CN110769689B - 用于保存生物样品的新型过冷方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供以改善的细胞存活率冷冻保存细胞群的方法。在一些方面，所述方法包括将细胞群与含有一个或多个极性类肽单体的、例如配制在冷冻保护液中的类肽聚合物接触，并且在0℃至约‑20℃的温度下冷却所述细胞群至少约3小时的时间段以产生过冷细胞群。本发明的过冷方法提供了优异的解冻后细胞存活率和恢复。在特定实施方案中，通过本发明所述的过冷方法冷冻保存存在于组织或器官中的细胞群。

Description

用于保存生物样品的新型过冷方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年4月12日提交的美国临时申请No.62/484,704的优先权，出于所有目的，该申请的公开内容通过引用其整体并入本文。

背景技术

差的冷冻保存是再生医疗中要解决的关键瓶颈。随着细胞和组织疗法转化为关键性试验和商业制造，运输新鲜的起始生物材料和最终药物产品的物流已证明是关键障碍。这些治疗的成功的关键是在零下温度下长期贮存后提供高且可再现水平的存活和恢复的系统。细胞和组织疗法的低温保存(或冷冻保存)对于早期临床试验、给药前的长期贮存、以及集中制造并且在大型患者网络中分配的晚期治疗是必须的。以细胞悬液或移植组织来施用的这样的疗法需要使用作为与细胞相容、对受试者无毒、并且适用于在施用前以高存活率和功能将治疗保存足够长的时间的媒介的冷冻保护液。

冷冻保存技术老旧、有毒且通常细胞解冻后的存活率低于50％为无效的，并且效力不可靠，这极大的阻碍了标准化运输、批量制造、时序安排、和终产物释放试验。例如DMSO等的冷冻保存试剂(CPA)的广泛使用通过阻止冰生长改善了冷冻保存的生物样品解冻后的存活率，但由于DMSO对细胞产物及其后对治疗的患者有毒，阻止了按需生物库和先进再生药物产品的实现。参见，Sauer-Heilborn等人，Transfusion,44(6)：907-16(20040；Hubel,Transfusion,41(5)：579-580(2001)。解冻后去除DMSO为低效的且恢复率保持小于60％。参见，Calmels等人，Bone Marrow Transplant,31(9)：823-828(2000)。作为强溶剂，DMSO溶解并浸出输液管和容器，这增加了cGMP过程的风险。动物和人源血清(例如，胎牛血清，FBS)作为具有不确定结构和组成的天然产物，引入批次间的变化、另外的生物危害，并且极大地受供应链问题和地理限制的影响。其他冷冻介质可含有不稳定的蛋白质导致贮存寿命缩短、或化学上未定义为单一产品的聚合物。FDA试图通过适当的替代品来限制DMSO和血清的使用，这对于实现高效且现成的细胞和组织产品的强大的基础设施是必需的。

因此，本领域需要用于以高存活率和功能保存基于细胞和组织的样品的无毒且高活性的防冰材料。本公开满足了该需求并且还提供了其它优点。

发明内容

在一些方面，本文提供了一种以改善的细胞存活率冷冻保存细胞群的方法，所述方法包括：

(a)将细胞群与含有一个或多个极性类肽单体的类肽聚合物或其盐接触；并且

(b)将细胞群冷却至0℃至约-20℃的温度至少约3小时的时间段以产生过冷细胞群(population of supercooled cells)，

其中所述过冷细胞群的至少约50％在复温至高于0℃后存活。

在一些实施方案中，通过将冷冻保存方法存活的细胞数与起始细胞数比较以计算复温后存活的过冷细胞群的百分比。在一些实施方案中，通过将过冷方法存活的细胞数归一化至预先确定的未冷冻细胞的细胞计数(例如，起始细胞数)来计算复温后存活的过冷细胞群的百分比。在特定实施方案中，通过确定复温后约1天以下(例如，约4、8、12、16、或20小时)的冷冻保存方法存活的细胞数来计算过冷细胞群的百分比。

在一些实施方案中，将细胞群冷却至约-5℃至约-20℃、约-6℃至约-20℃、约-7℃至约-20℃、约-10℃至约-20℃、或约-15℃至约-20℃的温度。在其他实施方案中，将细胞群冷却至0℃至约-15℃、0℃至约-10℃、或0℃至约-5℃的温度。在进一步的实施方案中，将细胞群冷却至约-5℃至约-15℃、约-5℃至约-10℃、约-6℃至约-15℃、约-7℃至约-15℃、或约-10℃至约-15℃的温度。在特定实施方案中，将细胞群冷却至约0℃、-1℃、-2℃、-3℃、-4℃、-5℃、-6℃、-7℃、-8℃、-9℃、-10℃、-11℃、-12℃、-13℃、-14℃、-15℃、-16℃、-17℃、-18℃、-19℃、或-20℃的温度。在一些实施方案中，冷却的细胞群在所述温度下未冷冻(例如，在液体、无冰悬浮液中)。

在一些实施方案中，将细胞群冷却至少约4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、或120小时的时间段。在其他实施方案中，将细胞群冷却约1至约10天、约2至约10天、约3至约10天、约4至约10天、约5至约10天、约1至约8天、约2至约8天、约3至约8天、约4至约8天、约5至约8天、约1至约5天、约2至约5天、约3至约5天、约4至约5天、约2至约4天、约2至约3天、或约3至约4天的时间段。在进一步实施方案中，将细胞群冷却至少约5天(例如，至少约6、7、8、9、或10天)的时间段。在特定实施方案中，将细胞群冷却约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24天的时间段。

在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约50％在复温至高于约5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、或35℃的温度后存活。在其他实施方案中，过冷细胞群的至少50％在复温至约1℃至约37℃、约5℃至约37℃、约10℃至约37℃、约15℃至约37℃、约20℃至约37℃、约25℃至约37℃、约30℃至约37℃、约35℃至约37℃、约1℃至约35℃、约10℃至约35℃、约20℃至约35℃、约30℃至约35℃、约1℃至约30℃、约10℃至约30℃、约20℃至约30℃、约1℃至约25℃、约10℃至约25℃、约20℃至约25℃、约1℃至约20℃、约10℃至约20℃、约1℃至约15℃、约10℃至约15℃、约1℃至约10℃、约5℃至约10℃、或约1℃至约5℃的温度后存活。在特定实施方案中，过冷细胞群的至少50％在复温至约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、或37℃温度后存活。

在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约55％在复温后存活。在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约60％在复温后存活。在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约65％在复温后存活。在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约70％在复温后存活。在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约75％在复温后存活。在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约80％在复温后存活。在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约85％在复温后存活。在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约90％在复温后存活。在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约95％在复温后存活。

在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％)在复温后存活至少1天。在其他实施方案中，过冷细胞群的至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％)在复温后存活约1至约10天、约2至约10天、约3至约10天、约4至约10天、约5至约10天、约1至约8天、约2至约8天、约3至约8天、约4至约8天、约5至约8天、约1至约5天、约2至约5天、约3至约5天、约4至约5天、约2至约4天、约2至约3天、或约3至约4天的时间段。在进一步实施方案中，过冷细胞群的至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％)在复温后存活至少约2天(例如，至少约3、4、5、6、或7天)。在特定实施方案中，过冷细胞群的至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％)在复温后存活约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24天。

在一些实施方案中，改善的细胞存活率包括与对照过冷细胞群相比，在复温后存活的过冷细胞群的增殖增强。在一些实施方案中，对照过冷细胞群不与类肽聚合物接触(例如，对照过冷细胞群仅与冷冻保护液(仅含有DMSO、或细胞培养基的溶液)接触培养基)。在特定实施方案中，在复温后特定时间点(例如，约在复温后1、2、3、4、5、6、或7天以上)过冷细胞群中的细胞数比该时间点对照过冷细胞群的细胞数大至少约1倍(例如，至少约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍更大)。作为非限定性实例，在复温后约3天过冷细胞群中的细胞数可比对照过冷细胞群中的细胞数大至少约1倍。作为另一个非限定性实例，在复温后约6天过冷细胞群中的细胞数比对照过冷细胞群中的细胞数大至少约2倍。

在相关方面中，本文提供了一种以改善的细胞存活率冷冻保存细胞群的方法，所述方法包括：

(a)将细胞群与含有一个或多个极性类肽单体的类肽聚合物或其盐接触；并且

(b)将细胞群冷却至0℃至约-20℃的温度至少约3小时的时间段以产生过冷细胞群，

其中所述改善的细胞存活率包括与对照过冷细胞群相比，在复温后存活的过冷细胞群的增殖增强。

在一些实施方案中，对照过冷细胞群不与类肽聚合物接触(例如，对照过冷细胞群仅与冷冻保护液(仅含有DMSO、或细胞培养基的溶液)接触培养基)。在特定实施方案中，在复温后特定时间点(例如，在复温后约1、2、3、4、5、6、或7天以上)过冷细胞群中的细胞数比该时间点对照过冷细胞群的细胞数大至少约1倍(例如，至少约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍更大)。例如，在上文[0007]和[0012]段中描述了涉及本发明的这些方面的进一步的实施方案。

在一些实施方案中，类肽聚合物以足以在细胞群冷却的温度下减少或抑制冰晶形成的量存在。在特定实例中，类肽聚合物以约100nM和约1000mM之间的量存在，例如，在约100nM和约100mM之间。

在一些实施方案中，细胞群包括组织或器官。在一些实施方案中，细胞群包括原代细胞。在特定实施方案中，细胞群选自由以下组成的组：心脏细胞、肝细胞、肺细胞、肾细胞、胰腺细胞、胃细胞、肠细胞、肌肉细胞、皮肤细胞、神经细胞、血细胞、免疫细胞、成纤维细胞、生殖泌尿细胞、骨细胞、干细胞、精细胞、卵母细胞、胚胎细胞、上皮细胞、内皮细胞、及其组合。生殖泌尿细胞的非限定性实例包括阴茎海绵体细胞，例如阴茎海绵体平滑肌细胞、阴茎海绵体上皮细胞、及其组合。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括：

(c)将过冷细胞群复温至高于0℃。

在一些实施方案中，类肽聚合物包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多的极性类肽单体。在一些实施方案中，所述极性类肽单体具有含羟基的独立选择的侧链。在一些实施方案中，所述独立选择的侧链为任选取代的C_1-18羟基烷基。在一些实施方案中，所述C_1-18羟基烷基为独立选择的任选取代的C_1-6羟基烷基。在特定实例中，所述极性类肽单体的一个或多个或全部侧链具有以下结构：

极性类肽单体的非限定性实例包括：

其中下标m为重复单元的数量且在1和10之间(例如，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10)。在一些实施方案中，所述重复单元，m可在1和2、1和3、1和4、1和5、1和6、1和7、1和8、1和9、或1和10之间。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物进一步包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多的疏水性类肽单体。疏水性类肽单体的非限定性实例包括：

其中下标m为重复单元的数量且在1和10之间(例如，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10)。在一些实施方案中，所述重复单元m可在1和2、1和3、1和4、1和5、1和6、1和7、1和8、1和9、或1和10之间。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物为含有类肽聚合物和一个或多个氨基酸的类肽-肽杂合物或其盐，其中所述一个或多个氨基酸位于所述类肽聚合物的一端或两端和/或在一个或多个类肽单体之间。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物具有式(I)的结构、其互变异构体或其立体异构体：

其中：

各R¹独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-18烷基、任选取代的C_2-18烯基、任选取代的C_2-18炔基、任选取代的C_1-18羟基烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的C_1-18烷基氨基、任选取代的C_1-18烷硫基、任选取代的羧基烷基、C_3-10环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、(C_3-10环烷基)烷基、(杂环烷基)烷基、芳烷基、和杂芳烷基；

其中R¹的至少一个实例为任选取代的C_1-18羟基烷基，并且

其中任何环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基被一个或多个R³基团任选且独立地取代；

各R²独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-18烷基、任选取代的C_2-18烯基、任选取代的C_2-18炔基、任选取代的C_1-18羟基烷基、任选取代的C_1-18烷基氨基、任选取代的C_1-18烷硫基、和任选取代的羧基烷基；

各R³独立地选自由卤素、氧代基、硫代基、-OH、-SH、氨基、C_1-8烷基、C_1-8羟基烷基、C_1-8烷基氨基和C_1-8烷硫基组成的组；

X和Y独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-8烷基、任选取代的C_1-8酰基、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、-NH₂、乙酰基、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、和卤素，或者

可选地，X和Y一起形成共价键；和

表示聚合物中的单体的数量的下标n在2和50之间。

在一些实施方案中，R¹的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多的实例为独立选择的任选取代的C_1-18羟基烷基。在一些实施方案中，所述C_1-18羟基烷基为独立选择的任选取代的C_1-6羟基烷基。

在一些实施方案中，一个或多个R¹具有根据R^1b所示的结构：

在一些实施方案中，所述类肽聚合物中的R¹的各个实例选自由以下组成的组：

其中：

m在1和8之间；和

R³选自由H、C_1-8烷基、卤素、羟基、巯基、硝基、胺(amine)、氧代基、和硫代基组成的组。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物中的R¹的各个实例选自由以下组成的组：

在一些实施方案中，所述类肽聚合物中的R¹的各个实例为C_1-18羟基烷基。在一些实施方案中，R¹的各个实例为C_1-6羟基烷基。在一些实施方案中，R¹的各个实例为相同的C_1-6羟基烷基。在一些实施方案中，R¹的各个实例为：

在一些实施方案中，R²的各个实例为H。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在3和25之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在5和25之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在6和50之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在6和25之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在6和20之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在8和50之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在8和25之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在8和20之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在10和25之间。

在一些实施方案中，X和Y为H、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、或卤素。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物的X和Y一起形成共价键。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物选自表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、或表10中记载的聚合物的组。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物包括亚单元，所述亚单元包括一个或多个第一疏水性类肽单体H和一个或多个第一极性类肽单体P，其排列使得所述类肽聚合物具有序列[H_aP_b]_n或[P_bH_a]_n，其中：

表示亚单元中的连续的第一疏水性类肽单体的数量的下标a在1和10之间；

表示亚单元中的连续的第一极性类肽单体的数量的下标b在1和10之间；和

表示所述类肽聚合物中亚单元的数量的下标n在2和50之间。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物进一步包括取代基X和Y使得所述类肽聚合物具有序列X-[H_aP_b]_n-Y或X-[P_bH_a]_n-Y，其中：

X和Y独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-8烷基、任选取代的C_1-8酰基、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、-NH₂、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、和卤素，或者

可选地，X和Y一起形成共价键。

在一些实施方案中，所述亚单元进一步包括第二疏水性类肽单体和/或第二极性类肽单体，使得所述类肽聚合物具有序列[H_aP_bH_cP_d]_n或[P_bH_aP_dH_c]_n，其中：

表示亚单元中的连续的第二疏水性类肽单体的数量的下标c为0和10之间；

表示亚单元中的连续的第二极性类肽单体的数量的下标d为0和10之间；并且

c和d不都为0。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物进一步包括取代基X和Y使得所述类肽聚合物具有序列X-[H_aP_bH_cP_d]_n-Y或X-[P_bH_aP_dH_c]_n-Y，其中：

X和Y独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-8烷基、任选取代的C_1-8酰基、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、-NH₂、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、和卤素，或者

可选地，X和Y一起形成共价键。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物进一步包括序列Z，所述序列Z包括一个或多个疏水性类肽单体和/或一个或多个极性类肽单体，其中Z位于第一个亚单元之前、最后一个亚单元之后、和/或一个或多个亚单元之间。在一些情况下，Z包括一个或多个疏水性类肽单体。在一些情况下，Z包括一个或多个极性类肽单体。在其他实例中，Z包括一个或多个疏水性类肽单体和一个或多个极性类肽单体。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物包括：(a)含有两个第一疏水性类肽单体H和两个第一极性类肽单体P的亚单元，和(b)位于所述类肽聚合物的C-末端的两个第二疏水性类肽单体，其排列使得所述类肽单体具有序列[H₂P₂]_nH₂或[P₂H₂]_nH₂，其中表示所述类肽聚合物中的亚单元的数量的下标n在1和50之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物包括化合物81。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物进一步包括取代基X和Y使得所述类肽聚合物具有序列X-[H₂P₂]_nH₂-Y或X-[P₂H₂]_nH₂-Y，其中X和Y独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-8烷基、任选取代的C_1-8酰基、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、-NH₂、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、和卤素，或者可选地，X和Y一起形成共价键。在一些实施方案中，n在1和10之间。

在一些实施方案中，所述第一和/或第二疏水性类肽单体独立地选自上述记载的疏水性类肽单体。在一些实施方案中，所述类肽聚合物包括具有含羟基的侧链的极性类肽单体。在一些实施方案中，所述第一和/或的人极性类肽单体独立地选自上述记载的极性类肽单体。

在一些实施方案中，第一和/或第二极性类肽单体各自包括侧链，所述侧链独立地选自由(C_1-6烷氧基)(C_1-6亚烷基)、(低聚[乙二醇])、(4-至10-元杂环烷基)(C_1-6亚烷基)、和(5-至10-元杂芳基)(C_1-6亚烷基)组成的组。在一些实施方案中，(4-至10-元杂环烷基)(C_1-6亚烷基)包括4-6元杂环，其中至少一个成员选自由O和N组成的组。在一些实施方案中，(4-至10-元杂环烷基)(C_1-6亚烷基)包括四氢呋喃基或氧代吡咯烷基部分。在一些实例中，类肽聚合物包括在特定实例中，极性类肽单体全部为为在一些实施方案中，所述类肽聚合物包括化合物63、化合物76、化合物86、或化合物87。

在一些实施方案中，(5-至10-元杂芳基)(C_1-6亚烷基)包括5-6元芳族环，其中至少一个环成员选自由O和N组成的组。在一些实施方案中，(5-至10-元杂芳基)(C_1-6亚烷基)包括呋喃基部分。在一些实例中，类肽聚合物包括在特定实例中，类肽聚合物包括化合物73。

在一些实施方案中，侧链包括甲氧基乙基。在一些实例中，类肽聚合物包括在特定实例中，类肽聚合物包括化合物62。

在一些实施方案中，侧链包括低聚(乙二醇)部分。在一些实施方案中，低聚(乙二醇)部分为2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基部分。在一些实例中，类肽聚合物包括在特定实例中，类肽聚合物包括化合物67。

在一些实施方案中，n在2和10之间。在一些实施方案中，a在1和5之间。在一些实施方案中，b在1和5之间。在一些实施方案中，a在1和3之间且b在1和3之间。在一些实施方案中，c在0和5之间。在一些实施方案中，d在0和5之间。

在一些实施方案中，所述类肽单体的约10％为疏水性的。在一些实施方案中，所述类肽单体的约20％为疏水性的。在一些实施方案中，所述类肽单体的约30％为疏水性的。在一些实施方案中，所述类肽单体的约40％为疏水性的。在一些实施方案中，所述类肽单体的约50％为疏水性的。在一些实施方案中，所述类肽单体的约60％为疏水性的。在一些实施方案中，所述类肽单体的约70％为疏水性的。在一些实施方案中，所述类肽单体的约80％为疏水性的。在一些实施方案中，所述类肽单体的约90％为疏水性的。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物或类肽-肽杂合物为盐形式。盐的非限定实例包括本文所述的类肽聚合物和类肽-肽杂合物的盐酸盐、乙酸盐、硫酸盐、磷酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、酒石酸盐、和葡糖酸盐。

在一些实施方案中，将所述类肽聚合物和/或类肽-肽杂合物配制在冷冻保护液中。在一些实施方案中，所述冷冻保护液进一步包括选自由以下组成的组的化合物：离子性物质、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂、抗氧化剂、细胞膜稳定化合物、水通道蛋白或其它通道形成化合物、醇、糖、糖衍生物、非离子表面活性剂、蛋白质、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、透明质酸、甲酰胺、天然或合成水凝胶、及其组合。

在一些实施方案中，冷冻保护液进一步包括选自由以下组成的组的醇：丙二醇、乙二醇、甘油、甲醇、丁二醇、阿东糖醇、乙醇、三亚甲基醇、二甘醇、聚环氧乙烷、赤藓糖醇、山梨醇、木糖醇、聚丙二醇、2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)、甘露醇、肌醇、二硫糖醇、1,2-丙二醇、及其组合。

在一些实施方案中，冷冻保护液进一步包括选自由单糖、二糖、多糖、及其组合组成的组的糖。在一些实例中，糖为选自由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、果糖、木糖、甘露糖、3-O-甲基-D-吡喃葡萄糖、及其组合组成的组的单糖。在其它实例中，糖为选自由蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、及其组合组成的组的二糖。仍在其它实例中，糖为选自由棉子糖、葡聚糖、及其组合组成的组的多糖。

在一些实施方案中，冷冻保护液进一步包括具有小于约3,000g/mol的平均分子量的PEG或PPG。在特定实例中，PEG或PPG具有约200g/mol和400g/mol之间的平均分子量。

在一些实施方案中，所述冷冻保护液进一步包括选自由牛血清白蛋白、人血清白蛋白、明胶、及其组合组成的组的蛋白质。在一些实施方案中，所述冷冻保护液进一步包括含有壳聚糖、透明质酸、或其组合的天然或合成水凝胶。在一些实施方案中，所述冷冻保护液进一步包括选自由聚氧乙烯月桂基醚、聚山梨酸酯80、及其组合组成的组的非离子表面活性剂。

在其他方面，本文提供了通过任何本文所述方法产生的具有改善的细胞存活率的过冷细胞群。

从下面的详细描述和附图中，本发明的其他用途、特征、和优点对于本领域技术人员将是显而易见的。

附图说明

图1示出使用“亚单体”方法合成类肽寡聚体的一般方案。

图2A和2B显示在-20℃下进行的毛细管冷冻测定的结果。图2A示出将化合物1(1当量)和10(1当量)溶解于MilliQ水中并且经受零度以下温度的测定。与单独的水和乙二醇(EG)(18当量)的溶液进行比较。图2B显示图2A中所示的测定的归一化结果。

图3A-3D显示X射线衍射(XRD)晶体学数据。图3A显示含有5mM化合物12和17.5％(v/v)乙二醇(EG)的溶液的XRD数据。图3B显示含有30％(v/v)EG的溶液的XRD数据。图3C显示含有17.5％(v/v)EG的溶液的XRD数据。图3D显示含有EG、化合物2(标记为“B”；SEQ IDNO：10)、化合物12(标记为“D”；SEQ ID NO：8)、和/或化合物8(标记为“E”；SEQ ID NO:9)的若干溶液的冰环(ice ring)分数。对于每种不同溶液，确定两种不同的冰环分数。

图4A-4G显示与乙二醇(EG)对照相比，含有5mg/mL化合物10、化合物12、化合物8、化合物13、化合物11、和化合物58的溶液的X射线衍射(XRD)晶体学数据。各溶液还含有300mM NaCl、100mM HEPES、15％(v/v)乙二醇，并且将pH调整为7.2。图4A：化合物10XRD晶体学图(左)和光谱图(右)。图4B：化合物12XRD晶体学图(左)和光谱图(右)。图4C：化合物8XRD晶体学图(左)和光谱图(右)。图4D：化合物13XRD晶体学图(左)和光谱图(右)。图4E：化合物11XRD晶体学图(左)和光谱图(右)。图4F：化合物58XRD晶体学图(左)和光谱图(右)。图4G：EG对照XRD晶体学图(左)和光谱图(右)。对于XDR光谱图，作为角度(2θ度)的函数绘制强度。

图5A-5G显示与乙二醇(EG)对照相比，含有1mg/mL化合物10、化合物12、化合物8、化合物13、化合物11、和化合物58的溶液的X射线衍射(XRD)晶体学数据。各溶液还含有300mM NaCl、100mM HEPES、17.5％(v/v)乙二醇，并且将pH调整为7.2。图5A：化合物10XRD晶体学图(左)和光谱图(右)。图5B：化合物12XRD晶体学图(左)和光谱图(右)。图5C：化合物8XRD晶体学图(左)和光谱图(右)。图5D：化合物13XRD晶体学图(左)和光谱图(右)。图5E：化合物11XRD晶体学图(左)和光谱图(右)。图5F：化合物58XRD晶体学图(左)和光谱图(右)。图5G：EG对照XRD晶体学图(左)和光谱图(右)。对于XDR光谱图，作为角度(2θ度)的函数绘制强度。

图6A-6C显示快速冷冻、复温、随后再次冷冻的两种溶液。对照溶液含有22.5％(v/v)乙二醇(EG)，同时试验溶液含有22.5％EG和5mg/mL(0.5％(w/v))化合物12。图6A显示在液氮中快速冷冻期间，含有化合物12的溶液玻璃化而对照溶液完全冷冻。图6B显示在37℃下复温期间，含有化合物12的溶液解冻(在两秒钟内)，而对照保持冷冻。图6C显示在-20℃冰箱中过夜后，与对照不同，化合物12溶液保持解冻。

图7显示对其中向细胞培养基中添加化合物12(正方形)或DMSO(圆形)的HEK 293细胞进行细胞毒性研究的结果。其中未添加化合物12或DMSO的样品(“培养基”(三角形))用作对照。进行连续稀释以测试不同浓度的化合物12和DMSO。

图8显示对HEK293细胞进行冷冻保存试验的结果，将含有乙二醇(EG)的溶液与含有EG和化合物12的溶液相比较。解冻12小时后测量细胞存活率。

图9显示对HEK293细胞进行冷冻保存试验的结果，将含有5mg/mL化合物12以及二醇、二糖和一般缓冲液的混合物的溶液与含有VS2E或M22的溶液相比较。解冻16小时后测量细胞存活率。用液氮(LN2)使细胞玻璃化。

图10A显示了在-20℃下贮存Jurkat细胞72小时后收集的流式细胞术数据的实例。将细胞数归一化至未冷冻对照以比较。制剂XT-SC3和XT-SC4含有HTK缓冲液、化合物12、和其他组分。HTK缓冲液和DMEM+10％FBS两者在贮存24小时后显示几乎无存活。XT-SC4在72小时后显示几乎无细胞死亡，XT-SC3显示出随着时间点延长，细胞存活率仅略微下降。

图10B显示了在-20℃下贮存HEK293细胞72小时后的荧光存活率试验，证实了Jurkat细胞的流式细胞术结果。在此，HTK和DMEM/FBS在24小时后在-20℃下无存活且在4℃下的存活很差。

图11显示了在过冷制剂(XT-SC5至8)和HTK溶液中在-20℃下贮存长达48小时的大鼠阴茎海绵体(CC)内皮细胞的时程存活率。在用过冷媒介处理后，在用钙黄绿素AM染色前，将细胞在37℃下的培养基(50X稀释)中恢复24小时。定量荧光信号在条形图中表示细胞存活率并且在底部显示相关细胞图像。

图12显示了在具有1％化合物12的XT制剂、仅XT制剂、10％DMSO制剂、或仅DMEM细胞培养基中、在-20℃下冷冻保存3天的SK-OV-3细胞的存活率。在复温后1天测量细胞存活率。

图13显示了在具有1％化合物12的XT制剂、10％DMSO制剂、或仅DMEM细胞培养基中、在-20℃下冷冻保存3天的SK-OV-3细胞的扩增。在复温后3天测量细胞存活率。

图14显示了在具有1％化合物12的XT制剂、仅XT制剂、10％DMSO制剂、或仅DMEM细胞培养基中、在-20℃下冷冻保存3天的K562细胞的扩增。在复温后3天测量细胞存活率。

图15显示了在具有1％化合物12的XT制剂、仅XT制剂、10％DMSO制剂、或仅DMEM细胞培养基中、在-20℃下冷冻保存3天的K562细胞的增殖。在复温后6天测量细胞存活率。

图16显示了在具有1％化合物12、27、62、74、或76的XT制剂、10％DMSO制剂、或仅DMEM细胞培养基中、在-20℃下冷冻保存3天的K562细胞的增殖。在复温后7天测量细胞存活率。

具体实施方式

I.简介

低温下使用冷冻保存来储存细胞和组织对于许多生物产品和应用是至关重要的，然而使治疗性细胞、组织、和器官成功地完全恢复或活化仍然是个重大难题。通常用冷冻保护剂(CPA)来进行冷冻保存，其是重要的化学添加剂，例如二甲基亚砜(DMSO)、牛血清白蛋白(BSA)、和其它。CPA通过防止冰晶成核和生长而用于改善冷冻保存的生物系统的解冻后存活率。然而，这些物质在其有效浓度下显示各种水平的细胞毒性，因此限制了冷冻保存、生物储存、和高级再生医学的成功。这种有效且安全的CPA的缺乏导致毒性CPA的广泛使用。

本发明是部分地基于含有至少一种极性类肽单体(例如，具有如羟基等的极性侧链)的类肽聚合物可用于无冰过冷方法的发现，与无类肽聚合物并且在3-24小时后完全损失细胞存活率的对照样品相比，所述无冰过冷方法在将细胞群冷却至过冷温度(例如，0℃至-20℃)至少约3小时的时间段后提供优异的细胞存活和恢复。作为非限定性实例，使用本文所述的无冰过冷方法用人模式细胞类型(例如，HEK-293、K562、Jurkat、SK-OV-3)的研究表明典型的解冻后(例如，复温后)细胞恢复率超过85％，有时在解冻后16小时实现几乎100％的存活率。

II.缩略语和定义

除非另外定义，否则本文使用的缩写是常规的。使用以下缩写来表示类肽聚合物的单体单元：Nsb(2-(仲丁基氨基)乙酸)、Nib(2-(异丁基氨基)乙酸)、Nbu(2-(丁基氨基)乙酸)、Npr(2-丙基氨基)乙酸)、Nip(2-(异丙基氨基)乙酸)、Nme(2-(甲基氨基)乙酸)、Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)、Nhe(2-((2-羟乙基)氨基)乙酸)、Ndp(2-((2,3-二羟丙基)氨基)乙酸、Nyp(2-((1-羟基丙-2-基)氨基)乙酸)、Nep(2-((1-(4-羟基苯基)乙基)氨基)乙酸、Ndh(2-((1,3,-二羟基丙-2-基)氨基)乙酸、Nop(2-((3-(2-氧代吡咯烷-1-基)丙基)氨基)乙酸、Nmo(2-(2-甲氧基乙基氨基)乙酸)、Ntf(2-((四氢呋喃-2-基)甲基氨基)乙酸)、Nff(2-(呋喃-2-基甲基氨基)乙酸)、Nmb(2-(2-甲基丁基氨基)乙酸)、Nrh(2-(R)-(2-羟丙基氨基)乙酸)、Nsh(2-(S)-(2-羟丙基氨基)乙酸)、N3p(2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基氨基)乙酸)、Nbr((2-(R)-仲丁基氨基)乙酸)、和Nbs((2-(S)-仲丁基氨基)乙酸)。以下缩写用于表示化合物：DMF(N,N’-二甲基甲酰胺)、DIEA(二异丙基乙胺)、DIC(N,N’-二异丙基碳二亚胺)、ACN(乙腈)、DCM(二氯甲烷)、HFIP(六氟异丙醇)；Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)。

如本文使用的术语“一个(a)”、“一种(an)”、或“该(the)”不仅包括具有一个成员的方面，还包括具有大于一个成员的方面。例如，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”、或“该”包括复数个对象。因此，例如，提及“细胞(a cell)”包括复数个此类细胞(cells)，并且提及“该试剂(the agent)”包括本领域技术人员公知的一种或多种试剂(agents)，等等。

如本文使用的修饰数值的术语“约”表示该值周围的限定范围。如果“X”为该值，“约X”将表示0.9X至1.1X的值，并且更优选地，0.95X至1.05X的值。对“约X”的任意提及具体地表示至少该值X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X、和1.05X。因此，“约X”旨在教导并提供对例如“0.98X”的权利要求限制的书面描述支持。

“烷基”是指具有指定碳原子数的直链或支链的、饱和、脂肪族基团。烷基可包括任意数量的碳，例如C_1-2、C_1-3、C_1-4、C_1-5、C_1-6、C_1-7、C_1-8、C_1-9、C_1-10、C_2-3、C_2-4、C_2-5、C_2-6、C_3-4、C_3-5、C_3-6、C_4-5、C_4-6和C_5-6。例如，C_1-6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。烷基也可指具有至多30个碳原子的烷基，例如但不限于庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可以为取代的或未取代的。烷基可以任选地被选自卤素、羟基、氨基、巯基、烷基氨基、烷氧基、卤代烷基、羧基、酰氨基、硝基、氧代基(oxo)、硫代基(thioxo)、和氰基的一个或多个部分取代。

“烯基”是指具有至少2个碳原子和至少1个双键的直链或支链烃。烯基可以包括任意数量的碳，例如C₂、C_2-3、C_2-4、C_2-5、C_2-6、C_2-7、C_2-8、C_2-9、C_2-10、C₃、C_3-4、C_3-5、C_3-6、C₄、C_4-5、C_4-6、C₅、C_5-6、和C₆。烯基可以具有任意合适数量的双键，包括但不限于1、2、3、4、5、或更多个。烯基的实例包括但不限于乙烯基(vinyl,ethenyl))、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、异戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、1,5-己二烯基、2,4-己二烯基、或1,3,5-己三烯基。烯基可以为取代的或未取代的。烯基可以任选地被选自卤素、羟基、氨基、巯基、烷基氨基、烷氧基、卤代烷基、羧基、酰氨基、硝基、氧代基、硫代基、和氰基的一个或多个部分取代。

“炔基”是指具有至少2个碳原子和至少1个三键的直链或支链烃。炔基可以包括任意数量的碳，例如C₂、C_2-3、C_2-4、C_2-5、C_2-6、C_2-7、C_2-8、C_2-9、C_2-10、C₃、C_3-4、C_3-5、C_3-6、C₄、C_4-5、C_4-6、C₅、C_5-6、和C₆。炔基的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、异戊炔基、1,3-戊二炔基、1,4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1,3-己二炔基、1,4-己二炔基、1,5-己二炔基、2,4-己二炔基、或1,3,5-己三炔基。炔基可以为取代的或未取代的。炔基可以任选地被选自卤素、羟基、氨基、巯基、烷基氨基、烷氧基、卤代烷基、羧基、酰氨基、硝基、氧代基、硫代基、和氰基的一个或多个部分取代。

“亚烷基”是指具有指定碳原子数并且连接至少两个其它基团，即二价烃基的直链或支链、饱和的、脂肪族基团。连接至亚烷基的两个部分可连接至亚烷基的相同原子或不同的原子。例如，直链亚烷基可以是-(CH₂)_n-的二价基团，其中n是任意合适的碳原子的数量。代表性的亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、异亚丙基、亚丁基、异亚丁基、仲亚丁基、亚戊基和亚己基。亚烷基可以为取代的或未取代的。亚烷基可以任选地被选自卤素、羟基、氨基、巯基、烷基氨基、烷氧基、卤代烷基、羧基、酰氨基、硝基、氧代基、硫代基、和氰基的一个或多个部分取代。

“亚烯基”是指连接至少两个其它基团，即二价烃基的如上定义的烯基。连接至亚烯基的两个部分可以连接至亚烯基的相同原子或不同的原子。亚烯基包括但不限于亚乙烯基、亚丙烯基、异亚丙烯基(isopropenylene)、亚丁烯基、异亚丁烯基、仲亚丁烯基、亚戊烯基和亚己烯基。亚烯基可以为取代的或未取代的。亚烯基可以任选地被选自卤素、羟基、氨基、巯基、烷基氨基、烷氧基、卤代烷基、羧基、酰氨基、硝基、氧代基、硫代基、和氰基的一个或多个部分取代。

“亚炔基”是指连接至少两个其它基团，即二价烃基的如上定义的炔基。连接至亚炔基的两个部分可以连接至亚炔基的相同原子或不同的原子。亚炔基包括但不限于亚乙炔基、亚丙炔基、异亚丙炔基、亚丁炔基、仲亚丁炔基、亚戊炔基和亚己炔基。亚炔基可以为取代的或未取代的。亚炔基可以任选地被选自卤素、羟基、氨基、巯基、烷基氨基、烷氧基、卤代烷基、羧基、酰氨基、硝基、氧代基、硫代基、和氰基的一个或多个部分取代。

“卤素(halogen或halo)”是指氟、氯、溴和碘。

“胺”或“氨基”是指-N(R)₂基团，其中R基团可以是氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基等。R基团可以相同或不同。氨基可以是伯氨基(各个R为氢)、仲氨基(一个R为氢)或叔氨基(各个R都不为氢)。烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基可以任选地被选自卤素、羟基、氨基、巯基、烷基氨基、烷氧基、卤代烷基、羧基、酰氨基、硝基、氧代基、硫代基、和氰基的一个或多个部分取代。

“羟基(hydroxyl或hydroxy)”是指-OH基团。羟基可以在任意合适的碳原子处。

“巯基”是指-SH基团。巯基可以在任意合适的碳原子处。

“氧代基”是指双键O基团(＝O,-C(O)-)。氧代基可以在任意合适的碳原子处。

“硫代基”是指双键S基团(＝S)。硫代基可以在任意合适的碳原子处。

“硝基”是指–NO₂基团。硝基可以在任意合适的碳原子处。

“羧基”是指式-C(O)OH或-CO₂H的羧酸基团。

“环烷基”是指含有3至12个环原子或指定数量的原子的饱和或部分不饱和的、单环、稠合二环或桥接多环集合。环烷基可包括任意数量的碳，例如C_3-6、C_4-6、C_5-6、C_3-8、C_4-8、C_5-8、C_6-8、C_3-9、C_3-10、C_3-11、和C_3-12。饱和的单环环烷基环包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、和环辛基。饱和的二环和多环环烷基环包括例如降冰片烷、[2.2.2]二环辛烷、十氢化萘和金刚烷。环烷基也可为部分不饱和的，在环中具有一个或多个双键或三键。代表性的部分不饱和的环烷基包括但不限于环丁烯、环戊烯、环己烯、环己二烯(1,3-和1,4-异构体)、环庚烯、环庚二烯、环辛烯、环辛二烯(1,3-、1,4-和1,5-异构体)、降冰片烯和降冰片二烯。当环烷基为饱和单环C_3-8环烷基时，示例性的基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。当环烷基为饱和的单环C_3-6环烷基时，示例性的基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、和环己基。环烷基可为取代的或未取代的。环烷基可以任选地被选自烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、氨基、烷基氨基、烷氧基、卤代烷基、羧基、酰氨基、巯基、硝基、氧代基、硫代基、和氰基的一个或多个部分取代。其中，例如，环烷基可以被C_1-6烷基或氧代基(＝O)取代。

“杂环烷基”是指具有3至12个环成员和1至4个N、O、或S的杂原子的饱和环体系。另外的杂原子也是有用的，包括但不限于B、Al、Si、和P。杂原子也可被氧化以形成包括但不限于-S(O)-和-S(O)₂-的部分。杂环烷基可包括任意数量的环原子，例如3至6、4至6、5至6、3至8、4至8、5至8、6至8、3至9、3至10、3至11、或3至12个环成员。杂环烷基中可包括任意合适数量的杂原子，例如1、2、3、或4、或1至2、1至3、1至4、2至3、2至4、或3至4。杂环烷基可包括如下基团，例如氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷、氮杂环辛烷、奎宁环、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪(1,2-、1,3-和1,4-异构体)、环氧乙烷(oxirane)、氧杂环丁烷、四氢呋喃、环氧乙烷(oxane)(四氢吡喃)、环氧己烷、环硫乙烷(thiirane)、硫杂环丁烷、硫杂环戊烷(thiolane)(四氢噻吩(tetrahydrothiophene)、硫化环戊烷(thiane)(四氢噻喃(tetrahydrothiopyran))、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、二氧戊环、二硫戊环、吗啉、硫代吗啉、二噁烷或二噻烷。杂环烷基还可以与芳族或非芳族环体系稠合以形成包括但不限于二氢吲哚的成员。杂环烷基可为取代的或未取代的。杂环烷基可以任选地被选自烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、氨基、巯基、烷基氨基、烷氧基、卤代烷基、羧基、酰氨基、硝基、氧代基、硫代基、和氰基的一个或多个部分取代。其中，例如，杂环烷基可被C_1-6烷基或氧代基(＝O)取代。

杂环烷基可通过环上的任何位置连接。例如，氮丙啶可以是1-或2-氮丙啶，氮杂环丁烷可以是1-或2-氮杂环丁烷，吡咯烷可以是1-、2-、或3-吡咯烷、哌啶可以是1-、2-、3-、或4-哌啶，吡唑烷可以是1-、2-、3-、或4-吡唑烷，咪唑烷可以是1-、2-、3-、或4-咪唑烷，哌嗪可以是1-、2-、3-、或4-哌嗪，四氢呋喃可以是1-或2-四氢呋喃，噁唑烷可以是2-、3-、4-、或5-噁唑烷，异噁唑烷可以是2-、3-、4-、或5-异噁唑烷，噻唑烷可以是2-、3-、4-、或5-噻唑烷，异噻唑烷可以是2-、3-、4-、或5-异噻唑烷，以及吗啉可以是2-、3-、或4-吗啉。

当杂环烷基包括3至8个环成员和1至3个杂原子时，代表性成员包括但不限于吡咯烷、哌啶、四氢呋喃、环氧乙烷、四氢噻吩、硫化环戊烷、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、吗啉、硫代吗啉、二噁烷、和二噻烷。杂环烷基也可以形成具有5至6个环成员和1至2个杂原子的环，代表性成员包括但不限于吡咯烷、哌啶、四氢呋喃、四氢噻吩、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、和吗啉。

“芳基”是指具有任意合适数量的环原子和任意合适数量的环的芳族环体系。芳基可以包括任意合适数量的环原子，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或16个环原子，以及6至10、6至12、或6至14个环成员。芳基可以是单环、稠合以形成双环或三环基团，或者通过键连接以形成联芳基。代表性的芳基包括苯基、萘基和联苯基。其它芳基包括具有亚甲基连接基团的苄基。一些芳基具有6至12个环成员，例如苯基、萘基或联苯基。其它芳基具有6至10个环成员，例如苯基或萘基。一些其它芳基具有6个环成员，例如苯基。芳基可为取代的或未取代的。芳基可任选地被选自烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、氨基、巯基、烷基氨基、烷氧基、卤代烷基、羧基、酰氨基、硝基、氧代基、硫代基、和氰基的一个或多个部分取代。

“杂芳基”是指含有5至16个环原子的单环、或稠合二环或三环芳族环集合，其中1至5个环原子是例如N、O或S等杂原子。另外的杂原子也是有用的，包括但不限于B、Al、Si、和P。杂原子也可被氧化以形成包括但不限于-S(O)-和-S(O)₂-的部分。杂芳基可包括任意数量的环原子，例如3至6、4至6、5至6、3至8、4至8、5至8、6至8、3至9、3至10、3至11、或3至12个环成员。杂芳基中可包括任意合适数量的杂原子，例如1、2、3、4、或5、或1至2、1至3、1至4、1至5、2至3、2至4、2至5、3至4、或3至5。杂芳基可具有5至8个环成员和1至4个杂原子、或者5至8个环成员和1至3个杂原子、或者5至6个环成员和1至4个杂原子、或者5至6个环成员和1至3个杂原子。杂芳基可包括以下基团：例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、四唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑、和异噁唑。杂芳基还可稠合至例如苯环等芳族环体系以形成包括但不限于以下的成员：苯并吡咯如吲哚和异吲哚、苯并吡啶如喹啉和异喹啉、苯并吡嗪(喹喔啉)、苯并嘧啶(喹唑啉)、苯并哒嗪如酞嗪和噌啉、苯并噻吩、和苯并呋喃。其它杂芳基包括通过键连接的杂芳基环，例如联吡啶。杂芳基可为取代的或未取代的。杂芳基可任选地被选自烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、氨基、巯基、烷基氨基、烷氧基、卤代烷基、羧基、酰氨基、硝基、氧代基、硫代基、和氰基的一个或多个部分取代。

杂芳基可以通过环上的任何位置连接。例如，吡咯包括1-、2-和3-吡咯，吡啶包括2-、3-和4-吡啶，咪唑包括1-、2-、4-和5-咪唑，吡唑包括1-、3-、4-和5-吡唑，三唑包括1-、4-和5-三唑，四唑包括1-和5-四唑，嘧啶包括2-、4-、5-和6-嘧啶，哒嗪包括3-和4-哒嗪，1,2,3-三嗪包括4-和5-三嗪，1,2,4-三嗪包括3-、5-和6-三嗪，1,3,5-三嗪包括2-三嗪，噻吩包括2-和3-噻吩，呋喃包括2-和3-呋喃，噻唑包括2-、4-和5-噻唑，异噻唑包括3-、4-和5-异噻唑，噁唑包括2-、4-和5-噁唑，异噁唑包括3-、4-和5-异噁唑，吲哚包括1-、2-和3-吲哚，异吲哚包括1-和2-异吲哚，喹啉包括2-、3-和4-喹啉，异喹啉包括1-、3-和4-异喹啉，喹唑啉包括2-和4-喹唑啉，噌啉包括3-和4-噌啉，苯并噻吩包括2-和3-苯并噻吩，以及苯并呋喃包括2-和3-苯并呋喃。

一些杂芳基包括具有5至10个环成员和1至3个包括N、O、或S的环原子的那些基团，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑、异噁唑、吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、酞嗪、噌啉、苯并噻吩、和苯并呋喃。其它杂芳基包括具有5至8个环成员和1至3个杂原子的那些，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑、和异噁唑。一些其它杂芳基包括具有9至12个环成员和1至3个杂原子的那些，例如吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、酞嗪、噌啉、苯并噻吩、苯并呋喃和联吡啶。其它杂芳基包括具有5至6个环成员和1至2个包括N、O、或S的环原子的那些，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑、和异噁唑。

“(环烷基)烷基”是指具有烷基组分和环烷基组分的基团，其中烷基组分将环烷基组分连接至连接点。烷基组分如上所述定义，除了烷基组分为至少二价的、亚烷基以连接至环烷基组分和连接点。烷基组分可包括任意数量的碳，例如C_1-6、C_1-2、C_1-3、C_1-4、C_1-5、C_2-3、C_2-4、C_2-5、C_2-6、C_3-4、C_3-5、C_3-6、C_4-5、C_4-6和C_5-6。环烷基组分如上所定义。示例性(环烷基)烷基包括但不限于甲基-环丙基、甲基-环丁基、甲基-环戊基、和甲基-环己基。

“(杂环烷基)烷基”是指具有烷基组分和杂环烷基组分的基团，其中烷基组分将杂环烷基组分连接至连接点。烷基组分如上定义，除了烷基组分为至少二价的、亚烷基以连接至杂环烷基组分和连接点。烷基组分可包括任意数量的碳，例如C_0-6、C_1-2、C_1-3、C_1-4、C_1-5、C_1-6、C_2-3、C_2-4、C_2-5、C_2-6、C_3-4、C_3-5、C_3-6、C_4-5、C_4-6和C_5-6。杂环烷基组分如上定义。(杂环烷基)烷基可为取代的或未取代的。

“芳烷基”是指具有烷基组分和芳基组分的基团，其中烷基组分将芳基组分连接至连接点。烷基组分如上定义，除了烷基组分为至少二价的、亚烷基以连接至芳基组分和连接点。烷基组分可包括任意数量的碳，例如C_0-6、C_1-2、C_1-3、C_1-4、C_1-5、C_1-6、C_2-3、C_2-4、C_2-5、C_2-6、C_3-4、C_3-5、C_3-6、C_4-5、C_4-6和C_5-6。芳基组分如上定义。芳烷基的实例包括但不限于苄基和乙基-苯。芳烷基可为取代的或未取代的。

“杂芳烷基”是指具有烷基组分和杂芳基组分的基团，其中烷基组分将杂芳基组分连接至连接点。烷基组分如上定义，除了烷基组分为至少二价的、亚烷基以连接至杂芳基组分和连接点。烷基组分可包括任意数量的碳，例如C_0-6、C_1-2、C_1-3、C_1-4、C_1-5、C_1-6、C_2-3、C_2-4、C_2-5、C_2-6、C_3-4、C_3-5、C_3-6、C_4-5、C_4-6和C_5-6。杂芳基组分如上定义。杂芳烷基可为取代的或未取代的。

“羧基烷基”是指与如上所述的烷基连接的羧基，并且通常具有式–C_1-8烷基-C(O)OH。任意合适的烷基链是有用的。羧基烷基可任选地被选自卤素、羟基、氨基、巯基、烷基氨基、烷氧基、卤代烷基、羧基、酰氨基、硝基、氧代基、硫代基、和氰基的一个或多个部分取代。

“酰基”是指在连接点处含有氧取代的碳的烷基(-C(O)–C_1-8烷基)。可以使用任意合适的烷基链。酰基可任选地被选自卤素、羟基、氨基、巯基、烷基氨基、烷氧基、卤代烷基、羧基、酰氨基、硝基、氧代基、硫代基、和氰基的一个或多个部分取代。

“羟基烷基”是指其中至少一个氢原子被羟基代替的如上定义的烷基。关于烷基，羟基烷基可具有任意合适数量的碳原子，例如C_1-6。示例性的羟基烷基包括但不限于羟基甲基、羟乙基(其中羟基在1-或2-位)、羟丙基(其中羟基在1-、2-或3-位)、羟基丁基(其中羟基在1-、2-、3-或4-位)、羟基戊基(其中羟基在1-、2-、3-、4-或5-位)、羟基己基(其中羟基在1-、2-、3-、4-、5-或6-位)、和1,2-二羟基乙基等。羟基烷基可任选地被选自卤素、巯基、氨基、烷基氨基、烷氧基、卤代烷基、羧基、酰氨基、硝基、氧代基、硫代基、和氰基的一个或多个部分取代。本领域技术人员应理解，在本发明中其它羟基烷基是有用的。

“烷氧基”是指具有至少一个桥氧原子的烷基。桥氧原子可在烷基链内的任意位置(烷基-O-烷基)，或者桥氧原子可将烷基连接至连接点(烷基-O-)。在一些实施方案中，桥氧原子不作为末端羟基(即，-OH)存在。在一些实例中，烷氧基含有1、2、3、4、或5个桥氧原子。关于烷基，烷氧基可具有任意合适数量的碳原子，例如C_1-2、C_1-4、和C_1-6。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、甲基氧基-乙基氧基-乙基(C₁-O-C₂-O-C₂-)等。烷氧基的一个实例为聚乙二醇(PEG)，其中聚乙二醇链可包括2至20个之间的乙二醇单体。烷氧基可任选地被选自卤素、羟基、氨基、巯基、烷基氨基、卤代烷基、羧基、酰氨基、硝基、氧代基、硫代基、和氰基的一个或多个部分取代。烷氧基可为取代的或未取代的。

“烷基氨基”是指具有一个或多个氨基的如上定义的烷基。氨基可为伯氨基、仲氨基或叔氨基。可用于本发明的烷基氨基包括但不限于乙基胺、丙基胺、异丙基胺、乙二胺和乙醇胺。氨基可将烷基氨基连接至连接点，其中化合物的其余部分在烷基的任意位置，或者将烷基的至少两个碳原子连接在一起。烷基氨基可任选地被选自卤素、羟基、巯基、烷基氨基、烷氧基、卤代烷基、羧基、酰氨基、硝基、氧代基、硫代基、和氰基的一个或多个部分取代。本领域技术人员应理解，在本发明中其它烷基氨基是有用的。

“烷硫基”是指具有一个或多个巯基的如上定义的烷基。可用于本发明的烷硫基包括但不限于乙基巯基、丙基巯基、和异丙基巯基。巯基可将烷硫基连接至连接点，其中化合物的其余部分在烷基的任意位置，或者可将烷基的至少两个碳原子连接在一起。烷硫基可任选地被选自卤素、羟基、氨基、烷基氨基、烷氧基、卤代烷基、羧基、酰氨基、硝基、氧代基、硫代基、和氰基的一个或多个部分取代。本领域技术人员应理解，在本发明中其它烷硫基是有用的。

术语“氧乙基”是指具有式–OCH₂CH₂-的二价基团。

术语“波浪线”表示取代基与分子的其余部分的连接点。当波浪线没有被描述为具体地附加至特定的环原子时，连接点可以是取代基的任意合适的原子。例如，以下结构中的波浪线：

旨在包括任意可取代的原子作为连接点。

术语“再生医学”是指处理使人体细胞、组织、或器官替换、改变、或再生的过程以恢复或建立正常功能的医学分支。在一些实施方案中，再生医学包括在实验室中生长组织和器官，并且在当身体不能自我治愈时将其安全地移植。

术语“过冷”是指将物质冷却至低于相变温度而无转变发生的过程。例如，过冷可以指降低液体的温度低于其凝固点而不发生凝固或结晶化的过程。

术语“生物工程化的组织”是指以再生医学为目的而产生的一种或多种合成产生的细胞、组织、或器官。在一些实施方案中，生物工程化的组织是指在实验室中开发的细胞、组织、或器官。在一些实施方案中，生物工程化的组织是指实验室衍生的心脏、肝脏、肺、肾、胰腺、肠、胸腺、角膜、干细胞(例如，人多能干细胞、造血干细胞)、淋巴细胞、粒细胞、免疫系统细胞、骨细胞、类器官、胚胎细胞、卵母细胞、精细胞、血小板、神经细胞、或其组合。

术语“冷冻保护液”是指用于减少或防止由冰晶形成引起的冷冻损伤的溶液。在一些实施方案中，冷冻保护液包括一种或多种本文所述的类肽聚合物。在其它实施方案中，冷冻保护液包括一种或多种本文所述的类肽聚合物，以及一种或多种本文所述的类肽-肽杂合物。在一些实施方案中，冷冻保护液保护生物样品免受冷冻损伤。在一些实施方案中，冷冻保护液保护非生物样品免受冰晶形成。在一些实施方案中，与生物样品未暴露于降低的温度的情况相比，冷冻保护液保存生物样品的时间更长。

术语“使玻璃化(vitrify)”和“玻璃化(vitrification)”是指将物质转化为玻璃态(即，非结晶无定形固体)。在水的情况下，与导致冰晶形成的普通的冷冻相反，玻璃化是指将水转变成玻璃态而不形成冰晶。通常通过非常快速的冷却和/或引入抑制冰晶形成的试剂来实现玻璃化。另一方面，“使去玻璃化(devitrify)”和“去玻璃化(devitrification)”是指在之前无晶体(无定形)的玻璃态中的结晶过程。在冰水的情况下，去玻璃化可意味着随着先前的非结晶无定形固体经历熔化而形成冰晶。

术语“类肽聚合物”或“类肽”是指约2和1,000个之间(例如，在约2和1,000、2和950、2和900、2和850、2和800、2和750、2和700、2和650、2和600、2和550、2和500、2和450、2和400、2和350、2和300、2和250、2和200、2和150、2和100、2和90、2和80、2和70、2和60、2和50、2和40、2和30、2和20、2和10、2和9、2和8、2和7、2和6、2和5、2和4、或2和3个之间)的酰胺氮原子上含有取代基“R¹”的类肽单体的聚酰胺。可选地，第二个独立选择的取代基“R²”可连接至羰基的α-的碳原子(即，连接至α-碳原子)。R²可为但不限于H。在特定实例中，类肽是肽的合成类似物，其中将连接至α-碳原子的侧链改为连接至酰胺氮原子。通常，可通过自动化固相有机合成来制备具有受控的单体序列和长度的、作为合成聚合物的类肽以包括具有不同化学功能的各种侧链。键合至类肽单体中的酰胺氮原子的R¹基团可包括但不限于H、任选取代的C_1-18烷基、任选取代的C_2-18烯基、任选取代的C_2-18炔基、任选取代的C_1-18羟基烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的C_1-18烷基氨基、任选取代的C_1-18烷硫基、任选取代的羧基烷基、C_3-10环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、(C_3-10环烷基)烷基、(杂环烷基)烷基、芳烷基、和杂芳烷基基团，其中任何环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基可任选且独立地被一个或多个R³基团取代。各R³基团可独立地选自卤素、氧代基、硫代基、-OH、-SH、磺胺基、氨基、C_1-8烷基、C_1-8羟基烷基、C_1-8烷基氨基、或C_1-8烷硫基基团。此外，R¹基团可包括任意以下氨基酸的侧链：丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、或酪氨酸(Tyr)。术语包括游离胺形式以及盐形式。

术语“极性类肽单体”和“具有极性侧链的类肽单体”可交换使用以指其中取代基“R¹”为极性侧链、或者R¹和取代基“R²”两者为极性侧链的类肽单体。通常，极性侧链将包括可参与氢键结合的羟基和/或原子(例如，硫、氮、氧)。在一些实例中，极性侧链包括在本质上相对于极性更疏水性的原子或基团(例如，芳族环)。在这些实例中，侧链还包括使得整个侧链相对于疏水性更极性的原子或基团。作为非限定性实例，极性侧链可包含其中连接有一个或多个羟基的芳族环。

在一些实施方案中，类肽聚合物包括选自由Nop、Nhp、Nhe、Ndp、Nyp、Nep、Ndh、及其组合组成的组的一个或多个极性类肽单体。

术语“疏水性类肽单体”和“具有疏水性侧链的类肽单体”可交换使用以指其中取代基“R¹”为疏水性侧链(例如，非极性)、或者R¹和取代基“R²”两者为疏水性侧链的类肽单体。通常，疏水性侧链包括未取代的烷基、未取代的环烷基、或未取代的芳族基团。

在一些实施方案中，类肽聚合物包括选自由Nsb、Nib、Nbu、Npr、Nip、Nme、及其组合组成的组的一个或多个疏水性类肽单体。

术语“类肽-肽杂合物”是指包含类肽单体单元和α氨基酸(即，肽单元)两者的寡聚体。术语包括游离胺形式以及盐形式。

术语“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本文中可交换使用以指氨基酸残基的聚合物，或者氨基酸残基的多种聚合物的集合。

术语“氨基酸”包括但不限于天然存在的α-氨基酸及其立体异构体。氨基酸的“立体异构体”是指氨基酸的镜像异构体，例如L-氨基酸或D-氨基酸。例如，天然存在的氨基酸的立体异构体是指天然存在的氨基酸的镜像异构体(即，D-氨基酸)。

天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及后来修饰的那些氨基酸(例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、和O-磷酸丝氨酸)。天然存在的α-氨基酸包括但不限于丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、及其组合。天然存在的α-氨基酸的立体异构体包括但不限于D-丙氨酸(D-Ala)、D-半胱氨酸(D-Cys)、D-天冬氨酸(D-Asp)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-组氨酸(D-His)、D-异亮氨酸(D-Ile)、D-精氨酸(D-Arg)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-甲硫氨酸(D-Met)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-谷氨酰胺(D-Gln)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-苏氨酸(D-Thr)、D-缬氨酸(D-Val)、D-色氨酸(D-Trp)、D-酪氨酸(D-Tyr)、及其组合。

氨基酸在本文中可以通过其公认的三字母符号或者通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来提及。例如，本文中L-氨基酸可以通过其公认的三字母符号(例如，Arg表示L-精氨酸)或者通过大写的单字母氨基酸符号(例如，R表示L-精氨酸)来表示。本文中D-氨基酸可以通过其公认的三字母符号(例如，D-Arg表示D-精氨酸)或者通过小写的单字母氨基酸符号(例如，r表示D-精氨酸)来表示。

III.实施方案的详细描述

本文提供了用于冷冻保存例如存在于组织或器官中的细胞等的细胞群的方法。在一些方面，所述方法包括将细胞群与含有一个或多个极性类肽单体的类肽聚合物接触，并且将细胞群冷却至0℃至约-20℃的温度所需的时间段，例如，至少约3小时。本发明的过冷方法有利地提供了适用于移植的组织和器官的优异的解冻后细胞存活和恢复。

A.类肽聚合物

在一些方法，本文提供了式(I)的类肽聚合物、其互变异构体或其立体异构体：

其中：

各R¹独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-18烷基、任选取代的C_2-18烯基、任选取代的C_2-18炔基、任选取代的C_1-18羟基烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的C_1-18烷基氨基、任选取代的C_1-18烷硫基、任选取代的羧基烷基、C_3-10环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、(C_3-10环烷基)烷基、(杂环烷基)烷基、芳烷基、和杂芳烷基，

其中R¹的至少一个实例为任选取代的C_1-18羟基烷基，并且

其中任何环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基被一个或多个R³基团任选且独立地取代；

各R²独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-18烷基、任选取代的C_2-18烯基、任选取代的C_2-18炔基、任选取代的C_1-18羟基烷基、任选取代的C_1-18烷基氨基、任选取代的C_1-18烷硫基、和任选取代的羧基烷基；

各R³独立地选自由卤素、氧代基、硫代基、-OH、-SH、氨基、C_1-8烷基、C_1-8羟基烷基、C_1-8烷基氨基和C_1-8烷硫基组成的组；

X和Y独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-8烷基、任选取代的C_1-8酰基、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、-NH₂、乙酰基、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、和卤素，或者

可选地，X和Y一起形成共价键；和

表示聚合物中的单体的数量的下标n在2和50之间。

在一些实施方案中，当n在3和7之间时，R¹的全部实例皆不为羟乙基。在一些实施方案中，所述类肽聚合物中的R¹的各个实例选自由以下组成的组：

其中：m在1和8之间；并且R³选自由H、C_1-8烷基、羟基、巯基、硝基、胺、氧代基和硫代基组成的组。在一些实施方案中，重复单元m可在1和2、1和3、1和4、1和5、1和6、或1和7之间。在一些实施方案中，重复单元m、为1、2、3、4、5、6、7、或8。

在一些实施方案中，一个或多个R¹单体具有根据R^1a所示的结构：

在一些实施方案中，各R^1a基团独立地选自在一些实施方案中，选择两种立体异构体的混合物。在一些实施方案中，仅选择单体的R立体异构体。在一些实施方案中，仅选择该单体的S立体异构体。

在一些实施方案中，一个或多个R¹单体具有根据R^1b所示的结构：

在一些实施方案中，各R^1b基团独立地选自在一些实施方案中，选择两种立体异构体的混合物。在一些实施方案中，仅选择单体的R立体异构体。在一些实施方案中，仅选择该单体的S立体异构体。

在一些实施方案中，一个或多个R¹单体具有根据R^1c所示的结构：

在一些实施方案中，各R^1c基团独立地选自在一些实施方案中，选择两种立体异构体的混合物。在一些实施方案中，仅选择单体的R立体异构体。在一些实施方案中，仅选择该单体的S立体异构体。

在一些实施方案中，一个或多个R¹单体具有根据R^1d所示的结构：

在一些实施方案中，各R^1d基团独立地选自在一些实施方案中，仅选择单体的R立体异构体。在一些实施方案中，仅选择该单体的S立体异构体。

在一些实施方案中，一个或多个R¹单体具有根据R^1e所示的结构：

在一些实施方案中，各R^1e基团独立地选自在一些实施方案中，选择两种立体异构体的混合物。在一些实施方案中，仅选择单体的R立体异构体。在一些实施方案中，仅选择该单体的S立体异构体。

每当本文中任意类肽单体不表示立体化学时，可使用任意立体异构体。在一些实施方案中，选择两种立体异构体的混合物。在包括立体异构体的混合物的实施方案中，类肽聚合物中的单体的R与S立体异构体的比例范围可为约95:5至约90:10、约90:10至约85:15、约85:15至约80:20、约80:20至约75:25、约75:25至约70:30、约70:30至约65:35、约65:35至约60:40、约60:40至约55:45、约55:45至约50:50、约50:50至约45:55、约45:55至约40:60、约40:60至约35:65、约35:65至约30:70、约30:70至约25:75、约25:75至约20:80、约20:80至约15:85、约15:85至约10:90、或约10:90至约5:95。在一些实施方案中，仅选择单体的R立体异构体。在一些实施方案中，仅选择单体的S立体异构体。

每当用楔形或虚线示出特定的立体化学时，单体基本上不含其它立体异构体。在一些实施方案中，基本上不含是指至少70％纯。在一些实施方案中，基本上不含是指至少80％纯。在一些实施方案中，基本上不含是指至少90％纯。在一些实施方案中，基本上不含是指至少95％纯。在一些实施方案中，基本上不含是指至少99％纯。在一些实施方案中，基本上不含是指至少99.9％纯。

在一些实施方案中，类肽聚合物中的R¹的各个实例选自由以下组成的组：

在一些实施方案中，类肽聚合物中的R¹的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多的实例为独立选择的C_1-18羟基烷基(例如，独立选择的C_1-6羟基烷基)。在一些实施方案中，类肽聚合物中的R¹的各个实例为C_1-18羟基烷基。在一些实例中，R¹的各个实例为C_1-6羟基烷基。在一些实施方案中，R¹的各个实例为相同的C_1-6羟基烷基。在一些实施方案中，R¹的各个实例为羟基烷基，其中各个羟基烷基中的烷基的长度选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、或18个或更多的碳原子。在一些实施方案中，羟基烷基含有1、2、3、4、5、6、7、或8个羟基取代。在一些实施方案中，R¹的各个实例为：

在一些实施方案中，R²的各个实例为H。在一些实施方案中，至少一个R²为卤素。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在3和25之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在5和25之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在6和50之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在6和25之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在6和20之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在8和50之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在8和25之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在8和20之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n可在约10至约28、约12至约26、约14至约24、约16至约22、或约18至约20之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n可在约8至约50、约8至约45、约8至约40、约8至约35、约8至约30、约10至约25、约10至约20、或约10至约15之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n可为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13,14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50。

在一些实施方案中，X和Y为H、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、乙酰基、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、或卤素。在一些实施方案中，X为乙酰基。在一些实施方案中，Y为羧基。

在一些实施方案中，类肽聚合物的X和Y一起形成共价键。X和Y之间的共价键的形成导致类肽聚合物的环化形式，其中末端NR¹基团和末端C＝O基团如下图所示连接。

在一些实施方案中，类肽聚合物由选自表1中记载的单体的组的单体单元组成。本领域技术人员将理解，本发明的边界不限于表1中列出的单体，并且任意有用的N-取代的取代基可用作N-取代的类肽单体。在一些实施方案中，N-取代的类肽单体上的N-取代的取代基可以是任何氨基酸丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、或酪氨酸(Tyr)的侧链。

在一些实施方案中，类肽聚合物选自由表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、或表10中记载的类肽聚合物的组。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n为10，并且所述类肽聚合物包括：10个Nsb单体、1个Nhp单体和9个Nsb单体、2个Nhp单体和8个Nsb单体、3个Nhp单体和7个Nsb单体、4个Nhp单体和6个Nsb单体、5个Nhp单体和5个Nsb单体、6个Nhp单体和4个Nsb单体、7个Nhp单体和3个Nsb单体、8个Nhp单体和2个Nsb单体、9个Nhp单体和1个Nsb单体、或10个Nhp单体。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物具有序列Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp(SEQ ID NO:2)，其中X为H或C_1-8酰基且Y为-OH或-NH₂或C_1-8烷基。在一些实施方案中，所述类肽聚合物具有序列Nsb-Nsb-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nsb(SEQ IDNO:1)，其中X为H或C_1-8酰基且Y为-OH或-NH₂或C_1-8烷基。在一些实施方案中，所述类肽聚合物具有序列Nsb-Nhp-Nhp-Nhp-Nsb-Nhp-Nhp-Nhp-Nsb-Nhp(SEQ ID NO:7)，其中X为H或C_1-8酰基且Y为-OH或-NH₂或C_1-8烷基。在一些实施方案中，所述类肽聚合物具有序列Nsb-Nsb-Nhp-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nhp-Nsb-Nsb(SEQ ID NO:8)，其中X为H或C_1-8酰基且Y为-OH或-NH₂或C_1-8烷基。在一些实施方案中，所述类肽聚合物具有序列Nsb-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nsb-Nhp-Nhp-Nhp(SEQ ID NO:9)，其中X为H或C_1-8酰基且Y为-OH或-NH₂或C_1-8烷基。在一些实施方案中，Y为仲胺或叔胺。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n为10，并且所述类肽聚合物包括：10个Nme单体、1个Nhp单体和9个Nme单体、2个Nhp单体和8个Nme单体、3个Nhp单体和7个Nme单体、4个Nhp单体和6个Nme单体、5个Nhp单体和5个Nme单体、6个Nhp单体和4个Nme单体、7个Nhp单体和3个Nme单体、和8个Nhp单体和2个Nme单体、或9个Nhp单体和1个Nme单体。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n为10，并且所述类肽聚合物包括：1个Nhe单体和9个Nsb单体、2个Nhe单体和8个Nsb单体、3个Nhe单体和7个Nsb单体、4个Nhe单体和6个Nsb单体、5个Nhe单体和5个Nsb单体、6个Nhe单体和4个Nsb单体、7个Nhe单体和3个Nsb单体、8个Nhe单体和2个Nsb单体、9个Nhe单体和1个Nsb单体、或10个Nhe单体。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n为10，并且所述类肽聚合物包括：10个Nbu单体、1个Nhp单体和9个Nbu单体、2个Nhp单体和8个Nbu单体、3个Nhp单体和7个Nbu单体、4个Nhp单体和6个Nbu单体、5个Nhp单体和5个Nbu单体、6个Nhp单体和4个Nbu单体、7个Nhp单体和3个Nbu单体、8个Nhp单体和2个Nbu单体、或9个Nhp单体和1个Nbu单体。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n为10，并且所述类肽聚合物包括：10个Nib单体、1个Nhp单体和9个Nib单体、2个Nhp单体和8个Nib单体、3个Nhp单体和7个Nib单体、4个Nhp单体和6个Nib单体、5个Nhp单体和5个Nib单体、6个Nhp单体和4个Nib单体、7个Nhp单体和3个Nib单体、8个Nhp单体和2个Nib单体、或9个Nhp单体和1个Nib单体。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n为10，并且所述类肽聚合物包括：10个Npr单体、1个Nhp单体和9个Npr单体、2个Nhp单体和8个Npr单体、3个Nhp单体和7个Npr单体、4个Nhp单体和6个Npr单体、5个Nhp单体和5个Npr单体、6个Nhp单体和4个Npr单体、7个Nhp单体和3个Npr单体、8个Nhp单体和2个Npr单体、或9个Nhp单体和1个Npr单体。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n为10，并且所述类肽聚合物包括：10个Nip单体、1个Nhp单体和9个Nip单体、2个Nhp单体和8个Nip单体、3个Nhp单体和7个Nip单体、4个Nhp单体和6个Nip单体、5个Nhp单体和5个Nip单体、6个Nhp单体和4个Nip单体、7个Nhp单体和3个Nip单体、8个Nhp单体和2个Nip单体、或9个Nhp单体和1个Nip单体。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n为14，并且所述类肽聚合物包括：6个Nhp单体和8个Nsb单体、7个Nhp单体和7个Nsb单体、8个Nhp单体和6个Nsb单体、10个Nhp单体和4个Nsb单体、或14个Nhp单体。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n为14，并且所述类肽聚合物包括：6个Nhp单体和8个Nib单体、7个Nhp单体和7个Nib单体、8个Nhp单体和6个Nib单体、10个Nhp单体和4个Nib单体、或14个Nhp单体。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n为16，并且所述类肽聚合物包括：5个Nhp单体和11个Nsb单体、7个Nhp单体和9个Nsb单体、8个Nhp单体和8个Nsb单体、10个Nhp单体和6个Nsb单体、12个Nhp单体和4个Nsb单体、或16个Nhp单体。

在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n为22，并且所述类肽聚合物包括：7个Nhp单体和15个Nsb单体、10个Nhp单体和12个Nsb单体、11个Nhp单体和11个Nsb单体、14个Nhp单体和8个Nsb单体、17个Nhp单体和5个Nsb单体、或22个Nhp单体。

在其他方面，本文提供了包括亚单元的类肽聚合物，所述亚单元包括一个或多个第一疏水性类肽单体H和一个或多个第一极性类肽单体P，其排列使得类肽聚合物具有序列[H_aP_b]_n或[P_bH_a]_n，其中下标a表示亚单元中连续的第一疏水性类肽单体的数量，下标b表示亚单元中连续的第一极性类肽单体的数量，且下标n表示类肽聚合物中亚单元的数量。在一些实施方案中，a在1和10之间(例如，a为1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10)。在其它实施方案中，b在1和10之间(例如，b为1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10)。在一些实例中，a在1和5之间。在其它实例中，b在1和5之间。在特定实例中，a在1和3之间且b在1和3之间。

在一些实施方案中，n在2和50之间(例如，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50)。在一些情况下，n在2和10之间(例如，n为2、3、4、5、6、7、8、9、或10)。在一些实施方案中，n在3和25之间。在一些实施方案中，n在5和25之间。在一些实施方案中，n在8和50之间。在一些实施方案中，n在8和25之间。在一些实施方案中，n在8和20之间。在一些实施方案中，n可以在约10至约28、约12至约26、约14至约24、约16至约22、或约18至约20之间。在一些实施方案中，n可以在约8至约50、约8至约45、约8至约40、约8至约35、约8至约30、约10至约25、约10至约20、或约10至约15之间。

在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度可在6和50之间。在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度可在10和50之间。在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度可在16和100之间。在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度可在16和50之间。在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度可在16和40之间。在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度可在约20至约56、约24至约52、约28至约48、约32至约44、或约36至约40之间。在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度可在约16至约100、约16至约90、约16至约80、约16至约70、约16至约60、约20至约50、约20至约40、或约20至约30之间。在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度可为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13,14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100以上。

当类肽聚合物中存在超过一个疏水性类肽单体时，所有的疏水性类肽单体可以为相同的，他们可以全部不同，或者为其组合。类似地，当类肽聚合物中存在超过一个极性类肽单体时，所有的极性类肽单体可以为相同的，他们可以全部不同，或者为其组合。

在一些实施方案中，亚单元进一步包括第二疏水性类肽单体和/或第二极性类肽单体，使得类肽聚合物具有序列[H_aP_bH_cP_d]_n或[P_bH_aP_dH_c]_n，其中下标c表示亚单元中连续的第二疏水性类肽单体的数量，和下标d表示亚单元中连续的第二极性类肽单体的数量。在一些实施方案中，c在0和10之间(例如，c为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10)。在其它实施方案中，d在0和10之间(例如，d为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10)。在特定的实施方案中，c和d不都为0。在一些实例中，c在0和5之间。在其它实例中，d在0和5之间。

作为非限定性实例，本发明的类肽聚合物的亚单元可包括序列HP、PH、HHPP、PPHH、HPHP、PHPH、HPPH、PHHP、HHP、PHH、HPP、PPH、HPPP、PPPH、HHPPHH、PPHHPP、HHHPPP、PPPHHH、HHHP、PHHH、HHHPPPHHH、或PPPHHHPPP。当a为1且b为1时，亚单元可包括序列HP或PH。当a为2且b为2时，亚单元可包括序列HHPP或PPHH。当a为1且b为2时，亚单元可包括序列HPP或PPH。当a为2且b为1时，亚单元可包括序列HHP或PHH。当a为1且b为3时，亚单元可包括序列HPPP或PPPH。当a为3且b为1时，亚单元可包括序列HHHP或PHHH。当a为3且b为3时，亚单元可包括序列HHHPPP或PPPHHH。

作为进一步的非限定性实例，当a、b、c、和d为1时，亚单元可包括序列HPHP或PHPH，尽管这些序列也可分别由式[H₁P₁]₂和[P₁H₁]₂表示，其中n为2。当a为1、b为2、c为1、和d为0时，亚单元可包括序列HPPH。当a为2、b为1、c为0、且d为1时，亚单元可包括序列PHHP(即，P₁H₂P₁H₀)。当a、b、和c为2且d为0时，亚单元可包括序列HHPPHH。当a、b、和d为2且c为0时，亚单元可包括序列PPHHPP(即，P₂H₂P₂H₀)。当a、b、和c为3且d为0时，亚单元可包括序列HHHPPPHHH。当a、b、和d为3且c为0时，亚单元可包括序列PPPHHHPPP(即，P₃H₃P₃H₀)。

在一些实施方案中，类肽聚合物进一步包括取代基X和Y使得类肽聚合物具有序列X-[H_aP_b]_n-Y、X-[P_bH_a]_n-Y、X-[H_aP_bH_cP_d]_n-Y、或X-[P_bH_aP_dH_c]_n-Y。X和Y独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-8烷基、任选取代的C_1-8酰基、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、-NH₂、乙酰基、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、和卤素。在一些实施方案中，X为乙酰基。在一些实施方案中，Y为羧基。可选地，X和Y一起形成共价键。X和Y之间的共价键的形成导致类肽聚合物的环化形式。

在一些实施方案中，X和Y为H、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、乙酰基、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、或卤素。在其它实施方案中，X或Y为仲胺或叔胺。

在一些实施方案中，类肽聚合物进一步包括序列Z，所述序列Z包括一个或多个疏水性类肽单体和/或一个或多个极性类肽单体。Z可位于第一个亚单元之前、最后一个亚单元之后、和/或一个或多个亚单元之间。在一些实例中，Z包括一个或多个疏水性类肽单体。在其它实例中，Z包括一个或多个极性类肽单体。在特定实例中，Z包括一个或多个疏水性类肽单体和一个或多个极性类肽单体。Z可包括多个连续的疏水性类肽单体，接着多个连续的极性类肽单体，或反之亦然。可选地，Z可包括多个连续的疏水性类肽单体，接着多个连续的极性类肽单体，接着另外的疏水性类肽单体，等等。当序列Z中存在超过一个疏水性类肽单体时，所有的疏水性类肽单体可以为相同的类型，它们可以彼此不同，或者为其组合。类似地，当序列Z中存在超过一个极性类肽单体时，所有的极性类肽单体可以为相同的类型，他们可以彼此不同，或者为其组合。在一些实施方案中，类肽聚合物包括超过一个序列Z(例如，2、3、4、5、或更多)的实例。在此类情况下，Z的全部实例可以相同，它们可以彼此不同，或者为其组合。在特定实施方案中，序列Z包括1、2、3、4、或更多个疏水性类肽单体。在又其它实施方案中，序列Z包括1、2、3、4、或更多个极性类肽单体。

在其他方面，本文提供类肽聚合物，其包括：(a)包括两个第一疏水性类肽单体H和两个第一极性类肽单体P的亚单元，和(b)位于类肽聚合物的C-末端的两个第二疏水性类肽单体，其排列使得类肽聚合物具有序列[H₂P₂]_nH₂或[P₂H₂]_nH₂，其中表示类肽聚合物中的亚单元的数量的下标n在1和50之间。

在仍其他方面，本文提供类肽聚合物，其包括：(a)包括两个第一疏水性类肽单体H和两个第一极性类肽单体P的亚单元，和(b)位于类肽聚合物的C-末端的两个第二极性类肽单体，其排列使得类肽聚合物具有序列[H₂P₂]_nP₂或[P₂H₂]_nP₂，其中表示类肽聚合物中的亚单元的数量的下标n在1和50之间。。

在不同实施方案中，所有的疏水性类肽单体可以相同，它们可以全部不同，或者为其组合。类似地，所有的极性类肽单体可以相同，它们可以全部不同，或者为其组合。

在一些实施方案中，类肽聚合物进一步包括取代基X和Y使得类肽聚合物具有序列X-[H₂P₂]_nH₂-Y、X-[P₂H₂]_nH₂-Y、X-[H₂P₂]_nP₂-Y、或X-[P₂H₂]_nP₂-Y。在一些实施方案中，X和Y独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-8烷基、任选取代的C_1-8酰基、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、-NH₂、乙酰基、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、和卤素。可选地，X和Y一起形成共价键。X和Y之间的共价键的形成导致类肽聚合物的环化形式。

在一些实施方案中，X和Y为H、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、乙酰基、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、或卤素。在其他实施方案中，X或Y为仲胺或叔胺。

在一些实施方案中，n在1和50之间(例如，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50)。在一些情况下，n在1和10之间(例如，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10)。在一些实施方案中，n在1和25之间。在一些实施方案中，n在3和25之间。在一些实施方案中，n在3和25之间。在一些实施方案中，n在5和25之间。在一些实施方案中，n在8和50之间。在一些实施方案中，n在8和25之间。在一些实施方案中，n在8和20之间。在一些实施方案中，n可为约10至约28、约12至约26、约14至约24、约16至约22、或约18至约20。在一些实施方案中，n可为约8至约50、约8至约45、约8至约40、约8至约35、约8至约30、约10至约25、约10至约20、或约10至约15。

在一些实施方案中，类肽聚合物包括化合物62、化合物63、化合物67、化合物73、化合物76、化合物86、或化合物87(即，当n为2时)。在一些实例中，类肽聚合物包括化合物76。在其它实施方案中，类肽聚合物包括化合物81(即，当n为1时)。

在一些实施方案中，类肽聚合物包括选自上表1中记载的单体的组的一个或多个疏水性类肽单体。在一些实施方案中，类肽聚合物包括选自上表1中记载的单体的组的一个或多个极性类肽单体。类肽聚合物包括选自上表1中记载的单体的组的一个或多个疏水性类肽单体以及一个或多个极性类肽单体。

在一些实施方案中，第一和/或第二疏水性类肽单体独立地选自由以下组成的组：

其中下标m为重复单元的数量并且在1和10之间(例如，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10)。在一些实施方案中，重复单元，m，可以在1和2、1和3、1和4、1和5、1和6、1和7、1和8、1和9、或1和10之间。

在一些实施方案中，类肽聚合物中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多疏水性类肽单体具有侧链(例如，R¹)，所述侧链包括独立地选择的其中烷基具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、或更多个碳原子的烷基。在特定的实施方案中，烷基具有5个碳原子。在一些实例中，5-碳烷基为戊基。在其它实例中，5-碳烷基为取代的丁基(例如，1-甲基丁基、2-甲基丁基、和3-甲基丁基等)。在又其它实例中，5-碳烷基为取代的丙基(例如，1-乙基丙基、和1,2-二甲基丙基等)。

在一些实施方案中，第一和/或第二极性类肽单体独立地选自由以下组成的组：

其中下标m为重复单元的数量且在1和10之间(即，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10)。在一些实施方案中，重复单元，m，可以在1和2、1和3、1和4、1和5、1和6、1和7、1和8、1和9、或1和10之间。

在一些实施方案中，第一和/或第二极性类肽单体具有含有羟基的侧链(例如，R¹)。在其它实施方案中，类肽聚合物中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多极性类肽单体具有含有独立地选择的C_1-18羟基烷基(例如，独立地选择的C_1-6羟基烷基)的侧链(例如，R¹)。在一些实例中，各C_1-18羟基烷基为C_1-6羟基烷基。在特定实例中，各C_1-6羟基烷基为相同的C_1-6羟基烷基。在一些实施方案中，类肽聚合物中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多极性类肽单体具有含有独立地选择的羟基烷基的侧链(例如，R¹)，其中羟基烷基中的烷基的长度选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、或更多个碳原子。在特定实施方案中，羟基烷基含有1、2、3、4、5、6、7、或8个羟基取代基。

在一些实施方案中，极性类肽单体都不包括含有任选取代的C_1-18羟基烷基的侧链(例如，R¹)。

在一些实施方案中，极性类肽单体的侧链(例如，R¹)包括(4-至10-元杂环烷基)(C_1-6亚烷基)或(5-至10-元杂芳基)(C_1-6亚烷基)。例如，亚烷基部分可以为直链亚烷基部分，例如亚甲基、亚乙基、正亚丙基(即，-CH₂CH₂CH₂-)、或正亚丁基(即，-CH₂CH₂CH₂CH₂-)。亚烷基接头也可以是支链的，如仲亚丁基(即，-CH(CH₃)CH₂CH₂-)或异亚丁基(即，-CH₂CH(CH₃)CH₂-)的情况。在一些实施方案中，亚烷基部分为亚甲基(即，-CH₂-)。在一些实施方案中，亚烷基部分为正亚丙基。在一些实施方案中，4-、5-、6-、7-、8-、9-、或10-元环的至少一个成员为O。在其它实施方案中，4-、5-、6-、7-、8-、9-、或10-元环的至少一个成员为N。

杂环烷基可以为但不限于4-至8-元环、4-至6-元环、或5-至6-元环。杂环烷基部分可以为例如氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、氮丙啶基、氮杂环辛烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、哌嗪基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、环氧己烷基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、异噻唑烷基、或吗啉基。在一些实施方案中，杂环烷基部分选自吡咯烷-1-基、吡咯烷-2-基、吡咯烷-3-基、四氢呋喃-2-基、和四氢呋喃-3-基。在一些实施方案中，杂环烷基部分为吡咯烷-1-基。在一些实施方案中，杂环烷基部分为四氢呋喃-2-基。在一些实施方案中，吡咯烷基或四氢呋喃基中的一个或多个碳环成员被氧取代。

在一些实施方案中，类肽聚合物包括和/或在一些实例中，类肽聚合物包括化合物63、化合物76、化合物86、和/或化合物87。在一些实施方案中，全部的极性类肽单体为在其它实施方案中，全部极性类肽单体为在一些实例中，类肽聚合物为化合物76、化合物86、或化合物87。

杂芳基部分可以为但不限于5-至10-元环、5-至9-元环、或5-至6-元环。杂芳基部分可以为例如吲哚基、喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、酞嗪基、噌啉基、苯并呋喃基、吡咯基、吡啶基、咪唑基、吡唑基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噻吩基、或呋喃基。在一些实施方案中，杂芳基部分选自呋喃-2-基、呋喃-3-基、噻吩-2-基、噻吩-3-基、吡咯-1-基、吡咯-2-基、和吡咯-3-基。

在一些实施方案中，侧链(例如，R¹)包括(2-氧代吡咯烷-1-基)(C_1-4亚烷基)。在一些实施方案中，侧链(例如，R¹)包括(四氢呋喃-2-基)(C_1-4亚烷基)。在一些实施方案中，侧链(例如，R¹)包括(呋喃-2-基)(C_1-4亚烷基)。

在一些实施方案中，类肽聚合物包括在特定实施方案中，极性类肽单体全部为在一些实例中，类肽聚合物为化合物73。

在一些实施方案中，极性类肽单体的侧链(例如，R¹)包括2-至20-元烷氧基。例如，侧链(例如，R¹)可以包括具有1-4个氧原子的2-12元烷氧基，或者具有1或2个氧原子的2-6元烷氧基。在一些实施方案中，侧链(例如，R¹)包括–CH₂CH₂OR′，其中R′为C_1-6烷基。在一些实施方案中，侧链(例如，R¹)包括–CH₂CH₂O(CH₂CH₂O)_nR′，其中R′为C_1-6烷基且下标n为1、2、或3。

在一些实施方案中，侧链(例如，R¹)包括(C_1-6烷氧基)(C_1-6亚烷基)。在一些实施方案中，侧链(例如，R¹)包括(低聚[乙二醇])基或(低聚[丙二醇])基。在一些实施方案中，侧链(例如，R¹)包括甲氧基乙基。在一些实施方案中，类肽聚合物包括在特定实施方案中，全部的极性类肽单体为在一些实例中，类肽聚合物为化合物62。

在一些实施方案中，低聚(乙二醇)部分为2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基部分。在一些实施方案中，类肽聚合物包括在特定实施方案中，极性类肽单体全部为在一些实例中，类肽聚合物为化合物67。

在又其他方面，本文提供类肽聚合物，其包括一个或多个疏水性类肽单体和一个或多个极性类肽单体。在一些实施方案中，极性类肽单体都不包括含有任选取代的C_1-18羟基烷基的侧链(例如，R¹)。在一些实施方案中，极性类肽单体的侧链(例如，R¹)包括(4-至10-元杂环烷基)(C_1-6亚烷基)。在其它实施方案中，极性类肽单体的侧链(例如，R¹)包括(5-至10-元杂芳基)(C_1-6亚烷基)。在一些实施方案中，极性类肽单体的侧链(例如，R¹)包括2-至20-元烷氧基。例如，侧链(例如，R¹)可以包括具有1-4个氧原子的2-12元烷氧基，或者具有1或2个氧原子的2-6元烷氧基。在一些实施方案中，侧链(例如，R¹)包括–CH₂CH₂OR′，其中R′为C_1-6烷基。在一些实施方案中，侧链(例如，R¹)包括–CH₂CH₂O(CH₂CH₂O)_nR′，其中R′为C_1-6烷基且下标n为1、2、或3。在一些实施方案中，极性类肽单体的侧链(例如，R¹)包括(C_1-6烷氧基)(C_1-6亚烷基)。在一些实施方案中，极性类肽单体的侧链(例如，R¹)包括(低聚[乙二醇])基或(低聚[丙二醇])基。

例如，亚烷基部分可以为直链亚烷基部分，例如亚甲基、亚乙基、正亚丙基(即，-CH₂CH₂CH₂-)、或正亚丁基(即，-CH₂CH₂CH₂CH₂-)。亚烷基接头也可以是支链的，如仲亚丁基(即，-CH(CH₃)CH₂CH₂-)或异亚丁基(即，-CH₂CH(CH₃)CH₂-)的情况。在一些实施方案中，亚烷基部分为亚甲基(即，-CH₂-)。在一些实施方案中，亚烷基部分为正亚丙基。在一些实施方案中，4-、5-、6-、7-、8-、9-、或10-元环的至少一个成员为O。在其它实施方案中，4-、5-、6-、7-、8-、9-、或10-元环的至少一个成员为N。

杂环烷基部分可以为但不限于4-至8-元环、4-至6-元环、或5-至6-元环。杂环烷基部分可以为例如氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、氮丙啶基、氮杂环辛烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、哌嗪基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、环氧己烷基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、异噻唑烷基、或吗啉基。在一些实施方案中，杂环烷基部分选自吡咯烷-1-基、吡咯烷-2-基、吡咯烷-3-基、四氢呋喃-2-基、和四氢呋喃-3-基。在一些实施方案中，杂环烷基部分为吡咯烷-1-基。在一些实施方案中，杂环烷基部分为四氢呋喃-2-基。在一些实施方案中，吡咯烷基或四氢呋喃基中的一个或多个碳环成员被氧取代。

在一些实施方案中，类肽聚合物包括和/或在一些实例中，类肽聚合物包括化合物63、化合物76、化合物86、和/或化合物87。在一些实施方案中，极性类肽单体全部为在其它实施方案中，极性类肽单体全部为在一些实例中，类肽聚合物为化合物76、化合物86、或化合物87。

杂芳基部分可以为但不限于5-至10-元环、5-至9-元环、或5-至6-元环。杂芳基部分可以为例如吲哚基、喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、酞嗪基、噌啉基、苯并呋喃基、吡咯基、吡啶基、咪唑基、吡唑基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噻吩基、或呋喃基。在一些实施方案中，杂芳基部分选自呋喃-2-基、呋喃-3-基、噻吩-2-基、噻吩-3-基、吡咯-1-基、吡咯-2-基、和吡咯-3-基。

在一些实施方案中，侧链(例如，R¹)包括(2-氧代吡咯烷-1-基)(C_1-4亚烷基)。在一些实施方案中，侧链(例如，R¹)包括(四氢呋喃-2-基)(C_1-4亚烷基)。在一些实施方案中，侧链(例如，R¹)包括(呋喃-2-基)(C_1-4亚烷基)。

在一些实施方案中，类肽聚合物包括在特定实施方案中，极性类肽单体全部为在一些实例中，类肽聚合物为化合物73。

在一些实施方案中，侧链(例如，R¹)包括甲氧基乙基。在一些实施方案中，类肽聚合物包括在特定实施方案中，极性类肽单体全部为在一些实例中，类肽聚合物为化合物62。

在一些实施方案中，低聚(乙二醇)部分为2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基部分。在一些实施方案中，类肽聚合物包括在特定实施方案中，极性类肽单体全部为在一些实例中，类肽聚合物为化合物67。

在一些实施方案中，一个或多个疏水性类肽单体各自独立地选自由以下组成的组： 其中下标m为重复单元的数量且在1和10之间。

在一些实施方案中，一个或多个极性类肽单体各自独立地选自由以下组成的组：

在一些实施方案中，类肽聚合物进一步包括分别位于类肽聚合物的N-末端和C-末端的取代基X和Y。在一些实施方案中，X和Y独立地选自由H、任选取代的C_1-8烷基、任选取代的C_1-8酰基、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、-NH₂、乙酰基、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、和卤素组成的组。可选地，X和Y一起形成共价键。X和Y之间的共价键的形成导致类肽聚合物的环化形式。

在一些实施方案中，X和Y为H、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、乙酰基、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、或卤素。在其它实施方案中，X或Y为仲胺或叔胺。

每当本文中任意类肽单体不表示立体化学时，可使用任意立体异构体。在一些实施方案中，选择立体异构体的混合物。上文中描述了疏水性类肽单体和极性类肽单体的的立体异构体的非限定性实例以及类肽聚合物中的类肽单体的R与S立体异构体的示例性比例。

在一些实施方案中，类肽聚合物中的类肽单体的约1％和约99％之间(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99％)为疏水性类肽单体。在其他实施方案中，类肽聚合物中的类肽单体的1％和约99％之间(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99％)为极性类肽单体。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约5％的类肽单体为疏水性的且约95％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约10％的类肽单体为疏水性的且约90％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约15％的类肽单体为疏水性的且约85％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约20％的类肽单体为疏水性的且约80％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约25％的类肽单体为疏水性的且约75％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约30％的类肽单体为疏水性的且约70％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约35％的类肽单体为疏水性的且约65％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约40％的类肽单体为疏水性的且约60％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约45％的类肽单体为疏水性的且约55％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约50％的类肽单体为疏水性的且约50％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约55％的类肽单体为疏水性的且约45％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约60％的类肽单体为疏水性的且约40％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约65％的类肽单体为疏水性的且约35％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约70％的类肽单体为疏水性的且约30％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约75％的类肽单体为疏水性的且约25％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约80％的类肽单体为疏水性的且约20％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约85％的类肽单体为疏水性的且约15％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约90％的类肽单体为疏水性的且约10％的类肽单体为极性的。

在一些实施方案中，类肽聚合物中约95％的类肽单体为疏水性的且约5％的类肽单体为极性的。

在特定实施方案中，类肽聚合物包括以质量计约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、或95％的疏水性类肽单体。在其它实施方案中，类肽聚合物包括以质量计约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、或95％的极性类肽单体。

在一些实施方案中，本文所述的类肽聚合物形成螺旋结构。在一些实施方案中，螺旋结构采用类似于聚脯氨酸螺旋的结构。在某些实例中，类肽聚合物形成聚脯氨酸I螺旋。在某些其它实例中，类肽聚合物形成聚脯氨酸II螺旋。在一些实施方案中，当类肽聚合物含有至少一个N-芳基侧链时采用螺旋结构。在一些实施方案中，N-芳基侧链是Nep单体。

在一些实施方案中，类肽聚合物在约0℃至约-20℃内减少或抑制冰晶形成。在其他实施方案中，类肽聚合物在约-10℃至约-20℃内减少或抑制冰晶形成。在特定实施方案中，类肽聚合物在约-5℃、约-10℃、约-15℃、或约-20℃下减少或抑制冰晶形成。

在一些实施方案中，类肽聚合物(例如，存在于组合物、制剂、或例如冷冻保护液等产品中)的浓度在约100nM和约1M之间。在特定实施方案中，类肽聚合物(例如，存在于组合物、制剂、或例如冷冻保护液等产品中)的浓度在约100nM和约250nM之间、在约250nM和约500nM之间、在约500nM和约750nM之间、在约750nM和约1μM之间、在约1μM和约5μM之间、在约5μM和约25μM之间、在约25μM和约50μM之间、在约50μM和约100μM之间、在约100μM和约250μM之间、在约250μM和约500μM之间、在约500μM和约750μM之间、在约750μM和约1mM之间、在约1mM和约10mM之间、在约10mM和约50mM之间、在约50mM和约100mM之间、在约100mM和约250mM之间、在约250mM和约500mM之间、在约500mM和约750mM之间、或约750mM和约1M之间。在一些实施方案中，类肽聚合物(例如，存在于组合物、制剂、或例如冷冻保护液等产品中)的浓度在约100nM和约100mM之间。在其他实施方案中，类肽聚合物(例如，存在于组合物、制剂、或例如冷冻保护液等产品中)的浓度为约100nM、约500nM、约1μM、约10μM、约100μM、约500μM、约1mM、约10mM、约100mM、约500mM、或约1M。在特定实施方案中，类肽聚合物的浓度在约1和100mM之间(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或10mM)。

B.类肽-肽杂合物

在另一方面，本发明提供类肽-肽杂合物。在一些实施方案中，类肽-肽杂合物包括本文所述的类肽聚合物和一个或多个氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸或其变体。在一些实施方案中，类肽-肽杂合物包括约1和10个之间的氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸)。在其它实施方案中，类肽-肽杂合物包括约10和100个之间的氨基酸(例如，约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100个氨基酸)。在一些实施方案中，类肽-肽杂合物包括大于约100个氨基酸。在其它实施方案中，类肽-肽杂合物包括约2和50个之间的类肽单体(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、42、44、45、46、47、48、49、或50个类肽单体)和至少约1和100个之间的氨基酸(例如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100个氨基酸)。

氨基酸可位于聚合物内的任何位置，包括N-和C-末端和/或在任何类肽单体或亚单元之间。在类肽-肽杂合物包括两个以上的氨基酸的实例中，氨基酸可以全部为连续的，或者仅它们的一部分可以是连续的。可选地，所有的氨基酸可以被一个或多个类肽单体或亚单元分开。

在一些实施方案中，氨基酸为D-氨基酸。在其他实施方案中，氨基酸为L-氨基酸。在一些其他实施方案中，类肽-肽杂合物包括D-和L-氨基酸的组合。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸选自由以下组成的组：丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸、及其组合。在一些实例中，一个或多个氨基酸选自由异亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸、及其组合组成的组。

在一些实施方案中，用一个或多个异亮氨酸氨基酸残基替换类肽聚合物中的一个或多个Nsb类肽单体来创造类肽-肽杂合物。所述一个或多个异亮氨酸氨基酸可为D-氨基酸、L-氨基酸、或其组合。在其他实施方案中，用一个或多个苏氨酸氨基酸残基替换类肽聚合物中的一个或多个Nhp类肽单体来创造类肽-肽杂合物。一个或多个苏氨酸氨基酸可为D-氨基酸、L-氨基酸、或其组合。在一些其他实施方案中，用一个或多个丙氨酸氨基酸残基替换类肽聚合物中的一个或多个Nme类肽单体来创造类肽-肽杂合物。所述一个或多个丙氨酸氨基酸可为D-氨基酸、L-氨基酸、或其组合。

在一些实施方案中，所述类肽-肽杂合物包括序列：

Nep-Nep-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Nep-Nep-Nep-Nep-Nme-Nme(SEQ ID NO:3)；

其中Xaa氨基酸残基为独立选择的氨基酸例如D-氨基酸、L-氨基酸、或其组合。作为非限定性实例，Xaa的全部实例为Arg、Ala、Val、和/或Ser氨基酸残基。

在其他实施方案中，所述类肽-肽杂合物包括序列：

Nme-Nme-Xaa-Nme-Nme-Nme-Nme-Nhp-Nhp-Nsb-Xaa-Nme-Nme-Xaa-Nme-Nme-Nme(SEQ ID NO:4)；

其中Xaa氨基酸残基为独立选择的氨基酸例如D-氨基酸、L-氨基酸、或其组合。作为非限定性实例，Xaa的全部实例为Arg、Ala、Val、和/或Ile氨基酸残基。

在其他实施方案中，所述类肽-肽杂合物包括序列：

Nme-Nme-Xaa-Nme-Nme-Nme-Nme-Nme-Nme-Nme-Xaa-Xaa(SEQ ID NO:5)；

其中Xaa氨基酸残基为独立选择的氨基酸如D-氨基酸、L-氨基酸、或其组合。作为非限定性实例，Xaa的全部实例为Arg、Ala、Val、和/或Leu氨基酸残基。

在一些实施方案中，所述类肽-肽杂合物包括序列：

Arg-Nsb-Nsb-Nhp-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nhp-Nsb-Nsb(SEQ ID NO:6)；

其中Arg氨基酸残基为D-氨基酸或L-氨基酸。在一些实施方案中，类肽-肽杂合物包括表11中记载的结构。

C.合成方法

在另一方面，本发明提供类肽聚合物或者类肽-肽杂合物的合成方法。本发明的类肽聚合物和类肽-肽杂合物可以使用本文所述的一般方法和过程从易得的原料制备。应理解的是，除非另有说明，否则在给出典型或优选的工艺条件(即，反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)的情况下，也可以使用其它工艺条件。最佳反应条件可以随所用的特定反应物或溶剂而变化，但此类条件可以由本领域技术人员通过常规优化过程来确定。

本发明的类肽聚合物和类肽-肽杂合物可以由有机合成领域的技术人员从已知的或商购可得的原料和试剂来制备。溶剂和试剂购自商业渠道并且无需进一步纯化而使用。

在一些实施方案中，亚单体方法(图1)用于类肽的合成，其中各N-取代的甘氨酸单体由两种容易获得的“亚单体”组装而成。类似于肽合成，低聚类肽的合成基于标准固相方法的鲁棒化学。单体添加的各循环由酰化步骤和亲核取代步骤两个步骤组成。在一些实施方案中，固相组装不需要N-保护的单体，因为不存在需要保护的反应性侧链官能团。本领域技术人员将认识到存在许多固相合成方法，包括自动化机器人合成仪。在一些实施方案中，所使用的合成仪是由Protein Technologies,Inc.制造的X Multiplex多肽合成仪。在一些实施方案中，所使用的合成仪是由Protein Technologies,Inc.制造的Overture多肽合成仪。在其它实施方案中，使用本领域已知的传统有机化学方法人工地合成类肽。通过在合成期间在适当的时间提供合适的氨基酸代替类肽单体，可以将相同的技术或与上述类似的技术应用于类肽-肽寡聚体的合成。

作为非限制性实例，可以在100mg Rink酰胺树脂(NovaBiochem；0.49mmol/g)上合成类肽聚合物。Rink酰胺树脂(100mg)可以在1.5mL的DCM中洗涤两次，随后在1.5mL的DMF中溶胀。溶胀步骤可以进行两次。通过添加20％哌啶/DMF可以将Fmoc保护基团从树脂中除去。将混合物搅拌10分钟，排干，并且重复哌啶处理，随后用DMF(1.5mL，5次)充分洗涤。可以通过将37mg溴乙酸(0.27mmol；Sigma-Aldrich)和189μL DIEA(1.08mmol；Chem ImpexInternational)在2mL DCM中在摇床平台上在室温下反应30分钟，随后用DCM(2mL，5次)和DMF(2mL，5次)充分洗涤来人工地添加第一单体。溴代酰化树脂可以与2mL的1M胺亚单体在DMF中在摇床平台上在室温下温育30分钟，然后用DMF(2mL，5次)充分洗涤。在溴乙酸的初始人工装载之后，第一亚单体取代步骤和所有随后的溴乙酰化和胺取代步骤可通过机器人合成仪来进行，直至获得期望的寡聚体长度。自动的溴乙酰化步骤可以通过添加1660μL在DMF中的1.2M溴乙酸和400μL的DIC(Chem Impex International)来进行。将混合物搅拌20分钟，排干，并且用DMF(2mL，3次)洗涤。接着，可以添加2mL在DMF中的亚单体(2mmol)的1M溶液以通过溴化物的亲核取代引入侧链。可将混合物搅拌20分钟，排干，用DMF(2mL，3次)洗涤且用DCM(2mL，3次)洗涤。类肽-树脂可以在室温下在2mL DCM中的20％HFIP(Alfa Aesar)(v/v)中裂解。裂解可以在恒定搅拌下在玻璃管中进行30分钟。HFIP/DCM可以在氮气流下蒸发。可以将终产物溶解于5mL HPLC级H₂O中的50％ACN中，并且用0.5pm不锈钢烧结的注射器尖端过滤器(Upchurch Scientific)过滤。可以使用Beckman Coulter System Gold仪器在室温下在C₁₈反相分析HPLC柱(Peeke Scientific，5pm，2.0×50mm)上分析类肽寡聚体。可以使用经20分钟5-95％乙腈/水(0.1％TFA，Acros Organics)的线性梯度，其中流速为0.7mL/min。为了除去样品溶液中的任意痕量HFIP，可以将溶解于50％ACN/H₂O中的线性前体冷冻干燥过夜。

可以通过电喷雾电离(ESI)质谱来分析类肽聚合物和类肽-肽杂合物。通常，在具有1％例如三氟乙酸等有机酸的50％去离子水/50％HPLC级ACN中制备0.5-2mL的1-5μM待分析的类肽聚合物或类肽-肽杂合物。通过用电子轰击使制备的样品离子化，从而使分子分裂成带电的碎片。然后通过使碎片加速并且将它们暴露于电场或磁场，根据离子的质荷比来将其分离。通过例如电子倍增器等能够检测带电颗粒的机构来检测离子。通过将质量与鉴定的质量相关联或者通过特征性碎片模式来鉴定类肽和类肽-肽杂合物。

D.使用方法

在一些方面，本发明提供冷冻保护液。在一些实施方案中，冷冻保护液包含本文所述的类肽聚合物、本文所述的类肽-肽杂合物、或者其组合。在其它实施方案中，冷冻保护液进一步包含选自由以下组成的组的化合物：离子性物质、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂、抗氧化剂、细胞膜稳定化合物、水通道蛋白或其它通道形成化合物、醇、糖、糖衍生物、非离子表面活性剂、蛋白质、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、透明质酸、甲酰胺、天然或合成水凝胶、及其组合。在特定实施方案中，渗透性冷冻保护剂渗透细胞膜并降低细胞内水的浓度，从而减少在任意温度下形成的冰的量。在其它特定实施方案中，非渗透性冷冻保护剂通过诱导的离子相互作用诱导胶体渗透压的变化并且改变细胞膜与细胞外水的缔合。

在一些实例中，冷冻保护液进一步包括选自由以下组成的组的醇：丙二醇、乙二醇、甘油、甲醇、丁二醇、阿东糖醇、乙醇、三亚甲基醇、二甘醇、聚环氧乙烷、赤藓糖醇、山梨醇、木糖醇、聚丙二醇、2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)、甘露醇、肌醇、二硫糖醇、1,2-丙二醇、及其组合。

在其它实例中，冷冻保护液进一步包括选自由单糖、二糖、多糖、及其组合组成的组的糖。在特定实例中，糖选自由葡萄糖、3-O-甲基-D-吡喃葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、果糖、木糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、棉子糖、葡聚糖、及其组合组成的组。

在其他实例中，冷冻保护液进一步包括PEG、PPG、或多种不同的PEG或PPG化合物。在一些其他情况下，至少一种PEG或PPG化合物具有小于约3,000g/mol(例如，小于约3,000、2,500、2,000、1,500、1,000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、或100g/mol)的平均分子量。在特定实例中，至少一种PEG或PPG化合物具有约200和400g/mol之间(例如，约200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、或400g/mol)的平均分子量。在一些情况下，冷冻保护液包括PEG或选自由PEG 200、PEG 300、PEG 400、及其组合组成的组的多种PEG化合物。

在其它实例中，冷冻保护液进一步包括选自由卵清蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、明胶、及其组合组成的组的蛋白质。在仍其它实例中，冷冻保护液进一步包括天然或合成水凝胶，其中天然或合成水凝胶包括壳聚糖、透明质酸、或其组合。

可以使用包括但不限于如下的模式细胞或组织来评估冷冻保护液的各种性质的非限定性实例，例如有效浓度、粘度、水溶性、和/或膜渗透性，所述模式细胞或组织包括但不限于生殖泌尿细胞(例如，阴茎海绵体细胞(例如，阴茎海绵体平滑肌细胞和/或阴茎海绵体上皮细胞)、干细胞、肝组织或干细胞、肾、肠、心脏、胰腺、骨髓、类器官和用于冷冻保存的其他生物组织。

在一些实施方案中，冷冻保护液在约0℃至约-20℃内的温度下抑制或减少冰晶形成。在其他实施方案中，所述冷冻保护液在约-10℃至约-20℃的温度下减少或抑制冰晶形成。在特定实施方案中，所述冷冻保护液在约-20℃下减少或抑制冰晶形成。在特定其他实施方案中，所述冷冻保护液在约-5℃、约-10℃、约-15℃、或约-20℃下减少或抑制冰晶形成。

在一些实施方案中，冷冻保护液中的类肽聚合物和/或类肽-肽杂合物的浓度在约100nM和约1M之间。在一些实施方案中，冷冻保护液中的类肽聚合物和/或类肽-肽杂合物的浓度在约100nM和约250nM之间、在约250nM和约500nM之间、在约500nM和约750nM之间、在约750nM和约1μM之间、在约1μM和约5μM之间、在约5μM和约25μM之间、在约25μM和约50μM之间、在约50μM和约100μM之间、在约100μM和约250μM之间、在约250μM和约500μM之间、在约500μM和约750μM之间、在约750μM和约1mM之间、在约1mM和约10mM之间、在约10mM和约50mM之间、在约50mM和约100mM之间、在约100mM和约250mM之间、在约250mM和约500mM之间、在约500mM和约750mM之间、或在约750mM和约1M之间。在一些实施方案中，冷冻保护液中的类肽聚合物和/或类肽-肽杂合物的浓度在约100nM和约100mM之间。在其他实施方案中，冷冻保护液中的类肽聚合物和/或类肽-肽杂合物的浓度为约100nM、约500nM、约1μM、约10μM、约100μM、约500μM、约1mM、约10mM、约100mM、约500mM、或约1M。在特定实施方案中，冷冻保护液中的类肽聚合物和/或类肽-肽杂合物的浓度在约1和100mM之间(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100mM)。

在其它方面，本文提供用于保存生物样品的方法。在特定实施方案中，生物样品具有细胞组成。在一些实施方案中，生物样品是细胞。在一些实施方案中，生物样品包括原代细胞。在其他实施方案中，生物样品包括组织或器官。在特定实施方案中，生物样品包括一种或多种细胞、组织、器官、或其组合。在一些实施方案中，所述方法包括使生物样品与本文所述的类肽聚合物、本文所述的类肽-肽杂合物、本文所述的冷冻保护液、或其组合接触。在一些情况下，当使用组合物或溶液的组合时，使生物样品与组合物或溶液接触可以在多个步骤中完成。作为非限制性实例，可以首先将生物样品与本文所述的类肽聚合物接触，然后在稍后的时间点将生物样品与本文所述的冷冻保护溶液接触。

在特定实例中，组织是生物工程化的组织。在一些实例中，生物样品选自由以下组成的组：心脏、肝脏、肺、肾、胰腺、肠、胸腺、角膜、神经细胞、血小板、精细胞、卵细胞、胚胎细胞、干细胞、骨细胞、及其组合。在其他实例中，生物样品包括选自由以下组成的组的细胞(例如，原代细胞)群：心脏细胞、肝细胞、肺细胞、肾细胞、胰腺细胞、胃细胞、肠细胞、肌肉细胞、皮肤细胞、神经细胞、血细胞、免疫细胞、成纤维细胞、生殖泌尿细胞、骨细胞、干细胞、精细胞、卵母细胞、胚胎细胞、上皮细胞、内皮细胞、及其组合。

生物样品的冷冻保护可用于多种目的。非限制性实例包括类器官保存，干细胞(例如，造血干细胞、胚胎干(ES)细胞、多能干细胞(PSC)、和诱导多能干细胞(iPSC))保存，成体细胞和细胞系(例如，淋巴细胞、粒细胞、免疫系统细胞、骨细胞)的保存，胚胎、精子和卵母细胞的保存，组织保存，和器官保存。例如，在器官移植领域，组织、器官和其它生物样品及结构的保存是非常有用的。本领域技术人员将容易了解本发明对生物样品冷冻保护的其它有用的应用。

在又其它方面，本文提供用于保存一种或多种生物大分子的方法。所述生物大分子可以为天然或非天然存在的生物大分子。适合于通过本发明的方法进行冷冻保护的生物大分子的非限制性实例包括核酸(例如，DNA、RNA)、氨基酸、蛋白质、肽、脂质、和复合结构(例如，脂质体)。在一些实施方案中，方法包括使生物大分子与本文所述的类肽聚合物、本文所述的类肽-肽杂合物、本文所述的冷冻保护液、或者其组合接触。在一些实例中，生物大分子是分离的蛋白质。在特定实例中，分离的蛋白质是蛋白酶蛋白。在一些实例中，当使用组合物或溶液的组合时，使一种或多种生物大分子与组合物或溶液接触可以在多个步骤内完成。作为非限制性实例，可以首先将一种或多种生物大分子与本文所述的类肽聚合物接触，然后在稍后的时间点将生物样品与本文所述的冷冻保护剂溶液接触。

生物大分子的冷冻保护可用于多种目的。此类目的的非限制性实例包括DNA(例如，基因组DNA)和RNA样品的保存、干细胞生长因子的保存、和抗体的保存。本领域技术人员将容易了解本发明的其它有用的目的和合适的应用。

适用于根据本发明的冷冻保护的生物样品和大分子可以来自任何生物界(例如，动物界(包括但不限于人和家畜动物)、植物界、真菌(包括但不限于蘑菇)、原生生物、古菌/古细菌、和细菌/真细菌)。

E.冷冻保存方案

本文所述的方法适用于过冷至高零下温度(high sub-zero temperature)(例如，0℃至-20℃)期间的冷冻保存。在器官移植领域，通常将器官在冰上冷却(例如，至0℃至-4℃)，这将移植窗口限制在约10小时。通过使用含有标准小分子CPA的冷冻保护剂进行离体机器灌注，可以在-6℃的温度下将器官保存长达96小时。尽管期望进一步将冷冻保存温度降低到低于-6℃，这将延长可能的冷冻保存时间，但是不能这样做，因为进一步降低温度所需的高浓度的标准CPA由于CPA相关毒性而导致不可逆的器官损伤。有关更多信息，参见，例如，Uygun K等人,Nat.Protoc.10(3):484-94(2015)。采用离体灌注方法或者以其它方式使生物样品(例如，器官和组织)或大分子与本文所述的类肽聚合物、类肽-肽杂合物、和/或冷冻保护液接触，对于过冷至高零下温度，使得与目前可行的方案相比，在更低的温度下冷冻保存更长的时间是有用的。本领域技术人员容易了解本发明对高零下温度过冷的其它合适的应用。

本领域技术人员将容易理解，取决于被冷冻保存的特定的生物样品和/或大分子以及采用的特定的冷冻保存方案，本文所述的类肽聚合物、类肽-肽杂合物、和冷冻保护液的浓度和组成可以随之改变。

F.筛选方法

在相关方面，本文提供了筛选类肽聚合物、类肽-肽杂合物、和/或冷冻保护液的活性的方法。

在一个实施方案中，使用偏振光显微镜检测冰晶形成来筛选类肽聚合物、类肽-肽杂合物、和/或冷冻保护液是否可以降低水的冰点。偏振光显微镜是使用偏振光作为光源的光学显微镜技术。图像对比产生于平面偏振光与双折射(birefringent或doubly-refracting)物质的相互作用，以产生在相互垂直的平面中各自偏振的两个单独的波分量。称为寻常波前(ordinary wavefronts)和异常波前(extraordinary wavefronts)的这些分量的速度是不同的，并且随着穿过样本的传播方向而变化。离开样品后，光分量变得不同相，但当它们通过分析仪时，会与相长干涉和相消干涉重新组合。该干涉在样品中产生可检测的对比度。使用该技术容易检测到冰晶形成，这是因为冰晶是双折射物质。在标准实验中，将包括类肽聚合物、类肽-肽杂合物、和/或冷冻保护液的样品冷却至期望的温度持续期望的时间。将一个或多个样品在期望的温度下放置在偏振光显微镜下并且目视检查冰晶的形成。

在一个实施方案中，使用差示扫描量热法定量热滞后活性来筛选类肽聚合物、类肽-肽杂合物、和/或冷冻保护液是否可以降低水溶液的凝固点。差示扫描量热法是其中测量升高样品和参比样品所需热量的差作为温度的函数的热分析技术。当发生例如相变等物理转变时，将需要比参比样品更多或更少的热量流向样品，以将两者维持在相同的温度。参比样品和样品的相变之间的温度差报告了样品在0℃以下的温度下减少或抑制冰晶形成的能力。在标准实验中，将包含类肽聚合物、类肽-肽杂合物、和/或冷冻保护液的样品与缺少类肽聚合物、类肽-肽杂合物、和/或冷冻保护液的参比样品进行比较。

G.细胞存活率试验以测试活性

在相关方面，本文提供细胞存活率试验以测试本发明的类肽聚合物、类肽-肽杂合物、和/或冷冻保护液在降低的温度下维持细胞存活率(例如，在贮存后)的能力。

在一些实施方案中，使用由Thermo Fisher Scientific,Inc.提供的细胞存活率试验方案来测试细胞存活率。简言之，是刃天青(resazurin)(7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮10-氧化物)的商品名，其是呈蓝色且几乎无荧光的无毒的细胞渗透性化合物。进入细胞后，刃天青被还原成呈红色且高度荧光的化合物试卤灵(resorufin)。活细胞不断地将刃天青转化为试卤灵，增加了细胞周围的培养基的整体荧光和颜色。无活力的细胞不能将刃天青转化为试卤灵；因此细胞周围的培养基的整体荧光和颜色是样品中活细胞的相对量的指标。在标准实验中，将细胞与类肽聚合物、类肽-肽杂合物、和/或冷冻保护液在任意合适的容器中混合。然后将混合物冷却至期望的0℃以下的温度并且保持期望的时间。然后将细胞恢复至环境温度并且添加试剂，温育并且按照Thermo Fisher方案进行测量。通常，通过测量样品在波长处的相对荧光来确定细胞存活率的直接读数。

在一些实施方案中，使用由Thermo Fisher Scientific,Inc.提供的用于哺乳动物细胞的存活率/细胞毒性试剂盒来测试细胞存活率。该试剂盒使用两种指示剂分子：钙黄绿素AM和溴乙啡锭二聚体-1(Ethidium homodoimer-1)(EthD-1)。活细胞的特征在于普遍存在的细胞内酯酶活性，该活性通过将实际上无荧光的细胞渗透性钙黄绿素AM酶促转化为强荧光的钙黄绿素来测定。聚阴离子染料钙黄绿素很好地保留在活细胞内，在活细胞中产生强的均匀的绿色荧光相反，EthD-1进入膜损伤的细胞并且在与核酸结合后经历增强40倍的荧光，从而在死细胞中产生亮红色荧光值得注意的是，EthD-1被活细胞的完整细胞膜排除在外，因此活细胞和死细胞的确定是容易区分的。可以用传统的荧光素长通滤光片同时观察钙黄绿素和EthD-1。可选地，也可以分别观察来自这些染料的荧光；可以用标准荧光素带通滤光片观察钙黄绿素，并且可以用碘化丙啶或Texas 染料的滤光片观察EthD-1。在标准实验中，将细胞与类肽聚合物、类肽-肽杂合物、和/或冷冻保护液在任意合适的容器中混合。然后将混合物冷却至期望的0℃以下的温度，在该温度下保持期望的时间，然后恢复至环境温度。如Thermo Fisher方案中所述进行涉及添加钙黄绿素AM和EthD-1试剂并且测量试验结果的随后的步骤。通常，通过在两种试剂的上述波长下测量相对荧光来确定细胞存活率的直接读数。

在一些实施方案中，使用MTT测定法测试细胞存活率。MTT测定法是比色细胞存活率和增殖测定法，其依赖于黄色四唑鎓MTT(3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)向具有紫色的不溶性的甲瓒(Formazan)的还原。四唑鎓染料还原取决于主要位于代谢活性细胞的胞质室中的NAD(P)H-依赖性氧化还原酶。MTT测定法可从例如ATCC(www.atcc.org)或Sigma-Aldrich(www.sigmaaldrich.com)获得。在标准实验中，将细胞与类肽聚合物、类肽-肽杂合物、和/或冷冻保护液在任意合适的容器中混合。然后将混合物冷却至期望的0℃以下的温度并且保持期望的时间。然后将细胞恢复至环境温度，并且添加MTT试剂，温育并且按照ATCC或Sigma-Aldrich方案进行测量。通常，在570nm的波长下测量转换的染料的吸光度，其中在630-690nm处进行背景扣除。

IV.实施例

提供以下实施例来说明，但不限制要求保护的发明。

实施例1.类肽介导的冰晶形成的抑制

该实施例说明了在0℃以下的温度下N-取代的类肽聚合物和类肽-肽杂合物的冰晶抑制性质。

毛细管测定法

在该实验中，在含有MilliQ纯水的毛细管中制备四种水系样品。一个样品仅含有水，并且另一个样品含有160mM乙二醇(EG)。另两个样品各含有9mM的类肽聚合物。一个类肽聚合物样品含有称为“化合物1”的类肽聚合物，而另一个样品含有称为“化合物10”的类肽聚合物。类肽聚合物的序列如下：化合物1：Nsb-Nsb-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nsb(SEQ ID NO:1)；化合物10：Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp(SEQ ID NO:2)。

表2中提供了这些化合物的化学结构。

样品制备后，将所有样品在Peltier冷却台上缓慢冷却并且在-20℃下温育。一小时后，取出样品并且即刻使用连接至180x立体变焦显微镜的数码相机拍照(图2A)。水和EG样品显示明显的冰晶形成，尽管EG样品显示比仅含水样品更少的冰形成。相对地，含有类肽聚合物化合物的样品均未显示明显的冰晶形成。图2B显示归一化的数据。值得注意的是，含有比类肽样品浓度高约18倍的CPA浓度的EG样品仍显示明显的冰形成，然而类肽样品没有如此。

晶体X射线衍射测定法

为了增加库分析的通量，使用晶体X射线衍射(XRD)技术来评价冰晶形成。对于这些实验，测试命名为“化合物2”、“化合物8”、“化合物10”、“化合物11”、“化合物12”、“化合物13”、和“化合物58”的化合物。化合物2、8、10、11、12、和13是类肽聚合物，其结构在表2中给出。化合物58是类肽-肽杂合物，其结构在表10中给出。除了将精氨酸氨基酸附加至N-末端之外，化合物58与化合物12类似。

对于这些实验，使用15％和30％(v/v)之间的EG浓度。通常，在XRD样品分析期间以35-40％(v/v)的浓度使用EG、DMSO、和其它冷冻保护剂来使溶液玻璃化并且避免来自冰晶的衍射干扰。使用浓度为1和5mg/mL的类肽和类肽-肽化合物。图3A、3B、和3C分别示出在完全玻璃化、存在立方冰的情况下的部分玻璃化、和冷冻(立方冰晶)的条件下的示例性XRD数据。图4A-4G和图5A-5G中提供化合物8、10、11、12、13、和58的XRD数据。图3D提供各种EG浓度和化合物2、8、和12的两种浓度的冰环分数。

试验溶液样品组的几种混合物显示强的抗冰效果。图3D显示与EG相比的一些类肽聚合物溶液的实验结果。“冰环1”和“冰环2”是指冰形成的得分，其范围在0(无冰形成)和15(大的冰形成)之间。化合物2、12、和8等在防止冰形成的同时显著地降低必需的EG浓度。

在水中含有浓度为5mg/mL(0.5％(w/v))的化合物12和浓度为17.5％(v/v)的EG的样品在快速冷冻后无冰。发现该特定混合物在液氮蒸气流中在多次快速冷冻试验中完全地消除所有冰形成(图3A)，并且大大优于30％EG的标准溶液(图3B)。在图中，黑点和环表示冰晶。与相同摩尔浓度的EG相比，其抗冰效果强500倍，并且在不受任何特定理论约束的情况下，表明抗冰的非依数性机制，这是天然抗冻蛋白使用的机制。

更大体积测定

为了以更大的规模测试本发明的组合物的有用性，使用与用于标准卵子和干细胞保存的体积类似的溶液体积进行实验。对于这些实验，将一个仅含有22.5％EG和缓冲液、并且另一个含有22.5％EG和5mg/ml(0.5％w/v)化合物12和缓冲液的两个样品在液氮中快速冷冻。如图6A所示，化合物12溶液在从液氮中取出后显示完全的玻璃化，无即刻的冰形成，而对照溶液明显地冷冻，产生大量白色冰晶。溶液在37℃水浴中的复温导致了意想不到的且有益的效果。化合物12溶液在复温时在小于2秒内经历去玻璃化(图6B，右)，而在20秒后看到冰块漂浮在对照样品中(图6B，左)。各样品管上均看到冷凝，因为样品管实际上仍然远低于室温。该结果表明化合物12在解冻期间用作活性除冰剂。

此外，将100μL样品在-20℃冰箱中放置过夜后，发现化合物12溶液未冷冻(图6C，右)。该结果表明，本发明的组合物提供在低于0℃的温度下长时间保存样品而无任何冰形成的能力。此外，这些实验表明，用低温冷冻保存，或者通过过冷方法，在-20℃以及接近玻璃化至-80℃下通过引入本发明的化合物可以达到无冰条件，从而显著降低渗透性CPA的临界浓度并且减轻冷冻保存毒性。

如此处所示，发现化合物12的制剂在玻璃化期间防止亚毫升体积的冰形成。实际上，溶液在-20℃下能够保持完全地解冻，并且当在-196℃下快速冷冻时也能够玻璃化。目前，用于体外受精的标准人类卵细胞保存技术限于溶液体积小于5uL(通常为0.5至2.5μL)，同时使用50％以上的冷冻保护剂浓度。因此，化合物12能在极少的冷冻保护剂的情况下在实际体积中防止冰形成，这使其可用于例如保存用于体外受精的人类卵母细胞。

实施例2.细胞毒性和冷冻保存筛选

该实施例表明，当与现有化合物相比时，本文所述的组合物几乎不具有细胞毒性，并且可以实现优异的冷冻保存，同时减少CPA的需要量并因此降低CPA相关的毒性。

细胞毒性测定

为了证明本发明冷冻保护剂组合物的安全性，使用HEK 293细胞系开发了基于细胞的高通量细胞毒性测定，HEK 293细胞系是在组织培养中从人类胚胎肾细胞中生长的健全和强健的干细胞系。

使用Tecan Genesis机器人工作站在96-和384-孔板中制备溶液。溶液含有培养基、缓冲液、本发明的冷冻保护剂组合物(化合物12)或DMSO。将溶液调整为期望的pH。进行连续稀释以获得含有各种浓度的化合物12和DMSO的溶液。仅使用培养基进行对照实验。

对于这些实验，将细胞以低密度(即，10％融合)接种，暴露于含有化合物12或DMSO的溶液，并且置于37℃培养箱中。使细胞生长直至仅用空载体处理的对照细胞接近70％融合(通常约3至5天)。通过MTT测定法评估化合物的细胞毒性。

如图7所示，当通过MTT测定法分析时，化合物12的毒性没有显著地偏离单独的培养基的毒性。另一方面，DMSO在高于0.5％(v/v)的任何浓度下没有使复温存活持续延长的时间段。值得注意的是，化合物12在其可以防止非生物样品中冰形成的浓度(0.5％w/v)下不显示毒性，并且在比该浓度高4倍的浓度下也没有显示明显的毒性。

这些结果表明，即使在DMSO毒性显著降低细胞存活的浓度下，本发明的组合物在防冰方面也是有效的。

冷冻保存测定

在添加和不添加化合物12的情况下，使用非常简单的溶液来进行最初的冷冻保存测定，以使混杂的外部因素最小化。对于第一组实验，制备两种样品溶液。第一样品溶液含有简单缓冲液和浓度为22.5％(v/v)的乙二醇(EG)，以及第二样品溶液含有简单缓冲液、EG(22.5％(v/v))、和5mg/mL(0.5％(w/v))的化合物12。

使HEK 293细胞生长直至70％融合，然后用胰蛋白酶处理以除去粘附蛋白并且产生游离的漂浮细胞。使用血细胞计数器对细胞进行计数，并且将样品细胞浓度调整为每微升10,000个细胞的终浓度。通过离心将细胞压缩成紧密的团块，其后将各样品与20μL的样品溶液之一混合。然后通过将样品浸入液氮中快速冷冻，随后在37℃水浴中复温。在冷冻-解冻过程后，将细胞悬浮在400x体积的培养基中来恢复。阳性对照样品在37℃下用培养基处理并且不进行冷冻-解冻过程。阴性对照样品仅在冷冻-解冻过程期间用培养基处理。恢复后，将细胞用钙黄绿素AM染色30分钟，并且使用荧光板读数器测量细胞存活率。

如图8所示，化合物12的添加极大地改善了细胞存活率，并且证明了该化合物冷冻保存细胞的能力。观察到含有化合物12的样品在冷冻过程期间实现完全玻璃化而无冰形成。另外，与缺少化合物12的样品相比，更快地越过去玻璃化过程。

进行第二组实验以评价含有5mg/mL化合物12加上二醇、二糖、和一般缓冲液的混合物的制剂的冷冻保存能力。如上所述评价在液氮中玻璃化后的解冻后存活率。从图9中可以看出，该制剂实现细胞的近乎100％(即，98％)的解冻后存活率，这与未暴露于冷冻处理的对照组类似。细胞形态和荧光信号看起来与非冷冻对照相同，这表明在实验期间细胞受到小的损伤。

作为第二组实验的一部分，将制剂的冷冻保存能力与两种已知的冷冻保存试剂进行比较。VS2E是含有非化学定义的聚合物的无DMSO且无血清的溶液(参见，例如，Nishigaki等人,Int.J.Dev.Biol.55:3015-311(2011))，和M22是从21^st Century Medicine获得的器官玻璃化溶液。图9显示含有化合物12的制剂实现了优异的冷冻保存，因为VS2E和M22的细胞存活率分别为72％和51％。应该注意的是，对于M22样品，背景荧光可能影响该结果的准确性，因为图像中的活细胞的计数表明远低于51％的细胞存活。

本发明的组合物在防止含有明显减少的乙二醇的溶液中的冰形成方面非常有效。具体地，在用于保存各种类型的细胞的20uL规模上，低浓度的组合物(例如，0.5％(w/v))足以在玻璃化期间阻止冰生长并且使溶液保持在液体、无冰状态。

总之，这些结果显示本发明的组合物可以实现优异的冷冻保存并且减少CPA的需要量，从而减少与CPA相关的细胞毒性。本发明的组合物的优异性能对于特别敏感的细胞系和/或当需要将细胞培养更长时间时的处理特别有用。

实施例3.对于延长的时间段的细胞过冷

本实施例显示了使用本文所述的过冷制剂和方法的成功的细胞保存对于延长的时间段是可行的。

在高零下温度(high sub-zero temperature)下将保存的细胞和组织从实验室运输至患者可导致：1)与4℃贮存相比，增加的细胞存活率和延长的贮存时间(超过24小时)；(2)与避免使用LN2的冷冻保存相比，减少的运输成本；和(3)避免了在深冷贮存方案(例如，-80℃和-196℃)中的水相转变期间发生的冰损害。由于不利的毒性，传统渗透性CPA在过冷贮存期间不可达到超过-6℃的低温。在较低温度下贮存可提供更长的代谢暂停以延长细胞贮存时间并且还可整合在冷链基础设施中的-20℃冷却/运输以实现最佳的实际应用。

过冷保存方案

我们使用HEK293和K562细胞比较了各种制剂。简言之，将100μL的细胞(0.5x10⁶个细胞/mL)悬浮于试验冷冻保护剂(或在用于未冷冻对照的培养基)中，一式两份。将试验管置于-20℃冰箱中的架子上并且在指定时间点取出。在37℃水浴中复温样品并且将每个样品的10μL等分至含有500uL DMEM+10％FBS的恢复孔中，并置于培养箱中(37℃、5％CO₂)16小时以使进行细胞凋亡的细胞通过。用染色细胞或通过流式细胞仪获得数据以提高和与经历冷却和复温方案的那些在相同生长阶段的未冷冻细胞的比较。将细胞计数归一化至非冷冻臂。

将样品在冷冻管中直接置于-20℃冰箱中或者通过置于Mr.Frosty来更精确地控制，Mr.Frosty是一种用于将冷冻管的冷却速率控制至～1℃/分钟(当置于-80℃冰箱中)的含异丙醇的设备。在冷却至-20℃后，以各个试验时间间隔检查-20℃下的各个管的外观，并且记录为液体、半固体、或晶体，其旨在报告冰形成和细胞存活率之间的关系。

结果

用在-20℃下1-和3-天贮存的制剂验证细胞存活率。在表现相当少或无结晶形成的制剂中观察到增加的细胞存活率。然而，注意到含有活性类肽的制剂与增加的细胞存活率具有更好的相关性。制剂还提供在第1天和第3天后一致的细胞存活率，然而DMSO和培养基显示出时间点之间的巨大差异。

通过与各种基础缓冲液、小分子CPA浓度、与选择的细胞保护剂的交叉实验进一步调整了制剂。方案改善检查了在3、24、48、72、和120小时后(-20℃)的细胞保存，以及与许多其他制剂的比较。我们还扩展了我们的细胞模型以包括作为非粘附血细胞代表的K562细胞和Jurkat细胞。

图10A和10B显示了本发明的方法可在-20℃下过冷细胞。含有例如化合物12的类肽聚合物的制剂具有在-20℃下保存细胞的独特能力并且在过冷条件下72小时后具有显著存活率。相反，FDA批准的设计用于运输人器官以移植的器官保存液HTK缓冲液在其建议的运输/工作温度(4℃)下，在4℃下仅保持细胞存活低于24小时。

实施例4.用于移植的原代生殖泌尿细胞和组织的过冷

本实施例显示了使用本文所述过冷制剂和方法成功保存原代生殖泌尿(GU)细胞。

人GU细胞类型的实例包括BJ(人成纤维细胞包皮)、PC-3(人前列腺腺癌)、和SK-OV-3(人卵巢腺癌)。原代GU细胞类型的实例包括原代阴茎海绵体(CC)细胞如平滑肌和内皮细胞。在阴茎组织中，CC内皮和平滑肌细胞提供了基础形态和功能。可使用GU外植体来进行细胞保存实验。

内皮细胞

简言之，收集、处理、消化和过滤阴茎海绵体(CC)组织来产生单一内皮细胞，然后将其在细胞培养基中重悬接着培养5天。参见，Chung等人，Korean Journal of Urology,53(8):556-563(2012)。然后进一步处理汇合粘附的内皮细胞、在RPMI培养基中重悬并且通过70μm尼龙筛过滤。然后在20℃下用生物素化的抗大鼠CD146抗体培养细胞30分钟。清洗后，在缓冲液中重悬细胞并且用链霉亲和素包覆的磁珠培养。使用磁柱分离磁力标记的CD146细胞。参见，Weber等人，Pediatr Res,70(3):236-41(2011)。在EC培养基中重悬洗脱物并且培养。

平滑肌细胞

在37℃下、在95％空气和5％CO₂的湿润气氛中清洗、处理海绵体组织并且置于最小体积的补充DMEM中。参见，Pilatz等人，European Urology,47(5):710-719(2005)。在进一步处理后，将细胞移出外植体(4-10天)，去除外植体，并且允许细胞实现汇合，培养基中存在D-缬氨酸以控制成纤维细胞的生长且不影响平滑肌细胞形态。通过免疫染色和荧光显微镜来检查细胞的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达。

过冷保存方案

以约70％平均汇合使用少量的CC内皮和平滑肌细胞。本实验需要较小的体积，因此将1μL的制备的细胞浆液悬浮于Biorad 96孔PCR板中的19μL(～250,000个细胞/mL)的各种制剂中。将孔板置于装备有用于温度稳定性的帕尔贴板的-20℃冰箱中，并且在指定时间点对细胞进行采样。在37℃、5％CO₂下将含有1mL的含20％FBS的Medium 199(原代细胞)或DMEM+10％FBS(HEK293对照)的24孔组织培养板预平衡1小时。将冷冻保存的细胞液(20μL)移入24孔组织培养板中使其恢复过夜，其后在复温24小时后用钙黄绿素AM进行存活率试验。HEK293细胞作为外部细胞计数标准并且以高保真度定量(R²>98)。

结果

与在-20℃下贮存的原代细胞混合的制剂在过冷至-20℃后的各个时间点均未冷冻。图11显示了HTK溶液在-20℃下无法保护CC内皮细胞，导致在48小时后的零细胞存活率，可能因为在保存期间的固体冰形成。CC平滑肌细胞得到类似结果。重要的是，与制剂XT-SC6、XT-SC7、和XT-SC8相比，过冷制剂XT-SC5的使用导致48小时后原代CC内皮细胞和平滑肌细胞的较高存活率。XT-SC5与XT-SC6、XT-SC7、和XT-SC8分享相同的基础缓冲液，但具有另外的0.5％类肽化合物12。全部四种制剂含有不同浓度的小分子CPA(XT-SC5＝XT-SC6、XT-SC7＝1.25X、以及XT-SC8＝1.5X)。

内皮细胞的保护和时程存活率研究揭示了具有类肽聚合物的XT-SC5在48小时的时程中提供了超常的细胞存活率(94％)，同时无类肽聚合物和具有增加的CPA浓度的制剂在48小时中表现降低的内皮细胞存活率(约20％)。平滑肌细胞存活率的整体趋势与从内皮细胞保存中得到的结果相一致。

实施例5.模型细胞系中的生殖泌尿细胞的过冷

本实施例显示了使用本文所述的过冷制剂和方法成功保存来自模型人GU细胞系的生殖泌尿(GU)细胞。

在-20℃下进行过冷保存实验。检查了存活、存活率、和增殖。通过荧光板度数试验来分析细胞。

细胞系SK-OV-3(人卵巢腺癌)在含有类肽聚合物(例如，化合物1-8)的各种冷冻保存液中在-20℃下作为模型人生殖泌尿细胞保存。各个溶液在5个时间点具有4个相同副本。在各个时间点，用外标定量细胞数。

简言之，将100μL的细胞(0.5x 10⁶个细胞/mL)在试验冷冻保护剂(或在用于非冷冻对照的培养基)中悬浮，一式两份。将试验管置于-20℃冰箱中的架子上并且在指定时间点取出。在37℃水浴中复温样品并且将10μL的各个样品等分至含有500μL DMEM+10％FBS的恢复孔中并且置于培养箱(37℃、5％CO₂)中16小时以使进行细胞凋亡的细胞通过。染色细胞并且归一化细胞计数。

我们将强制冷冻的制剂中的细胞的存活率与未冷冻制剂对比。如表12中所记载的，与通过用冰晶引晶强制冷冻的制剂(“冷冻”)相比，当制剂在过冷至-20℃后保持未冷冻时，大部分的制剂在6天内显示出非常高的存活率(“液体”)。这些结果说明在-20℃下在液体中保留6天的细胞具有更高的存活率，并且证实了过冷的、非冷冻溶液在降低的温度和代谢的条件下增强细胞存活率。

表12

实施例6.过冷细胞的存活和增殖研究

本实施例显示了根据本文所述的过冷制剂和方法保存细胞为可行的，并且说明了与无类肽聚合物的对照样品相比具有增强的存活率和增殖。

SK-OV-3细胞

我们在含有显著减少的小分子过冷保护剂(约5X更小浓度)的溶液中评价了在-20℃下在各种制剂中过冷保存3天后的细胞存活率和增殖。在具有1％化合物12的冷冻保存制剂(“XT制剂+1％化合物12”)和仅XT制剂、10％DMSO制剂(用于冷冻保存的标准)、和/或DMEM(基础培养基，阴性对照)之间进行了对比。“XT制剂”含有HTK缓冲液和其他组分。

图12显示了含有类肽聚合物的制剂在增强本文所述过冷保存方法后的SK-OV-3细胞存活率方面为有效的。具体地，与起始细胞数相比，类肽制剂中的过冷细胞的至少50％在复温后1天存活，复温后1天类肽制剂中的细胞数比无类肽聚合物的制剂或DMSO制剂大至少约2至4倍。

图13显示了含有类肽聚合物的制剂在增强本文所述过冷保存方法后的SK-OV-3细胞存活方面为有效的。具体地，复温后3天类肽制剂中的细胞数比含DMSO的制剂大至少约5至6-倍。

K562细胞

我们评价了在-20℃下在各种制剂中过冷保存、在培养复温后3、6、7天的细胞增殖。通过在-20℃下过冷3天来保存K562细胞，将具有类肽聚合物(例如，化合物12)的XT制剂与仅XT制剂(即，无类肽)、10％DMSO制剂(用于冷冻保存标准)、和DMEM(基础培养基，阴性对照)相比较。简言之，通过使用铝块将200μL的细胞(0.5 x 10⁶个细胞/mL)在冷冻管中试验冷冻保护剂中(或在用于非冷冻对照的培养基中)在4℃下悬浮10分钟，一式两份。将试验管置于-20℃冰箱中的架子上并且在指定时间点取出。在37℃水浴中复温样品同时温和搅拌并且将2μL的各个样品(10,000个细胞)等分至含有200μL DMEM+10％FBS的恢复孔中并且置于培养箱(37℃、5％CO₂)中。培养细胞3、6、或7天，在不同时间段染色，并且通过读板器分析。

图14和15显示了含有类肽聚合物的制剂在增强本文所述过冷保存方法后的K562细胞存活率方面为有效的。具体地，图14显示了复温后3天具有化合物12的类肽制剂中的细胞数比无类肽聚合物的制剂或DMSO制剂大至少约1至2倍。图15显示了复温后6天具有化合物12的类肽制剂中的细胞数比无类肽聚合物的制剂或DMSO制剂大至少约2至3倍。

图16显示了含有各种类肽聚合物的许多制剂对于增强本文所述过冷保存方法后的K562细胞存活率为有效的。具体地，复温后7天具有化合物12、27、62、74、或76的类肽制剂中的细胞数比含有DMSO的制剂大至少约3至4倍。

V.示例性实施方案

根据当前公开的主题提供的示例性实施方案包括但不限于权利要求和以下实施方案：

1.一种以改善的细胞存活率冷冻保存细胞群的方法，所述方法包括：

(a)将细胞群与含有一个或多个极性类肽单体的类肽聚合物或其盐接触；并且

(b)将细胞群冷却至0℃至约-20℃的温度至少约3小时的时间段以产生过冷细胞群，

其中所述过冷细胞群的至少约50％在复温至高于0℃后存活。

2.根据实施方案1所述的方法，其中所述温度为约-10℃至约-20℃。

3.根据实施方案1或2所述的方法，其中所述温度为约-20℃。

4.根据实施方案1至3任一项所述的方法，其中所述时间段为至少约8或16小时。

5.根据实施方案1至3任一项所述的方法，其中所述时间段为约2至约5天。

6.根据实施方案5所述的方法，其中所述时间段为约2、3、4、或5天。

7.根据实施方案1至3任一项所述的方法，其中所述时间段为至少约5天。

8.根据实施方案1至7任一项所述的方法，其中所述过冷细胞群的至少约50％在复温至37℃后存活。

9.根据实施方案1至8任一项所述的方法，其中所述过冷细胞群的至少约60％在复温后存活。

10.根据实施方案1至8任一项所述的方法，其中所述过冷细胞群的至少约70％在复温后存活。

11.根据实施方案1至8任一项所述的方法，其中所述过冷细胞群的至少约80％在复温后存活。

12.根据实施方案1至8任一项所述的方法，其中所述过冷细胞群的至少约90％在复温后存活。

13.根据实施方案1至12任一项所述的方法，其中所述改善的细胞存活率包括与对照过冷细胞群相比，复温后存活的所述过冷细胞群的增殖增强。

14.根据实施方案13所述的方法，其中所述对照过冷细胞群不与所述类肽聚合物接触。

15.根据实施方案13或14所述的方法，其中在复温后约3天所述过冷细胞群中的细胞数比所述对照过冷细胞群中的细胞数大至少约1倍。

16.根据实施方案13或14所述的方法，其中在复温后约6天所述过冷细胞群中的细胞数比所述对照过冷细胞群中的细胞数大至少约2倍。

17.根据实施方案1至16任一项所述的方法，其中所述类肽聚合物以足以在所述温度下减少或抑制冰晶形成的量存在。

18.根据实施方案17所述的方法，其中所述类肽聚合物以约100nM和约1000mM之间的量存在。

19.根据实施方案1至18任一项所述的方法，其中所述细胞群包括组织或器官。

20.根据实施方案1至19任一项所述的方法，其中所述细胞群选自由以下组成的组：原代细胞、心脏细胞、肝细胞、肺细胞、肾细胞、胰腺细胞、胃细胞、肠细胞、肌肉细胞、皮肤细胞、神经细胞、血细胞、免疫细胞、成纤维细胞、生殖泌尿细胞、骨细胞、干细胞、精细胞、卵母细胞、胚胎细胞、上皮细胞、内皮细胞、及其组合。

21.根据实施方案1至20任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：

(c)将所述过冷细胞群复温至高于0℃。

22.根据实施方案1至21任一项所述的方法，其中所述类肽聚合物包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多的极性类肽单体。

23.根据实施方案1至22任一项所述的方法，其中所述极性类肽单体具有独立选择的含羟基的侧链。

24.根据实施方案23所述的方法，其中所述独立选择的侧链为任选取代的C_1-18羟基烷基。

25.根据实施方案24所述的方法，其中所述C_1-18羟基烷基为独立选择的任选取代的C_1-6羟基烷基。

26.根据实施方案1至25任一项所述的方法，其中所述类肽聚合物为含有所述类肽聚合物和一个或多个氨基酸的类肽-肽杂合物或其盐，其中所述一个或多个氨基酸位于所述类肽聚合物的一端或两端和/或在一个或多个类肽单体之间。

27.根据实施方案1至26任一项所述的方法，其中所述类肽聚合物具有根据式(I)所示的结构、其互变异构体或其立体异构体：

其中：

各R¹独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-18烷基、任选取代的C_2-18烯基、任选取代的C_2-18炔基、任选取代的C_1-18羟基烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的C_1-18烷基氨基、任选取代的C_1-18烷硫基、任选取代的羧基烷基、C_3-10环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、(C_3-10环烷基)烷基、(杂环烷基)烷基、芳烷基、和杂芳烷基，

其中R¹的至少一个实例为任选取代的C_1-18羟基烷基，并且

其中任何环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基被一个或多个R³基团任选且独立地取代；

各R²独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-18烷基、任选取代的C_2-18烯基、任选取代的C_2-18炔基、任选取代的C_1-18羟基烷基、任选取代的C_1-18烷基氨基、任选取代的C_1-18烷硫基、和任选取代的羧基烷基；

各R³独立地选自由卤素、氧代基、硫代基、-OH、-SH、氨基、C_1-8烷基、C_1-8羟基烷基、C_1-8烷基氨基和C_1-8烷硫基组成的组；

X和Y独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-8烷基、任选取代的C_1-8酰基、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、-NH₂、乙酰基、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、和卤素，或者

可选地，X和Y一起形成共价键；和

表示聚合物中的单体的数量的下标n在2和50之间。

28.根据实施方案27所述的方法，其中所述R¹的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或25个或更多的实例为独立选择的任选取代的C_1-18羟基烷基。

29.根据实施方案28所述的方法，其中所述C_1-18羟基烷基为独立选择的任选取代的C_1-6羟基烷基。

30.根据实施方案27所述的方法，其中各R¹独立地选自由以下组成的组：

其中：

m在1和8之间；和

R³选自由H、C_1-8烷基、卤素、羟基、巯基、硝基、胺、氧代基、和硫代基组成的组。

31.根据实施方案30所述的方法，其中所述一个或多个R¹具有根据R^1b所示的结构：

32.根据实施方案27所述的方法，其中各R¹独立地选自由以下组成的组：

33.根据实施方案27至32任一项所述的方法，其中R²的各个实例为H。

34.根据实施方案27至33任一项所述的方法，其中n在6和25之间。

35.根据实施方案27至33任一项所述的方法，其中n在6和20之间。

36.根据实施方案27至33任一项所述的方法，其中n在10和25之间。

37.根据实施方案27至36任一项所述的方法，其中X选自由H、C_1-8烷基、和C_1-8酰基组成的组；和Y选自由-OH和氨基组成的组。

38.根据实施方案1至26任一项所述的方法，其中所述类肽聚合物包括亚单元，所述亚单元包括一个或多个第一疏水性类肽单体H和一个或多个第一极性类肽单体P，其排列使得所述类肽聚合物具有序列[H_aP_b]_n或[P_bH_a]_n，其中：

表示亚单元中的连续的第一疏水性类肽单体的数量的下标a在1和10之间；

表示亚单元中的连续的第一极性类肽单体的数量的下标b在1和10之间；和

表示所述类肽聚合物中亚单元的数量的下标n在2和50之间。

39.根据实施方案38所述的方法，其进一步包括取代基X和Y使得所述类肽聚合物具有序列X-[H_aP_b]_n-Y或X-[P_bH_a]_n-Y，其中：

X和Y独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-8烷基、任选取代的C_1-8酰基、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、-NH₂、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、和卤素，或者

可选地，X和Y一起形成共价键。

40.根据实施方案38或39所述的方法，其中所述亚单元进一步包括第二疏水性类肽单体和/或第二极性类肽单体，使得所述类肽聚合物具有序列[H_aP_bH_cP_d]_n或[P_bH_aP_dH_c]_n，其中：

表示亚单元中的连续的第二疏水性类肽单体的数量的下标c为0和10之间；

表示亚单元中的连续的第二极性类肽单体的数量的下标d为0和10之间；并且

c和d不都为0。

41.根据实施方案40所述的方法，其进一步包括取代基X和Y使得所述类肽聚合物具有序列X-[H_aP_bH_cP_d]_n-Y或X-[P_bH_aP_dH_c]_n-Y，其中：

X和Y独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-8烷基、任选取代的C_1-8酰基、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、-NH₂、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、和卤素，或者

可选地，X和Y一起形成共价键。

42.根据实施方案38至41任一项所述的方法，其进一步包括序列Z，所述序列Z包括一个或多个疏水性类肽单体和/或一个或多个极性类肽单体，其中Z位于第一个亚单元之前、最后一个亚单元之后、和/或一个或多个亚单元之间。

43.根据实施方案1至26任一项所述的方法，其中所述类肽聚合物包括：

(a)包括两个第一疏水性类肽单体H和两个第一极性类肽单体P的亚单元，和

(b)位于所述类肽聚合物的C-末端的两个第二疏水性类肽单体，

其排列使得所述类肽聚合物具有序列[H₂P₂]_nH₂或[P₂H₂]_nH₂，其中表示所述类肽聚合物中的亚单元的数量的下标n在1和50之间。

44.根据实施方案43所述的方法，其中所述类肽聚合物进一步包括取代基X和Y使得所述类肽聚合物具有序列X-[H₂P₂]_nH₂-Y或X-[P₂H₂]_nH₂-Y，其中：

X和Y独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-8烷基、任选取代的C_1-8酰基、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、-NH₂、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、和卤素，或者

可选地，X和Y一起形成共价键。

45.根据实施方案43或44所述的方法，其中n在1和10之间。

46.根据实施方案38至45任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二疏水性类肽单体独立地选自由以下组成的组：

其中下标m为重复单元的数量且在1和10之间。

47.根据实施方案38至46任一项所述的方法，其中所述类肽聚合物包括具有含羟基的侧链的极性类肽单体。

48.根据实施方案38至47任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二极性类肽单体独立地选自由以下组成的组：

其中下标m为重复单元的数量且在1和10之间。

49.根据实施方案38至48任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二极性类肽单体各自包括侧链，所述侧链独立地选自由(C_1-6烷氧基)(C_1-6亚烷基)、(低聚[乙二醇])、(4-至10-元杂环烷基)(C_1-6亚烷基)、和(5-至10-元杂芳基)(C_1-6亚烷基)组成的组。

50.根据实施方案49所述的方法，其中(4-至10-元杂环烷基)(C_1-6亚烷基)包括4-6元杂环，其中至少一个成员选自由O和N组成的组。

51.根据实施方案49或50所述的方法，其中(4-至10-元杂环烷基)(C_1-6亚烷基)包括四氢呋喃基或氧代吡咯烷基部分。

52.根据实施方案51所述的方法，其中所述类肽聚合物包括

53.根据实施方案52所述的方法，其中所述极性类肽单体全部为

54.根据实施方案49所述的方法，其中(5-至10-元杂芳基)(C_1-6亚烷基)包括5-6元芳族环，其中至少一个环成员选自由O和N组成的组。

55.根据实施方案49或54所述的方法，其中(5-至10-元杂芳基)(C_1-6亚烷基)包括呋喃基部分。

56.根据实施方案55所述的方法，其中所述类肽聚合物包括

57.根据实施方案49所述的方法，其中所述侧链包括甲氧基乙基。

58.根据实施方案57所述的方法，其中所述类肽聚合物包括

59.根据实施方案49所述的方法，其中所述侧链包括低聚(乙二醇)部分。

60.根据实施方案59所述的方法，其中所述低聚(乙二醇)部分为2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基部分。

61.根据实施方案60所述的方法，其中所述类肽聚合物包括

62.根据实施方案38至42或46至61任一项所述的方法，其中n在2和10之间。

63.根据实施方案38至42或46至62任一项所述的方法，其中a在1和5之间。

64.根据实施方案38至42或46至63任一项所述的方法，其中b在1和5之间。

65.根据实施方案63或64所述的方法，其中a在1和3之间且b在1和3之间。

66.根据实施方案40至42或46至65任一项所述的方法，其中c在0和5之间。

67.根据实施方案40至42或46至66任一项所述的方法，其中d在0和5之间。

68.根据实施方案38至67任一项所述的方法，其中所述类肽单体的约10、20、30、40、50、60、70、80、或90％为疏水性的。

69.根据实施方案1至68任一项所述的方法，其中所述类肽聚合物的盐选自由盐酸盐、乙酸盐、硫酸盐、磷酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、酒石酸盐、葡萄糖酸盐、及其组合组成的组。

70.根据实施方案1至69任一项所述的方法，其中所述类肽聚合物配制在冷冻保护液中。

71.根据实施方案70所述的方法，其中所述冷冻保护液进一步包括选自由以下组成的组的化合物：离子性物质、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂、抗氧化剂、细胞膜稳定化合物、水通道蛋白或其它通道形成化合物、醇、糖、糖衍生物、非离子表面活性剂、蛋白质、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、透明质酸、甲酰胺、天然或合成水凝胶、及其组合。

72.一种通过实施方案1至71任一项所述的方法产生的具有改善的细胞存活率的过冷细胞群。

在本说明书中说明并公开的实施方案仅旨在教导本领域技术人员本发明人已知的最佳方法来制造和使用本发明。本说明书中的任何内容均不视为限制本发明的范围。提出的全部实施例为代表性且非限定性的。如本领域技术人员从上述教导中所理解的，在不脱离本发明的情况下，可修改或改变本发明的上述实施方案。因此应当理解，在权利要求及其等同物的范围内，可以以不同于具体描述的方式来实践本发明。本说明书中引用的全部出版物、专利、和专利申请通过引用结合在此，如各个单独的出版物、专利、或专利申请被具体且单独地指出通过引用结合在此。

VI.非正式的序列列表

Claims (37)

1.一种保存细胞群的方法，所述方法包括：

(a)将细胞群与包含类肽聚合物的溶液接触，所述类肽聚合物具有根据式(I)的结构、其互变异构体或其立体异构体：

其中：

各R¹独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-18烷基、任选取代的C_2-18烯基、任选取代的C_2-18炔基、任选取代的C_1-18羟基烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的C_1-18烷基氨基、任选取代的C_1-18烷硫基、任选取代的羧基烷基、C_3-10环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、(C_3-10环烷基)烷基、(杂环烷基)烷基、芳烷基、和杂芳烷基，

其中R¹的至少一个实例为任选取代的C_1-18羟基烷基，并且

其中任何环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基被一个或多个R³基团任选且独立地取代；

各R²独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-18烷基、任选取代的C_2-18烯基、任选取代的C_2-18炔基、任选取代的C_1-18羟基烷基、任选取代的C_1-18烷基氨基、任选取代的C_1-18烷硫基、和任选取代的羧基烷基；

各R³独立地选自由卤素、氧代基、硫代基、-OH、-SH、氨基、C_1-8烷基、C_1-8羟基烷基、C_1-8烷基氨基和C_1-8烷硫基组成的组；

X和Y独立地选自由以下组成的组：H、任选取代的C_1-8烷基、任选取代的C_1-8酰基、任选取代的C_1-8烷基氨基、-OH、-SH、-NH₂、乙酰基、羧基、任选取代的C_1-8羟基烷基、任选取代的C_1-8烷基氨基、任选取代的C_2-8烷硫基、任选取代的C_1-8羧基烷基、和卤素；和

表示聚合物中的单体的数量的下标n在2和50之间；并且

(b)将所述溶液冷却至0℃至-20℃的温度至少3小时的时间段以产生保存的细胞群，

其中所述保存的细胞群的至少50％在复温至高于0℃后存活。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述温度为-5℃至-20℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述温度为-5℃至-15℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述温度为-5℃至-10℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述时间段为至少8或16小时。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述时间段为2至5天。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述时间段为2、3、4、或5天。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述时间段为至少72小时。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述保存的细胞群的至少50％在复温至37℃后存活。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述保存的细胞群的至少60％在复温后存活。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述保存的细胞群的至少70％在复温后存活。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述保存的细胞群的至少80％在复温后存活。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述保存的细胞群的至少90％在复温后存活。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述保存的细胞群在所述温度下未冷冻。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述保存的细胞群在所述温度下在液体、无冰悬浮液中。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述类肽聚合物以足以在所述温度下减少或抑制冰晶形成的量存在。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述类肽聚合物以100nM和1000mM之间的量存在。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞群包括组织、工程化的组织或器官。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞群选自由以下组成的组：原代细胞、心脏细胞、肝细胞、肺细胞、肾细胞、胰腺细胞、胃细胞、肠细胞、肌肉细胞、皮肤细胞、神经细胞、血细胞、免疫细胞、成纤维细胞、生殖泌尿细胞、骨细胞、干细胞、精细胞、卵母细胞、胚胎细胞、上皮细胞、内皮细胞、及其组合。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括：

(c)将所述保存的细胞群复温至高于0℃。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述类肽聚合物为含有所述类肽聚合物和一个或多个氨基酸的类肽-肽杂合物或其盐，其中所述一个或多个氨基酸位于所述类肽聚合物的一端或两端和/或在一个或多个类肽单体之间。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述R¹的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多的实例为独立选择的任选取代的C_1-18羟基烷基。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述C_1-18羟基烷基为独立选择的任选取代的C_1-6羟基烷基。

24.根据权利要求1所述的方法，其中各R¹独立地选自由以下组成的组：

其中：

m在1和8之间；和

R³选自由H、C_1-8烷基、卤素、羟基、巯基、硝基、胺、氧代基、和硫代基组成的组。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述一个或多个R¹具有根据R^1b所示的结构：

26.根据权利要求1所述的方法，其中各R¹独立地选自由以下组成的组：

27.根据权利要求1所述的方法，其中R²的各个实例为H。

28.根据权利要求1所述的方法，其中n在6和25之间。

29.根据权利要求1所述的方法，其中n在6和20之间。

30.根据权利要求1所述的方法，其中n在10和25之间。

31.根据权利要求1所述的方法，其中X选自由H、C_1-8烷基、和C_1-8酰基组成的组；和Y选自由-OH和氨基组成的组。

32.根据权利要求1所述的方法，其中X和Y一起形成共价键。

33.根据权利要求1至32任一项所述的方法，其中所述类肽聚合物的盐选自由盐酸盐、乙酸盐、硫酸盐、磷酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、酒石酸盐、葡萄糖酸盐、及其组合组成的组。

34.根据权利要求1至32任一项所述的方法，其中所述类肽聚合物配制在冷冻保存液中。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述冷冻保存液进一步包括选自由以下组成的组的化合物：离子性物质、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂、抗氧化剂、细胞膜稳定化合物、醇、糖、糖衍生物、非离子表面活性剂、蛋白质、天然或合成水凝胶、及其组合。

36.根据权利要求34所述的方法，其中冷冻保存液进一步包括选自由以下组成的组的化合物：水通道蛋白或其它通道形成化合物。

37.根据权利要求34所述的方法，其中冷冻保存液进一步包括选自由以下组成的组的化合物：二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、透明质酸和甲酰胺。