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CN110652585B - 多糖-蛋白缀合物免疫制剂及其制备与应用 - Google Patents

多糖-蛋白缀合物免疫制剂及其制备与应用 Download PDF

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CN110652585B
CN110652585B CN201911020193.6A CN201911020193A CN110652585B CN 110652585 B CN110652585 B CN 110652585B CN 201911020193 A CN201911020193 A CN 201911020193A CN 110652585 B CN110652585 B CN 110652585B
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Abstract

本发明提供了一种多糖‑蛋白缀合物免疫制剂及其制备与应用。所述的多糖‑蛋白缀合物中，载体蛋白为Ag473或者保留抗原活性的Ag473蛋白片段。本发明的多糖‑蛋白缀合物不仅可预防其所含荚膜多糖对应的细菌引起的感染性疾病，还可用于预防血清群B脑炎奈瑟氏球菌引起的感染性疾病。本发明的联合免疫制剂理化性质稳定，各组分间无干扰，可达到广谱抗菌的作用。使用Ag473作为载体蛋白，可一定程度上规避TT、DT为载体蛋白的表位抑制现象，以及毒性逆转和过敏反应等不安全风险。

Description

多糖-蛋白缀合物免疫制剂及其制备与应用
技术领域
本发明涉及一种多糖-蛋白缀合物免疫制剂及其制备与应用。
背景技术
细菌感染性疾病是一类严重危害人类健康的疾病，目前，临床上用于治疗细菌感染性疾病的药物主要为抗菌药物，但抗菌药物的滥用导致耐药菌尤其是多重耐药菌迅速增加，使其不能有效控制感染，成为临床处理的难题，也给社会带来了沉重的经济负担。细菌疫苗能提高易感人群对病原菌的抵抗力，降低病原菌感染的发生率，有利于感染性疾病的控制，所以，开发相关细菌疫苗一直是该领域的研究热点。实践证明，细菌疫苗在过去一个多世纪的发展中取得了辉煌的成果，对预防细菌感染性疾病发挥了巨大作用；常见的细菌类疫苗例如肺炎链球菌疫苗、脑膜炎奈瑟菌疫苗，B型流感嗜血杆菌(Hib)疫苗等。
(一)脑膜炎奈瑟菌主要引起流行性脑脊髓膜炎，并有许多资料表明脑膜炎奈瑟菌可作为原发性下呼吸道感染的致病菌，引起原发性脑膜炎奈瑟菌肺炎。脑膜炎奈瑟菌隐藏于患者或带菌者的鼻、咽分泌物中，主要通过咳嗽、打喷嚏、说话等方式由飞沫直接从空气传播，通过进入呼吸道引起感染，传染性很强，流行地域极广，遍及全球各地。通常以7岁以下儿童的发病率最高，学校、工地和商场等人群集中的地区为易发地。脑膜炎奈瑟菌按其荚膜多糖的特异性可分为A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y、Z共13个血清型致病菌。其中，A群、B群、C群、Y群及W135群五个血清群几乎是造成所有人类患病个案的血清群。目前，已上市脑膜炎球菌多糖或多糖结合疫苗包括单价疫苗，如A群脑膜炎球菌多糖疫苗和C群脑膜炎球菌多糖-蛋白结合疫苗等；以及多价疫苗，如A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗、A群C群脑膜炎球菌多糖-蛋白结合疫苗、ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗和ACYW135群脑膜炎球菌多糖-蛋白结合疫苗，以及由AC群脑膜炎球菌多糖-蛋白结合疫苗与Hib结合苗的联合疫苗等。B群脑膜炎奈瑟菌(MenB)荚膜多糖不适合作为疫苗候选物，这是由于MenB的荚膜多糖是由聚唾液酶构成的，它与发育中的人神经组织上的碳水化合物部分类似，这种糖部分被识别为自身抗原，因此对人的免疫原性弱。目前已有两款针对MenB的疫苗上市，分别为Trumenba(辉瑞)和Bexsero(诺华)，Trumenba的抗原成分主要为bivalent rLP2086；Bexsero的抗原活性成分主要为NadA,NHBA,fHbp,OMV-NZ。
由于脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖属T细胞非依赖性抗原，且两岁以下儿童的免疫系统尚未成熟，对大多数荚膜多糖的免疫应答较弱，不能够达到保护人体所需的抗体水平；同时由于荚膜多糖并不能在体内诱导免疫记忆，抗体在体内的存留时间较短。因此，脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖疫苗仅适用于5岁以上的儿童，不能用于2岁以下儿童的常规接种。将脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖与载体蛋白结合，可使荚膜多糖转化为T细胞依赖性抗原，从而刺激婴幼儿的T细胞依赖性抗体的合成，并可产生加强应答，同时还能提高免疫球蛋白(IgG)的抗体比例和抗体亲和力的成熟。这种多糖结合疫苗不仅适用于成人，而且适用于婴幼儿。
(二)肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，简称肺炎球菌(pneumococcus)，可引起肺炎、脑膜炎、败血症、中耳炎等疾病，5％～10％健康成年人以及20％～40％儿童的鼻咽等呼吸道中携带此菌，目前经发现的肺炎链球菌有90多个血清型。肺炎链球菌导致的疾病一直是全球严重的公共卫生问题，在全世界范围内有较高的发病率和病死率，尤其是对2岁以下的儿童和老人。目前已上市的肺炎链球菌荚膜糖疫苗和荚膜糖蛋白质结合疫苗，其设计都基于肺炎链球菌荚膜多糖，涵盖了导致肺炎链球菌性疾病的最常见血清型。肺炎球菌多糖抗原是非T细胞依赖性抗原，初次免疫能诱导产生保护水平的抗体，再次免疫不能诱导产生免疫记忆；肺炎链球菌荚膜糖疫苗对2岁以下的儿童不能引起有效的保护性抗体应答。现有的肺炎链球菌荚膜糖蛋白结合疫苗均用白喉或破伤风类毒素作为蛋白载体，这种多糖结合疫苗不仅适用于成人，而且适用于婴幼儿。
(三)B型流感嗜血杆菌(Hib)是儿童鼻咽部常见的共生细菌，可引起儿童肺炎和脑膜炎，Hib发病与死亡多见于发展中国家，疾病负担在4-18月龄儿童最为严重，但小于3月龄和大于5岁儿童也偶有发病。在未免疫人群，Hib是1岁以内儿童非流行性细菌性脑膜炎的主要病因。即便及时给予足量的抗生素治疗，3-20％的Hib脑膜炎患者仍会死亡。对Hib感染最有效的预防措施是肌肉注射Hib偶联菌苗，可大大降低肺炎及脑膜炎的发病几率。Hib荚膜多糖虽然有一定的免疫原性，但由于儿童免疫系统发育不健全，对多糖的免疫应答较弱，因此，需将Hib荚膜多糖与载体蛋白进行缀合后免疫，激发婴幼儿体内的DT免疫途径，以增强婴幼儿对多糖的免疫应答。目前国内上市的Hib疫苗为Hib荚膜多糖与TT的缀合疫苗。
综上所述，目前上市的脑膜炎球菌多糖结合疫苗、肺炎链球菌荚膜糖蛋白结合疫苗及Hib多糖结合苗中多使用TT或者DT作为载体蛋白，而约有95％的儿童患者接受过DT和TT疫苗，所以对DT和TT预先存在免疫力的人占有非常高的比例。当患者预先接种了DT或TT疫苗后，如果再采用DT或TT作为蛋白载体，则很大程度上会产生表位抑制现象。另TT、DT为载体蛋白的可能会有毒性逆转、过敏反应等不安全风险。同时由于B群脑膜炎奈瑟菌的特殊性，目前的脑膜炎球菌联合疫苗中，均未包含针对B群脑膜炎奈瑟菌的抗原成分，无法达到广谱抗脑膜炎奈瑟菌的作用。
另外，联合疫苗的开发有利于节省接种疫苗的次数、简化免疫程序、降低免疫接种成本，并提高免疫覆盖率，同时可以提供广谱的免疫效果，故联合疫苗的开发具有重要的意义。肺炎链球菌疫苗、脑膜炎奈瑟菌疫苗、B型流感嗜血杆菌疫苗有广泛的受种人群，接种程序的相近性，故可进一步开发联合疫苗，达到广谱抗脑膜炎和/或肺炎的作用。
发明内容
本发明是为了克服以上技术问题而提供了一种多糖-蛋白缀合物免疫制剂及其制备与应用。本发明的多糖-蛋白缀合物不仅可预防其所含荚膜多糖对应的细菌(如肺炎链球菌、脑炎奈瑟氏球菌和Hib)引起的感染性疾病，且使用Ag473作为载体蛋白还可用于预防血清群B脑炎奈瑟氏球菌引起的感染性疾病。基于此的联合免疫制剂(联合免疫制剂一般指包含至少两种如上所述的多糖-蛋白缀合物的免疫制剂)理化性质稳定，各组分间无干扰，可有效预防由上述细菌引起的疾病，减少接种疫苗的次数、简化免疫程序、降低免疫接种成本，并提高免疫覆盖率；进一步地可达到广谱抗菌的作用。且使用Ag473作为载体蛋白，可一定程度上规避TT、DT为载体蛋白的表位抑制现象，及毒性逆转和过敏反应等不安全风险。
本发明第一方面提供了一种多糖-蛋白缀合物，其中，载体蛋白为Ag473蛋白或保留抗原活性的Ag473片段。
Ag473是一种来自于脑膜炎奈瑟氏菌血清型B的表面蛋白，可被单克隆抗体(mAb)4-7-3特异性识别(记载于US7357932B2和Hsu C A,Lin W R,Li J C,etal.Immunoproteomic identification of the hypothetical protein NMB1468as anovel lipoprotein ubiquitous in Neisseria meningitidis with vaccine potential[J].Proteomics,2010,8(10):2115-2125中)。本申请中可使用脂质化Ag473(简称L-Ag473)或非脂质化的Ag473(简称NL-Ag473)做为载体蛋白使用；L-Ag473的氨基酸序列为与SEQ IDNO.1至少具有90％(优选如：95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的氨基酸序列(结构如图1所示)，脂蛋白信号序列的三重结构，N-区至少有两个带正电的残基；H-区或疏水区由7-22个主要为疏水和不带电的残基组成；C-区具有一致的[LVI][ASTVI][GAS][C]序列，称为脂盒。NL-Ag473的氨基酸序列为与SEQ ID NO.2至少具有90％(优选如：95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的氨基酸序列所示，L-Ag473和NL-Ag473参见Ching-LiangC,Yen-Ling Y,Yueh-Chen K,et al.The Immunomodulatory Activity of MeningococcalLipoprotein Ag473Depends on the Conformation Made up of the Lipid and ProteinMoieties[J].PLoS ONE,2012,7(7):e40873-.
SEQ ID NO.1：
MKKLLIAAMMAAALAACSQEAKQEVKEAVQAVESDVKDTAASAAESAASAVEEAKDQVKDAAADAKASAE(EAVTEAK)1～4EAVTEAAKDTLNKAADATQEAADKMKDAAK
SEQ ID NO.1中的7个氨基酸序列EAVTEAK可存在1个或2-4个的重复，分别形成L-Ag473-1(107aa，来自血清型B脑膜炎奈瑟氏菌株MC58的1468假想蛋白)、L-Ag473-2(114aa)、L-Ag473-3(121aa)或L-Ag473-4(128aa)共4种变体。
脂质化的Ag473一般指L-Ag473的N末端第17位半胱氨酸(Cys，简写C)的磺基被通过硫醚键连接的二酰基甘油基团改性，和/或氨基用脂肪酸酰化改性，如式I结构所示；R1、R2或R3分别为1-30个碳原子的支链或直链的饱和或非饱和烃基，进一步地为14-20碳原子的支链或直链的烷基或烯基，更进一步地，R1或R3为-(CH2)14CH3；R2为-(CH2)7-CH＝CH-(CH2)5CH3。
Figure BDA0002246961710000041
SEQ ID NO.2：
MWRSQEAKQEVKEAVQAVESDVKDTAASAAESAASAVEEAKDQVKDAAADAKASAE(EAVTEAK)1～ 4EAVTEAAKDTLNKAA DATQEAADKM KDAAK
SEQ ID NO.2中的7个氨基酸序列EAVTEAK可存在1个或2-4个的重复，分别形成NL-Ag473-1(93aa)、NL-Ag473-2(100aa)、NL-Ag473-3(107aa)或NL-Ag473-4(114aa)共4种变体。
SEQ ID NO.2同源性氨基酸序列例如SEQ ID NO.3：
MCSQEAKQEVKEAVQAVESDVKDTAASAAESAASAVEEAKDQVKDAAADAKASAEEAVTEAKEAVTEAKEAVTEAKEAVTEAAKDTLNKAADATQEAADKMKDAAK
在本发明的一些实施方案中，本发明中保留抗原活性的Ag473蛋白片段的氨基酸序列为：N端起始自SEQ ID NO.1中第18～40中的任一位氨基酸，C端终止于最后一位氨基酸。
在本发明的所述的保留抗原活性的Ag473蛋白片段的氨基酸序列SEQ ID NO.4(SEQ ID NO.1的N端第18～121残基，为Ag473成熟蛋白的氨基酸序列)所示：
SQEAKQEVK EAVQAVESDV KDTAASAAES AASAVEEAKD QVKDAAADAKASAEEAVTEAKEAVTEAKEA VTEAKEAVTEAAKDTLNKAA DATQEAADKM KDAAK。
Ag473可以通过生物、生物化学等方法生成，可参考文献Ching-Liang,Chu,etal."The Immunomodulatory Activity of Meningococcal Lipoprotein Ag473Dependson the Conformation Made up of the Lipid and Protein Moieties."PLoS ONE 7.7(2012):e40873-进行制备。
本发明Ag473可采用大肠杆菌表达，大肠杆菌包括但不限于C43(DE3)、C41(DE3)、DK8(DE3)S或C2014(DE3)；表达载体包括但不限于pET21或pET22b。培养基包括但不限于Luria-Bertani液体培养基(LB)、Super液体培养基(SB)、Terrific液体培养基(TB)、2xYT、M63培养基或M9培养基。
在本发明一些实施例中，所述多糖-蛋白缀合物中的多糖选自：肺炎链球菌荚膜多糖、脑炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)荚膜多糖或Hib(B型流感嗜血杆菌)荚膜多糖。
所述脑炎奈瑟氏球菌可选自A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y或Z血清群。优选地，所述的脑炎奈瑟氏球菌选自A、C、W135、X或Y血清群。
所述的脑炎奈瑟氏球菌荚膜多糖的定义或者制备可参见本领域技术人员所公知的技术标准或公开文献。如2015版中国药典中描述了A(如CMCC29201)、C(如CMCC29205)、W135(CMCC29037)或Y(CMCC29028)血清群脑炎奈瑟氏球菌荚膜多糖的定义和制备。
在本发明的一些实施方案中，所述的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖(如所述的A、C、W135、X或Y血清群脑膜炎奈瑟氏球菌)被部分解聚成小于500,000道尔顿的平均大小，如大约5,000-100,000道尔顿的平均大小，进一步可为8,000-75,000道尔顿的平均大小，更进一步可为12,000-35,000道尔顿的平均大小。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述的每种血清群脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖可部分解聚成大约12,000-22,000道尔顿的平均大小。
在本发明的一些实施方案中，所述的单一血清群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖与载体蛋白的平均比率为20:1至1:50(w/w)，进一步可为10:1至1:20(w/w)。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述的单一血清群脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与载体蛋白的平均比率为5:1至1:10(w/w)，进一步可为3:1至1:5(w/w)，如2:1(w/w)、1:1(w/w)、1:2(w/w)、1:3(w/w)、1:4(w/w)等。
Hib荚膜多糖的定义和制备可参照本领域技术人员所公知的技术标准或公开文献。如2015版中国药典中有描述Hib(如CMCC 58534)荚膜多糖的定义和制备。
在本发明的一些实施方案中，所述的Hib荚膜多糖还可被部分解聚成大约聚合度为10-35的荚膜多糖。进一步地，在本发明的一些实施方案中，被部分解聚成大约聚合度为15-35的荚膜多糖。
在本发明的一些实施方案中，所述的Hib荚膜多糖与载体蛋白的平均比率可为20:1至1:50(w/w)，进一步可为10:1至1:20(w/w)。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述的Hib荚膜多糖与载体蛋白的平均比率为5:1至1:10(w/w)，进一步可为3:1至1:5(w/w)，如2:1(w/w)、1:1(w/w)、1:2(w/w)、1:3(w/w)、1:4(w/w)等。
所述肺炎链球菌可选自如下血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、6C、7A、7B、7C、7F、8、9A、9L、9N、9V、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11F、12A、12B、12F、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、36、37、38、39、40、41、41F、42、43、44、45、46、47A、47F或48。本发明中优选的为致病肺炎链球菌血清型。
优选地，所述肺炎链球菌血清型可选自如下血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23A、23B、23F或33F。
所述的肺炎链球菌荚膜多糖的定义或者制备可参见本领域技术人员所公知的技术标准或公开文献。如专利WO2006110381A中公开了部分型别的肺炎链球菌荚膜多糖的制备以及纯化。
在本发明的一些实施方案中，所述的单一血清型肺炎链球菌荚膜多糖与载体蛋白的平均比率为20:1至1:50(w/w)，进一步可为10:1至1:20(w/w)。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述的每种血清群脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与载体蛋白的平均比率为5:1至1:10(w/w)，进一步可为3:1至1:5(w/w)，如2:1(w/w)、1:1(w/w)、1:2(w/w)、1:3(w/w)、1:4(w/w)等。
本发明一些实施方式中，所述的多糖-蛋白缀合物中，单一的载体蛋白可以携带多于一种多糖抗原。优选地，所述的多糖抗原为致病血清群/型。例如，单一载体蛋白可以缀合选自如下任一细菌组合的荚膜多糖：MenA和MenC；MenA和MenW135；MenA和MenX；MenA和MenY；MenC和MenW135；MenC和MenX；MenC和MenY；MenW135和MenX；MenW135和MenY；MenX和MenY；MenA、MenC和MenW135；MenA、MenC和MenX；MenA、MenC和MenY；MenA、MenW135和MenX；MenA、MenW135和MenY；MenC、MenW135和MenX；MenC、MenW135和MenY；MenW135、MenX和MenY；MenA、MenC、MenW135和MenX；MenA、MenC、MenW135和MenY；MenC、MenW135、MenX和MenY；Hib和MenA；Hib和MenC；Hib和MenW135；Hib和MenX；Hib和MenY；Hib、MenA和MenC；Hib、MenA和MenW135；Hib、MenA和MenX；Hib、MenA和MenY；Hib、MenC和MenW135；Hib、MenC和MenX；Hib、MenC和MenY；Hib、MenX和MenY；Hib、MenW和MenY；Hib、MenA、MenC和MenW135；Hib、MenA、MenC和MenX；Hib、MenA、MenC和MenY；Hib、MenA、MenW135和MenY；Hib、MenA、MenX和MenY；Hib、MenC、MenW135和MenY；Hib、MenC、MenX和MenY；Hib、MenW135、MenX和MenY；Hib、MenA、MenC、MenW135和MenY；Hib、MenA、MenC、MenX和MenY；Hib、MenC、MenW135、MenX和MenY；或，Hib、MenA、MenC、MenW135、MenX和MenY；血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌；血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌；血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌；血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌；血清型1、2、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌；血清型1、2、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和和33F的肺炎链球菌；血清型1、2、3、4、5、6B、7、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、20F、23F和33F的肺炎链球菌；血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib；血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib；血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib；血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib；血清型1、2、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib；血清型1、2、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和和33F的肺炎链球菌以及Hib；血清型1、2、3、4、5、6B、7、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、20F、23F和33F的肺炎链球菌以及Hib；血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA和MenC；血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA和MenC；血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA和MenC；血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA和MenC；血清型1、2、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA和MenC；血清型1、2、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和和33F的肺炎链球菌以及Hib、MenA和MenC；血清型1、2、3、4、5、6B、7、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、20F、23F和33F的肺炎链球菌以及Hib、MenA和MenC；血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135和MenY；血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135和MenY；血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135和MenY；血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135和MenY；血清型1、2、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135和MenY；血清型1、2、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和和33F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135和MenY；血清型1、2、3、4、5、6B、7、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、20F、23F和33F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135和MenY；血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135、MenX和MenY；血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135、MenX和MenY；血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135、MenX和MenY；血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135、MenX和MenY；血清型1、2、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135、MenX和MenY；血清型1、2、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和和33F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135、MenX和MenY；血清型1、2、3、4、5、6B、7、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、20F、23F和33F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135、MenX和MenY。
在本发明一些实施方式中，所述的多糖-蛋白缀合物中，当单一的载体蛋白携带多于一种多糖抗原时，多糖抗原的总含量与载体蛋白的平均比率可为20:1至1:50(w/w)，进一步可为10:1至1:20(w/w)。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述的Hib荚膜多糖与载体蛋白的平均比率为5:1至1:10(w/w)，进一步可为3:1至1:5(w/w)，如2:1(w/w)、1:1(w/w)、1:2(w/w)、1:3(w/w)、1:4(w/w)等。
在本发明一些实施方式中，所述的多糖-蛋白缀合物中，当单一的载体蛋白携带多于一种多糖抗原时，各多糖抗原之间的含量比可大于等于1(w/w)(例如2，3，4或更高)。
本发明第二方面提供了一种如上所述多糖-蛋白缀合物的制备方法，其包括将纯化的多糖与载体蛋白进行缀合。
肺炎链球菌多糖、脑膜炎球菌荚膜多糖与Hib荚膜多糖可通过本领域技术人员所公知的技术标准或者文献报道进行制备。在本发明的一些实施方案中，纯化的多糖在连接至载体蛋白质前可被解聚，例如利用温和氧化条件将来源于脑膜炎奈瑟氏球菌血清型的荚膜多糖部分解聚。又如在酸性条件下将HIb荚膜多糖解聚。
本发明所述的多糖与载体蛋白的缀合可以通过本领域中常规的偶联技术进行制备，多糖可以直接或者经过间隔基团(例如ADH、B-丙酰胺基(WO00/10599)、硝基苯基-乙胺(Gever等人(1979)Med.Microbiol.Immunol.165；171-288)、卤代烷基卤化物(US4057685)、糖苷键(US4673574、US4808700)、己二胺和6-氨基己酸(US4459286)等)连接至载体蛋白上。在本发明的一些实施方案中，纯化的多糖与载体蛋白进行缀合可通过共价键直接缀合。一般将多糖活化后与载体蛋白进行缀合，“活化”是指对多糖进行化学处理以提供能够与载体蛋白质反应的化学基团，活化和缀合的方法可以参照本领域常规方法进行；例如，可将脑膜炎球菌荚膜多糖在15到30℃、pH 5.0±0.1下于生理盐水中利用己二酸二酰肼处理；约2小时。
本发明第三方面提供了一种如上所述的多糖-蛋白缀合物在用于制备免疫制剂中的应用。本发明所述的免疫制剂优指疫苗。
本发明还提供了如上所述的多糖-蛋白缀合物在制备用于预防和/或治疗由肺炎链球菌和/或脑炎奈瑟氏球菌和/或B型流感嗜血杆菌引起的疾病的药物中的应用。所述由肺炎链球菌引发的疾病包括但不限于肺炎、脑膜炎、败血症、中耳炎等疾病；所述由肺炎链球菌引发的疾病包括但不限于流行性脑脊髓膜炎、原发性脑膜炎奈瑟菌肺炎等；所述B型流感嗜血杆菌引起的疾病包括但不限于肺炎和脑膜炎等。
本发明的第四方面还提供了一种免疫制剂，其包含至少一种如上所述的多糖-蛋白缀合物。
优选地，所述的免疫制剂包含选自：血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23A、23B、23F和33F肺炎链球菌荚膜多糖-蛋白缀合物；A、C、W135、X和Y群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖-蛋白缀合物；以及Hib荚膜多糖-蛋白缀合物中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种……至少三十一种。
在本发明的一些实施方式中，当所述的免疫制剂包含至少两种或以上的多糖-蛋白缀合物时，其中所述多糖可选自如下任一细菌荚膜多糖的组合：MenA和MenC；MenA和MenW135；MenA和MenX；MenA和MenY；MenC和MenW135；MenC和MenX；MenC和MenY；MenW135和MenX；MenW135和MenY；MenX和MenY；MenA、MenC和MenW135；MenA、MenC和MenX；MenA、MenC和MenY；MenA、MenW135和MenX；MenA、MenW135和MenY；MenC、MenW135和MenX；MenC、MenW135和MenY；MenW135、MenX和MenY；MenA、MenC、MenW135和MenX；MenA、MenC、MenW135和MenY；MenC、MenW135、MenX和MenY；Hib和MenA；Hib和MenC；Hib和MenW135；Hib和MenX；Hib和MenY；Hib、MenA和MenC；Hib、MenA和MenW135；Hib、MenA和MenX；Hib、MenA和MenY；Hib、MenC和MenW135；Hib、MenC和MenX；Hib、MenC和MenY；Hib、MenX和MenY；Hib、MenW和MenY；Hib、MenA、MenC和MenW135；Hib、MenA、MenC和MenX；Hib、MenA、MenC和MenY；Hib、MenA、MenW135和MenY；Hib、MenA、MenX和MenY；Hib、MenC、MenW135和MenY；Hib、MenC、MenX和MenY；Hib、MenW135、MenX和MenY；Hib、MenA、MenC、MenW135和MenY；Hib、MenA、MenC、MenX和MenY；Hib、MenC、MenW135、MenX和MenY；Hib、MenA、MenC、MenW135、MenX和MenY；血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌；血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌；血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌；血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌；血清型1、2、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌；血清型1、2、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和和33F的肺炎链球菌；血清型1、2、3、4、5、6B、7、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、20F、23F和33F的肺炎链球菌；血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib；血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib；血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib；血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib；血清型1、2、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib；血清型1、2、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和和33F的肺炎链球菌以及Hib；血清型1、2、3、4、5、6B、7、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、20F、23F和33F的肺炎链球菌以及Hib；血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA和MenC；血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA和MenC；血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA和MenC；血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA和MenC；血清型1、2、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA和MenC；血清型1、2、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和和33F的肺炎链球菌以及Hib、MenA和MenC；血清型1、2、3、4、5、6B、7、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、20F、23F和33F的肺炎链球菌以及Hib、MenA和MenC；血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135和MenY；血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135和MenY；血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135和MenY；血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135和MenY；血清型1、2、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135和MenY；血清型1、2、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和和33F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135和MenY；血清型1、2、3、4、5、6B、7、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、20F、23F和33F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135和MenY；血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135、MenX和MenY；血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135、MenX和MenY；血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135、MenX和MenY；血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135、MenX和MenY；血清型1、2、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135、MenX和MenY；血清型1、2、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和和33F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135、MenX和MenY；血清型1、2、3、4、5、6B、7、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、20F、23F和33F的肺炎链球菌以及Hib、MenA、MenC、MenW135、MenX和MenY。
在本发明的一些实施方式中，当所述的免疫制剂包含至少两种或以上的多糖-蛋白缀合物时，所述免疫制剂为单种所述多糖-蛋白缀合物的混合。
在本发明的一些实施方案中，所述免疫制剂中，单次剂量中单种血清群脑炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖的质量含量为0.5～15ug。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述免疫制剂中，单次剂量中单种血清群脑炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖的质量含量为2ug～10ug，进一步可为5ug。
在本发明的一些实施方案中，所述免疫制剂中，单次剂量中单种血清群脑炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖的质量含量可有10％-20％的误差。
在本发明的一些实施方案中，所述免疫制剂中，单次剂量中Hib荚膜多糖的质量含量为2～20ug。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述免疫制剂中，单次剂量中Hib荚膜多糖的质量含量为2.5ug～10ug。
在本发明的一些实施方案中，所述免疫制剂中，单次剂量中Hib荚膜多糖的质量含量可有10％-20％的误差。
在本发明的一些实施方案中，所述免疫制剂中，单次剂量中单种血清群肺炎链球菌的荚膜多糖的质量含量为0.5～15ug。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述免疫制剂中，单次剂量中单种血清型肺炎链球菌的荚膜多糖的质量含量为2ug～10ug，进一步可为4ug-8ug。
在本发明的一些实施方案中，所述免疫制剂中，单次剂量中单种血清型肺炎链球菌的荚膜多糖的质量含量可有10％-20％的误差。
在本发明一些实施方式中，血清型6B肺炎链球菌的荚膜多糖的质量含量是其它血清型肺炎链球菌的荚膜多糖的2倍。
在本发明的一些实施方案中，所述免疫制剂中，单次剂量中载体蛋白的总质量含量为10ug～200ug。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述免疫制剂中，单次剂量中载体蛋白的总质量含量为20ug～100ug，更进一步地可为50ug～80ug。
在本发明的一些实施方案中，所述免疫制剂中，单次剂量中载体蛋白的总质量含量可有10％-20％的误差。
所述的免疫制剂还可进一步包含药学上可接受的载体和/或佐剂。
所述的佐剂可选自铝佐剂、BAY、DC-chol、pcpp、TLR激动剂、单磷酰脂A、CpG、QS-21、MF57、免疫刺激复合物(ISCOMs)、或霍乱毒素甲酰甲硫氨酰肽等。
所述的铝佐剂可选自磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝。
在本发明的一些实施方案中，当采用L-Ag473作为载体蛋白时可以添加或不添加佐剂；当采用NL-Ag473作为载体蛋白时优选地添加所述佐剂。
在本发明的一些实施方案中，所述免疫制剂中，单次剂量中含有0.2mg～0.8mg元素铝佐剂。在本发明的一些实施方案中，所述免疫制剂中，单次剂量中元素铝的质量含量可有10％-50％的误差。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述免疫制剂中，单次剂量中含有0.4mg±20％元素铝佐剂。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述免疫制剂的单次免疫剂量科为0.5ml-1ml。
本发明所述的免疫制剂可以以单一剂量或以系列剂量(初免-加强免疫程序，可进行“一次加强”或“几次加强”)形式施用。初免-加强免疫程序包括向受试者施用第一种免疫组合物(初免疫苗)，然后施用第二种免疫组合物(加强疫苗)以诱导最佳的免疫反应。本领域技术人员应当了解初次免疫与加强免疫之间的合适时间间隔。
本发明所述免疫制剂包括：经管口，例如口、鼻、肛、阴道、经口、胃内、粘膜(例如经舌、肺泡、牙龈、嗅觉或呼吸粘膜)等施用的液体制剂(诸如混悬液、糖浆或酏剂)；以及经肠胃外、皮下、皮内、肌肉、腹膜内或静脉施用(例如注射施用)的制剂，诸如无菌混悬剂或乳剂。优选静脉内和肠胃外施用。所述免疫制剂可以与适当载体、稀释剂或赋形剂诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖等混合。所述免疫制剂也可以被冻干。根据所期望的施用路径和制剂形式，所述免疫制剂可以包含诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、胶凝剂或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等辅料。本领域技术人员将认识到：所选的免疫制剂组分必须为与免疫活性成分(即如上述所述的多糖-蛋白质载体缀合物)不起化学反应的。
使用剂量取决于免疫组分、给药途径、目标人群和其他因素。临床试验人员将根据他们的知识确定每种免疫组分的适当剂量和有效的免疫方案。单次给药即足够或需要采用单个和/或联合免疫原进行多次给药。
进一步地，在本发明的一个实施方案中，所述免疫制剂的施用路径是肌肉或皮下，优选肌肉施用路径。可以通过注射或备选的递送装置进行施用。
本发明第五方面提供了一种制备所述免疫制剂的方法，其包括混合所述多糖-蛋白缀合物。
在本发明一些实施例中，制备所述免疫制剂的方法，包括如下步骤：
(1)分别制备所述多糖-蛋白缀合物，并分别进行铝吸附；
(2)将步骤(1)制备的铝吸附后的多糖-蛋白缀合物混合。
本发明的第六方面提供一种所述免疫制剂的应用，所述免疫组合制剂在制备用于预防和/或治疗由肺炎链球菌和/或脑炎奈瑟氏球菌和/或B型流感嗜血杆菌引起的疾病的药物中的应用。所述由肺炎链球菌引发的疾病包括但不限于肺炎、脑膜炎、败血症、中耳炎等疾病；所述由肺炎链球菌引发的疾病包括但不限于流行性脑脊髓膜炎、原发性脑膜炎奈瑟菌肺炎等；所述B型流感嗜血杆菌引起的疾病包括但不限于肺炎和脑膜炎等。
本发明所涉及的多糖-蛋白缀合物及包含其的免疫制剂具有如下技术优势：
(一)本发明所述的多糖-蛋白缀合物不仅可预防其所含荚膜多糖对应的细菌(如肺炎链球菌、脑炎奈瑟氏球菌和Hib)引起的感染性疾病，且使用Ag473作为载体蛋白还可用于预防血清群B脑炎奈瑟氏球菌引起的感染性疾病。基于此的联合免疫制剂(联合免疫制剂一般指包含至少两种如上所述的多糖-蛋白缀合物的免疫制剂)理化性质稳定，各组分间无干扰，可有效预防由上述细菌引起的疾病，减少接种疫苗的次数、简化免疫程序、降低免疫接种成本，并提高免疫覆盖率。进一步地，可同时针对引起脑膜炎流行最常见的菌株A、C、W135、X、Y和B脑膜炎奈瑟菌同时达到免疫的效果，可达到广谱抗脑膜炎奈瑟菌的作用。在增加了Hib多糖蛋白和/或肺炎链球菌多糖蛋白的基础上，还可进一步的对其它细菌引起的脑膜炎起到预防的作用，同时还可预防由Hib和/或肺炎链球菌引起的其它疾病，如肺炎等。
(二)本发明的免疫制剂不仅适用于成人，而且适用于婴幼儿，受众范围更广。
(三)本发明使用Ag473作为载体蛋白，可一定程度上规避TT、DT为载体蛋白的表位抑制现象，及毒性逆转和过敏反应等不安全风险。
附图说明
图1为脂质化Ag473具有90％同源性的氨基酸结构图；
图2为实施例4中分析收集液样品的SDS-PAGE图；
图3为实施例5中分析收集液样品的SDS-PAGE图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
实施例1 脑膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W135、Y的纯化荚膜多糖的制备
分别地，将脑膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W135和Y的冻存湿种子培养物融化并在液体Watson Scherp培养基的帮助下重构，后接种至含有Mueller Hinton琼脂培养基的Blake瓶中，CO2气氛中35至37℃孵育15至19小时。孵育后，将生长物再依次扩增至4L和50L含有Watson Scherp培养基的摇瓶中，摇瓶在水平摇床上35至37℃孵育。孵育后，采用塞太弗伦(Cetavlon)沉淀，离心收集多糖糊状物粗品。
多糖糊状物采用2-4次0.9M氯化钙悬浮离心，收集上清，将上清用10-30kD截留分子量的超滤膜包超浓缩。浓缩液加入氯化镁，调节PH 7.2-7.5，加入DNase和RNase孵育，加乙醇使其终浓度为30％～50％，离心去除核酸和蛋白质，回收上清加乙醇至终浓度为80％，离心后收集沉淀，分别用乙醇和丙酮洗涤沉淀多糖。沉淀多糖用乙酸钠溶液复溶，加入氯化镁，调节PH7.2-7.5，加入DNase和RNase孵育去除残余的核酸，酶孵育后向多糖-酶混合物中加入等体积乙酸钠-苯酚溶液，混合后离心，去除蛋白质和内毒素，收集水相。合并的水相加水稀释后进行超滤透析(diafilter)，透析液加乙醇至80％并于1至5℃用以沉淀，弃掉乙醇上清，离心收集多糖沉淀并进行干燥。
将上述纯化的荚膜多糖粉末加入无菌50mM乙酸钠缓冲液(pH6.0)复溶，多糖浓度为1.25g/L，将多糖溶液加热至55℃±0.1。向反应混合物中加入30％过氧化氢至其反应浓度为1％。反应进程每隔15至20分钟监测多糖分子大小的变化，当多糖的分子大小到达目标分子大小时，将多糖溶液迅速冷却至5℃，将解聚多糖溶液浓缩至15g/L，浓缩后的解聚多糖溶液对10倍体积无菌生理盐水(0.85％氯化钠)超滤透析，得到解聚多糖待用，经测定脑膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W135和Y多糖分子量分别为15,000-22,000道尔顿的平均大小。
实施例2 Hib荚膜多糖的制备
B型流感嗜血杆菌菌种来源于中国医学菌种保藏中心，工作种子在Hib综合培养基上扩增、培养、热灭活后离心收集上清，上清液用100KD截留分子量的超滤膜包浓缩超滤。
用pH7.0左右的磷酸盐缓冲液对超滤液进行超滤换液，然后加入无水乙醇，使乙醇终浓度为30％，充分搅拌后离心去除核酸。
向上清中加入乙醇使其终浓度达到70％，搅拌后离心，收集沉淀。
沉淀经注射用水复溶后，加入2倍溶液体积的苯酚抽提4～6次，去除蛋白。
向苯酚抽提液中加入乙醇，使其终浓度达到65～75％，离心后收集沉淀，将沉淀采用注射水复溶，经过0.22μm的无菌滤器除菌过滤后，获得B型流感嗜血杆菌荚膜多糖原液。
实施例3 肺炎链球菌多糖的制备
1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F血清型肺炎球菌菌种进行传代建立原始种子库、主种子库和工作种子库，代次分别为：原始种子批为第1代，主种子批为第4代，工作种子批为第8代。工作种子批启开后至接种发酵罐培养，传代应不超过10代。每代种子采用奶粉做冻干保护剂，冻干保藏。取工作种子在大豆蛋白胨固体培养基划线挑取菌种，接种于5ml的液体综合培养基，35℃培养后，转种到200ml的培养液后经过培养再扩增至2L培养液和30L培养液。于对数生长期的后期或静止期的前期中止培养，取样进行纯菌检查，在收获的培养液中加入福尔马林溶液杀菌两小时后再加入适量的去氧胆酸钠至终浓度为0.3％搅拌两小时以裂解细菌并释放荚膜多糖。将已裂解的培养液离心后收集上清液，上清液用100KD截留分子量的超滤膜包超滤浓缩10倍。
用pH7.0左右的磷酸盐缓冲液对超滤液进行超滤换液，然后加入无水乙醇，使乙醇终浓度为30％，充分搅拌后离心去除核酸。
向上清中加入乙醇使其终浓度达到70％，搅拌后，离心，去除上清收集沉淀。
加水溶解沉淀，加入2倍溶液体积的苯酚进行多次抽提，去除蛋白。
向上清中加入乙醇，使其终浓度达到55％，离心后收集沉淀，将沉淀采用注射水复溶，经过0.22μm的无菌滤器除菌过滤后，获得1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F血清型的肺炎球菌荚膜多糖原液。
实施例4 L-Ag473蛋白的制备
1.重组质粒的构建
参考L-Ag473的核酸序列设计并合成引物，上游引物中引入NdeI酶切位点，下游引物中引入XhoI酶切位点，进行全基因合成。
L-Ag473氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示：
MKKLLIAAMMAAALAACSQEAKQEVKEAVQAVESDVKDTAASAAESAASAVEEAKDQVKDAAADAKASAEEAVTEAKEAVTEAKEAVTEAKEAVTEAAKDTLNKAADATQEAADKMKDAAK
Primer I如SEQ ID NO:6所示：GGATCCCATGAAAAAATTATTGATTGCCGCAATG
Primer II如SEQ ID NO:7所示：AAGCTTGGCGGCATCTTTCATTTTGTCTGCCG
PCR扩增得到编码L-Ag473目的基因，利用NdeI和XhoI位点将PCR产物克隆到pET21载体，连接后转化至大肠杆菌C41(DE3)细胞中，挑取重组子，将测序正确的质粒命名为pET21-L-Ag473-His。
2.目的蛋白的表达及纯化
将测序正确的重组子单菌落接种至5ml M9(补充50μg/ml苄青霉素)培养基中，37℃、220rps摇床培养过夜；取1ml转接至100ml M9(补充50μg/ml苄青霉素)培养基中，相同条件培养，至OD值约为0.5时，加入0.5mM的IPTG诱导L-Ag473表达，4h后，将诱导的菌液以10000rpm离心10min，收集菌体。
将菌体重新悬浮于均质缓冲液中(20mMTris–Cl，500mM NaCl，10％甘油，50mM蔗糖，10mM咪唑，pH 8.0)，于高压均质仪破菌，离心收集上清液。上清液经
Figure BDA0002246961710000171
的膜过滤，后装载于20ml镍-NTA柱(2.2cm I.D.×5.3cm)纯化，先用均质缓冲液冲洗，然后含50mm咪唑的缓冲液冲洗，最后用含500mm咪唑的缓冲液洗脱，收集L-Ag473。SDS-PAGE分析收集液样品，SDS-PAGE图如图2所示。Edman降解法N端测序结果显示，L-Ag473的N端被封闭，表明该蛋白可能发生了脂质化修饰。
实施例5 NL-Ag473的制备
1.重组质粒的构建
参考NL-Ag473的核酸序列(SEQ ID NO:5)设计并合成引物，上游引物中引入BamHI酶切位点，下游引物中引入Hind III酶切位点，进行全基因合成。
NL-Ag473氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示：
MCSQEAKQEVKEAVQAVESDVKDTAASAAESAASAVEEAKDQVKDAAADAKASAEEAVTEAKEAVTEAKEAVTEAKEAVTEAAKDTLNKAADATQEAADKMKDAAK
Primer I’如SEQ ID NO:9所示：GGAATTCCATATGAAAAAATTATTGATTGC
Primer iI’如SEQ ID NO:10所示：
CCGCTCGAGGTGATGATGTTTGGCGGCATCTTTCATTTTG
PCR扩增得到编码NL-Ag473目的基因，利用BamHI和Hind III位点将PCR产物克隆到pET21载体，连接后转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，挑取重组子，将测序正确的质粒命名为pET21-NL-Ag473-His。
2.目的蛋白的表达及纯化
将测序正确的重组子单菌落接种至5ml LB(补充50μg/ml氨苄青霉素)培养基中，37℃、220rps摇床培养过夜；取1ml转接至100ml LB(补充50μg/ml氨苄青霉素)培养基中，相同条件培养，至OD值为0.5-0.8时，加入0.5mM的IPTG诱导NL-Ag473表达，4h后，将诱导的菌液以10000rpm离心10min，收集菌体。
将菌体重新悬浮于均质缓冲液中(20mMTris–Cl，500mM NaCl，10％甘油，50mM蔗糖，10mM咪唑，pH 8.0)，于高压均质仪破菌，离心收集上清液。上清液经0.45mM的膜过滤，后装载于20ml镍-NTA柱(2.2cm I.D.×5.3cm)纯化，先用均质缓冲液冲洗，然后含50mm咪唑的缓冲液冲洗，最后用含500mm咪唑的缓冲液洗脱，收集NL-Ag473。SDS-PAGE分析收集液样品，SDS-PAGE图如图3所示。Edman降解法N端测序结果显示，NL-Ag473的N端氨基酸序列为MCSQEA。
实施例6 Hib荚膜多糖蛋白缀合物的制备
Ag473蛋白(采用NL-Ag473和L-Ag473分别进行制备，浓度10mg/ml，溶剂：PBS)与己二酰肼(100mg/ml，溶剂：碳酸氢钠水溶液)混合，Ag473蛋白与己二酰肼投料质量为1:10；加入EDAC(1mol/L，溶剂：水)至其终浓度分别为0.1mol/L，在室温反应2小时，以pH7.0左右的磷酸盐缓冲液超滤透析后即得Ag473-ADH衍生物(分别可得到NL-Ag473-ADH衍生物和L-Ag473-ADH衍生物)。
按照Hib多糖与CDAP(1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸)质量比为1:0.75向Hib多糖溶液(实施例2制备，多糖浓度为10mg/ml)中加入CDAP(100mg/ml，溶剂乙腈)，控制PH为9.2，室温反应约2分钟。按Hib多糖与Ag473-ADH衍生物质量比1:1的进行结合反应，PH为9～9.5，反应3小时加入甘氨酸(甘氨酸与CDAP的质量比为1:1)终止结合反应，结合物经超滤透析和凝胶层析纯化去除游离蛋白、游离多糖和反应化学试剂，经0.2μm滤器除菌过滤，分别得到Hib多糖-L-Ag473蛋白缀合物和Hib多糖-NL-Ag473蛋白缀合物原液。
(2)将纯化后的Hib多糖-L-Ag473蛋白缀合物和Hib多糖-NL-Ag473蛋白缀合物原液与磷酸铝佐剂吸附，使含Hib多糖含量为20μg/ml，磷酸铝佐剂终浓度为2.72mg/ml。
实施例7 脑膜炎奈瑟氏球菌多糖蛋白缀合物的制备
原料为实施例1制备的脑膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W-135和Y解聚的荚膜多糖，每一血清型多糖分别进行缀合。
按照脑膜炎奈瑟氏球菌多糖与CDAP质量比为1:0.75向脑膜炎奈瑟氏球菌多糖溶液(浓度为6mg/ml，溶剂：注射用水)中加入CDAP(100mg/ml，溶剂乙腈)，控制PH为9.2，室温反应约2分钟。按脑膜炎奈瑟氏球菌多糖与L-Ag473-ADH衍生物(实施例6制备)质量比1:1的进行结合反应，PH为9～9.5，反应3小时加入甘氨酸(甘氨酸与CDAP的质量比为1:1)终止结合反应，结合物经超滤透析和凝胶层析纯化去除游离蛋白、游离多糖和反应化学试剂，经0.2μm滤器除菌过滤，得到脑膜炎奈瑟氏球菌多糖蛋白缀合物原液。
实施例8 肺炎链球菌多糖蛋白的制备
分别向实施例3中制备的13种肺炎球菌荚膜多糖原液中加入CDAP活化多糖，活化的多糖：蛋白质＝1:1的重量比加入L-Ag473-ADH(实施例6制备)进行结合反应，PH为9～9.5，反应3小时加入甘氨酸终止结合反应，制备肺炎球菌荚膜多糖结合物，结合物采用超滤透析，去除未结合的蛋白质和多糖，纯化后采用0.2μm的滤器除菌过滤，即得到肺炎球菌荚膜多糖蛋白单价缀合物。
按照药典规定的方法检测得到上述制备多糖蛋白缀合物的表征数据如下：
Figure BDA0002246961710000191
Figure BDA0002246961710000201
实施例9 Hib荚膜多糖蛋白缀合物的免疫效果实验
12～14g的BALB/c小鼠按体重随机分组，每组6只，阴性对照组注射0.5ml无菌生理盐水，实验组Hib多糖含量为10ug/剂，每2周免疫1次，每次0.5ml，共3次。于6周眼眶静脉丛采血，采用ELISA方法检测各小鼠血清中抗Hib多糖特异性抗体和抗Ag473抗体的IgG的含量。
表1抗体水平(GM，95％CI)
Figure BDA0002246961710000202
结论：由表1中的抗体水平可以看出，脂质化和非脂质化的Ag473与Hib多糖结合后均有良好的免疫效果，说明Ag473作为载体蛋白与Hib的缀合效果好。就脂质化与非脂质化的Ag473相比，脂质化的Ag473免疫效果优于非脂质化的Ag473。
实施例10脑膜炎球菌多糖蛋白的免疫效果实验
实验组为①血清型A、C、W135和Y单价脑膜炎球菌多糖蛋白，②A、C、W135和Y脑膜炎球菌多糖蛋白缀合物的组合物，③Hib多糖蛋白缀合物，与A、C脑膜炎球菌多糖蛋白缀合物的组合物；其中，各脑膜炎球菌多糖含量为5ug/剂；Hib多糖为5ug/剂，载体蛋白均为L-Ag473。
12～14g的BALB/c小鼠按体重随机分组，每组6只，阴性对照组注射0.5ml无菌生理盐水，每2周免疫1次，每次0.5ml，共3次。于6周眼眶静脉丛采血，采用ELISA方法检测各小鼠血清中抗相应多糖特异性抗体和抗Ag473抗体的IgG的含量，数据见表2和表3。
表2抗多糖特异性抗体水平(GMT，95％CI)
Figure BDA0002246961710000211
表3.抗Ag473抗体水平(GMT，95％CI)
Figure BDA0002246961710000212
实施例11
12～14g的BALB/c小鼠按体重随机分组，每组6只，阴性对照组注射0.5ml无菌生理盐水；将实施例8制备的13种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物混合得到13价组合物作为实验组，确定pH值在6-7的范围内，其中各个血清型肺炎链球菌多糖含量为2ug/剂；每2周免疫1次，每次0.5ml，共3次。于6周眼眶静脉丛采血，采用ELISA方法检测各小鼠血清中抗肺炎链球菌多糖特异性抗体和抗Ag473抗体的IgG的含量，见表4。
表4
Figure BDA0002246961710000221
结论：由表4数据可知，肺炎球菌多糖与Ag473载体蛋白的缀合良好，肺炎球菌各血清型多糖与Ag473缀合均可引起6周以上的免疫反应，且抗体滴度维持较高水平。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Figure BDA0002246961710000231
Figure BDA0002246961710000241
Figure BDA0002246961710000251
Figure BDA0002246961710000261
Figure BDA0002246961710000271
序列表
<110> 武汉博沃生物科技有限公司
<120> 多糖-蛋白缀合物免疫制剂，及其制备、免疫制剂与应用
<150> 2018112585349
<151> 2018-10-26
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(107)
<400> 1
Met Lys Lys Leu Leu Ile Ala Ala Met Met Ala Ala Ala Leu Ala Ala
1 5 10 15
Cys Ser Gln Glu Ala Lys Gln Glu Val Lys Glu Ala Val Gln Ala Val
20 25 30
Glu Ser Asp Val Lys Asp Thr Ala Ala Ser Ala Ala Glu Ser Ala Ala
35 40 45
Ser Ala Val Glu Glu Ala Lys Asp Gln Val Lys Asp Ala Ala Ala Asp
50 55 60
Ala Lys Ala Ser Ala Glu Glu Ala Val Thr Glu Ala Lys Glu Ala Val
65 70 75 80
Thr Glu Ala Ala Lys Asp Thr Leu Asn Lys Ala Ala Asp Ala Thr Gln
85 90 95
Glu Ala Ala Asp Lys Met Lys Asp Ala Ala Lys
100 105
<210> 2
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(93)
<400> 2
Met Trp Arg Ser Gln Glu Ala Lys Gln Glu Val Lys Glu Ala Val Gln
1 5 10 15
Ala Val Glu Ser Asp Val Lys Asp Thr Ala Ala Ser Ala Ala Glu Ser
20 25 30
Ala Ala Ser Ala Val Glu Glu Ala Lys Asp Gln Val Lys Asp Ala Ala
35 40 45
Ala Asp Ala Lys Ala Ser Ala Glu Glu Ala Val Thr Glu Ala Lys Glu
50 55 60
Ala Val Thr Glu Ala Ala Lys Asp Thr Leu Asn Lys Ala Ala Asp Ala
65 70 75 80
Thr Gln Glu Ala Ala Asp Lys Met Lys Asp Ala Ala Lys
85 90
<210> 3
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(106)
<400> 3
Met Cys Ser Gln Glu Ala Lys Gln Glu Val Lys Glu Ala Val Gln Ala
1 5 10 15
Val Glu Ser Asp Val Lys Asp Thr Ala Ala Ser Ala Ala Glu Ser Ala
20 25 30
Ala Ser Ala Val Glu Glu Ala Lys Asp Gln Val Lys Asp Ala Ala Ala
35 40 45
Asp Ala Lys Ala Ser Ala Glu Glu Ala Val Thr Glu Ala Lys Glu Ala
50 55 60
Val Thr Glu Ala Lys Glu Ala Val Thr Glu Ala Lys Glu Ala Val Thr
65 70 75 80
Glu Ala Ala Lys Asp Thr Leu Asn Lys Ala Ala Asp Ala Thr Gln Glu
85 90 95
Ala Ala Asp Lys Met Lys Asp Ala Ala Lys
100 105
<210> 4
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(104)
<400> 4
Ser Gln Glu Ala Lys Gln Glu Val Lys Glu Ala Val Gln Ala Val Glu
1 5 10 15
Ser Asp Val Lys Asp Thr Ala Ala Ser Ala Ala Glu Ser Ala Ala Ser
20 25 30
Ala Val Glu Glu Ala Lys Asp Gln Val Lys Asp Ala Ala Ala Asp Ala
35 40 45
Lys Ala Ser Ala Glu Glu Ala Val Thr Glu Ala Lys Glu Ala Val Thr
50 55 60
Glu Ala Lys Glu Ala Val Thr Glu Ala Lys Glu Ala Val Thr Glu Ala
65 70 75 80
Ala Lys Asp Thr Leu Asn Lys Ala Ala Asp Ala Thr Gln Glu Ala Ala
85 90 95
Asp Lys Met Lys Asp Ala Ala Lys
100
<210> 5
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(121)
<400> 5
Met Lys Lys Leu Leu Ile Ala Ala Met Met Ala Ala Ala Leu Ala Ala
1 5 10 15
Cys Ser Gln Glu Ala Lys Gln Glu Val Lys Glu Ala Val Gln Ala Val
20 25 30
Glu Ser Asp Val Lys Asp Thr Ala Ala Ser Ala Ala Glu Ser Ala Ala
35 40 45
Ser Ala Val Glu Glu Ala Lys Asp Gln Val Lys Asp Ala Ala Ala Asp
50 55 60
Ala Lys Ala Ser Ala Glu Glu Ala Val Thr Glu Ala Lys Glu Ala Val
65 70 75 80
Thr Glu Ala Lys Glu Ala Val Thr Glu Ala Lys Glu Ala Val Thr Glu
85 90 95
Ala Ala Lys Asp Thr Leu Asn Lys Ala Ala Asp Ala Thr Gln Glu Ala
100 105 110
Ala Asp Lys Met Lys Asp Ala Ala Lys
115 120
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
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ggatcccatg aaaaaattat tgattgccgc aatg 34
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(32)
<400> 7
aagcttggcg gcatctttca ttttgtctgc cg 32
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(106)
<400> 8
Met Cys Ser Gln Glu Ala Lys Gln Glu Val Lys Glu Ala Val Gln Ala
1 5 10 15
Val Glu Ser Asp Val Lys Asp Thr Ala Ala Ser Ala Ala Glu Ser Ala
20 25 30
Ala Ser Ala Val Glu Glu Ala Lys Asp Gln Val Lys Asp Ala Ala Ala
35 40 45
Asp Ala Lys Ala Ser Ala Glu Glu Ala Val Thr Glu Ala Lys Glu Ala
50 55 60
Val Thr Glu Ala Lys Glu Ala Val Thr Glu Ala Lys Glu Ala Val Thr
65 70 75 80
Glu Ala Ala Lys Asp Thr Leu Asn Lys Ala Ala Asp Ala Thr Gln Glu
85 90 95
Ala Ala Asp Lys Met Lys Asp Ala Ala Lys
100 105
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(30)
<400> 9
ggaattccat atgaaaaaat tattgattgc 30
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(40)
<400> 10
ccgctcgagg tgatgatgtt tggcggcatc tttcattttg 40

Claims (5)

1.一种多糖-蛋白缀合物，其特征在于，载体蛋白为Ag473，所述多糖选自：肺炎链球菌荚膜多糖、脑炎奈瑟氏球菌荚膜多糖或Hib荚膜多糖；所述多糖-蛋白缀合物可预防其所含荚膜多糖对应的细菌引起的感染性疾病，且可用于预防血清群B脑炎奈瑟氏球菌引起的感染性疾病；当Ag473是脑膜炎奈瑟氏菌表面的脂质化重组蛋白时，其氨基酸序列SEQ IDNO.5所示，当Ag473是脑膜炎奈瑟氏菌表面的非脂质化重组蛋白时，其氨基酸序列SEQ IDNO.8所示；其中，脑炎奈瑟氏球菌选自A、C、W135、X或Y血清群，单一血清群脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖与载体蛋白的平均比率为20:1至1:50(w/w)，脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖被解聚成12,000-22,000道尔顿的平均大小，肺炎链球菌选自如下血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23A、23B、23F或33F，单一血清型肺炎链球菌荚膜多糖与载体蛋白的平均比率为3:1至1:5 (w/w)，多糖抗原的总含量与载体蛋白的平均比率为3:1至1:5 (w/w)。
2.一种如权利要求1所述的多糖-蛋白缀合物的制备方法，其特征在于，包括将纯化的多糖与载体蛋白进行缀合。
3.如权利要求1所述的多糖-蛋白缀合物在用于制备免疫制剂中的应用。
4.一种免疫制剂，其特征在于，包含至少一种如权利要求1所述的多糖-蛋白缀合物。
5.一种如权利要求4所述的免疫制剂的制备方法，其特征在于，混合所述的多糖-蛋白缀合物。
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