CN110669119A - 调控枇杷开花时间的EjAGL17蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷开花时间调控相关的EjAGL17基因及其应用。EjAGL17基因的cDNA的编码区序列全长如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明的EjAGL17基因在烟草叶片细胞中瞬时表达，定位于细胞核，表明该基因编码的蛋白具有典型的转录因子特性。同时，该基因在枇杷花发育不同时期的表达具有显著性差异。通过农杆菌介导的花序浸染法将EjAGL17基因过表达载体转入野生型拟南芥。结果显示，野生型拟南芥中过量表达EjAGL17基因，能促进拟南芥开花时间提前14天左右。利用EjAGL17基因过表达载体获得的转基因植物材料，能使显著提前植物的花期，进而促使结果的时间提前，可用于植物早花早熟品种的定向选育，具有良好的应用前景。

Description

调控枇杷开花时间的EjAGL17蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷EjAGL17蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

枇杷(Eriobotrya japonica)是蔷薇科枇杷属植物，是我国南方重要的常绿果树；其果实成熟于春末夏初的水果淡季，果肉鲜嫩多汁，具有润肺、化痰止咳的功效，深受到消费者喜爱。与其他大多数蔷薇科植物明显不同，枇杷花芽在夏季开始分化，通常在秋末冬初开花。其花发育经过花芽形态分化期、花序主轴和支轴分化期、侧生支轴快速伸长期，形成一个圆锥花序；进而在支轴上出现小花分化期和开花期等过程。因此，对枇杷花期的分子调控机制研究有利于综合了解蔷薇科植物的开花过程。

开花是被子植物从营养生长向生殖生长的关键转变过程，涉及多基因分子调控网络途径，并受到外界环境和内源多种开花相关基因表达调控的影响。MADS-box基因家族普遍存在被子植物中，并与花发育的调控密切相关，如：诱导开花、花器官形成和发育等。MADS-box基因是一类拥有特异结构域和功能的基因，对信号转导和植物生长发育有极其重要的作用。其中，AGAMOUS-Like 17及同源基因是参与调控被子植物花发育的关键MADS-box基因。近些年，仅有模式植物拟南芥和水稻的研究表明，AGL17及同源基因参与了花发育过程的调控。但是，关于枇杷AGAMOUS-Like 17(EjAGL17)基因调控其花发育过程和开花时间的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供枇杷EjAGL17蛋白及其编码基因与应用。

首先，本发明提供枇杷EjAGL17蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质，其中，所述的由1)衍生的蛋白质包括MADS结构域、I结构域、K结构域、C末端结构域。

本发明还提供编码所述的枇杷EjAGL17蛋白的基因。

所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述基因在调控被子植物开花时间中的用途。

本发明从枇杷花芽中分离了1个枇杷花发育调控密切相关的EjAGL17基因。通过将EjAGL17基因在烟草叶片细胞中瞬时表达，发现其定位于细胞核，表明该基因编码典型的转录因子。通过实时荧光定量PCR证实了EjAGL17基因在二倍体和三倍体枇杷早晚花品种中表达均显示出明显的差异，表明EjAGL17基因的表达模式与枇杷的花期密切相关。利用基因工程的手段构建了EjAGL17基因的植物过表达载体，将其转转入野生型拟南芥中超量表达，能促进拟南芥提前开花，进而促进其提前结果。本发明为被子植物花期和果期的改造提供了很好的应用前景。

附图说明

图1是枇杷EjAGL17基因的3'RACE、5'RACE和基因编码区序列验证的电泳照片。其中，A是3'RACE的电泳照片，M为DL2000DNA marker，3R1为3'RACE第1步PCR产物，3R2为3'RACE第2步PCR产物；B是5'RACE的电泳照片，M为DL2000 DNA marker，5R2为5'RACE第2步PCR产物；C为EjAGL17基因ORF验证的PCR电泳照片，M为DL2000 DNA marker，1为EjAGL17基因ORF的PCR产物；黑色箭头指示为PCR扩增的目的基因的条带。

图2是枇杷花期调控相关EjAGL17基因编码区的cDNA核苷酸序列图。

图3是枇杷EjAGL17蛋白质的氨基酸序列和结构域划分图。

图4是枇杷EjAGL17编码蛋白质的氨基酸序列与梨、咖啡树、拟南芥和欧洲油菜的序列对比图，该蛋白序列与其近缘物种及其他被子植物的序列相比，序列差异明显，特别是C结构域的氨基酸序列差异最大，表明了该蛋白序列的特异性。第1个横线是M结构域；第2个横线是K结构域；M和K结构域之间是I结构域；K结构域之后是C结构域。

图5是枇杷EjAGL17基因在烟草叶片中瞬时表达的亚细胞定位，显示该基因的表达产物定位于细胞核。GFP：绿色荧光蛋白；DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚；BF：明场成像；Merged：GFP，DAPI和BF的合并后的图像。

图6是枇杷EjAGL17基因在枇杷花发育不同时期的表达显示出显著的差异。

图7是EjAGL17基因过表达载体构建酶切电泳图。其中，a是pBI121载体酶切电泳图，M为DL15000 DNA marker，1为双酶切后的pBI121载体；b是EjAGL17过表达载体pBI121-EjAGL17的双酶切验证电泳图，M为DL15000 DNA marker，1为双酶切后的pBI121-EjAGL17载体。

图8是6转基因前后拟南芥的开花时间照片。其中，与未转基因野生型拟南芥中相比，过量表达EjAGL17基因能促进转基因拟南芥开花时间提前14天左右。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1枇杷EjAGL17基因cDNA序列的克隆

枇杷花芽总RNA的提取

采集新鲜长度约1.0cm的枇杷分化期的花芽，迅速放入冻存管中，放入液氮中速冻2h后，放入-80℃超低温冰箱中待用。采用RNA提取试剂盒提取枇杷花芽的总RNA：从-80℃超低温冰箱中取出收集的花芽材料，放入预先冷冻并且加有1mL RLT裂解液和100μLPLANTaid的研钵中，在室温条件下，充分研磨；将上述研磨液转移至1.5mL的eppendorf离心管中，13000rpm离心10min后，吸取500μL上清液，转移至新的1.5mL离心管；向上清液中加入250μL无水酒精，吸打混匀后，加入吸附柱中，接着将吸附柱放入收集管；向吸附柱中加入500μL去蛋白液，13000rpm离心2min后；加入500μL漂洗液，13000rpm离心2min后，倒掉收集管中的废液，再次重复一次加入漂洗液并13000rpm离心2min；将吸附柱重新放回空收集管中，13000rpm空离心3min，去除残留的漂洗液，将吸附柱在超净工作台中放置2min，使残留的漂洗液挥发；将吸附柱放回至空的RNase-free离心管中，加入50μL的RNase free water室温放置2min，接着13000rpm离心2min；再次将第一次的洗脱液再次加入到吸附柱中，再离心一次，以提高RNA的提取浓度。吸取2μL稀释后的RNA样品，用微量核酸浓度检测仪检测RNA浓度。

枇杷EjAGL17基因的3'RACE实验

采用提取的枇杷花芽总RNA为3'RACE实验模板，以3'RACE Adaptor为接头引物进行逆转录反应，合成3'RACE实验的第一链cDNA。具体操作为：吸取总RNA 1μL，3'RACEAdaptor 1μL，DEPC-ddH₂O 4.5μL，混合均匀后，在70℃条件下，变性10min后，冰浴2min；RNA变性反应结束后，依次加入RNase inhibitor 0.25μL，10mM dNTP 1μL，5×M-MLV buffer 2μL，M-MLV 0.25μL，混合均匀后，置于42℃条件下，反应60min；接着，在70℃条件下，反应10min；冰浴2min，接着放置在-20℃条件下，保存待用。

根据NCBI网站公布的枇杷近缘种梨(KP164022)以及模式植物拟南芥(AB763910)AGAMOUS-Like 17同源基因序列的保守区域，直接设计3′RACE实验的上游特异性引物3REjAGL17F1和3REjAGL17F2，3REAGL17F1：5′-GAAGGCTAAGGGGCTATCAATCC-3′和3REjAGL17F2：5′-GCGGAGCATCAACTGCCGAATCCG-3′。以3'RACE逆转录产物为模板，使用高保真EX-taq酶，上游外侧特异性引物3REjAGL17F1和3'RACE Outer Primer：5'-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'，进行第一链PCR反应，反应条件为95℃4min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。接着，以第一链PCR反应产物为模板，使用高保真EX-taq酶，上游外侧特异性引物3REjAGL17F2和3'RACE Inner Primer：5'-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'，进行第二链巢式PCR反应，反应条件为95℃4min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。待第二链PCR反应结束后，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1A)，切下目的条带，按照说明书用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序。

枇杷EjAGL17基因的5'RACE实验

根据3′RACE实验的序列，设计5′RACE实验的特异性引物5REjAGL17R1和5REjAGL17R2，其中5REAGL17R1：5′-CTTCTCATTCTCTTTACTTACGAGGT-3′，5REjAGL17R2：5′-TATTTCATCATTAAATATCTGGTTC-3′。根据5'RACE实验操作步骤：第一链合成，首先配制BufferMix，即依次加入1.0μL的dNTP Mix(10mM)，2.0μL的5×First-strand Buffer，1.0μL的DTT(20mM)，混合均匀，室温放置。

在200μL的eppendorf管，加入1.0μL总RNA，1.0μL的5’-CDS primer A，1.75μL的H₂O，混合均匀，瞬时离心后，72℃3min，冷却至42℃2min，冷却后，14000g离心10s，加入1μL的SMARTER IIA oligo，1.0μL的SMARTscrube Reverse Transcriptese(100U)，4.0μL的Buffer Mix，0.25μL的RNase inhibitor(400U/μL)，总体积10μL，混合均匀，瞬时离心后，42℃反应90min，70℃变性10min，获得control 5’-RACE-Ready cDNA。

5'RACE扩增体系：34.5μL的PCR-Grade water，5.0μL的10×Advantage 2PCRBuffer，1.0μL的50×Advantage 2polymerase Mix，1.0μL的dNTP Mix，2.5μL的control5’-RACE-Ready cDNA，1.0μL的5REjAGL17R1引物，5.0μL的UPM(10×)。降落PCR的程序为：95℃30s，72℃3min，5个循环；95℃30s，70℃30s，5个循环；72℃3min，95℃30s，68℃30s，30个循环；72℃5min。PCR反应结束后，以第一链5'RACE的PCR反应产物为模板，使用高保真LA-taq酶，上游外侧特异性引物5REjAGL17R2和UPM Primer，进行第二链PCR反应，反应程序为95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，进行30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测第二链的PCR反应(图1B)。切下目的条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序分析。

使用DNAMAN软件对3'RACE和5'RACE实验的PCR测序结果，进行拼接和分析，得到枇杷EjAGL17基因cDNA的编码区序列(SEQ ID No.1)，其序列图片见图2。

在枇杷EjAGL17基因序列全长的设计引物FLEjAGL17F:5'-ATGGGGAGAGGAAAGATTGTGATTAGA-3'和FLEjAGL17R:5'-ATTGTTCGAAGGCCCAAGCCCATG-3'，反应条件为95℃4min；95℃40s，56℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带(图1C)，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序，对EjAGL17基因的编码区序列进行验证。

使用primer 5软件，对枇杷EjAGL17基因的cDNA的编码区序列，进行蛋白质序列翻译(SEQ ID No.2)，并根据MADS-box蛋白质特点，枇杷EjAGL17蛋白质序列进行MADS结构域、I结构域、K结构域和C末端结构域的划分(图3)。进一步，将枇杷EjAGL17编码蛋白质的氨基酸序列与梨、咖啡树、拟南芥和欧洲油菜的序列对比，该蛋白序列与其近缘物种及其他被子植物的序列相比，序列差异明显，特别是C结构域的氨基酸序列差异最大，表明了该蛋白序列的特异性(图4)。

实施例2枇杷EjAGL17基因的亚细胞定位分析

利用软件Oligo7对EjAGL17基因的ORF序列进行酶切位点分析，并设计两端的酶切位点引物，EjAGL17-SacI：5'-cgagctcATGGGGAGAGGAAAGATTGTGAT-3'；EjAGL17-BamHI：5'-cgggatccCTAAGTTTGAATCTGTGGCTGGC-3'。以测序正确的pMD18-EjAGL17质粒为模板进行扩增，得到含有SacI和BamHI酶切位点的EjAGL17基因ORF序列。分别提取目的基因和改造的载体pCAMBIA1300质粒，用限制性内切酶SacI和BamHI分别进行双酶切反应，经琼脂糖凝胶电泳后进行回收。利用T₄ DNA连接酶将双酶切后的目的基因EjAGL17和改造的pCAMBIA1300载体进行连接，并将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，之后进行菌液PCR和双酶切验证后进行测序，确保目的基因序列成功连接到载体。提取构建好的载体质粒通过冻融法转入农杆菌GV1301感受态细胞。

从固体LB培养基平板上挑取农杆菌的单克隆菌落，接种至10mL液体培养基(含Rif+kan)中，28℃，250rpm培养至OD600＝0.5。取5mL培养液离心10min收集菌体，然后加入2mL渗透液重新悬浮菌体，接着离心10min加入2mL渗透液悬浮菌体。最后稀释成OD600＝0.03～0.1后进行烟草叶片的转化，转化后的烟草弱光培养16h后，恢复正常生长，3-4d后进行GFP荧光的观察(图5)。

结果表明：枇杷EjAGL17基因的表达产物定位于细胞核，表明该基因编码的蛋白具有典型的转录因子特性。

实施例3枇杷EjAGL17基因的实时荧光定量PCR表达量分析

枇杷的开花过程包含了：(A)花芽的生理分化期，(B)花芽形态分化期，(C)花序主轴分化期，(D)花序支轴分化期，(E)花序侧生支轴快速伸长期，(F)小花分化期，(G)花蕾露白期，(H)盛花期和(I)谢花期。分别提取枇杷这9个发育时期的总RNA，去除总RNA中微量的DNA后，逆转录成cDNA。根据枇杷cDNA为模板，利用oligo 6.0软件设计实时荧光定量PCR引物qRTEjAGL17F:5'-TTGACGAGCAGGCAAGTGAC-3'和qRTEjAGL17R:5'-TAGCATAATCGTAAAGCCTG-3'。以枇杷actin基因为内参基因，引物为qRTEjactinF：5'-AATGGAACTGGAATGGTCAAGGC-3'和qRTEjactinR：5'-TGCCAGATCTTCTCCATGTCATCCCA-3'，用PCR对其特异性进行检测，在确保PCR特异性扩增前提下，方可进行实时荧光定量PCR实验，每个反应设置3个生物学重复。PCR反应程序为:94℃预变性5min；94℃20s，55℃20s，72℃20s，41个循环，接着，采集溶解曲线：将温度调至60℃，90s，预溶解；接着以1.0℃/s速度升温，每升温1℃保温5s，直至95℃。

结果显示：在枇杷花发育过程中，EjAGL17基因在花发育的9个不同发育时期中均有表达，其中，在花芽形态分化期的表达量最高，并且在不同发育时期表达量出现显著差异(图6)；表明EjAGL17基因与枇杷花发育过程密切相关。

实施例4枇杷EjAGL17基因的植物转基因载体pBI121-EjAGL17构建

采用PCR扩增，在枇杷EjAGL17基因的CDS区两端引入酶切位点。以枇杷花芽总RNA逆转录的cDNA为模板，以TEjAGL17-F：5′-TCTAGAATGGGGAGAGGAAAGATTGTGATTAG-3′(引入XbaⅠ酶切位点)和TEjAGL17-R：5′-CCCGGG CTAAGTTTGAATCTGT GGCTGGC-3′(引入SmaⅠ酶切位点)为引物，使用Ex-taq酶，进行PCR扩增。PCR反应程序：95℃4min；95℃40s，56℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物与pMD18-T载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆后，进行测序。根据测序结果分析，提取质粒。使用XbaⅠ和SmaⅠ限制性内切酶分别双酶切pMD18-EjAGL17重组质粒和pBI121载体，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。使用T₄ DNA连接酶将双酶切后的EjAGL17基因与pBI121连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，获得植物转基因表达载体pBI121-EjAGL17。将pBI121(对照)和获得的pBI121-EjAGL17表达载体分别使用XbaⅠ和SmaⅠ进行双酶切，酶切后的pBI121只出现了1条带(图7A)，而pBI121-EjAGL17载体分别出现了pBI121载体和EjAGL17基因2条带(图7B)，证明EjAGL17基因与pBI121载体连接成功。

实施例5将转基因表达载体pBI121-EjAGL17转入拟南芥

取1μg的pBI121-EjAGL17质粒，加入100μL农杆菌感受态细胞，混合均匀；冰浴10min，转入液氮，迅速冷冻2min，快速置于37℃，水浴10min；加入800μL的LB液体培养基，28℃、250rpm振荡5h；将菌液转移至LB(50mL LB+50μg/mL Kan+50μg/mL Rif)固体选择培养基中，涂布均匀，在28℃条件下倒置培养48h。

将含有pBI121-EjAGL17阳性克隆的农杆菌在25mL固体平板培养基(含有25μg/mLKan+25μg/mL Rif)上划线，28℃，倒置培养48h；选取单克隆，接种到10mL的液体LB培养基(含有10μg/mL Kan+10μg/mL Rif)中；在28℃、250rpm条件下，振荡培养过夜至OD＝0.7-0.8。取1mL的培养菌液均匀涂布在25mL固体LB培养基平板(含有25μg/mL Kan+25μg/mLRif)上，28℃，倒置培养48h；利用灭菌的玻璃三角棒将固体培养基上的农杆菌刮下来，将菌块重悬于含有5％蔗糖和3％Silwet L-77的1/2MS液体培养基中，使其OD＝0.2，用于拟南芥转基因。

将拟南芥种子放在湿润的滤纸上，并置于4℃，48h，接着播种至营养土(珍珠岩：蛭石：营养土＝1:4:5)，在温度22℃，湿度70％，14h光照/10h黑暗条件下，培养；转基因前，将拟南芥(购自拟南芥突变体库)植株浇透水；在浸染时将待用的拟南芥植株上已有角果剪掉，将花芽浸入PBI121-EjAGL17农杆菌浸染液中90s左右；罩上黑色封口膜，并保持膜内的高温和高湿环境，暗培养2d后，揭开薄膜；上述方法侵染4次，间隔时间为7d。

实施例6枇杷EjAGL17基因的转基因拟南芥筛选和表型鉴定

收取EjAGL17转基因拟南芥成熟种子，将种子处理干净。置于4℃冰箱中进行春化处理14d；将拟南芥种子放入收集管中，向种子中加入800μL无水乙醇，摇动6min；离心5000rpm，2min；倒掉收集管中的酒精，向收集管中加入800μL 70％乙醇，摇晃5min；离心5000rpm，2min；晾干种子；均匀铺在1/2MS培养基(pH＝5.8，含50μg/mL的Kan，3％蔗糖和0.8％琼脂)平板上。将接种后的平板放入到4℃冰箱，进行再春化处理2d；将春化后的种子置于人工气候箱中，进行正常培养。待其长出6片真叶后，将其移至营养土中，经过炼苗、壮苗后，按照常规的水肥管理，直至开花。

提取EjAGL17转基因拟南芥DNA，取1小片拟南芥的叶片置于1.5mL的eppendorf管中，放入液氮速冻，研磨；加入600μL提取缓冲液，涡旋震荡后，置于冰上；待所有样品处理完后，置于65℃水浴中，25min；将样品从水浴中取出，放置到室温，待冷却至室温后，加入340μL乙酸钾溶液，涡旋震荡，冰浴20min；13000rpm，高速离心5min，将上清液转移至新的eppendorf管中；加等量体积的异丙醇，4℃，13000rpm，离心10min，倒掉清液，用冰无水乙醇(提前2h将无水乙醇放入-20℃冰箱)漂洗；沉淀依次用70％、100％乙醇漂洗；沉淀吹干后，溶于50μL无菌水。

以未转基因野生型拟南芥的DNA作为对照，使用载体构建的引物TEjAGL17-F和TEjAGL17-R，对转基因拟南芥的阳性植株DNA进行PCR筛选。PCR扩增程序：95℃4min；95℃40s，56℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。共获得31株阳性的EjAGL17转基因野生型拟南芥植株。

对转基因的野生型拟南芥进行开花时间的表型鉴定，对拟南芥的开花时间表型进行观察统计和拍照。表型结果显示：与野生型拟南芥相比，转基因野生型拟南芥中过量表达EjAGL17基因，均能促进拟南芥开花时间提前14d左右(图8)。结果表明，EjAGL17基因有促进拟南芥提前开花时间的功能，EjAGL17基因的转基因拟南芥材料可用于植物开花时间的改造，进而使植物提前结果，能有效提前植物的果实成熟时间。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 调控枇杷开花时间的EjAGL17蛋白及其编码基因与应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 788

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 1

atggggagag gaaagattgt gattagaagg attgacaatt tgacgagcag gcaagtgacc 60

ttttctaaga gaagaaatgg gttgcttaag aaggctaagg ggctatcaat cctttgtgat 120

gctgaggttg gattgattat cttctctggc accggcaggc tttacgatta tgctagcact 180

agcatgaaat cagttaccga tcgtttcaac aaactgaaag cggagcatca actgccgaat 240

ccggcttcag aagtcaagtt ttggcaaagg gaaacagcaa gcttgaggca acaattgtgg 300

tacttggaag aatgtcacag gcagttaatg ggggaagaac tttctggttt gagtgccaac 360

gatctacaga atttggaaag ccagcttgag atgagtttga aaggtgtccg aacgaaaaag 420

aaccagatat ttaatgatga aataaaagaa ctgaaccaga agggatcttt catacatcaa 480

gagaatatag aacttcataa gaagctggac ctcgtaagta aagagaatga gaagctgaaa 540

aagaaggctt ataaagcaag ggatgtgaat caaggaaaca aaagttccca gcctccatat 600

agcatcagca atgaagatga tttgcatgca cccatccatt tgcagctaag ccagccacag 660

attcaaactt agcatgggct tgggccttcg aacaatgaag taccagcaaa agttatatat 720

aaccccacta atgcgtaata tagcccatat tgatccaatg gaccaacccc caaaaaaaaa 780

aaaaaaaa 788

<210> 2

<211> 223

<212> PRT

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 2

Met Gly Arg Gly Lys Ile Val Ile Arg Arg Ile Asp Asn Leu Thr Ser

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala

20 25 30

Lys Gly Leu Ser Ile Leu Cys Asp Ala Glu Val Gly Leu Ile Ile Phe

35 40 45

Ser Gly Thr Gly Arg Leu Tyr Asp Tyr Ala Ser Thr Ser Met Lys Ser

50 55 60

Val Thr Asp Arg Phe Asn Lys Leu Lys Ala Glu His Gln Leu Pro Asn

65 70 75 80

Pro Ala Ser Glu Val Lys Phe Trp Gln Arg Glu Thr Ala Ser Leu Arg

85 90 95

Gln Gln Leu Trp Tyr Leu Glu Glu Cys His Arg Gln Leu Met Gly Glu

100 105 110

Glu Leu Ser Gly Leu Ser Ala Asn Asp Leu Gln Asn Leu Glu Ser Gln

115 120 125

Leu Glu Met Ser Leu Lys Gly Val Arg Thr Lys Lys Asn Gln Ile Phe

130 135 140

Asn Asp Glu Ile Lys Glu Leu Asn Gln Lys Gly Ser Phe Ile His Gln

145 150 155 160

Glu Asn Ile Glu Leu His Lys Lys Leu Asp Leu Val Ser Lys Glu Asn

165 170 175

Glu Lys Leu Lys Lys Lys Ala Tyr Lys Ala Arg Asp Val Asn Gln Gly

180 185 190

Asn Lys Ser Ser Gln Pro Pro Tyr Ser Ile Ser Asn Glu Asp Asp Leu

195 200 205

His Ala Pro Ile His Leu Gln Leu Ser Gln Pro Gln Ile Gln Thr

210 215 220

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 3

gaaggctaag gggctatcaa tcc 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 4

gcggagcatc aactgccgaa tccg 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 5

taccgtcgtt ccactagtga ttt 23

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 6

cgcggatcct ccactagtga tttcactata gg 32

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 7

cttctcattc tctttactta cgaggt 26

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 8

tatttcatca ttaaatatct ggttc 25

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 9

atggggagag gaaagattgt gattaga 27

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 10

attgttcgaa ggcccaagcc catg 24

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 11

cgagctcatg gggagaggaa agattgtgat 30

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 12

cgggatccct aagtttgaat ctgtggctgg c 31

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 13

ttgacgagca ggcaagtgac 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 14

tagcataatc gtaaagcctg 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 15

aatggaactg gaatggtcaa ggc 23

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 16

tgccagatct tctccatgtc atccca 26

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 17

tctagaatgg ggagaggaaa gattgtgatt ag 32

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 18

cccgggctaa gtttgaatct gtggctggc 29

Claims (10)

1.枇杷EjAGL17蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质，其中，所述的由1)衍生的蛋白质包括MADS结构域、I结构域、K结构域、C末端结构域。

2.编码权利要求1所述的枇杷EjAGL17蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。

6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

7.权利要求2或3所述基因在调控被子植物开花时间的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，将所述EjAGL17基因转入被子植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，促进植物的提前开花结果。

9.一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有权利要求2或3所述基因的过表达载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株。

10.如权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的转基因植株与野生型相比，其花序和花器官的分化和发育时间提前。

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