用高效液相色谱法，结合紫外双波长切换的检测方式，首次建立了可同时用于穿黄制剂指纹图谱及10个主要成分含量测定的检测方法。本试验结果表明，该方法操作简便、快速，测得的指纹图谱特征性强，含量测定结果重复性、准确性好，可同时用于穿黄制剂的定性与定量分析。该法可以更加全面地对穿黄制剂进行质量控制。

与现有技术相比，本发明采用高效液相色谱结合紫外双波长切换检测方法，建立了一个既可测定穿黄制剂的特征指纹图谱，又可同时测定该制剂中咖啡酰奎尼酸类及穿心莲内酯类等10种主要成分的检测方法。试验结果表明，该方法准确、高效、重复性及稳定性好，指纹图谱特征性强，含量测定结果准确，可作为穿黄制剂的质量控制方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种穿黄制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：

其中，指纹色谱条件为：

采用Agilent Technologies EC-C18色谱柱，4.6mm×250mm，4μm，流动相：乙腈-0.2％磷酸水溶液系统；采用梯度洗脱方式：0min→10min→15min→20min→30min→40min→50min→65min；乙腈10％→15％→21％→25％→28％→34％→36％；流速1.0mL·min^-1；双波长切换时间序列采样：0～35min，323nm；35～65min，215nm；进样量5μL；柱温25℃；分析时间65min；理论塔板数以异绿原酸C峰计算不低于41000。

2.根据权利要求1所述一种穿黄制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述穿黄制剂粉末的制备方法如下：取穿黄清热片，去掉薄膜衣，研细过五号筛。

3.根据权利要求1所述一种穿黄制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述穿黄制剂粉末的制备方法如下：取穿黄清热胶囊，倾出内容物，研细过五号筛。

4.一种如权利要求1-3任一项所述指纹图谱用于穿黄制剂的组分含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.混合对照品溶液的制备：精密称取各对照品适量，分置于10个5mL的量瓶中，加甲醇溶解并定容，分别制得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的对照品储备液；取上述各对照品储备液适量，置于同一个5ml量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀，制成含上述各对照品浓度分别为0.184、0.258、0.202、0.260、0.178、0.0934、0.652、1.034、0.234、1.132mg·mL^-1的混合对照品储备液，精密吸取混合对照品储备液0.5mL，置于2mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成含新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯浓度分别为0.0460，0.0645，0.0505，0.0650，0.0445，0.0234，0.163，0.258，0.0585，0.283mg·mL^-1的混合对照品溶液，即得；

S3.色谱条件选择及系统适应性试验：采用Agilent Technologies EC-C18色谱柱，4.6mm×250mm，4μm，流动相：乙腈-0.2％磷酸水溶液系统；采用梯度洗脱方式：0min→10min→15min→20min→30min→40min→50min→65min；乙腈10％→15％→21％→25％→28％→34％→36％；流速1.0mL·min^-1；双波长切换时间序列采样：0～35min，323nm；35～65min，215nm；进样量5μL；柱温25℃；分析时间65min；理论塔板数以异绿原酸C峰计算不低于41000；

5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述穿黄制剂粉末的制备方法如下：取穿黄清热片，去掉薄膜衣，研细过五号筛。

6.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述穿黄制剂粉末的制备方法如下：取穿黄清热胶囊，倾出内容物，研细过五号筛。

7.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，步骤S4中所述对照品溶液和供试品溶液的吸取量分别为5μL。